Репаративний остеогенез в умовах техногенних мікроелементозів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

ДУ "Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського"

УДК 616.71-001.52:574(043.3)

14.03.01 - нормальна анатомія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

РЕПАРАТИВНИЙ ОСТЕОГЕНЕЗ В УМОВАХ ТЕХНОГЕННИХ МІКРОЕЛЕМЕНТОЗІВ

Кореньков Олексій Володимирович

Сімферополь - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Медичному інституті Сумського державного університету МОН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Сікора Віталій Зіновійович, Медичний інститут Сумського державного університету МОН України, завідувач кафедри анатомії людини.

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Фоміних Тетяна Аркадіївна, ДУ "Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського" МОЗ України, завідувач кафедри топографічної анатомії та оперативної хірургії;

- доктор медичних наук, професор Лузін Владислав Ігоревич, ДЗ "Луганський державний медичний університет" МОЗ України, завідувач кафедри нормальної анатомії людини.

Захист відбудеться " 25 " травня 2011 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 52.600.02 ДУ "Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського" (95006, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ "Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського" (95006, м. Сімферополь, бульвар Леніна, 5/7)

Автореферат розісланий " 15 " ___ квітня_______ 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Г.О. Мороз

Анотації

Кореньков О.В. Репаративний остеогенез в умовах техногенних мікроелементозів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.01 - нормальна анатомія. - ДУ "Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського" МОЗ України. - Сімферополь, 2011.

Дисертація присвячена вивченню морфологічних змін регенерату травмованих великогомілкових кісток щурів різного віку в умовах техногенного мікроелементозу організму і пошуків шляхів їх корекції. Структурно-функціональну характеристику регенерату великогомілкової кістки після нанесення у її діафізі дірчастого дефекту вивчали за допомогою спектрофотометрії, гістоморфометрії, трансмісійної та растрової електронної мікроскопії, рентгенівського мікроаналізу та біомеханічних випробувань (міцність, твердість, жорсткість). Установлено, що в умовах надлишкового надходження до організму щурів солей важких металів відбувається зниження інтенсивності проліферації і диференціювання клітинних елементів, дистрофічні і деструктивні зміни в фібро- і остеобластах, затримка формування тканиноспецифічних структур регенерату, зменшення інтенсивності його мінералізації, а також зниження міцності, твердості і пружних властивостей посттравмованих кісток.

Фармакологічний препарат діаліпон призводить до стабілізації мікро- і макроелементного балансу великогомілкових кісток, унаслідок чого підсилюється регенераторний процес у кістковій рані, активуються процеси новоутворення і дозрівання кісткових структур та відновлюються їх біомеханічні властивості.

Ключові слова: репаративний остеогенез, важкі метали, великогомілкова кістка, діаліпон.

Кореньков А.В. Репаративный остеогенез в условиях техногенных микроэлементозов. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.01 - нормальная анатомия. - ГУ "Крымский государственный медицинский университет имени С.И. Георгиевского" МЗ Украины. - Симферополь, 2011.

Диссертация посвящена изучению морфологических изменений регенерата травмированных большеберцовых костей крыс разного возраста в условиях техногенного микроэлементоза организма и поиску путей их коррекции. Экспериментальные исследования проведены на 351 белой лабораторной крысе-самце, которым в средней части диафиза большеберцовых костей с помощью шаровидного стоматологического бора наносили дырчатый дефект под струйным охлаждением физиологическим раствором диаметром 1,2-1,5 мм. Структурно-функциональную характеристику регенерата большеберцовой кости изучали при помощи спектрофотомерии, гистоморфометрии, трансмиссионной и растровой электронной микроскопии, рентгеновского микроанализа и биомеханических испытаний (прочность, твердость, жесткость). Животные были разделены на две серии: І серия - контрольные животные молодого (3-месячного), зрелого (8-месячного) и старческого (24-месячного) возраста, которые употребляли питьевую воду стандартного качества; ІІ серия - экспериментальная, в которую входили две группы: 1-я группа - животные, которые употребляли питьевую воду с солями тяжелых металлов в течение двух месяцев в концентрациях, которые определяются в грунтах и водоемах отдельных районов Сумской области; 2-я группа - животные, у которых исследовалась возможность коррекции морфологических изменений репаративной регенерации большеберцовых костей фармакологическим препаратом диалипон. В условиях техногенного микроэлементоза организма происходит пролонгация воспалительного процесса, на что указывает увеличение количества нейтрофилов при одновременном уменьшении фибробластов на 3-и сутки после перелома. В фибро- и остеобластах набухшие митохондрии с просветленным или уплотненным матриксом, лизис мембран и крист митохондрий, разрыхление и лизис ядерной, цитоплазматической мембран, просветление ядерного матрикса, отсутствие органел в перинуклеарной области, наличие в цитоплазме вторичных лизосом, лизис и разрыхление мембран гранулярного эндоплазматического ретикулума с одиночними рибосомами на их поверхности, редукция и дезорганизация мембран цитоплазматического комплекса Гольджи. Изменения на первой стадии репарации и наличие дистрофических и деструктивных изменений в остеобластах обеспечивают дальнейшее замедление костно-регенераторного процесса, о чем свидетельствуют увеличение соединительнотканного компонента и уменьшение прироста и созревания костной части регенерата. В трабекулах ретикулофиброзной костной ткани определяются микротрещины и отсутствие в последнем сроке наблюдения надежных связей между регенератом и материнской костью, наличие костных углублений, что является прямым свидетельством незрелости костной мозоли и отсутствие восстановления анатомической целостности кости как органа. В условиях эксперимента уменьшается интенсивность минерализации костной части регенерата, что отражается в соответствующем снижении твердости, жесткости, а также прочности костей.

Фармакологический препарат диалипон приводит к стабилизации макро- и микроэлементного баланса травмированных костей, вследствие чего ускоряется регенераторный процесс в костной ране, активируются процессы новообразования и созревания костных структур и восстанавливаются их биомеханические свойства.

Ключевые слова: репаративный остеогенез, тяжелые металлы, большеберцовая кость, диалипон.

Korenkov O.V. Reparative osteogenesis under the conditions of technogenic microelementosis. - Manuscript.

