Вплив вітамінів С та Е на активність NO-синтазної системи та процеси ліпопероксидації при експериментальній виразці шлунка

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Державний заклад "Луганський державний медичний університет"

УДК: 612.015.6:(612.015.33+612.015.11):616.33-002.44]-8

14.01.32 - медична біохімія

Вплив вітамінів С та Е на активність NO-синтазної системи та процеси ліпопероксидації при експериментальній виразці шлунка

Журомський Вячеслав Сергійович

Луганськ - 2011

Дисертацією є рукопис.

- доктор біологічних наук, професор Борзенко Берта Георгієвна, Донецький національний медичний університет ім. Максима Горького, завідуюча кафедри біологічної хімії (м. Донецьк).

Захист відбудеться " 16 " червня 2011 року о 12⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 29.600.03 Державного закладу "Луганський державний медичний університет" (91045, м. Луганськ, кв. 50 - річчя Оборони Луганська, 1г).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державного закладу "Луганський державний медичний університет" (91045, м. Луганськ, кВ. 50 - річчя Оборони Луганська, 1г).

Автореферат розісланий " 12 " травня 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Вишницька І.А.

Анотації

Журомський В.С. Вплив вітамінів С та Е на активність NO-синтазної системи та процеси ліпопероксидації при експериментальній виразці шлунка. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.32 - медична біохімія. - Державний заклад "Луганський державний медичний університет", Луганськ, 2011.

Дисертація присвячена вивченню впливу вітамінів С та Е на регуляцію активності NO-синтаз, процесів ліпопероксидації у СОШ, вмісту L-аргініну та їх змін у плазмі крові за умов інгібування активності іNOS та ЦОГ-2 при експериментальній виразці шлунка у щурів. Доведено, що самостійна дія вітамінів С та Е на тлі експериментальної виразки шлунка підвищувала цитопротекцію, зменшувала активність загальної NOS, активність іNOS; вміст нітрит-аніону, ТБК-активних продуктів, рівень активності СОД, тоді як концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала.

Відзначено, що поєднана дія вітамінів С та Е на тлі експериментальної виразки шлунка у порівнянні з їх самостійною дією не призводила до виражених змін активності NO-синтаз, вмісту ТБК-активних продуктів та активності СОД і каталази. Визначені особливості дії вітамінів С та Е на тлі інгібування активності іNOS, ЦОГ-2 та введення L-аргініну за умов експериментальної виразки шлунка

Показані зміни вмісту вітамінів С та Е у плазмі крові за умов їх самостійної та поєднаної дії, а також інгібування активності іNOS та ЦОГ-2.

Ключові слова: вітаміни С та Е, NO-синтази, циклооксигеназа-2, процеси ліпопероксидації, ензими антиоксидантного захисту, виразка шлунка.

Журомский В.С. Влияние витаминов С и Е на активность NO-синтазной системы и процессы липопероксидации при экспериментальной язве желудка. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.32 - медицинская биохимия. - Государственное заведение "Луганский государственный медицинский университет", Луганск, 2011.

Диссертация посвящена изучению влияния витаминов С (в дозе 200 мг/кг, внутрибрюшинно) и Е (в дозе 150 мг/кг, внутримышечно) на регуляцию активности NO-синтаз, процессов липопероксидации в слизистой оболочке желудка (СОЖ), содержание L-аргинина и витаминов С и Е в плазме крови при ингибировании активности іNOS и ЦОГ-2 при экспериментальной язве желудка у крыс. Деструктивные процессы в СОЖ моделировались путем введения адреналина внутрибрюшинно в дозе 2 мг/кг. Показано, что самостоятельное действие витаминов С и Е на фоне экспериментальной язвы желудка повышало цитопротекцию, снижало активность общей NOS, активность іNOS, содержание нитрит-аниона, ТБК-активных продуктов, активность СОД, тогда как концентрация L-аргинина в плазме крови возрастала.

Совместное действие витаминов С и Е на фоне экспериментальной язвы желудка, по сравнению с их самостоятельным действием, не вызывало выраженных изменений активности NO-синтаз, содержания ТБК-активных продуктов и активности СОД и каталазы.

В результате проведенных комплексных исследований получены новые данные относительно действия витамина С на фоне ингибирования активности іNOS и ЦОГ-2 при экспериментальной язве желудка. При этом показано выраженное снижение активности сNOS, тогда как изменения активности іNOS были недостоверными. Содержание нитрит-аниона в СОЖ снижалось по сравнению с самостоятельным влиянием витамина С на фоне действия адреналина.

Показано, что выраженных изменений активности іNOS, процессов липопероксидации, активности СОД и каталазы на фоне ингибирования активности іNOS, ЦОГ-2 и экзогенного введения L-аргинина при самостоятельном введении витамина С на фоне экспериментальной язвы желудка не происходило, что свидетельствует о его ингибирующем влиянии на активность іNOS и доминирующей роли при оксидативном стрессе.

Отмечено, что при совместном введении витамина Е и L-аргинина, в отличии от самостоятельного действия витамина Е, наблюдалось повышение активности сNOS, возрастание содержания нитрит-аниона; процессы липопероксидации и активность энзимов антиоксидантной защиты изменялись недостоверно. Действие витамина Е на фоне ингибирования активности iNOS и ЦОГ-2 при экспериментальной язве желудка приводило к снижению активности iNOS, содержания ТБК-активных продуктов и нитрит-аниона.

Ключевые слова: витамины С и Е, NO-синтазы, циклооксигеназа-2, процессы липопероксидации, энзимы антиоксидантной защиты, язва желудка.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. У функціонуванні антиоксидантної системи СОШ суттєве значення відіграють вітаміни С та Е. Антиоксидантна роль аскорбінової кислоти пов'язана з декількома механізмами, які включають як зв'язування активних форм кисню (супероксидний радикал, синглентний кисень), пероксиду водню (Н₂О₂), гідроксильного радикалу (ОН^-), гіпохлоридної кислоти (HOCl), так і відновлення глутатіону або б - токофероксил-радикалу [Kamiya Y. et al., 2005; Lee W.-J., 2009; Harrison F.E., May J. M., 2009].

