Генотипові та фенотипові ознаки вірулентності вірусів ЕСНО

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ О.О.БОГОМОЛЬЦЯ МОЗ УКРАЇНИ

03.00.06 - Вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Генотипові та фенотипові ознаки вірулентності вірусів ЕСНО

Гриценко Лариса Миколаївна

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені О.О.Богомольця МОЗ України

Науковий керівник

доктор медичних наук, професор,

академік НАН України, член-кореспондент НАМН України

Широбоков Володимир Павлович

Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України,

завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дзюблик Ірина Володимирівна, Національна медична академія післядипломної освіти імені П.Л.Шупика МОЗ України, завідувач кафедри вірусології;

доктор медичних наук, доцент Євтушенко Олександр Іванович, Державна Установа “Інститут гігієни та медичної екології імені О.М.Марзєєва АМН України”, заступник директора.

Захист відбудеться “_03_”___лютого__ 2011 року о _15 30 годині

На засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.003.01 Національного медичного університету імені О.О.Богомольця за адресою: 03680, м. Київ, пр. Перемоги, 34, санітарно-гігієнічний корпус, аудиторія №2.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О.Богомольця за адресою: 03680, м.Київ, вул. Зоологічна, 1.

Автореферат розісланий “_30_”__грудня__ 2011 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

д.мед.н., професор Войцеховський В.Г.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Постійні зміни в екосистемах обумовлюють еволюційні перетворення як макро- так і мікроорганізмів. Це приводить до появи нових збудників, рекомбінантних мікроорганізмів, які можуть виявитися більш життєздатними, відрізнятися генетичними, антигенними та імуногенними властивостями. У значній мірі це відноситься й до ентеровірусів.

На сучасному етапі серед ентеровірусів набувають великого значення в підтримці епідемічного процесу віруси ЕСНО (Enteric cytopathogenic human orphan). За літературними даними, великий відсоток спалахів, які викликані неполіомієлітними ентеровірусами (ЕВ), пов'язані саме з цими вірусами. Більшість типів вірусів ЕСНО мають поліорганний тропізм. Вони є етіологічними агентами менінгітів (Perez C., 2003, Avellon A., 2003, Machado B.C., 2007 та ін.), патологій серцево-судинної системи (Амосова К.М., 1998, Ferreira A.G., 1995, Galama J.M.D., 1996, Newcombe N. G., 2004), патологій кишково-шлункового тракту (Abe O., 2000, Лукашев А.Н., 2008).

Науково-технічний прогрес призвів до того, що діяльність людини стала потужним чинником біологічної еволюції. З одного боку, хімічне забруднення довкілля, радіаційне навантаження, стреси, загострення соціальних умов життя негативно впливають на загальний імунний стан людини, що відбивається на формуванні специфічного імунітету як основного регулюючого фактора інтенсивності циркуляції ентеровірусів, з другого боку, широкомасштабні акції щодо ліквідації поліовірусної інфекції значно розширюють екологічну нішу для інших ЕВ. Це призводить не лише до активізації епідемічного процесу ентеровірусних інфекцій (ЕВІ), а й до появи нових епідемічно актуальних типів ЕВ. За рахунок розширення екологічної ніші складаються сприятливі умови для еволюції певних серотипів ЕВ у бік набуття вірулентних властивостей зі здатністю викликати нові клінічні форми хвороби.

За даними іноземних вчених, у теперішній час ЕВ все частіше стають причиною захворювань з проявами від незначної лихоманки та шкіряних висипів до цукрового діабету, вроджених вад, міокардитів, уражень нервової системи (Paanen A., 2007, Широбоков В.П., Амосова К.М., 1998 та ін). У літературі є повідомлення про визначення нових властивостей вірусів ЕСНО: доведена здатність вірусів ЕСНО-11 та 19 викликати увеїти та некроз печінки з блискавичним перебігом, що закінчується летально (Лашкевич В.А., Королева Г.А., 2005, Лукашев А.Н., 2007). У теперішній час, завдяки розвитку молекулярно-генетичних методів дослідження, вдалося довести причетність ЕВ до тих захворювань, що раніше вважалися суто соматичними.

Детальне вивчення біологічних властивостей та молекулярної структури ентеровірусів, у тому числі вірусів ЕСНО окремих типів, дозволяє вносити зміни до їх класифікації. Прикладом є віруси ЕСНО 22 та 23 типів, які на підставі відмінностей в генетичній структурі від інших вірусів ЕСНО, виділені в новий рід (Schnurr D., 1996, Oberste M.Steven,1998). Як показали дослідження (Savolainen C.,2001), геном вірусу ЕСНО-30 подібний до геному вірусів групи Коксакі В, що повинно взагалі змінити погляд на ту умовну диференціацію груп ЕВ, яка сьогодні існує.

Особливу увагу привертає виділення вірусів ЕСНО від здорових осіб (Dos Santos G.P., 2006, Khetsuriani N., LaMonte-Fowlkes A., 2006), що свідчить про велику внутрішньотипову диференціацію популяції цих вірусів. У зв'язку з відсутністю чутливих лабораторних тварин для вірусів ЕСНО феномен їх вірулентності вивчено недостатньо. Зокрема не відомо, чи придатні фенотипові маркери вірулентності поліовірусів для вивчення вірулентності вірусів ЕСНО. Саме тому потребують глибокого порівняльного вивчення зміни безпосередньо в геномі вірусів ЕСНО, які ізольовані при патології та від здорових осіб. Це, в свою чергу, може стати основою для внутрішньотипової диференціації авірулентних та вірулентних штамів вірусів ЕСНО.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана наукова робота виконувалась як фрагмент науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та імунології імені О.О.Богомольця “ Вивчення фенотипових та генотипових ознак вірусів ЕСНО, що корелюють з їх вірулентністю”, державний реєстраційний номер 0108U007321.