Thesis for acquiring the candidate's degree in medicine in the specialty 14.03.01 - normal anatomy. Crimean State Medical University named after S.I. Georhiyevsky MPH Ukraine. - Simferopol, 2011.

The thesis is devoted to studying morphological changes of a regenerate of traumatized tibia of rats of different age under the conditions of technogenic microelementosis of a body and search of ways of their correction. Structural-functional characteristics of regenerate of tibia of causing perforated defect in its diaphysis was studied with the help of spectrophotometry, histomorphometry, transmission and raster electronic microscopy, x-ray microanalysis and biomechanical testing (strength, hardness, rigidity). It was determined that under the conditions of extra supply of salts of heavy metals to the body of rats there is decrease in intensity of proliferation and differentiation of cellular elements, dystrophic and destructive changes in fibroblasts and osteoblasts, delay in formation of fibre-specific structures of regenerate, decrease in intensity of its mineralization, and also decrease in strength, hardness and elastic qualities of post-traumatized bones.

Pharmacologic medicine dialipon results in stabilization of micro and macroelemental balance in tibia which results in intensification of regenerative process in osseous wound, activation of processes of neoformation and maturing of osseous structures and renovation of their biomechanics qualities.

Key words: reparative osteogenesis, heavy metals, tibia, dialipon.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Проблема регенерації кістки в ортопедії й травматології займає одне з центральних місць. Сьогодні досягнуті певні успіхи у вивченні різних сторін цього процесу, але лікування переломів довгих кісток, незважаючи на сучасний стан розвитку науки та впровадження нових методів дослідження, характеризується значним відсотком незадовільних результатів (M. Weight, С. Collinge, 2004).

Кістка є найбільш міцною тканиною в організмі, вона дуже лабільна і чутлива до впливу різноманітних зовнішніх чинників, особливо у процесі її регенерації, що пов'язано з дуже інтенсивними обмінними реакціями, які відбуваються в ній (Т.К. Осипенкова-Вичтомова, 2009). Проліферацію і диференціювання клітинних елементів, ангіогенез, оксигінацію клітин регенерату, синтез основних компонентів органічної матриці кістки та її мінералізацію, утворення енергії, захист клітин та їх структур від вільних радикалів забезпечують ферменти і специфічні білки, активування яких здійснюється мікроелементами (А.П. Авцын и др., 1991; А.А. Корж и др., 2003; В.К. Мазо и др., 2009).

Сьогодні людство вступило в такий період свого розвитку, коли сприймається як реальність передбачення Вернадського про те, що господарська діяльність людини набула геологічної сили, здатної змінити світ, і поставила його на грань глобальної екологічної катастрофи (А.Н. Батян и др., 2009). Різноманітність і велика кількість забруднювальних речовин роблять практично неможливим контроль за вмістом кожного з них в об'єктах навколишнього середовища. Державами ООН, які брали участь у заходах щодо покращання й збереження навколишнього середовища, був прийнятий загальний перелік пріоритетних речовин, які забруднюють біосферу. Однією із таких головних і небезпечних речовин є сполуки важких металів (А.В. Скальный, 2003). Незважаючи на значне поширення цих металів у довкіллі, їх вміст у тканинах та органах людини в нормі не перевищує 10^-3% від маси тіла, але антропогенне забруднення довкілля викликає накопичення важких металів у воді, ґрунті, повітрі і, як наслідок, в організмі людей і тварин, що, у свою чергу, призводить до дисбалансу мікроелементів в організмі (А.В. Скальный, И.А. Рудаков, 2003).

Проблема впливу комбінації солей важких металів на репаративний остеогенез вивчена мало, хоча заслуговує спеціального розгляду як проблема екологічного значення (В.В. Некачалов, 2000). У літературі відсутні дані щодо морфологічних змін репаративного остеогенезу за умов комбінованої дії підвищених концентрацій солей важких металів, які притаманні екологічним умовам Сумщини, що і визначило мету нашого дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану наукових досліджень Сумського державного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми Медичного інституту Сумського державного університету "Вивчення стану здоров'я дитячого та дорослого населення Сумської області в умовах впливу несприятливих соціальних, економічних та екологічних чинників" (№ держреєстрації 0101U00298) та складовою частиною науково-дослідної теми кафедри анатомії людини "Морфофункціональні особливості перебудови скелета та внутрішніх органів в умовах порушення гомеостазу організму" (№ держреєстрації 010U001287).

Мета і завдання дослідження. Дослідити у віковому аспекті морфологічні особливості перебігу репаративного остеогенезу, зміни хімічного складу травмованих кісток та їх біомеханічні властивості в умовах споживання надмірної кількості солей важких металів і встановити можливість корекції виявлених змін фармакологічним препаратом діаліпон.

Для досягнення поставленої мети визначені завдання:

1. Виявити мікроструктурні особливості репаративного остеогенезу, хімічний склад та біомеханічні показники травмованих великогомілкових кісток контрольних тварин у віковому аспекті для проведення коректного порівняльного аналізу отриманих даних із результатами експерименту.

2. Установити характер мікроелементозу під час надходження до організму щурів комбінації солей важких металів.

3. Отримати дані про мікроскопічну будову регенерату травмованих великогомілкових кісток в умовах споживання надмірної кількості солей важких металів.

4. З'ясувати вплив комбінації солей важких металів на ультраструктуру клітин регенерату травмованих великогомілкових кісток щурів.

5. Визначити хімічний склад і біомеханічні властивості травмованої великогомілкової кістки та її регенерату в умовах техногенного мікроелементозу організму, встановити кореляційні зв'язки між зазначеними показниками.

6. Установити можливість корекції виявлених змін репаративного остеогенезу фармакологічним препаратом діаліпон.

Об'єкт дослідження - репаративна регенерація довгої кістки скелета в умовах техногенного мікроелементозу організму.

Предмет дослідження - морфофункціональна характеристика репаративного остеогенезу великогомілкових кісток білих лабораторних щурів різного віку в умовах токсичної дії надмірної кількості солей важких металів.