Особливістю антиоксидантної дії вітаміну С у шлунку є те, що його вміст у слизовій оболонці та шлунковому вмісті є значно вищим, ніж у плазмі крові.

Вітамін Е приймає участь у регуляції процесів: проліферації, апоптозу, впливає на продукцію активних форм кисню, реакціях агрегації та адгезії, стабілізації мембран клітин організму [Капралов О.О. та ін., 2002]. Антиоксидантна дія б-токоферолу пов'язана із зв'язуванням ліпідних радикалів, які утворюються під час ланцюгових реакцій, що лежать в основі процесів перекисного окисненя ліпідів [Wang X., Quinn P.J., 2000; Sen C.K. et al., 2006; Engin K.N., 2009].

На сьогоднішній день показано, що спектр дії вітамінів С та Е у клітині є значно ширшим і включає не тільки їх антиоксидантний вплив, а також дію на інші процеси [Wang X., Quinn P.J., 2000; Hensley К. et al., 2004; Traber M.G., Atkinson J., 2007; Kaya F. et al., 2008].

У розвитку виразки шлунка значне місце займають системи L-аргінін/NO-синтази/нітрогену оксид та циклооксигеназа-2/ПГЕ ₂. За умов виразкоутворення шлунка різко зростає експресія індуцибельної NO-синтази (iNOS) та циклоксигенази-2 (ЦОГ-2), внаслідок чого підвищується утворення пероксинітриту та ПГЕ ₂, які спільно приймають участь у розвитку деструктивних ушкоджень слизової оболонки шлунка (СОШ) [Wallace J., 2001; Alderton W.K., Cooper C.E., 2001; Beharka A.A. et al., 2002; Lanas A., 2008].

Не дивлячись на те, що введення вітаміну С при виразці шлунка знижувало деструктивні ушкодження, збільшувало вміст непротеїнових SH-груп, зменшувало процеси ліпопероксидації, концентрацію нітрогену оксиду, активність мієлопероксидази, концентрацію цитокінів, попереджало адгезію та інфільтрацію нейтрофілами СОШ [Ohta Y. et al., 2005; Kamiya Y. et al., 2005], його вплив на активність NO-синтаз вивчено недостатньо.

Цитопротективна дія вітаміну Е викликає зниження вмісту продуктів тіобарбітурової кислоти, підвищення активності СОД, зниження утворення цитокінів [Sun Y.Q. et al., 2005; Golestani A. et al., 2006; Ohta Y. et al., 2010].

Натомість, невизначений характер самостійного та поєднаного впливу вітамінів С та Е на стан системи L-аргінін/NO-синтази/нітрогену оксид за умов інгібування активності iNOS та ЦОГ-2. Потребує поглибленого аналізу і поєднаний вплив вітамінів С та Е на процеси ліпопероксидації та активність ензимів антиоксидантного захисту при виразці шлунка.

Тому, важливим є з'ясування самостійного та поєднаного впливу вітамінів С та Е, їх дію на тлі блокування активності іNOS, ЦОГ-2 та введення L-аргініну на стан системи L-аргінін/NO-синтази/нітрогену оксид та процеси ліпопероксидації при експериментальній виразці шлунка.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є фрагментом комплексної теми кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького "Клініко-експериментальні обґрунтування моніторингу діагностики та лікування захворювань травної системи та гепатопатій", № державної реєстрації 0100U002267.

Мета та завдання дослідження. Мета роботи - з'ясувати вплив вітамінів С та Е на активність NO-синтаз, процеси ліпопероксидації, вміст L-аргініну та вітамінів С та Е у плазмі крові за умов інгібування активності індуцибельної NO-синтази та циклооксигенази-2 при експериментальній виразці шлунка у щурів.

Для досягнення мети нами були поставлені наступні завдання:

1.Дослідити зміни рівня активності NO-синтаз, вмісту нітрит-аніону, процесів ліпопероксидації та активності ензимів антиоксидантного захисту (СОД та каталази) у СОШ та концентрації L-аргініну, вітамінів С та Е у плазмі крові за умов самостійної та поєднаної дії вітамінів С та Е.

2. З'ясувати вплив самостійної та поєднаної дії вітамінів С та Е на активність ензимів NO-синтазної системи, процеси ліпопероксидації, активність ензимів антиоксидантного захисту та вміст нітрит-аніону у СОШ за умов введення L-аргініну.

3. Встановити вплив самостійної та поєднаної дії вітамінів С та Е на активність ензимів NO-синтазної системи, процеси ліпопероксидації, активність ензимів антиоксидантного захисту та вміст нітрит-аніону у СОШ за умов інгібування активності іNOS та ЦОГ-2.

4. Визначити вміст вітамінів С та Е у плазмі крові за умов самостійної, поєднаної їх дії та при інгібуванні активності iNOS, ЦОГ-2 та введенні L-аргініну.

Об'єкт досліджень - механізми впливу вітамінів С та Е на регуляцію активності прозапальних ензимів, оксидативні та цитопротективні механізми за умов експериментальної виразки шлунка.

Предмет досліджень - вплив вітамінів С та Е на регуляцію активності NO-синтаз, процеси ліпопероксидації, активність ензимів антиоксидантного захисту, вміст нітрит-аніону у СОШ та концентрацію L-аргініну, вітамінів С та Е у плазмі крові при експериментальній виразці шлунка.

Методи досліджень - оцінку показників активності NO-синтаз, оксидативного стресу, вмісту вітамінів С та Е, L-аргініну у плазмі крові проводили із застосуванням методів колориметрії, спектрофотометрії, статистичних методів аналізу. Морфологічну оцінку змін СОШ проводили на основі методу планіметрії та за шкалою макроскопічного індексу уражень.

Наукова новизна одержаних результатів. Виконаними дослідженнями виявлено зміни активності ензимів NO-синтазної системи за умов поєднаної дії вітамінів С та Е, їх впливу на тлі інгібування активності іnos, ЦОГ-2 та введення L-аргініну при експериментальній виразці шлунка. Доведено, що самостійна дія вітамінів С та Е на тлі експериментальної виразки шлунка зменшувала активність загальної NO-синтази, активність іNOS, вміст нітрит-аніону, ТБК-активних продуктів, активність СОД у СОШ, тоді як концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала.