Мета і завдання дослідження. Мета: Встановити генотипові та фенотипові ознаки вірулентності вірусів ЕСНО та обґрунтувати їх використання для диференціації вірусів.

Для досягнення мети були поставлені наступні завдання:

Створити колекцію актуальних в епідеміологічному плані типів вірусів ЕСНО, які циркулюють на території України.

Встановити придатність використання фенотипових поліовірусних маркерів вірулентності для вірусів ЕСНО.

З'ясувати сорбційні властивості вірусів ЕСНО на бентоніті, з урахуванням типу вірусу. вірулентність вірус мутаційний нуклеотид

Оцінити потенційні можливості використання ознаки rct40 для внутрішньотипової диференціації вірусів.

Виявити методом секвенування фрагменту РНК мутаційні зміни в локусі поверхневого білку VP1 на рівні нуклеотидів між штамами, ізольованими від здорових та хворих осіб.

Об'єкти дослідження: вірулентність вірусів ЕСНО, генотипові та фенотипові ознаки.

Предмет дослідження: штами вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів (37 штамів), які виділені від здорових та хворих осіб на території України, дані річної звітності вірусологічних лабораторій СЕС згідно з додатком 10 Наказу МОЗ України від 14.07.98р.№196.

Методи дослідження: медико-статистичні - результати річної звітності вірусологічних лабораторій СЕС, вірусологічні - культивування вірусів у 3 лініях перещеплювальних клітинних культурах: НЕр-2, RD, Vero, бентонітовий тест та маркуюча ознака rct40; імунологічні - реакція вірусної нейтралізації; генетичні - полімеразна ланцюгова реакція, передсіквенсова реакція та безпосередньо секвенування фрагменту гену vp1; статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено актуальні в епідеміологічному плані типи вірусів ЕСНО, які циркулюють на території України, а саме віруси ЕСНО 3,6,11,13,24,30 типів. Визначено генотипові та фенотипові характеристики 18 штамів, виділених від здорових осіб та 19 штамів - від хворих осіб.

Доведено, що вірусам ЕСНО притаманна дисоціація за бентонітовим генетичним маркером після репродукції вірусів в культурі клітин з утворенням двох популяцій, одна з яких сорбується на бентоніті (Абент+), інша - не сорбується (Абент-). Штами вірусів, виділені від хворих осіб з асептичним менінгітом, переважно мають маркер Абент- (63,16 % штамів), штами, виділені від здорових осіб - маркер Абент+ (66,67 % штамів).

Встановлено, що серед досліджених перещеплювальних культур клітин RD, HEp-2, Vero. Найбільшу чутливість до вірусів ЕСНО проявляла лінія RD. Інфекційна активність штамів, виділених від хворих, виявилася більшою у порівнянні зі штамами виділеними від здорових осіб, на всіх культурах клітин.

Визначено придатність маркеру rct40 для диференціації авірулентних і вірулентних штамів вірусів ЕСНО за умов використання культури клітин НЕр-2. Серед вірусів ЕСНО, виділених від здорових осіб переважають штами з характеристикою rct40- (72,22 %), серед штамів, виділених від хворих- rct40+ (73,68 %).

При секвенуванні нуклеотидної послідовності гені vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу виділених від здорових та хворих осіб виявлено 13 точкових мутацій. Для штамів, виділених від здорових осіб, в позиціях нуклеотидної послідовності №№ 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 характерні нуклеотиди T, C, A, A, C, G, T, G, T, T, C, T, T. Для штамів, виділених від хворих осіб, у вище зазначених позиціях, характерні нуклеотиди C, T, G, G, T, A, С, A, C, A, T, C, A.

Практичне значення одержаних результатів. Створена колекція вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів, що циркулюють на території України. Доведена здатність використання бентонітового маркеру з метою диференціації вірулентності штамів вірусів ЕСНО. На штамах вірусів ЕСНО 6 та 30 типів встановлено придатність використання маркеру rct40 для диференціації цих вірусів за вірулентністю. Встановлені 13 мутацій на рівні нуклеотидів гену vp1 у штамів, ізольованих від здорових та хворих осіб, які можуть бути використані як генотиповий маркер вірулентності для вірусів ЕСНО 6 типу, що може бути використано як молекулярно-епідеміологічний маркер при проведенні моніторингу циркуляції вірусів.

Крім того, результати дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес і науково-дослідну роботу кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету імені О.О.Богомольця, кафедри медичної біології, мікробіології, вірусології та імунології Тернопільського державного медичного університету імені І.Я.Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. У дисертації викладені результати теоретичних та експериментальних досліджень, проведених переважно особисто. Здобувачем самостійно проведено пошук джерел інформації наукової літератури за темою дисертації, їх аналіз, обрано і обґрунтовано методи дослідження, їх виконання та аналіз отриманих результатів.

Дисертантом самостійно проведено ідентифікацію вірусів ЕСНО, визначення сорбційної здатності виділених вірусів до бентоніту та придатність використання маркеру rct40, полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), ампліфікацію геному вірусів ЕСНО та гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, передсіквенсову обробку РНК вірусів ЕСНО, підбір і одержання праймерів для секвенування фрагменту геному, безпосередньо секвенування гену vp1, вирівнювання отриманих хроматограм, а також порівняння результатів секвенування за допомогою програм “Omiga”, “Vector NTI” з прототипними штамами вірусів ЕСНО 6 типу Charles і Lytic та між собою.

Всі положення та висновки дисертаційної роботи належать автору. Всі розділи дисертації написані автором під керівництвом академіка НАН України, професора Широбокова В.П.