Методи дослідження: гістоморфометричні - для вивчення структури регенерату великогомілкових кісток на світлооптичному рівні; трансмісійна електронна мікроскопія - для визначення функціонального стану клітин регенерату; растрова електронна мікроскопія з рентгенівським мікроаналізом - для визначення структурних особливостей та елементного складу кісткової частини регенерату; біомеханічні - для визначення міцності, твердості та жорсткості травмованих кісток і їх регенерату; спектрофотометричний - для визначення хімічного складу діафізів ушкоджених кісток; статистичний - для об'єктивного визначення відмінностей отриманих кількісних даних і оцінки їх взаємозв'язків.

Наукова новизна одержаних результатів. На достатньому експериментальному матеріалі вперше за допомогою комплексу морфологічних методів дослідження розкриті основні закономірності структурно-функціонального відновлення травмованої довгої кістки щурів молодого, зрілого і старечого віку в умовах надмірного надходження до їх організму комбінації солей важких металів (марганець, залізо, мідь, цинк, свинець). Виявлено, що в цих умовах спостерігається затримка формування повноцінної кісткової мозолі. На стадії запалення визначилося достовірне збільшення сегментоядерних лейкоцитів при одночасному зменшенні кількості фібробластів, що свідчить про пролонгування запального процесу і затримку диференціювання остеогенних клітинних елементів. Уперше доведено, що в умовах експерименту у подальших термінах регенерації відбувається затримка дозрівання сполучної та кісткової частин регенерату.

Уперше встановлені ультрамікроскопічні зміни клітин регенерату великогомілкових кісток, які мали дистрофічний і деструктивний характер.

Новими є дані щодо хімічного складу кісткової частини регенерату, отримані за допомогою рентгенівського мікроаналізу, які свідчать про зменшення інтенсивності його мінералізації за умов техногенного мікроелементозу організму.

Отримані нові дані щодо біомеханічних властивостей посттравмованої великогомілкової кістки та її регенерату, які свідчать про зниження показників міцності, жорсткості й твердості.

Експериментально доведена можливість корекції негативного впливу солей важких металів на процес репарації кісток антиоксидантним фармакологічним препаратом діаліпон.

Практичне значення отриманих результатів. Дане дослідження дозволило експериментально визначити механізми впливу комбінації солей важких металів, що містяться в надлишковій кількості у воді й ґрунті Сумської області, на формування посттравматичного регенерату, хімічний склад та біомеханічні властивості великогомілкових кісток тварин різного віку. Отримані нові експериментальні дані є морфологічною основою для прогнозування змін у травмованих трубчастих кістках, що може бути використано в травматології, ортопедії, функціональній анатомії кісткової системи, терапії, педіатрії тощо як теоретичне підґрунтя для оптимального розроблення лікувальних заходів та профілактики ускладнень загоєння ушкоджених кісток скелета. Пропонується використання антиоксидантного фармакологічного препарату діаліпон як ефективного корегувального засобу для зниження ушкоджувальної дії солей важких металів на репаративний остеогенез у осіб різного віку в екологічно несприятливих районах Сумщини.

Результати експериментальних досліджень впроваджені у навчальний процес на кафедрі анатомії, топографічної анатомії та оперативної хірургії Буковинського державного медичного університету, кафедрі нормальної анатомії людини Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, кафедрі нормальної анатомії людини ДЗ "Луганський державний медичний університет", кафедрі анатомії людини Буковинського державного медичного університету, кафедрі анатомії людини Дніпропетровської державної медичної академії, кафедрі нормальної анатомії ДУ "Кримський державний медичний університет імені С.І. Георгієвського, кафедрі анатомії людини Одеського державного медичного університету, кафедрі анатомії людини Запорізького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно здійснені патентно-інформаційний пошук та аналіз літературних джерел. Автор оволодів методами дослідження, які використовувалися під час проведення наукової роботи, провів усі експериментальні дослідження, здійснив аналіз і статистичну обробку отриманих результатів. Дисертантом написані всі розділи роботи, зроблені узагальнення, сформульовані висновки, підготовлені наукові матеріали до публікації та виступів на конференціях.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертації повідомлені й обговорені на Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні питання експериментальної та клінічної медицини" (м. Суми, 25-26 квітня 2007 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Сучасні досягнення теоретичної та практичної медицини" (м. Суми, 24-25 квітня 2008 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні питання теоретичної медицини" (м. Суми, 20 березня 2009 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Молодь - медицині майбутнього" (м. Одеса, 23-24 квітня 2009 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології" (м. Вінниця, 20-21 травня 2009 р.), Міжнародній науково-практичній конференції "Морфологічний стан тканин і органів систем організму в нормі та патології" (м. Тернопіль, 10-11 червня 2009 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальні проблеми ембріологічних досліджень" (м. Дніпропетровськ, 7-10 жовтня 2009 р.), Науково-практичній конференції "Актуальні питання теоретичної медицини" (м. Суми, 22-23 квітня 2010 р.), Міжнародній науковій конференції "Молодь медицині майбутнього" (м. Одеса, 22-23 квітня 2010 р.), Науково-практичній конференції "Фізіологічна та репаративна регенерація кістки: сучасний стан питання" (м. Євпаторія, 23-24 вересня 2010 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових робіт (13 одноосібних), із них 8 статей у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, 8 робіт - у матеріалах з'їздів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 240 сторінках компкомп'ютерного тексту і складається зі вступу, розділів: огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел (налічує 290 найменувань: 223 - кирилицею, 67 - латиницею) і додатків. Дисертаційна робота ілюстрована 13 таблицями та 112 рисунками. Бібліографічний перелік, ілюстрації та додатки викладені на 64 сторінках.

Основний зміст роботи

Матеріал та методи дослідження. Експериментальне дослідження проведене на 351 білому лабораторному щурі. Тварини до початку дослідження перебували на звичайному харчовому раціоні та утриманні, яке здійснювали відповідно до "Санітарних правил створення, обладнання та утримання експериментально-біологічних клінік (віваріїв)" від 06.04.73 р. та доповнень від 04.12.78 р. до наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.66 р. "Про добові норми харчування тварин та продуценти". Досліди на тваринах виконували відповідно до правил "Європейської конвенції захисту хребетних тварин, яких використовують в експериментальних і інших наукових цілях", "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах", прийнятих Першим національним конгресом з біоетики (Київ, 2001), Гельсінської декларації Генеральної асамблеї Всесвітньої медичної асоціації (2000).