Відзначено, що поєднана дія вітамінів С та Е на тлі експериментальної виразки шлунка, у порівнянні з їх самостійною дією, не призводила до підсумування їх ефектів по відношенню до активності NO-синтаз, вмісту ТБК-активних продуктів та активності СОД і каталази.

Вперше показано, що дія вітаміну С на тлі інгібування активності іNOS аміногуанідином за умов експериментальної виразки шлунка не призводила до значних змін активності NO-синтаз. При дії віт С на тлі інгібування активності ЦОГ-2 при експериментальній виразці шлунка виражено зменшувалась активність сNOS, тоді як зміни активності іNOS були недостовірними.

Вперше з'ясовано, що поєднана дія вітаміну С та L-аргініну викликала виражений гастропротективний ефект, при цьому знижувалась активність сNOS, вміст нітрит аніону, активність СОД.

Вперше показано, що за умов самостійного введення вітаміну С виражених змін процесів ліпопероксидації, активності СОД та каталази на тлі інгібування активності іNOS, ЦОГ-2 та введення L-аргініну при експериментальній виразці шлунка не відбувалось.

Відзначені особливості впливу вітаміну Е на стан системи L-аргінін/NO-синтази/нітрогену оксид та показники окиснювального стресу за умов інгібування активності іNOS та ЦОГ-2.

З'ясовано, що концентрація вітаміну С у плазмі крові при екзогенному його введенні дещо зростала і суттєво не змінювалась за умов введення вітаміну С на тлі інгібування активності іNOS та ЦОГ-2 та введення L-аргініну. Інгібування активності іNOS та ЦОГ-2 та введення L-аргініну викликало зниження концентрації віт С у плазмі крові.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати поглиблюють знання про роль вітамінів С та Е у процесах гастропротекції та регуляції активності NO-синтаз та ЦОГ-2, що може бути використано як у навчальному процесі для студентів медичних ВУЗів і біологічних факультетів

університетів, так і у практичній гастроентерології. Результати дисертаційної роботи впроваджені у навчальний процес кафедр біохімії та нормальної фізіології Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (додаток А, Б); кафедри фізіології людини та тварин Київського національного університету імені Тараса Шевченка (додаток В), кафедри біохімії Національного фармацевтичного університету (додаток Г). За результатами досліджень отриманий деклараційний патент № 55486 на корисну модель "Спосіб підвищення цитопротекції слизової оболонки шлунка в експериментальних тварин шляхом застосування поєднаної дії вітаміну С та L-аргініну" (UA, G09B 23/00, A61P 1/00, A61P 29/00, реєстраційний номер заявки u 2010 08540).

Поєднана дія вітаміну С та L-аргініну призводила до вираженого гастропротективного ефекту, що може бути рекомендовано для впровадження у практичну гастроентерологію з метою профілактики та лікування виразкової хвороби шлунка та дванадцятипалої кишки. Зростання процесів цитопротекції з одночасним зниженням оксидативного стресу при дії вітаміну Е на тлі інгібування індуцибельної NO-синтази дає підґрунтя для розробки нових підходів у лікуванні виразкової хвороби.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто виконано весь обсяг експериментальних досліджень на базі кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького, проведено статистичне опрацювання одержаних результатів, самостійно підібрана та проаналізована наукова література за темою дисертації, підготовлені наукові праці до друку, оформлено дисертаційну роботу. Планування напрямків досліджень, обговорення їх результатів, формулювання висновків здійснено за участі наукового керівника.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на наступних конференціях: Міжнародній науковій конференції "Механізми функціонування фізіологічних систем" (Львів, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції "Біологічне окиснення в нормі та патології" (Тернопіль, 2006); ІІІ-ій міжнародній конференції "Нейро-гуморальні та клітинні механізми регуляції процесів травлення" (Львів, 2007); V Львівсько-Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2008); 5-му міжнародному симпозиумі "Клітинне-тканинне ушкодження та цитопротекція - органопротекція" (Ялта, 2008); Всеукраїнській науково-практичній конференції "Досягнення і перспективи експериментальної і клінічної біохімії" (Тернопіль, 2009); науково-практичній конференції "Біологічно активні речовини: фундаментальні та прикладні питання отримання та застосування" (Крим, Новий Світ, 2009); науковій конференції фармацевтичного факультету ЛДМУ ім. Данила Галицького (2010) та на засіданнях кафедри біохімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького (2007-2010).

Публікації. За матеріалами роботи опубліковано 12 друкованих праць, з них 7 статей (5 - у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України, 1 - у закордонному виданні, 1 - у фаховому науковому виданні), 4 тези - у збірниках матеріалів вітчизняних і міжнародних наукових конференцій, 1 патент.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, чотирьох розділів з викладом отриманих власних результатів, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел, що містить 244 найменування (з них 49 - вітчизняних та країн СНД), 4 додатків. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 112 сторінках машинописного тексту, ілюстровані 4 таблицями, 28 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. Дослідження були проведені на 218 білих нелінійних щурах-самцях масою 180-250 г згідно нормативам Конвенції з біоетики Ради Європи (1997), Хельсинської декларації Всесвітньої Медичної Асоціації (1996), загальним етичним принципам експериментів на тваринах, ухвалених Першим національним конгресом України з біоетики (2001) згідно етичних норм роботи з лабораторними тваринами.

Вивчення активності NO-синтаз, вмісту нітрит-аніону, процесів ліпопероксидації та активності ензимів антиоксидантного захисту у СОШ та концентрації L-аргініну, вітамінів С та Е у плазмі крові були проведені у 9 серіях досліджень.