Автор безпосередньо приймав участь у написанні та аналізі наукових робіт за темою дисертації.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, що викладені в дисертаційній роботі, були представлені на V Міжнародній науково-практичній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2007 р.), Міжнародній науковій практичній конференції студентів, молодих вчених, лікарів та викладачів ”Актуальні питання експериментальної та клінічної медицини”, присвяченої Дню науки в Україні (Київ, 2007 р.), Міжнародній науково-практичній конференції ”Шпитальні інфекції: сучасний стан проблеми” (Харків, 2008 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих учених ”Медична наука - 2008” (Полтава, 2008 р.), V Міжнародній науково-практичній конференції “Розвиток наукових досліджень 2009”, (Полтава, 2009р.), VII Всеросійській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Молекулярная диагностика - 2010”, (Москва, 2010).

Публікації. Основні наукові положення та висновки, що сформульовані в дисертації викладено в 20 наукових працях, з яких: 9 опубліковані у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК України, 5 у збірках наукових праць, 6 тез конференцій, опубліковано 2 інформаційні листи.

Обсяг та структура дисертації. Роботу викладено на 145 сторінках тексту, яка містить 27 таблиць та 6 рисунків. Дисертація складається зі вступу, 6 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків. Список використаних джерел налічує 255 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. З точки зору молекулярної генетики описана структура вірусів ЕСНО, будова геному та поверхневі білки. Висвітлені сучасні молекулярно-генетичні підходи до класифікації ентеровірусів. Охарактеризовано розповсюдженість епідемічно актуальних типів вірусів ЕСНО, як на території України, так і в усьому світі. Детально проаналізовані типи вірусів ЕСНО, які спричинюють патологічні процеси у людей. Описані властивості бентонітових варіантів (дисоціантів) ентеровірусів. Висвітлено вивчення вірулентності вірусів ЕСНО. Охарактеризована рецепторна специфічність вірусів ЕСНО.

Матеріали і методи досліджень. Віруси: використовували штами вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24 та 30 типів, які були виділені від здорових та хворих осіб на території України за останні роки.

Культури клітин: для накопичення, визначення типу та титру вірусів ЕСНО використовували перещеплювальні культури клітин лінії HEp-2 (які походять із епідермоїдної карциноми людини).

Середовища: перещеплювальні клітини культивували на середовищі ДМЕМ та 199, фірми "Sigma", з додаванням 4% розчину гентаміцину та 8-10% ембріональної телячої сироватки для лінії клітин RD та 5-7% сироватки новонароджених телят для ліній клітин НЕр-2 та Vero.

Пасажи вірусів проводили за загальноприйнятою методикою, інфікуючи моношари клітин. Титр вірусів визначали мікрометодом за ЦПД.

Визначення бентонітового маркеру вірусів ЕСНО проводили згідно методики, яка була розроблена В.П.Широбоковим та рекомендована як бентонітовий маркер вірулентності для вірусів поліомієліту і Коксакі на трьох лініях перещеплювальних культур клітин: HEp-2, RD (походять із рабдоміосаркоми ембріона людини) та Vero ( отримані з нирок африканських зелених мавп).

Визначення ознаки rct40 проводили мікрометодом, шляхом паралельного титрування штамів при 370С та 400С на трьох лініях перещеплювальних культур клітин: RD, НЕр-2 та Vero. Інкубували в термостатах з додаванням 5% СО2.

Першим етапом для генетичних досліджень був вибір гену вірусного геному для секвенування та підбір праймерів для ПЛР, який проводили за допомогою пакету комп'ютерних програм Vector NTI. Олігонуклеотидні праймери були синтезовані на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології НМУ імені О.О.Богомольця на синтезаторі “ASM-800” (“Biosset”, Росія).

Наступним етапом було проведення полімеразної ланцюгової реакції зі зворотною транскрипцією. Цю реакцію проводили з використанням стандартних наборів реагентів ”РибоСорб” та ”Реверта-R-100” (“АмпліСенс”, Росія).

Наявність та якість отриманих ПЛР-продуктів аналізували методом гель-електрофорезу, який проводили у 1,5% агарозному гелі з використанням комерційного маркеру з відомою кількістю пар нуклеотидів (“Fermentas”, Вільнюс).

Для реакції секвенування необхідні високоочищені фрагменти. Тому, після проведення електрофорезу в агарозному гелі, вирізані продукти ПЛР-ампліфікації (кДНК), очищували користуючись набором реагентів для предсіквенсової обробки (“NucleoSpin”, Німеччина).

Матрицею для секвенування були використані одержані фрагменти кДНК з відомою концентрацією. Секвенування проводили з праймерами, які використовувались при ампліфікації дослідного фрагменту. Компонентами реакції служили реагенти з набору “CEQ 2000”(“Backman culture”, США). Підготовлена та очищена матриця підлягала автоматичному скануванню (зчитуванню сигналів специфічної мітки) на секвенаторі “CEQ 2000” (“Backman culture”, США). Вирівнювання одержаних послідовностей проводили за допомогою програми, яка належить до програмного забезпечення секвенатора “CEQ 2000”(“Backman culture”, США). Аналіз нуклеотидних послідовностей та порівняння результатів секвенування здійснювали за допомогою програм “Omiga” i “Vector NTI”.

Всі числові результати підлягали загальноприйнятим методам статистичної обробки варіаційної статистики з використанням значень середньої арифметичної (М) та її похибки (m), достовірності результатів досліджень (t, критерію Ст'юдента), достовірності результатів двох серій досліджень (р) з використанням пакету програм Microsoft XP. Результати вважалися достовірними при значеннях р<0,05.

Розповсюдженість вірусів ЕСНО. Створення колекції актуальних штамів вірусів ЕСНО. Географічне розповсюдження вірусів ЕСНО є глобальним. Спалахи виникають, головним чином, у дитячих дошкільних закладах, лікарнях та школах. В епідеміологічному плані віруси ЕСНО небезпечні своєю непередбачуваністю. Один клінічний синдром може бути викликаний різними серотипами і, навпаки, один серотип вірусу може бути причиною різних патологій. За рахунок нестабільності геному для вірусів ЕСНО притаманний величезний потенціал генетичної мінливості, зокрема велику роль відіграють рекомбінації, які приводять у природніх умовах до утворення нових високопатогенних варіантів.