Операцію виконували на обох кінцівках щурів. Під ефірним наркозом робили поздовжній розріз шкіри і фасції завдовжки 0,8-1,5 см по лінії margo anterior tibia і оголяли діафіз великогомілкової кістки. Дірчастого дефекту завдавали за допомогою кулеподібного зубного бора у середній третині діафізу великогомілкової кістки під струминним охолодженням фізіологічним розчином.

Усі оперовані тварини були поділені на такі серії:

I серія (117 щурів) - контрольні тварини молодого (3-місячного), зрілого (8-місячного), та старечого (24-місячного) віку, які споживали питну воду стандартної якості.

II серія (234 щури) - експериментальна, в яку входили дві групи:

- 1-ша група (117 щурів) - тварини трьох вікових груп, які споживали питну воду з солями важких металів протягом двох місяців у концентрації, що визначається у ґрунтах та водоймищах окремих районів Сумської області: мідь (CuSO₄ х 5Н ₂О) - 5 мг/л, цинк (ZnCl₂) - 5 мг/л, залізо (FeSO₄₎ - 10 мг/л, марганець (MnCl₂ х 4Н ₂О) - 1 мг/л, і свинець (Рb(NO₃)₂) - 3 мг/л.

-2-га група (117 щурів) - тварини трьох вікових груп, у яких досліджувалася можливість корекції морфологічних змін репаративної регенерації великогомілкових кісток в умовах мікроелементозу препаратом діаліпон, який вводили у черевну порожнину один раз на добу у дозі 50 мг на 1 кг маси тіла протягом 30 діб.

Препарат діаліпон випускається фармацевтичною компанією "Фармак" і затверджений наказом Міністерства охорони здоров'я України від 24.03.2009 № 177 з реєстраційним посвідченням № UA/0794/01/01.

Дозу фармакологічного препарату стандартизували за площею поверхні тіла тварин, яку розраховували на основі результатів зважування. Для цього використовували формулу Meeh -

,

де площа поверхні тіла у см²; маса тіла в грамах; а коефіцієнт, який для щурів становить 10. Для людини 0,123112, при цьому масу тіла виражали у кілограмах, а результат отримували у м² (И.А. Волчегорский и др., 2000).

Терміни забору матеріалу для вивчення репаративного процесу пошкодженої кістки проводили на 3-тю, 10-ту, 15-ту і 24-ту добу від моменту нанесення травми відповідно до стадій репаративного остеогенезу за Коржом М.О., Дєдух Н.В. (2006). Виведення тварин з експерименту здійснювали шляхом декапітації під глибоким ефірним наркозом.

Для вивчення особливостей перебігу репаративних процесів в умовах споживання надмірної кількості солей важких металів використовували такі методи дослідження:

1. Гістологічне дослідження ділянки дефекту. Готували гістологічні зрізи кісткової мозолі за загальноприйнятою методикою та забарвлювали їх гематоксилін-еозином, за Маллорі та за Ван-Гізоном. Отримані препарати вивчали за допомогою світлового мікроскопа "OLIMPUS".

2. Морфометрія гістологічних препаратів. За допомогою комп'ютерної програми "Видео Тест 5,0" та "Видео Размер 5,0" на мікрознімках вимірювали клітинний склад регенерату (на 3-тю добу після перелому - нейтрофіли, плазмоцити, лімфоцити, макрофаги, фібробласти і малодиференційовані стромальні клітини (МСК)) та його тканинні компоненти: сполучна тканина (грануляційна і фіброретикулярна) і кісткова (ретикулофіброзна і пластинчаста). Відсоткове співвідношення клітин розраховували після підрахунку ста клітин у декількох полях зору.

3. Трансмісійна електронна мікроскопія клітин регенерату кістки. Матеріал з кісткової мозолі готували за стандартною методикою (В.С. Пикалюк, 2008). Ультратонкі зрізи виготовляли на вдосконаленому ультрамікротомі УМТП - 6, які після контрастування цитратом свинцю вивчали під електронним мікроскопом ЕМВ-100БР.

4. Растрова електронна мікроскопія регенерату з рентгенівським мікроаналізом її кісткової частини. У якості фіксаторів кісток використовували 2,5% буферний розчин глутарового альдегіду і 1% буферний розчин чотириокису осмію. Зневоднення проводили в спиртах зростаючої концентрації і ацетоні. Кістки приклеювали на столики струмопровідним клеєм і напиляли вуглецем у стандартній вакуумній установці типу ВУП-5. Аналіз поверхні травмованої кістки проводили методом рентгенівського мікроаналізу. Растрова електронна мікроскопія здійснена на мікроскопі "РЭМ 106-И".

5. Визначення хімічного складу травмованих кісток. Відокремлений і зважений кістковий фрагмент з регенератом у середній третині великогомілкової кістки висушували до постійної ваги у сухожаровій шафі. Вміст води розраховували за формулою

,

де - маса вологої кістки; - маса сухої кістки. Потім висушену тканину спалювали у порцелянових тиглях у муфельній печі до озолення. Отриману золу розтирали у ступці і розчиняли в 2 мл 10% хімічно чистої соляної та 1мл азотної кислот, доводили до кипіння, після чого розбавляли бідистильованою водою до об'єму 10 мл. На атомному абсорбційному спектрофотометрі С-115М 1 за загальноприйнятою методикою визначали вміст марганцю, заліза, міді, цинку і свинцю.

6. Вивчення біомеханічних властивостей посттравмованих кісток. З біомеханічних властивостей посттравмованих кісток проводили визначення таких показників, як міцність, жорсткість, твердість. Усі дослідження проводили на 24-ту добу після перелому. З руйнівних механічних випробувань досліджували межу міцності при центральному розтягненні, стисканні та поперечному згинанні. Першим етапом визначали внутрішні силові чинники через дію на кістку зовнішніх сил. Другим етапом проводили розрахунок геометричних характеристик плоских перетинів кісток. Для розрахунку межі міцності при центральному розтягненні, стисканні використовували таку геометричну характеристику кістки, як площу поперечного перетину, а при згинанні - момент опору поперечного перетину кістки. З неруйнівних механічних випробувань проводили визначення твердості і жорсткості кісткової частини регенерату за допомогою методу безперервного індентування. Для цього використовували прилад "Мікрон-гамма", який був розроблений в Аерокосмічному інституті національного авіаційного університету.