Експериментальне моделювання ульцерогенних ушкоджень СОШ проводили, застосовуючи адреналін в дозі 2 мг/кг маси тіла [Белостоцкий, 1988]. Вітамін С (ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров'я", м. Харків, Україна) вводили вутрішньоочеревинно у дозі 200 мг/кг [Altuntas L., 2002; Gultekin F., 2001], вітаміну Е (б-токоферол, C₂₉H₅₀O₂, "Sigma", USA) - внутрішньом'язево у дозі 150 мг/кг [Ohta Y., 2006], інгібування активності iNOS проводили введенням внутрішньоочеревинно селективного блокатора аміногуанідину ("Sigma", USA) у дозі 20 мг/кг [Aoi Y., 2008; Harisa G., 2010], інгібування активності ЦОГ-2 здійснювали селективним блокатором целекоксибом ("Артеріум", Україна), що вводили перорально у дозі 10 мг/кг [Shafiq N., 2005]; L-аргінін (Curtis healthcare, Poland) - прекурсор NO-синтаз, вводили вутрішньоочеревинно у дозі 300 мг/кг [Mane J., 2001]. Всі речовини вводились за 30 хв до дії адреналіну.

Визначення активності NO-синтаз проводили за методом Сумбаєва В.В., Ясинської І.М. [2000 з використанням NADPH+H⁺; активність супероксиддисмутази (СОД) визначали за допомогою реакції відновлення нітротетразолію синього до нітроформазану [Чеварі С., 1991]; активність каталази - з використанням реакції Н ₂О ₂ з молібдатом амонію [Королюк, 1991], вміст нітрит-аніону - за допомогою реактиву Гріса [Green L.C., David A.W., 1982]; активність процесів ліпопероксидації оцінювали за вмістом продуктів ТБК [Тимирбулатов, 1981]. Концентрацію L-аргініну в плазмі крові визначали за методом Алейникової Т.Л., Рубцової Г.В. [1988], вітамін С - за методом Шпакова А.Е. [1967], вітамін Е - за методом Кондрахіна І.П. [1985].

Визначення характеру та ступеня ушкодження СОШ проводили шляхом оцінки площі структурних ушкоджень та їх характеру - наявності масивних крововиливів, гіперемії з крапковими геморагіями, ерозій і виразок при макроскопічному візуальному дослідженні. Диференційно оцінювали у балах макроскопічний індекс уражень (МІУ) СОШ : 1) слизова без видимих змін (норма) - 0 балів; 2) майже нормальний стан СОШ - присутні наліт, гіперемія - 2 бали; 3) наліт та дрібні крапкові крововиливи - червоні плями діаметром менше 1 мм - 4 бали; 4) наявність масивних крововиливів - бурого або чорного кольору плями овальної форми діаметром 2-3 мм і більші, як правило, з ерозійною поверхнею - 6 балів; 5) масивні ерозії - у вигляді тріщин слизової, або декілька ерозій - 8 балів; 6) виразки - у вигляді глибоких округлих уражень слизової оболонки з фіброзним нальотом на дні та запальним валиком навколо них - 10 балів; 7) одночасна присутність кількох ступенів ушкодження СОШ - виразки, ерозії, крововиливи - 22 бали.

Результати досліджень оброблені статистично. Вірогідність отриманих результатів визначали, використовуючи t-критерій вірогідності Стьюдента. Зміни вважали вірогідними при р?0,05. Статистичні розрахунки та побудову діаграм проводили за допомогою комп'ютера типу IBM PC Pentium з використанням Microsoft Excel Windows XP.

Результати досліджень та їх обговорення

Зміна активності NO-синтаз, ензимів антиоксидантного захисту, вмісту нітрит-аніону та процесів ліпопероксидації у СОШ та концентрації L-аргініну у плазмі крові при експериментальній виразці шлунка.

Введення адреналіну викликало розвиток деструктивних ушкоджень шлунка у вигляді масивних та крапкових крововиливів, ерозій та виразок. При цьому площа деструктивних уражень СОШ складала - 46,4±5,45 мм ², МІУ - 22 бали. За умов експериментальної виразки відзначалось зростання активності загальної NO-синтази з 0,545±0,206 до 2,193±0,261 нмоль НАДФ/хв*мг (в 4 рази, р<0,01). При цьому відзначено різке підвищення активності іNOS з 0,145±0,079 до 1,558±0,235 нмоль НАДФ/хв*мг (у 11 разів, р<0,01), активність сNOS підвищувалась на 58 % у порівнянні з інтактними тваринами (рис. 1 - А 2; рис. 1 - Б 2). Вміст нітрит-аніону у СОШ зростав з 15,3±2,7 до 26,7±1,1 мкмоль/л (на 75 %, р<0,01). Активація іNOS у СОШ призводила до зменшення концентрації L-аргініну в плазмі крові з 42,9±10,2 мкг/мл до 28,8±2,7 мкг/мл (на 33 %, р<0,05). При цьому різко підвищувався вміст ТБК-активних продуктів на 56 % (р<0,05) та активність СОД на 78 % (р<0,05) у СОШ (рис. 2 - А 2; 2 - Б 2).

Отже, адреналін-індуковані деструктивні ушкодження СОШ супроводжуються значним зростанням активності iNOS, вмісту нітрит-аніону, ТБК-активних продуктів та активності СОД у СОШ та зменшенням концентрації L-аргініну у плазмі крові.

Вплив вітамінів С та Е на активність NO-синтаз, ензимів антиоксидантного захисту, вміст нітрит-аніону та процеси ліпопероксидації у СОШ та концентрації L-аргініну у плазмі крові при експериментальній виразці шлунка.

Введення вітаміну С на тлі дії адреналіну викликало зниження: площі деструктивних ушкоджень СОШ - до 16 мм ² (на 65 %, р<0,05) та МІУ - до 6,97±1,76 бали (на 68 %, р<0,05). При цьому, активність загальної NO-синтази зменшилась на 36 % (р<0,05), активність iNOS знизилась на 51 % (р<0,05), активність сNOS достовірно не змінювалась. Вміст нітрит-анінону зменшився на 23 % (р<0,05). Концентрація L-аргініну в плазмі крові підвищилась на 108 % (р<0,01), у порівнянні з дією адреналіну (рис. 1 - А 3; 1 - Б 3).