До недавнього часу на Європейському континенті домінантна роль у більшості спалахів серозних менінгітів належала вірусу ЕСНО-30. Починаючи з 1999 року, цей вірус був причиною спалахів серозного менінгіту на території Німеччини (Oberst M.S., 1999), Франції (Bernit E., 2005), Бельгії (Thoelen I., 2003), Швейцарії (Schumacher J.D., 1999), Туреччини (Uysal G., 1999), Іспанії (Perez C., 2000), Тайвані (Wang J.R.,2001), Норвегії (Christensen A., 2003), Бразилії (Dos Santos, 2006), Чілі (Soza G.C., 2005-2006). Серед спалахів серозного менінгіту, які реєструвалися протягом 2003 року на території США, окрім вірусів ЕСНО 30 типу, який виділявся у 85 %, було виявлено ЕСНО віруси 9 типу (CDC, 2004). В 2006 році в Білорусії причиною спалахів серозного менінгіту були віруси ЕСНО 30 та 9 типів (Амвросьева Т.В.,2006).

Великої актуальності в останні роки набуває вірус ЕСНО-13, який викликає серозні менінгіти у багатьох країнах світу, але до 2000 року у світі його визначали дуже рідко. Так, у США за період 1970-1999 рр. ЕСНО 13 типу виділяли в поодиноких випадках, а в країнах Європи його не виділяли взагалі. Починаючи з 2000 року в літературі з'являються повідомлення про його причетність до спалахів серозних менінгітів на території Франції (Bernit E., 2005), Бельгії (Thoelen I., 2003), Німеччини (Diedrich S., 2001), США (CDC, 2001), Іспанії (Avellon A., 2003), Японії (Kashiyama S., 2003), Ізраїлю (Somekn E., 2003), в той час як на території України він виділявся з водних об'єктів та від здорових дітей. В Іспанії цей вірус вперше став причиною епідемії серозного менінгіту.

Все частіше стають причиною захворювань віруси ЕСНО 6-го типу. В Росії у 2006 році серед 3194 спорадичних випадків ентеровірусного менінгіту, у 80 % хворих ізолювали ЕСНО вірус 6-го типу (Лукашев А.Н., 2008). Типи вірусів, які раніше викликали лише спорадичні захворювання, ЕСНО-33 та 29, стали причиною спалахів серозних менінгітів в Новій Зеландії (Huang Q.M.,2003) та Китаї (Chen L.,2001).

На території України в останні роки розповсюдженими були різні серотипи вірусів ЕСНО. Так, в 1994 році вірусологічні лабораторії СЕС визначали 23 серотипи вірусів ЕСНО (6 з яких були причетні до неврологічної патології), у 2002-2003 рр. актуальними були 7 серотипів, із яких 6 були причетні до захворювань нервової системи (Задорожна В.І., 2004).

В регіонах України захворюваність на вірусні менінгіти поступово збільшується. Прикладом може бути Харківська область, в якій в 2001 р. захворюваність становила 0,8 на 100 тис населення, в 2005р - до 2,1 на 100 тис населення, а в 2006 р. збільшилася в 10 разів в порівнянні з 2001р. і становила 8,3 на 100 тис населення. Крім 22 штамів вірусів Коксакі В 1 та 5, за період 2001-2006 рр. було виділено 65 штамів вірусів ЕСНО (6, 7, 11, 13, 30 типів), з превалюванням ЕСНО 6 типу (29,2%) та ЕСНО 30 типу (19,1%) (Чумаченько Т.А., 2007).

Перші випадки серозного менінгіту, які були викликані вірусом ЕСНО 13-го типу, були зареєстровані у 2001 р. у Харківській області, а у 2002 р. такі захворювання реєстрували вже в 3-х областях України та в м. Києві. За даними річної звітності вірусологічних лабораторій СЕС згідно з додатком № 10 Наказу МОЗ України від 14.07.98 р. № 196 нами була створена колекція епідемічно актуальних штамів вірусів ЕСНО, які були виділені від здорових та хворих осіб на території України. Колекція налічує 37 штамів вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів, виділені від здорових та хворих осіб на території України.

Дисоціація вірусів ЕСНО за бентонітовим маркером. Фенотипові ознаки являються основними маркерами для встановлення вірулентності вірусів в лабораторних умовах. Зважаючи на те, віруси ЕСНО стають все більш актуальними, доцільно адаптувати ці маркери для встановлення вірулентності саме вірусів ЕСНО.

При дослідженні бентонітового тесту у вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24 та 30 типів, ізольованих з різних регіонів України, в різні роки та від різного контингенту встановлено, що серед штамів, виділених від здорових осіб, превалюють штами (66,67 %) з високою сорбційною здатністю до бентоніту (Абент+), 27,77 % штамів належать до варіанту з низькою сорбційною здатністю (Абент- варіант), та лише 5,56 % штамів мають проміжну сорбційну характеристику Абент + (рис.1.) .

Серед штамів, які були виділені від хворих осіб, більший відсоток (63,16%) штамів характеризується низькою здатністю до сорбції на бентоніті, 21,05 % штамів має високу спорідненість до бентоніту та 15,79% штамів належать до проміжного варіанту (рис.1.).

Рис.1. Розподіл за сорбційною здатністю до бентоніту штамів вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24 та 30 типів, виділених від здорових та хворих осіб.

При аналізі результатів бентонітового тесту окремих штамів дослідних вірусів ЕСНО було встановлено, що в цілому характеристика штамів вірусів ЕСНО 6, 30 типів співпадає із загальною характеристикою всіх ЕСНО вірусів: всі штами, які були ізольовані від здорових осіб маркуються як Абент+, серед штамів, ізольованих від хворих осіб, превалює маркер Абент -.