Статистична обробка отриманих даних проведена на основі загальноприйнятих методів варіаційної статистики з розрахунком середнього арифметичного (М) і його похибки (m) за допомогою пакета прикладних статистичних комп'ютерних програм Excel. Оцінку достовірності між порівнювальними серіями проводили за критерієм Стьюдента, різницю вважали достовірною при р < 0,05 (В.М. Бенсман, 2002). З метою з'ясування наявності стохастичної залежності між двома показниками використовували коефіцієнт кореляції r_х/у, який описує ступінь щільності лінійної залежності між випадковими величинами і . У першому випадку показником був вміст мінерального компонента діафізу кісток, а - міцність кісток, у другому випадку - концентрація кальцію у кістковій частині регенерату на 24-ту добу після перелому, а - мікротвердість і модуль Юнга, в третьому випадку - кількість нейтрофілів, а - фібробластів у регенераті на 3-тю добу після перелому.

Результати дослідження та їх обговорення. Проведені дослідження за допомогою атомно-абсорбційної спектрофотометрії показали, що вплив надлишкової кількості солей важких металів на організм щурів викликає дисбаланс мікроелементів у діафізі посттравмованих великогомілкових кісток. В умовах техногенного мікроелементозу організму відбуваються складні зміни у динаміці кількісних показників марганцю, заліза, міді, цинку і свинцю. Рівень заліза і свинцю набагато вищий за контроль. У щурів молодого, зрілого і старечого віку ця різниця становила 593,00% (р<0,05), 379,05% (р<0,05), 281,24% (р<0,05) для свинцю і 91,74% (р<0,05), 120,01% (р<0,05), 325,71% (р<0,05) - для заліза. У той самий час у кістковій тканині концентрація марганцю, міді і цинку знижена на 34,54% (р<0,05), 30,65% (р<0,05), 45,04% (р<0,05) у першому, на 65,85% (р<0,05), 56,65% (р<0,05), 52,70% (р<0,05) - у другому і на 93,55% (р<0,05), 42,97% (р<0,05), 50,63% (р<0,05) - у третьому випадку.

Отримані результати мікроскопічного дослідження на 3-тю добу після перелому свідчать, що розвиток у тварин техногенного мікроелементозу призводить до пролонгації запального процесу у ділянці кісткового дефекту, про що свідчить достовірне збільшення у регенераті великогомілкових кісток щурів молодого, зрілого і старечого віку кількості нейтрофілів на 64,60% (р<0,05), 68,82% (р<0,05), 62,88% (р<0,05) при одночасному зменшенні кількості фібробластів на 17,52% (р<0,05), 25,64% (р<0,05), 29,38% (р<0,05). Проведений кореляційний аналіз між кількістю нейтрофілів і фібробластів установив зворотну залежність між названими показниками, при цьому коефіцієнт кореляції для тварин молодого, зрілого і старечого віку становив r= -0,755; -0,817; -0,670.

Ультрамікроскопічна характеристика фібробластів на 3-тю добу після перелому у тварин молодого віку характеризується слаборозвинутим гранулярним ендоплазматичним ретикулумом і гіпертрофованим пластинчастим цитоплазматичним комплексом Гольджі. У тварин зрілого і старечого віку ядра фібробластів мають неправильну форму, ядерна мембрана утворює численні глибокі та дрібні інвагінації, місцями піддається лізису і розпушена. Хроматин представлений переважно конденсованою формою. Цитоплазматична мембрана місцями зруйнована. Цистерни гранулярного ендоплазматичного ретикулума сильно розширені і заповнені безструктурною субстанцією з середньою електронною щільністю. У тварин старечого віку у цитоплазмі розташовується невелика кількість набряклих мітохондрій із зруйнованими кристами і електронно-прозорим матриксом. Пластинчастий цитоплазматичний комплекс Гольджі редукований, а його гладенькі мембрани дезорганізовані. Поблизу мембран інколи виявляються вторинні лізосоми. Вищеперелічені ознаки фібробластів свідчать про розвиток дистрофічних і деструктивних змін їх субмікроскопічної організації, особливо у тварин старечого віку.

Пролонгація запального процесу, зниження кількості і синтетичної активності фібробластів (з дистрофічними і деструктивними змінами органел) у першій стадії репарації забезпечило і подальше уповільнення кістково-регенераторних процесів. Так, на 10-ту добу у тварин першої групи, порівняно з контрольною серією гістологічно має місце значуще збільшення частки грануляційної тканини і зменшення частки кісткової частини регенерату. У тварин зрілого і старечого віку контури країв дефекту залишаються рівними, але при великому збільшенні в компактній речовині визначалися мікротріщини. По краю дефекту спостерігаються поля без остеоцитів та некробіозу. Контури країв дефекту чіткі, між ними і регенератом існує вільний простір. На 15-ту добу після травматичного ушкодження заповнення дефекту у тварин молодого, зрілого і старечого віку відбувається переважно сполучною і значно меншою мірою незрілою кістковою тканиною. Необхідно відмітити, що у тварин зрілого віку в цей термін спостереження кісткова регенерація відбувається більш активно, про що свідчить більша частка кісткового регенерату, ніж у тварин молодого і особливо старечого віку. Характерною морфологічною ознакою на 10-ту добу у тварин старечого віку є наявність відшарованого окістя у крайових відділах дефекту, що може бути пов'язано зі збільшенням кількості крововиливів та збільшенням терміну їх реорганізації. Зрілих кісткових структур на 15-ту добу не виявлено, що є суттєвою різницею з тваринами зрілого віку контрольної серії.