Рис 1. Вплив вітамінів С та Е на активність іNOS (А) та сNOS (Б) за умов адреналін-індукованих деструктивних ушкоджень СОШ: 1 - контрольні тварини; 2 - вплив адреналіну; 3 - вплив вітаміну С на тлі введення адреналіну; 4 - вплив вітаміну Е на тлі введення адреналіну; 5 - поєднана дія вітамінів С та Е на тлі введення адреналіну

Введення вітаміну С спричинило зменшення вмісту ТБК-активних продуктів на 27 % (р<0,05), зниження активності СОД на 35 % (р<0,05) та каталази на 17 % (рис. 2 - А 3, Б 3).

Таким чином, дія вітаміну С призводила до зростання процесів гастропротекції, що супроводжувалось зменшенням активності NO-синтаз, в першу чергу iNOS, зниженням вмісту нітрит-аніону, активність сNOS мала тенденцію до зростання, концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала.

Введення вітаміну Е знижувало площу деструктивних ушкоджень СОШ до 22,1±6,99 мм ² (на 52 %, р<0,05) та МІУ - до 8,32±2,42 бали (на 62 %). Активність загальної NOS знизилась на 40 % (р<0,05), активність іNOS - на 36 %, активність сNOS - на 31 % (рис. 1 - А 4, Б 4). За цих умов вміст нітрит-аніону в гомогенаті СОШ зменшився на 25 %, вміст ТБК-активних продуктів знизився на 20 %, активність СОД - на 33 % (р<0,05) (рис. 2-А 4, Б 4), активність каталази - незначно (на 14 %) у порівнянні з показниками при адреналін-індукованих ушкодженнях СОШ, а концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала на 42 % (р<0,05) і майже досягала показників інтактних тварин.

Таким чином, введення вітаміну Е (200 мг/кг) викликало посилення гастропротективних механізмів, зменшувало активність NO-синтаз, знижувало вміст нітрит-аніону, ТБК-активних продуктів та активність СОД у СОШ та зростання концентрації L-аргініну в плазмі крові.

Поєднана дія вітамінів С та Е призвела до зменшення площі деструктивних ушкоджень СОШ до 3,1±0,79 мм² та МІУ до 6±2,3 бали (на 72 %), у порівнянні з показниками при дії адреналіну. Вміст нітрит-аніону зменшувався на 24 %, у порівнянні з дією адреналіну, і його вміст у СОШ суттєво не відрізнявся від показників при самостійній дії вітамінів С та Е. Показники NO-синтазної системи знаходились на рівні значень дії вітаміну Е. Концентрація L-аргініну в плазмі крові була меншою на 37 %, ніж при дії вітаміну С. Вміст ТБК-активних продуктів та активність СОД зменшились на 11 %, у порівнянні з дією вітаміну Е на тлі адреналін-індукованої виразки шлунка (рис. 2 - А 5, Б 5).

Таким чином, поєднана дія вітамінів С та Е на тлі адреналін-індукованих ушкоджень шлунка не призводила до виражених змін активності NO-синтаз, вмісту ТБК-активних продуктів, активності СОД та каталази у порівнянні з їх самостійною дією.

Рис 2. Вплив вітамінів С та Е на вміст ТБК-активних продуктів (А) та активність СОД (Б) за умов адреналін-індукованих деструктивних ушкоджень СОШ: 1 - контрольна група; 2 - вплив адреналіну; 3 - вплив вітаміну С на тлі введення адреналіну; 4 - вплив вітаміну Е на тлі введення адреналіну; 5 - поєднана дія вітамінів С та Е на тлі введення адреналіну

Вплив вітаміну С на активність ензимів NO-синтазної системи, антиоксидантного захисту, процеси ліпопероксидації за умов введення L-аргініну та інгібування активності iNOS та ЦОГ-2 при адреналін-індукованій виразці шлунка.

Дія вітаміну С за умов інгібування активності іNOS аміногуанідином суттєво не змінювала активність загальної NO-синтази, активність іNOS та сNOS, вміст нітрит-аніону у СОШ незначно зменшувався (рис. 3 - А, Б). Концентрація L-аргініну в плазмі крові незначно перевищувала (на 11 %) його концентрацію при дії вітаміну С на тлі адреналін-індукованих ушкоджень СОШ.

Аналізуючи вплив вітаміну С на активність сNOS та іNOS на тлі інгібування активності іNOS, у порівнянні з самостійним впливом вітаміну С, можна відзначити наступне: якщо самостійна дія вітаміну С різко зменшувала активність іNOS (на 51 %, р<0,05), то на тлі інгібування активності іNOS аміногуанідином не спостерігалось значного зменшення активності NO-синтаз у порівнянні з самостійним впливом вітаміну С. Слід відзначити, що як при самостійній дії вітаміну С, так і при його дії на тлі інгібування активності іNOS різко зростала концентрація L-аргініну в плазмі крові, що об'єктивно пов'язано із зменшенням його використання в якості субстрату NO-синтазами.

Рис 3. Зміна активності іNOS (А) та сNOS (Б) за умов дії вітаміну С на тлі інгібування активності iNOS та ЦОГ-2 та введенні L-аргініну на тлі адреналін-індукованих ушкоджень СОШ: 1 - контрольна група; 2 - вплив адреналіну; 3 - вплив вітаміну С на тлі введення адреналіну; 4 - вплив вітаміну С за умов інгібування активності іNOS на тлі введення адреналіну; 5 - поєднана дія вітаміну С та L-аргініну на тлі введення адреналіну; 6 - вплив вітаміну С за умов інгібування активності ЦОГ-2 на тлі введення адреналіну.

Введення вітаміну С на тлі інгібування активності іNOS призводило до незначного зменшення вмісту ТБК-активних продуктів та активності СОД, активність каталази зменшилась на 15 %, що суттєво не відрізнялось від показників у порівнянні з самостійним введенням вітаміну С (рис. 4- А 4, Б 4).

Рис. 4. Зміни вмісту ТБК-активних продуктів (А) та активності СОД (Б) у СОШ за умов дії вітаміну С та інгібіторів активності iNOS та ЦОГ-2, введення L-аргініну на тлі адреналін-індукованих ушкоджень СОШ: 1 - контрольна група; 2 - вплив адреналіну; 3 - дія вітаміну С на тлі введення адреналіну; 4 -дія вітаміну С на тлі інгібування активності iNOS; 5 - поєднана дія вітаміну С та L-аргініну на тлі введення адреналіну; 6 - дія вітаміну С на тлі інгібування активності ЦОГ-2.