Для штамів 24 типу було виявлено, що всі штами, виділені від здорових осіб, мали високу сорбційну здатністю. Серед штамів, ізольованих від хворих осіб, провідна роль належала штамам з характеристикою Абент-, (66,67%). 33,33 % штамів належали до проміжного варіанту Абент +.

Для ЕСНО вірусів 3, 11, 13 чіткої закономірності не встановлено.

Порівняльна чутливість перещеплювальних клітинних культур до вірусів ЕСНО. Встановлено, що віруси ЕСНО різних типів, ізольованих як від здорових, так і від хворих осіб, найкраще розмножувалися і мали вищі інфекційні титри на культурі клітин RD, відповідно - 3,97+0,18 і 4,25+0,19 (таблиця 1). Для штамів, виділених від здорових осіб, найменші показники титрів були на лінії клітин Vero - 2,08+0,18. Для штамів, ізольованих від хворих осіб, найменші інфекційні титри реєстрували на культурі клітин

НЕр-2 - 3,06+0,18.

Таблиця 1

Середній інфекційний титр штамів вірусів ЕСНО 3,6,11,13,24 та 30 типів в дослідних культурах клітин

Дослідний вірусний матеріал	Кількість штамів	Середні інфекційні титри вірусів в культурах клітин (-lg10)	Р
		НЕр-2	Vero	RD
штами, ізольовані від здорових осіб	18	3,29+0,18	2,08+0,18	3,97+0,18	Р1<0,05 Р2<0,05
штами, ізольовані від хворих осіб	19	3,06+0,18	3,27+0,18	4,25+0,19	Р1>0,05 Р2<0,05
Загалом	37	3,17+0,17	2,98+0,18	4,11+0,19	Р1<0,05 Р2<0,05

Примітка: Р1 - достовірність різниці показників між титрами вірусів ЕСНО на культурах клітин НЕр-2 і Vero;

Р2 - достовірність різниці показників між титрами вірусів ЕСНО на культурах клітин НЕр-2 і RD.

Дослідні лінії клітинних культур виявили неоднакову чутливість до вірусів ЕСНО. Так, порівняльний ряд чутливості клітинних культур до штамів, ізольованих від здорових осіб, є таким - RD>HEp-2>Vero. Для штамів, ізольованих від хворих осіб - RD>Vero>HEp-2 (рис.2.).

а б

Рис.2. Узагальнені дані щодо порівняльної чутливість клітинних культур до штамів вірусів ЕСНО виділених від: а) здорових осіб; б) хворих осіб.

Для всіх дослідних штамів вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів, виділених як від здорових, так і хворих осіб, найбільш чутливою виявилася культура клітин RD. У порівнянні з лінією клітин HEp-2, на культурі клітин RD реєстрували підвищення титру, у 72,22 % штамів виділених від здорових осіб, та у 89,47 % штамів, виділених від хворих осіб. Серед штамів, виділених від здорових осіб, титри залишилися без змін у 16,67 % на культурі клітин RD та у 22,22 % на лінії Vero. Для штамів, ізольованих від хворих осіб, цей показник становив по 10,53% для культур клітин RD та Vero. Найменше підвищення титрів зареєстроване на клітинах лінії Vero серед штамів, ізольованих від здорових осіб (5,56 %). Для штамів, ізольованих від хворих, цей показник становив 47,47 %.

Але, зважаючи на те, що чутливість кожної культури клітин до різних типів та штамів вірусів ЕСНО не однакова, культури клітин бажано використовувати у комплексі.

Диференціація штамів вірусів ЕСНО за ознакою rct40. При визначенні фенотипового маркеру rct40 вірусів ЕСНО було встановлено, що для штамів, ізольованих від здорових осіб, в більшості своїй (72,22 %) притаманна ознака rct40-, (у поліовірусів цю маркуючу ознаку мають атенуйовані штами). 16,67 % штамів мали маркер rct40+ та 11,11 % штамів належали до проміжного варіанту (rct40+). Розподіл штамів, які були виділені від хворих осіб, виявився таким: у 73,68% превалював маркер rct40+, (який і у поліовірусів притаманний вірулентним штамам). 15,79 % штамів характеризувалися як проміжний варіант (rct40+) та 10,53 % штамів мали негативну (rct40-) характеристику даного маркеру (рис.3).

а б

Рис.3. Розподіл серед штамів вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24 та 30 типів за ознакою rct40 ізольованих від: а) здорових осіб; б) хворих осіб.

Диференціація штамів вірусів ЕСНО 6 типу за генетичним аналізом ділянок їх геномів. Фенотипові ознаки вірусів безумовно мають генетичні підстави. Для підтвердження такого ствердження існує декілька методів, серед яких найточнішим є секвенування нуклеїнових кислот.

Важливим етапом для проведення секвенування є вибір певного гена, який кодує відповідні структури вірусу та характеризує деякі з його функцій. Тому, за аналізом робіт, які присвячені генотипуванню вірусів поліомієліту, було встановлено, що саме структурний ген vp1, який кодує основний капсидний білок, є інформативним для такого дослідження. Базуючись на даних з “Genebank”, було підготовлено нуклеотидні фрагменти генів прототипних штамів вірусів ЕСНО 6 типу Сharles та Lytic. До них були підібрані та синтезовані праймери. Для запобігання випадкової інтерпретації результатів та для отримання більш якісних хроматографічних даних секвенування гену vp1 довжиною в 1тис. нуклеотидних пар, крім його повного секвенування в 1 тис. нуклеотидних пар (н.п.), секвенували частинами в 600 н.п.та 400 н.п. тричі з прямими та зворотніми праймерами.

В результаті проведення ПЛР фрагментів гену vp1 (рис.4.) з використанням пари праймерів “long” та “Ins. Long/Ins. Revers” було синтезовано продукт, довжина якого складала приблизно 600 пар нуклеотидів. При ампліфікації фрагменту vp1 з праймерами “Ins. Long/Ins. Revers” та “revers” одержано продукт, довжиною приблизно 400 нуклеотидних пар. Ампліфікація з праймерами long і revers давала вихід продукту завдовжки у 1000 н. п.