Трансмісійна ультрамікроскопія довела, що у тварин в умовах техногенного мікроелементозу в остеобластах спостерігаються дистрофічні та деструктивні зміни органел. У щурів молодого віку характерним для цих клітин є наявність у цитоплазмі мітохондрій зі зруйнованими зовнішніми мембранами і кристами. Ядра мають неправильну форму і розпушену ядерну мембрану. На 10-ту добу більша частина ядерного хроматину знаходиться у конденсованому стані, тоді як у контрольних тварин в ядрі спостерігається переважно деконденсований хроматин. На 15-ту добу в ядрах остеобластів відзначається збільшення кількості деконденсованого ядерного хроматину. У цитоплазмі остеобластів нерідко зустрічаються вторинні лізосоми. Цитоплазматична мембрана розпушена з ділянками лізису. У тварин зрілого і старечого віку ядра остеобластів мають розпушену і осміофільну мембрани. У перинуклеарній ділянці цитоплазми практично відсутні органели. Мітохондрії остеобластів набряклі, з деструктивними змінами зовнішніх мембран і крист. У окремих мітохондріях виявляються мієліноподібні утворення. Цистерни гранулярного ендоплазматичного ретикулума сильно розширені, мембрани розпушені з поодинокими рибосомами на їх поверхні, що свідчить про зниження біосинтетичної активності цих клітин. У цитоплазмі наявні включення ліпідів з різко зменшеною кількістю вільних рибосом і полісом. У невеликої кількості остеобластів визначалися ділянки некробіозу цитоплазми. Мембрани пластинчастого цитоплазматичного комплексу Гольджі піддаються редукції і дезорганізації.

Рентгенівський мікроаналіз поверхні кісткових балочок і пластинчастої кістки у всі терміни спостереження свідчить про зменшення інтенсивності процесу мінералізації, що відображається у зниженні вмісту кальцію на 12,10%-24,00% (р<0,05) і фосфору - на 4,35%-26,78% (р<0,05). У щурів першої групи всіх вікових груп відбувається зростання у кістковому регенераті кількості натрію і калію на 4,00%-11,10% (р<0,05), що ми оцінюємо як збільшення накопичення рідини у кістковому регенераті великогомілкових кісток за умов техногенного мікроелементозу організму.

Як показують подальші дослідження, на 24-ту добу після перелому у тварин першої групи у регенераті зберігаються значні ділянки незрілої кісткової тканини, що свідчить про зниження активності процесу компактизації і диференціювання кісткової речовини (особливо у тварин старечого віку) порівняно з контролем, де переважає зріла пластинчаста кісткова тканина. У деяких трабекулах грубоволокнистої кісткової тканини містяться безклітинні ділянки, осередки лізису, мікротріщини. Краї материнської кістки піддаються резорбції і в них можна спостерігати порожні остеоцитарні лакуни та мікротріщини. Регенерат повністю заповнює кістковий дефект, але між краями останнього і регенератом зберігається вільний простір, що свідчить про відсутність формування кортикальної пластинки між двома структурами, і, як наслідок, не відбувається відновлення анатомічної цілісності кістки як органа.

Растрово-електронно-мікроскопічно встановлена наявність у тварин зрілого і старечого віку на періостальній поверхні кістки невідновленої заглибини від колишньої травми, хоча у тварин контрольної серії межа дефекту важко прослідковується.

Ультрамікроскопічне дослідження встановило, що у тварин першої групи молодого віку спостерігається помірне зниження електронної щільності ядерного матриксу остеобластів. Мітохондрії мають щільний осміофільний матрикс і містять велику кількість крист. У тварин зрілого віку в остеобластах зберігаються дистрофічні зміни, а у субмікроскопічній організації остеобластів тварин старечого віку визначаються виражені дистрофічні зміни органел з елементами деструктивних порушень. Так, ядра остеобластів мають витягнуту форму, просвітлений матрикс, конденсований хроматин і ділянки лізису ядерної мембрани. Перинуклеарна ділянка цитоплазми заповнена аморфними масами з низькою електронною щільністю і в ній в основному відсутні органели. У тварин зрілого віку мітохондрії мають округлу форму з деяким збільшенням кількості крист порівняно з попереднім терміном спостереження, а матрикс зберігає грубоволокнисту структуру. Також зустрічаються мітохондрії з кристами, які піддаються лізису, а у щурів старечого віку кристи мітохондрій піддаються тотальному лізису, а їх матрикс є електронно-прозорим. Залишаються суттєво розширені цистерни гранулярного ендоплазматичного ретикулума, а на його мембранах практично відсутні рибосоми. Пластинчастий цитоплазматичний комплекс Гольджі слабо розвинутий. У цитоплазмі дуже часто спостерігаються вторинні лізосоми і незначна кількість рибосом і полісом. Вищезазначене свідчить про значні патологічні зміни остеобластів, які особливо виражені у щурів старечого віку.

Дослідженням механічних властивостей посттравмованих великогомілкових кісток тварин молодого, зрілого і старечого віку встановлено, що їх міцність знижується і до кінця експерименту становить лише 57,91% (р<0,05), 63,47% (р<0,05) і 63,80% (р<0,05) при розриві, 43,78% (р<0,05), 63,60% (р<0,05) і 52,21% (р<0,05) при стисканні та 67,21% (р<0,05), 70,14% (р<0,05) і 74,94% (р<0,05) при випробуванні на згин порівняно з контрольними показниками. Результати кінетичного індентування інтермедіарної частини регенерату свідчать також про наявність достовірних змін мікротвердості та жорсткості. Так, показник мікротвердості є нижчим за контроль на 19,11% (р<0,05), 19,47% (р<0,05) і 19,13% (р<0,05), а модуль пружності знизився на 17,50% (р<0,05), 16,00% (р<0,05) і 18,36% (р<0,05) відповідно.

Зменшення показників міцності, твердості і жорсткості великогомілкових кісток та їх регенерату супроводжується зниженням мінеральної фази і остеотропних макроелементів кальцію і фосфору з одночасним підвищенням натрію, калію і вільної води. У тварин молодого, зрілого і старечого віку виявлена кореляції між відсотком мінерального компонента кісток і межею міцності на розрив (r=0,837; 0,774; 0,795), стиск (r=0,924; 0,851; 0,944) та згин (r=0,87; 0,921; 0,955). Вміст кальцію у кістковій частині регенерату також має позитивний кореляційний зв'язок середньої сили з мікротвердістю (r=0,578; 0,573; 0,570) і модулем Юнга (r=0,538; 0,736; 0,588).