Отже, вплив вітаміну С на тлі інгібування активності іNOS аміногуанідином не викликав виражених змін активності іNOS, сNOS, вмісту ТБК-активних продуктів, нітрит-аніону, активності СОД у СОШ.

За умов поєднаної дії вітаміну С з L-аргініном відзначалось виражене зростання процесів гастропротекції, площа СГУ зменшилась на 58%, при цьому відзначалось зниження активності сNOS на 24 %, активність іNOS суттєво не змінювалась, вміст нітрит-аніону зменшився на 24 % (рис. 3 - А 5, Б 5), вміст ТБК-активних продуктів не змінювався, активність СОД зменшувалась у СОШ (рис. 4 - А 5, Б 5), концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала на 31 % у порівнянні з самостійним впливом вітаміну С на тлі адреналін-індукованих ушкоджень СОШ.

Дія вітаміну С на тлі інгібування активності ЦОГ-2 призводила до зменшення вмісту нітрит-аніону на 22 % та активності сNOS (на 36 %), тоді як активність іNOS змінювалась недостовірно, у порівнянні з впливом вітаміну С на тлі дії адреналіну (рис. 3 - А, Б). За цих умов вміст ТБК-активних продуктів не змінювався, активність СОД та каталази були на рівні показників інтактних тварин (рис. 4 - А 6, Б 6).

Отже, нами не відзначено виражених змін процесів ліпопероксидації, активності СОД та каталази при дії вітаміну С на тлі інгібування активності іNOS, ЦОГ-2 та введення L-аргініну у порівнянні з самостійним впливом вітаміну С за умов експериментальної виразки шлунка. Отримані результати свідчать, що дія вітаміну С є домінуючою і отримані результати щодо зміни показників ліпопероксидації та ензимів антиоксидантного захисту підтверджують те, що вітамін С проявляє як антиоксидантну дію, так і гальмує активність іNOS та ЦОГ-2.

Вплив вітаміну Е на активність ензимів NO-синтазної системи, антиоксидантного захисту, процеси ліпопероксидації за умов введення L-аргініну та інгібування активності iNOS та ЦОГ-2 при адреналін-індукованій виразці шлунка.

Дія вітаміну Е на тлі інгібування активності iNOS аміногуанідином викликала зменшення площі деструктивних ушкоджень СОШ на 49 %, МІУ знизився на 12 %, у порівнянні з самостійним впливом вітаміну Е на тлі введення адреналіну. При цьому активність загальної NO-синтази незначно зменшилась (на 11 %), активність iNOS - на 33 % (p <0,05), активність сNOS не змінювалась, у порівнянні з впливом вітаміну Е на тлі дії адреналіну (рис. 5 - А 4, Б 4). Зміни вмісту ТБК-активних продуктів мали тенденцію до зниження (на 16 %), активність СОД при цьому зросла на 36 %, активність каталази суттєво не змінювалась у порівнянні з показниками дії вітаміну Е на тлі дії адреналіну (рис. 6 - А 4, Б 4).

Рис. 5. Зміна активності іNOS (А) та сNOS (Б) за умов дії вітаміну Е на тлі інгібування активності iNOS та ЦОГ-2 та введення L-аргініну на тлі адреналін-індукованих ушкоджень СОШ: 1 - контрольна група; 2 - вплив адреналіну; 3 - вплив вітаміну Е на тлі введення адреналіну; 4 - вплив вітаміну Е за умов інгібування активності іNOS на тлі введення адреналіну; 5 - вплив вітаміну Е за умов введення L-аргініну на тлі введення адреналіну; 6 - вплив вітаміну Е за умов інгібування активності ЦОГ-2 на тлі введення адреналіну

Поєднана дія вітаміну Е з L-аргініном проявляє виражений цитопротективний ефект на СОШ. Площа деструктивних ушкоджень СОШ зменшилась до 4,33±2,35 мм ², а МІУ знизився до 3,5±1,93 балів (на 57 %), у порівнянні з самостійним впливом вітаміну Е за умов експериментальної виразки. За цих умов активність iNOS змінювалася недостовірно, активність сNOS зросла на 49 % (р<0,05) (рис. 5 - А 5, Б 5). Концентрація L-аргініну у плазмі крові незначно знижувалась. Вміст ТБК-активних продуктів, активність СОД та каталази не змінювалась, у порівнянні з впливом вітаміну Е на тлі дії адреналіну (рис. 6 - А 5, Б 5). Тобто, модулююча дія L-аргініну при його введенні одночасно з вітаміном Е проявлялась у зростанні процесів цитопротекції та активності сNOS у СОШ.

При дії вітаміну Е на тлі інгібування активності ЦОГ-2 за умов експериментальної виразки СОШ площа деструктивних ушкоджень зменшилась на 66 % (p <0,05), а МІУ зменшився на 11 %, у порівнянні з самостійною дією вітаміну Е.

За цих умов активність загальної NOS та сNOS не змінювались, активність iNOS - мала динаміку до зменшення (на 18 %) (рис. 5 - А 6, Б 6). Вміст нітрит-аніону у СОШ знизився на 29 %, а вміст ТБК-активних продуктів та активність СОД не змінювались (рис. 5 - А 6, Б 6), у порівнянні з показниками самостійної дії вітаміну Е на тлі дії адреналіну.

Рис. 6. Зміни вмісту ТБК-активних продуктів (А) та активності СОД (Б) у СОШ за умов дії вітаміну Е на тлі інгібування активності iNOS та ЦОГ-2, введення L-аргініну за умов адреналін-індукованих ушкоджень СОШ: 1 - контрольна група; 2 - вплив адреналіну; 3 - вплив вітаміну Е на тлі введення адреналіну; 4 -дія вітаміну Е на тлі інгібування активності iNOS; 5 - поєднана дія вітаміну Е та L-аргініну на тлі введення адреналіну; 6 - дія вітаміну Е на тлі інгібування активності ЦОГ-2

Таким чином, отримані результати свідчать про те, що дія вітаміну Е на тлі інгібування активності ЦОГ-2 целекоксибом при виразці шлунка призводила до незначного зменшення активності iNOS та вмісту нітрит-аніону, що може бути пов'язане із зниженням біосинтезу ендогенних ПГЕ ₂, які є одним з факторів активації iNOS [Mollace V. et al., 2005].