Рис.4. Електрофорез фрагментів генів vp 1 вірусів ЕСНО 6 типу.

Ліворуч - маркер молекулярних мас: 1200 н.п., 1000 н.п., 900 н.п., 800 н.п.,700 н.п., 600 н.п., 500 н.п., 400 н.п., 300 н.п., 200 н.п., 100 н.п., 50 н.п.

треки № 1, 4, 7 - фрагменти гену vp1 довжиною 600 н.п.;

треки № 2, 5, 8 - фрагменти гену vp1довжиною 400 н. п.;

треки № 3, 6, 9 - фрагменти гену vp1 довжиною 1000 н.п.

За результатами триразового секвенування фрагментів з прямими та зворотніми праймерами, було виявлено 13 точкових нуклеотидних замін в позиціях гену №№ 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 н.п., між штамами вірусів ЕСНО 6 типу, виділених від здорових та хворих осіб (табл.2.)

Таблиця 2.

Характеристика нуклеотидних замін виявлених у гені vp1 серед штамів вірусів ЕСНО 6 типу, виділених від здорових та хворих осіб

№ з/п	Позиція нуклеотидів в гені vp1 за прототипними штамами вірусів ЕСНО Сharles, Lytic	Нуклеотиди у штамах виділених від здорових осіб	Нуклеотиди у штамах виділених від хворих осіб
1.	2494	T	C
2.	2549	C	T
3.	2574	A	G
4.	2577	A	G
5.	2605	C	T
6.	2621	G	A
7.	2622	T	С
8.	2626	G	A
9.	2638	T	C
10.	2663	T	A
11.	2686	C	T
12.	2787	T	C
13.	2916	T	A

Примітка: А-аденін, G-гуанін, Т-тімін, С-цитозін.

Таким чином, нами встановлена чітка закономірність в 13 нуклеотидних позиціях між штамами вірусів ЕСНО 6 типу, виділених від здорових та хворих осіб, та наявністю генетичних точкових мутацій в регіоні vp1. Зважаючи на кількість повторів проведених секвенувань та якість хроматограм, випадкова помилковість виключається.

Виявлені 13 замін серед штамів, виділених від здорових та хворих осіб, свідчать про встановлення 13 стабільних точкових замін, які диференціюють штами вірусів за вірулентністю.

Встановлені вірусні мутації на нуклеотидному рівні в гені, який кодує поверхневий білок VP1, між штамами, виділеними від здорових та хворих осіб, у визначених 13 позиціях, можуть бути використані як маркер вірулентності при диференціації штамів вірусів ЕСНО 6 типу не лише у науково-дослідних лабораторіях, а також і в практичних вірусологічних лабораторіях регіональних та міських СЕС та при наданні молекулярно-генетичної характеристики штамам вірусів ЕСНО.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі розв'язано актуальне наукове завдання - диференціація вірусів ЕСНО за вірулентністю з використанням генотипових та фенотипових маркерів вірулентності. Вперше встановлено епідеміологічно актуальні типи вірусів ЕСНО, які циркулюють на території України. Доведено, що вірусам ЕСНО притаманна дисоціація за бентонітовим генетичним маркером після їх репродукції в культурі клітин з утворенням двох популяцій, одна з яких сорбується на бентоніті (Абент+), інша - не сорбується (Абент-). Встановлено, що серед досліджених перещеплювальних культур клітин RD, HEp-2, Vero найбільшу чутливість до вірусів ЕСНО проявляла лінія RD. Визначено придатність використання маркеру rct40 для диференціації авірулентних і вірулентних штамів вірусів ЕСНО при культивуванні їх на лінії НЕр-2. При досліджені нуклеотидних послідовностей гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, встановлено 13 точкових мутаційних замін у штамів, виділених від здорових осіб, у порівнянні зі штамами, виділеними від хворих осіб. Визначення даних мутацій запропоновано використовувати як молекулярний маркер для генотипової диференціації вірусів.

Створена колекція вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів, що циркулюють на території України. Паралельно охарактеризовані фенотипові і генотипові характеристики 18 штамів, виділених від здорових осіб та 19 штамів - від хворих осіб. На основі одержаних результатів розроблені критерії диференціації авірулентних і вірулентних штамів.

Доведено, що вірусам ЕСНО після репродукції вірусів в культурах клітин притаманна дисоціація на дві популяціі після сорбції на бентоніті. Штами вірусів, виділені від хворих осіб з асептичним менінгітом, переважно мають маркер Абент- (63,16 % штамів), штами, виділені від здорових осіб - маркер Абент+ (66,67 % штамів). Особливо чітко ця ознака виявляється для вірусів ЕСНО 6 і 30 типів, які є найбільш актуальними в епідемічному відношенні.

Серед досліджених перещеплювальних культур клітин (HEp-2, RD, Vero) найбільшу чутливість до вірусів ЕСНО проявляла лінія RD. Інфекційна активність штамів, виділених від хворих, виявилася більшою у порівнянні зі штамами виділеними від здорових осіб.

Визначено придатність маркеру rct40 для диференціації вірулентних і авірулентних штамів вірусів ЕСНО за умов використання культури клітин НЕр-2. Показано, що серед вірусів ЕСНО, виділених від здорових осіб переважають штами з характеристикою rct40- (72,22 %), серед штамів, виділених від хворих- rct40+ (73,68 %). Найбільш придатним цей маркер виявився для диференціації вірулентності вірусів ЕСНО 6 та 30 типів.