Для корекції виявлених змін репаративної регенерації кістки нами вибраний фармакологічний препарат діаліпон, діючими речовинами якого є альфа-ліпоєва і дигідроліпоєва кислоти, які згідно з даними Praffly здатні утворювати хелатні сполуки з іонами свинцю, міді, цинку, марганцю, заліза і виводити їх з організму, що дуже важливо у нашому експерименті. Крім цього, згідно з літературними джерелами (В.К. Мазо и др., 2009; А.В. Скальный 2004; Т.В. Плетенёва и др., 2008) можна стверджувати, що окрема негативна дія на організм надлишкової кількості або дефіциту таких важких металів, як марганець, залізо, мідь, цинк і свинець, в основному може бути пов'язана з їх прооксидантною властивістю. Тому в цьому випадку, на наш погляд, дуже важливими є висновки "батька-засновника" теорії антиоксидантів, лауреата Нобелівської премії доктора Lester Packer про альфа-ліпоєву кислоту, який назвав її ідеальною антиоксидантною речовиною.

Введення діаліпону в організм експериментальних щурів викликає суттєві зміни в обміні мікроелементів кісткової тканини. Було встановлено, що у діафізі травмованих великогомілкових кісток концентрація свинцю і заліза у щурів молодого, зрілого і старечого віку на 24-ту добу після перелому знизилася на 65,91% (р<0,05), 56,34% (р<0,05), 56,45% (р<0,05) і 29,90% (р<0,05), 39,44% (р<0,05), 49,73% (р<0,05) порівняно з тваринами першої групи. Одночасно вміст марганцю, міді і цинку збільшився на 33,50% (р<0,05), 21,74% (р<0,05), 47,93% (р<0,05) у першому, на 153,80% (р<0,05), 98,30% (р<0,05), 86,40% (р<0,05) - у другому і на 43,76% (р<0,05), 61,14% (р<0,05), 77,60% (р<0,05) - у третьому випадку.

На тлі введення діаліпону у тварин експериментальної серії відбувалось активування регенераторного процесу порівняно з тваринами, які препарат не отримували. При цьому вже на 3-тю добу після перелому гістологічно відмічено, що репаративна регенерація великогомілкових кісток відбувається на тлі менш вираженої запальної інфільтрації, про що свідчить зменшення кількості нейтрофілів у тварин молодого, зрілого і старечого віку на 30,88% (р<0,05), 27,78% (р<0,05) і 25,76% (р<0,05) та збільшення кількості фібробластів - на 13,32% (р<0,05), 27,03% (р<0,05) і 28,27% (р<0,05) відповідно. У тварин молодого і зрілого віку ультрамікроскопічно виявляються малозмінені лімфоцити і фібробласти, які мають добре розвинуті ультраструктури, що свідчить про високу метаболічну активність цих клітин. У тварин старечого віку також не спостерігаються суттєві зміни в ультраструктурі клітин регенерату порівняно з тваринами першої групи, але в деяких випадках визначаються дистрофічні зміни лімфоцитів, про що свідчать наявність розпушеної ядерної мембрани, поодиноких крист мітохондрій і просвітлення їх матриксу. Позитивні зміни, які відбулися на першій стадії репаративного остеогенезу внаслідок використання діаліпону, покращили умови і якість загоєння кісткового дефекту у подальші терміни регенерації.

Так, на 10-ту добу відбувалося помітне посилення кістково-регенераторного процесу у дефекті великогомілкових кісток. Про це свідчить інтенсивне збільшення у тварин молодого, зрілого і старечого віку маси кісткової складової регенерату на 36,02% (р<0,05), 16,28% (р<0,05) і 25,01% (р<0,05) при відповідному зменшенні частки грануляційної сполучної тканини - на 14,81% (р<0,05), 16,08% (р<0,05) і 12,18% (р<0,05). У групі тварин, яким вводили антиоксидантний фармакологічний препарат діаліпон, на 15-ту добу визначається значуще збільшення відсотка кісткової частини регенерату, кількість якої порівняно з тваринами першої групи збільшується на 25,02% (р<0,05), 13,22% (р>0,05) і 30,75% (р<0,05). Остання територія регенерату представлена фіброретикулярною і грануляційною сполучними тканинами, площа яких зменшилася на 12,52% (р<0,05), 3,27% (р>0,05) і 8,90% (р>0,05) у першому і на 10,60% (р>0,05), 13,80% (р<0,05) і 16,05% (р>0,05) - у другому випадках. Крім цього, у всі терміни спостереження на тлі приймання діаліпону кісткова частина регенерату не тільки збільшується в об'ємі, але й стає більш мінералізованою, про що свідчить збільшення кількості кальцію на 10,65% - 24,35% і фосфору - на 2,59% - 28,66% з одночасним зменшенням у ній концентрації натрію і калію на 2,19%-11,21%.

Таким чином, було виявлено, що під впливом діаліпону відбувається прискорення репаративного остеогенезу, причому у тварин молодого і зрілого віку воно більш виражене, ніж у тварин старечого віку.