Зміни вмісту вітамінів С та Е у плазмі крові за умов експериментальної виразки шлунка та інгібування активності іNOS, ЦОГ-2 та введення L-аргініну.

Антиоксидантна дія вітамінів С та Е залежить від їх поступлення у клітини з крові. Слід відзначити, що у шлунку вітамін С присутній у вигляді аскорбінової кислоти [Smith G. V., Farthing M. J. G., 2005]. Його концентрація у шлунковому соку та епітеліоцитах шлунка значно вища, ніж у плазмі крові [Waring A. J. et al., 1996].

За умов експериментальної виразки шлунка концентрація окисненої та загальної форм вітаміну С у плазмі крові незначно зростала - на 27 % для окисненої форми, на 44 % (р<0,05) - для загальної форми (табл. 1).

Таблиця 1. Концентрація вітаміну С в плазмі крові за умов експериментальної виразки шлунка та інгібування активності іNOS, ЦОГ-2 та введенні L-аргініну (М± m, n=8-10)

Введення вітаміну С на фоні виразкових ушкоджень призводило до підвищення: окисненої його форми на 38 %, вмісту загальної форми - на 15 %, у порівнянні з показниками при виразці шлунка. Отримані нами дані співпадають з результатами Ohta Y. et al. [2005]. За умов введення вітаміну С, а також при його дії на тлі інгібування активності iNOS, ЦОГ-2 або поєднаному впливі з L-аргініном, концентрація вітаміну Е у плазмі виражено не змінювалась. вітамін виразка шлунок ліпопероксидація

Введення вітаміну С на тлі інгібування активності iNOS, ЦОГ-2, поєднаній дії з вітаміном Е та L-аргініном суттєво не змінювало концентрацію вітаміну С у плазмі крові у порівнянні з його самостійним впливом. Тоді як за умов за умов інгібування активності iNOS, ЦОГ-2 або введення L-аргініну вміст загальної форми вітаміну С у плазмі крові зменшувався майже до показників інтактних тварин.

При виразковому ушкодженні спостерігається різке зниження вмісту вітаміну С у шлунковому соку унаслідок порушення його секреції. Це може бути одним з факторів зростання вмісту вітаміну С у плазмі крові [Smith G. V. et al., 2005].

Одноразове введення вітаміну Е на тлі адреналін-індукованої виразки шлунка супроводжувалось динамікою зростання його концентрації у плазмі крові (на 22 %), у порівнянні з показниками при адреналін-індукованій виразці шлунка.

При введенні вітаміну Е з L-аргініном або при інгібуванні активності iNOS, ЦОГ-2 суттєвих змін концентрації вітаміну С у плазмі крові не було відзначено (табл. 2).

Таблиця 2. Вміст вітаміну Е в плазмі крові за умов його введення та інгібування активності iNOS, ЦОГ-2 та дії L-аргініну при адреналін-індукованих ушкодженнях шлунка (М± m, n=8-10)

Отже, проведеними дослідженнями показано, що екзогенне введення вітамінів С та Е призводить до незначного їх зростання в плазмі крові, що асоціюється з гастропротекцією в СОШ. Концентрація вітамінів С та Е за умов інгібування активності iNOS, ЦОГ-2 та введення L-аргініну суттєво не змінювалась. За умов самостійного введення L-аргініну та інгібування активності iNOS, ЦОГ-2 відзначалась тенденція до зменшення загального вмісту віт С в плазмі крові.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нові підходи до вирішення наукової проблеми щодо дії вітамінів С та Е на активність NO-синтаз, процесів ліпопероксидації, активності ензимів антиоксидантного захисту у слизовій оболонці шлунка та концентрації L-аргініну, вітамінів С та Е в плазмі крові при експериментальній виразці шлунка.

1. У слизовій оболонці шлунка за умов експериментального виразкоутворення відзначалось різке зростання рівня активності загальної NO-синтази (у 4 рази), переважно за рахунок зростання рівня активності індуцибельної NO-синтази (у 11 разів); активність конститутивної NO-синтази підвищилась на 58 % (p<0,05), вміст нітрит аніону - на 75 % (р<0,01), вміст продуктів тіобарбітурової кислоти - на 56 %, активність супероксиддисмутази - на 78 %, тоді як концентрація L-аргініну в плазмі крові зменшувалась на 33 % (р<0,05).

2. Самостійна дія вітамінів С та Е зменшувала: площу деструктивних змін, активність загальної NO-синтази (на 36-40 %), активність індуцибельної NO-синтази (на 36-51 %), вміст нітрит-аніону (на 24 %), вміст продуктів тіобарбітурової кислоти, активність супероксиддисмутази у слизовій оболонці шлунка, концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала у порівнянні з показниками при дії адреналіну. Активність конститутивної NO-синтази при введенні вітаміну С не змінювалась, а при введенні вітаміну Е - зменшувалась на 31 %. Поєднана дія вітамінів С та Е не призводила до підсумування їх ефектів у регуляції активності NO-синтаз та процесів ліпопероксидації.

3. Вплив вітаміну С на тлі інгібування активності індуцибельної NO-синтази аміногуанідином не викликав виражених змін активності NO-синтаз, вмісту нітрит-аніону у слизовій оболонці шлунка. Поєднана дія вітаміну С та L-аргініну проявила виражений гастропротективний ефект на тлі експериментальної виразки шлунка, що супроводжувалось зниженням активності конститутивної NO-синтази на 24 %, вмісту нітрит-аніону - на 24 %, активності супероксиддисмутази - на 22 %. Концентрація L-аргініну в плазмі крові зростала на 31 %.