При порівняльному вивченні шляхом секвенування нуклеотидної послідовності гену vp1 штамів вірусів ЕСНО 6 типу, виділених від здорових та хворих осіб, виявлено 13 точкових мутацій. Для штамів, виділених від здорових осіб, в позиціях нуклеотидної послідовності №№ 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 характерні нуклеотиди T, C, A, A, C, G, T, G, T, T, C, T, T. Для штамів, виділених від хворих осіб, у вище зазначених позиціях, характерні нуклеотиди C, T, G, G, T, A, С, A, C, A, T, C, A.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Гриценко Л.М. Порівняльна чутливість перещеплювальних клітинних культур до вірусів ЕСНО / Л.М.Гриценко // Сучасні аспекти військової медицини. - 2010. - вип.16. - С. 73 - 76.

Гриценко Л.М. Генетичний аналіз вірусів ЕСНО 6 типу, ізольованих на території України / Л.М.Гриценко, В.П.Широбоков // Військова медицина. - 2009. - т.9, № 1. - С. 54 - 56. (* - проведення секвенування вірусів ЕСНО 6 типу для вивчення генетичних ознак вірулентності, підготовка статті до публікації).

Гриценко Л.М. Фенотипові та генетичні ознаки вірулентності вірусів ЕСНО, ізольованих на території України / Л.М.Гриценко, В.П.Широбоков // Клінічна фармація. - 2008. - т. 12. - № 4. - С. 40 - 42. (* - проведення лабораторних досліджень по вивченню генетичних та фенотипових ознак вірулентності вірусів ЕСНО, підготовка статті до публікації).

Гриценко Л.М. ЕСНО-вірусні внутрішньотипові маркери вірулентності / Л.М.Гриценко // Актуальні проблеми сучасної медицини - 2008. - т. 8, вип. № 4/ 24.- С. 159-160.

Гриценко Л.М. Вірусологічні та епідеміологічні аспекти ЕСНО-вірусної інфекції / Л.М. Гриценко // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2007. - т. 35. - № 2. - С. 127 - 133.

Доан С.І. Серопейзаж циркулюючих ентеровірусів в Україні / С.І. Доан, Л.М. Гриценко, В.І.Задорожна, В.П.Широбоков // Актуальные проблемы медицины и биологии. - 2005. - т. 33. - № 1. - С. 97 - 122. (* - лабораторні дослідження з встановлення маркерів вірулентності вірусів ЕСНО, підготовка статті до друку).

Бондаренко В.І. Гострі в'ялі паралічі в Україні у 1999 році / В.І.Бондаренко, В.І.Задорожна, Е.А.Лауген, Н.Л.Зубкова, С.І.Доан, Л.М.Гриценко, Т.О.Бура, І.Л.Маричев // Дитячі інфекції. Українська міжвідомча збірка. - Київ, 2001.- Вип. 28. - С.100 - 104. (* - проаналізовані результати даних ролі неполіомієлітних ЕВ у виникненні гострих в'ялих паралічів у 1999 р., статистична обробка результатів, підготовка до друку).

Задорожна В.І. Серозні менінгіти ентеровірусної етіології / В.І.Задорожна, В.Ю.Мартинюк, Л.М.Мухарська, Л.М.Гриценко, І.Л.Маричев, В.В.Торбенко, Н.Л.Зубкова, С.І.Доан, Т.О.Бура, Л.І.Єктова, В.В.Куцева // Український медичний альманах. - 2000. - т.3, № 2. - С.56 - 60. (* - проаналізовано та статистично оброблені дані спалахів серозних менінгітів на Україні, оформлення статті до друку).

Задорожна В.І. Захворюваність на ентеровірусні інфекції населення різних вікових груп / В.І.Задорожна, В.І.Бондаренко, К.І.Ліпатнікова, Т.О.Бура, С.І.Доан, Н.Л.Зубкова, Л.М.Гриценко // Дитячі інфекції. Українська міжвідомча збірка - 1999. - Вип. 26. - С.140-145 (* - узагальнено дані щодо розповсюдженості ЕВ інфекції населення, статистична обробка результатів, оформлення статті до друку).

АНОТАЦІЯ

Гриценко Л.М. Генотипові та фенотипові ознаки вірулентності вірусів ЕСНО. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія - Національний медичний університет імені О.О.Богомольця МОЗ України, Київ, 2011.

Дисертація присвячена дослідженню доцільності використання маркерів вірулентності для вірусів ЕСНО на підставі вивчення їх фенотипових і генотипових властивостей.

Досліджені маркери вірулентності (Абент і rct40) для штамів вірусів ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типів, ізольованих на території України показали, що штамам які були ізольовані від здорових осіб в більшості були властиві маркери Абент+ і rct40- , для штамів, ізольованих від хворих осіб - Абент- і rct40+ . Також доведено, що віруси ЕСНО різних типів, ізольованих як від здорових, так і від хворих осіб, найкраще розмножувалися і мали найбільші титри на культурі клітин RD відповідно. Для штамів, ізольованих від здорових осіб, найменші показники титрів були на лінії Vero. В той же час для штамів, ізольованих від хворих осіб найменші титри реєстрували на культурі клітин НЕр-2 - 3,06+0,18. Отже, для штамів, ізольованих від здорових осіб ряд чутливості дослідних клітинних ліній має такий вигляд - RD>НЕр-2>Vero. Для штамів ізольованих від хворих осіб - RD>Vero>НЕр-2.

Безумовно, фенотипові ознаки вірулентності мають генетичне підгрунття. Секвенування гену поверхневого капсидного білка VP1, виявило 13 точкових нуклеотидних замін між штамами, ізольованими від здорових та хворих осіб. Для штамів, ізольованих від здорових осіб, в позиціях гену нуклеотидів 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 характерні нуклеотиди T, C, A, A, C, G, T, G, T, T, C, T, T. Для штамів, ізольованих від хворих осіб, в цих же самих позиціях характерні нуклеотиди C, T, G, G, T, A, С, A, C, A, T, C, A. Встановлені нуклеотидні заміни можуть стати основою для внутрішньотипової диференціації авірулентних та вірулентних штамів вірусів ЕСНО.