4. Дія вітаміну С на тлі інгібування активності циклооксигенази-2 при експериментальній виразці шлунка призводила до вираженого зменшення активності конститутивної NO-синтази на 35 %, вміст нітрит аніону знижувався на 22 %, зміни активності індуцибельної NO-синтази були недостовірними. Концентрація L-аргініну в плазмі крові була на 14 % меншою, у порівнянні з самостійним впливом вітаміну С.

5. За умов поєднаного введення вітаміну Е та L-аргініну, на відміну від самостійної дії вітаміну Е, відзначалось зростання активності конститутивної NO-синтази, активність індуцибельної NO-синтази достовірно не змінювалась, а вміст нітрит-аніону мав тенденцію до зменшення; процеси ліпопероксидації та активність ензимів антиоксидантного захисту змінювались не достовірно.

6. За умов дії вітаміну Е на тлі інгібування активності індуцибельної NO-синтази аміногуанідином активність останньої знизилась на 33 %, активність конститутивної NO-синтази зросла на 14 %, у порівнянні з впливом вітаміну Е на тлі дії адреналіну. Вміст продуктів тіобарбітурової кислоти зменшився на 16 %, активність супероксиддисмутази зросла на 36 %, а каталази - суттєво не змінювалась. Дія вітаміну Е на тлі інгібування активності циклооксигенази-2 викликала зменшення вмісту нітрит-аніону (на 32 %), активність загальної та конститутивної NO-синтаз виражено не змінювались, активність індуцибельної NO-синтази - зменшувалась (на 18 %). Вміст продуктів тіобарбітурової кислоти та активність супероксиддисмутази у слизовій оболонці шлунка достовірно не змінювались, у порівнянні з самостійним впливом вітаміну Е при експериментальній виразці.

7. Вміст вітамінів С та Е у плазмі крові при адреналін-індукованих виразкових ушкодженнях шлунка незначно зростав. Введення вітаміну С призводило до підвищення концентрації його загальної форми у плазмі крові щурів на 15 %, при дії вітаміну Е його концентрація у плазмі крові підвищилась на 22 %. Введення вітамінів С та Е на тлі інгібування активності індуцибельної NO-синтази, циклооксигенази-2 та введення L-аргініну достовірно не змінювало їх концентрації у плазмі крові.

Список опублікованих праць за темою дисетації

1. Скляров О.Я. Роль вітамінів Е та С в антиоксидантних процесах органів травної системи / О.Я. Скляров, В.С. Журомський // Медична хімія. - 2006. - Т. 8, № 3. - С. 115-118. (Дисертант виконав пошук та аналіз літературних даних, провів експериментальні дослідження, оформив статтю.).

2. Скляров О.Я. Поєднана дія вітамінів Е та С на антиоксидантні та цитопротекторні механізми при експериментальній виразці шлунка / О.Я. Скляров, В. С Журомський // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. - 2009. - № 2. - С. 21-26. (Дисертант виконав пошук літератури, виконав експериментальні дослідження, провів статистичні обрахунки та оформив статтю).

3. Особливості дії вітамінів Е та С у регуляції NO-синтазної системи у слизових оболонках шлунка та товстої кишки за умов стресу / Журомський В.С., Шамро Н.Р., Грюк І. Б., Скляров О.Я. // Медична хімія. - 2009. - Т. 11, № 3. - С. 18-21. (Дисертант виконав пошук літератури, виконав частину експериментальних досліджень, провів статистичні обрахунки та написав фрагмент статті).

4. Sklyarov A. The role of vitamin E and NO-synthase system in cytoprotective mechanisms of gastric mucosa / A. Sklyarov, V. Zhuromskyi, J. Solski // Annales Universitatis Mariae Curie-Sklodowska. - 2009. - Vol. 22, № 3. - P. 13-16. (Дисертант виконав пошук літератури, здійснив аналіз літератури, обробку та узагальнення отриманих результатів.).

5. Вплив вітаміну С на антиоксидантні та цитопротекторні процеси в органах травної системи за умов експериментальної виразки шлунка / Грюк І. Б., Шамро Н.Р., Журомський В.С., Червінська М. Є., Скляров О.Я. // Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. - 2010. - № 2. - С. 50-56. (Дисертантом проведено пошук літератури, виконано експериментальні дослідження у шлунку, проаналізовано отримані результати).

6. Журомський В.С. Вміст вітамінів С та Е в плазмі крові за умов блокування іNOS, циклооксигенази-2 та введенні L-аргініну при експериментальній виразці шлунка / В.С. Журомський, О.Я. Скляров // Практична медицина. - 2010. - № 5. - С. 95-101. (Дисертант виконав пошук літератури та аналіз літератури, провів експериментальні дослідження, проаналізував результати, написав та оформив статтю).

7. Zhuromskyi V. Effect of vitamin C on the activity of NO-synthase system under conditions of experimental ulcer of the stomach / V. Zhuromskyi // Annals of pharmaceutical faculty Danylo Halytsky Lviv National Medical University. - 2010. - Vol. 3. - P. 45 - 47.

8. Журомський В.С. Вплив вітамінів Е та С на процеси ліпопероксидації за умов виразкового ушкодження слизової оболонки шлунка щурів / В.С. Журомський, О.Я. Скляров // "Механізми функціонування фізіологічних систем" : матеріали міжнародної наукової конференції, приуроченої до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин ЛНУ ім. І. Франка, 8-11 листопада 2006 р., м. Львів. - Львів, 2006. - С. 63-64.

9. Zhuromskyi V. Сombined action of vitamin E and vitamin C on the proctssts of cytoprotection in gastric mucosa of rats / V. Zhuromskyi, A. Sklyarov // Neuro - humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes : abstract III international conference, october 4 - 6, 2007, Lviv. - [Львів], 2007. - P. 53 - 54.

10. Sklyarov A. Role of vitamin E and NO-synthase system in cytoprotective mechanisms of gastric mucosa / A. Sklyarov, V. Zhuromskyi // 5 international symposium on cell/tissue injury and cytoprotection/organoprotection. Focus on GI tract : [abstract], september 17 - 19, 2008, Yalta. - Yalta, 2008. - P. 14.