Ключові слова: віруси ЕСНО, бентонітовий тест, маркер rct40, лінії клітинних культур RD, НЕр-2, Vero, ген vp1, секвенування.

АННОТАЦИЯ

Гриценко Л.Н. Генотипические и фенотипические признаки вирулентности вирусов ЕСНО. - Рукопись.

Диссертация на получение научной степени кандидата медицинских наук за специальностью 03.00.06 - вирусология - Национальный медицинский университет имени А.А.Богомольца МОЗ Украины, Киев, 2011.

Диссертация посвящена исследованию целесообразности использования маркеров вирулентности для вирусов ЕСНО на основании изучения их фенотипических и генотипических свойств.

Исследованы маркеры вирулентности (Абет и rct40) для штаммов вирусов ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 типов, изолированных на территории Украины, показали, что штаммам которые были изолированы от здоровых лиц в большинстве своем была свойственна высокая сорбционная активность к бентониту (Абент+), что составило 66,67%. Для этих же штаммов была установлена низкая репродуктивная способность при повышенном температурном режиме - 72,22% маркировались как rct40-. Для штаммов, изолированных от больных лиц характеристика штаммов была такова: больший процент штаммов (63,16) показали низкую сорбционную активность на бентоните (маркировались как Абент- ), в то же время достаточно высокий процент штаммов (73,68) имел высокую инфекционную активность при повышенной температуре, т.о. они маркировались как rct40+ . К промежуточному варианту по бентонитовому тесту отнесено 5,56% штаммов, выделенных от здоровых людей и 15,79% штаммов, выделенных от больных. 11,11% штаммов, выделенных от здоровых людей, характеризовались промежуточным вариантом при определении маркера rct40. Этим же вариантом маркера обладали 15,79% штаммов, выделенных от больных людей.

Также доказано, что вирусы ЕСНО разных типов, выделенных как от здоровых, так и от больных лиц, имели большую репродуктивную способность и имели высокие инфекционные титры на культуре клеток RD соответственно - 3,97+0,18 и 4,25+0,19. Для штаммов, изолированных от здоровых лиц, наименьшие показатели титров были на линии Vero - 2,08+0,18. В то же время, для штаммов изолированных от больных лиц, наименьшие титры регистрировали на культуре клеток НЕр-2 - 3,06+0,18. Следовательно, для штаммов, изолированных от здоровых лиц ряд чувствительности опытных клеточных линий имел такой вид - RD>НЕр-2>Vero. Для штаммов изолированных от больных лиц - RD>Vero>НЕр-2.

Безусловно, фенотипические признаки вирулентности имеют генетическую основу. Нами это было подтверждено на примере штаммов вирусов ЕСНО 6 типа. При современном молекулярно-генетическом исследовании секвенировании гена поверхностного капсидного белка VP1, было установлено 13 точечных нуклеотидных мутаций между штаммами изолированными от здоровых лиц и от больных. Для первых в позициях нуклеотидов гена vp1 №№ 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 были характерны нуклеотиды T, C, A, A, C, G, T, G, T, T, C, T, T. Для штаммов, изолированных от больных лиц, в этих же нуклеотидных позициях регистрировались нуклеотиды C, T, G, G, T, A, С, A, C, A, T, C, A. Выявление 13 точечных нуклеотидных мутаций могут стать основой для внутритиповой дифференциации авирулентных и вирулентных штаммов вирусов ЕСНО.

Ключевые слова: вирусы ЕСНО, бентонитовый тест, маркер rct40, линии клеточных культур RD, НЕр-2, Vero, ген vp1, секвенирование.

АNOTATION

Grytsenko L.M. to Genotype and phenotyping і signs of virulence of viruses of ECH it is Manuscript.

Dissertation for the candidate of medical scientific degree in speciality 03.00.06 - virology - O.O.Bogomolets National medical university of Ministry Public Heaith of Ukraine, Kyiv, 2011.

Dissertation is devoted to research of expedience of the use of markers of virulence for the viruses of ЕСНО on the basis of study them phenotyping and genotyping properties.

The markers of virulence (Аbent and rct40) are investigational for the cultures of viruses of ЕСНО 3, 6, 11, 13, 24, 30 types, isolated on territory of Ukraine rotined that to the cultures which were isolated from healthy persons in majority there were the peculiar markers of Аbent+ and rct40-, for the cultures isolated from the sick persons of Аbent- and rct40+. It is also well-proven that viruses of ЕСНО of the different types isolated both from healthy and from sick persons, the best propagated oneself and had most titles on the culture of mews of RD accordingly - 3,97+0,18 and 4,25+0,19. For the cultures isolated from healthy persons, the least indexes of titles were on the line of Vero - 2,08+0,18. At the same time for cultures isolated from sick persons the least titles registered on the culture of mews of НЕр-2 - 3,06+0,18. Consequently, for cultures. isolated from healthy persons the row of sensitiveness of experimental cellular lines had such kind - RD>НЕр-2>Vero. For cultures isolated from sick persons - RD>Vero>НЕр-2.

Sure, the phenotyp signs of virulence have genetic asis. That is why sequenation to the gene of superficial albumen of VP1, found out 13 points nucleotid replacements between cultures isolated from healthy and sick persons. For the first in positions the gene of nucleotid is 2494, 2549, 2574, 2577, 2605, 2621, 2622, 2626, 2638, 2663, 2686, 2787, 2916 nucleotidis of T answers, C, A, A, C, G, T, G, T, T, C, T, T. For other (cultures isolated from sick persons) in the same positions characteristic nucleotids of C, T, G, G, T, A, С, A, C, A, T, C, A. Nucleotides of replacement is set can become basis for nternal differentiation of avirulent and virulent cultures of viruses of ЕСНО.

Размещено на Allbest.ru

...