Растрово-електронно-мікроскопічно на 10-15-ту добу вздовж кісткових балочок розташовуються первинні остеобласти полігональної форми, ультраструктурна організація яких у тварин молодого і зрілого віку свідчить про високу метаболічну активність органел, про що свідчить наявність ядерної мембрани з чіткими контурами і дрібними інвагінаціями в остеобластах тварин молодого віку. Ядра містять великі осміофільні ядерця. Цитоплазматична мембрана є чіткою, без ділянок лізису. Визначається добре розвинутий ендоплазматичний ретикулум. На мембранах ендоплазматичної сітки виявляються численні рибосоми, що свідчить про їх високу біосинтетичну активність. Пластинчастий цитоплазматичний комплекс Гольджі добре розвинутий, стопки паралельно орієнтованих гладеньких мембран оточені значною кількістю дрібних електронно-прозорих вакуолей. Мітохондрії остеобластів мають електронно-прозорий матрикс. Зовнішні мембрани і кристи зберігають типову структуру. Ядра остеобластів у тварин зрілого віку також мають чітку ядерну мембрану. Мітохондрії мають середню електронну щільність і дрібногранулярну структуру. В ультраструктурній організації остеобластів щурів старечого віку деструктивних змін внутрішньоклітинних мембран і органел не виявлено, але зберігаються дистрофічні зміни. Ядерна мембрана з глибокими інвагінаціями, осміофільна, має ділянки розпушення. У центральній частині ядра визначаються електронно-прозорі ділянки матриксу, а на 15-ту добу у внутрішній частині ядра спостерігаються електронно-щільні ядерця. Матрикс мітохондрій має неоднорідну електронну щільність, його кристи розпушені. У щурів зрілого віку у цитоплазмі остеобластів спостерігаються сильно розширені, а у тварин старечого віку - сплющені цистерни і гіперплазія мембран ендоплазматичної сітки, на поверхні яких міститься велика кількість рибосом. Пластинчастий цитоплазматичний комплекс Гольджі у двох вікових групах суттєво гіпертрофований, а його гладенькі мембрани оточені великою кількістю дрібних везикул.

На 24-ту добу після перелому більш високим виявляються значення параметрів, які вказують на активність процесів компактизації і диференціювання кісткової речовини, тобто переважає частка саме зрілого кісткового регенерату, особливо у тварин молодого віку, з деяким відставанням в цьому процесі тварин старечого віку. Між регенератом і безостеоцитарними краями материнської кістки відновлюються надійні зв'язки. Ультраструктурна організація остеобластів набуває типової будови. Ядерна мембрана чітко контурована. Більша частина хроматину знаходиться у деконденсованому стані. Мітохондрії у тварин зрілого віку набувають дрібнозернистого матриксу, мають контуровану зовнішню мембрану і велику кількість крист, а у тварин старечого віку мітохондрії залишаються набряклими, де містяться електронно-прозорий матрикс і невелика кількість крист. Пластинчастий цитоплазматичний комплекс Гольджі являє собою стопки паралельно орієнтованих мембран, які оточені великою кількістю дрібних електронно-прозорих везикул. Цистерни гранулярної ендоплазматичної сітки сплющені. На їх мембранах визначається велика кількість рибосом. Таким чином, на тлі приймання діаліпону остеобласти регенерату великогомілкових кісток мають високу метаболічну активність. Остеоцити регенерату також характеризуються типовою ультраструктурою.

Позитивна динаміка на тлі приймання діаліпону у тварин усіх вікових груп відбувається і з боку біомеханічних властивостей кісток, про що свідчить збільшення середнього значення межі міцності на 115,40% (р<0,05), 48,22% (р<0,05) і 74,32% (р<0,05) при стисканні, на 58,84% (р<0,05), 44,22% (р<0,05) і 36,48% (р<0,05) - при розриві і на 39,63%, 29,78% (р<0,05) і 24,63% (р<0,05) - при згинанні порівняно з тваринами першої групи. Первинне зрощення переломів великогомілкових кісток у тварин, які приймали фармакологічний антиоксидантний препарат діаліпон, також характеризується поступовим відновленням пружно-пластичних властивостей інтермедіарної частини кісткового регенерату на 24-ту добу після перелому. Значення мікротвердості як показника, що відображає високе вдосконалення кісткової тканини з біомеханічної точки зору збільшилося на 19,09% (р<0,05), 18,20% (р<0,05) і 13,90% (р<0,05), а модуль пружності - на 15,65% (р<0,05), 13,54% (р<0,05), і 16,03% (р<0,05). Ураховуючи зв'язки біомеханічних властивостей кісток зі ступенем їх мінералізації, виявлено, що нормалізація кісткової міцності діафізу великогомілкових кісток щурів молодого, зрілого і старечого віку на тлі приймання діаліпону поєднувалася зі змінами його композитного складу: кількість вільної води зменшилася на 22,00% (р>0,05), 24,00% (р>0,05) і 21,30% (р<0,05) при одночасному збільшенні мінеральної фази - на 16,40% (р>0,05), 14,81% (р<0,05) і 10,37% (р<0,05).

Таким чином, дослідження корекції техногенного мікроелементозу організму дозволило визначити, що препарат діаліпон здатен корелювати якісний склад есенціальних макро- і мікроелементів у кістковій тканині під час її репаративної регенерації, внаслідок чого відбулося активування процесів внутрішньоклітинного метаболізму остеобластів, прискорився процес загоєння кісткової рани у вигляді формування більш зрілого регенерату і відновилися біомеханічні функції кістки як органа порівняно з тваринами першої групи.

Висновки

регенераторний біомеханічний мікроелементоз діаліпон

У дисертації представлене рішення актуального наукового завдання, присвяченого особливостям репаративного остеогенезу великогомілкових кісток та їх біомеханічних властивостей в умовах впливу надлишкової кількості солей важких металів, та підтверджена можливість корекції виявлених змін антиоксидантним фармакологічним препаратом.

1. Протікання репаративного остеогенезу у контрольних тварин відбувається у чотири стадії і закінчується відновленням анатомічної цілісності і функції великогомілкових кісток. Різниця між різними віковими групами полягала у швидкості репаративних процесів, тобто в динаміці збільшення кількості та зрілості кісткової частини регенерату і зменшення частки сполучної тканини, які найбільш виражені у тварин молодого віку. Максимальні значення біомеханічних показників спостерігаються у тварин зрілого віку, а найменші показники твердості та жорсткості мали тварини молодого віку. Мікроелементний склад діафізу великогомілкових кісток характеризується збільшенням у ньому з віком міді і свинцю при одночасному зменшені марганцю, заліза і цинку.

2. Надмірне надходження важких металів до організму тварин призводить до розвитку техногенного мікроелементозу організму, який характеризується складною динамікою кількісних змін мікроелементів у кістковій тканині: кількість свинцю і заліза у експериментальних тварин усіх вікових груп була вищою за контроль на 281,00%-593,00%; 91,70%-326,00%, а концентрація марганцю, міді і цинку - нижчою на 30,70%-45%; 52,70%-65,85%; 42,97%-93,55% відповідно, що пов'язано з антагоністичними взаємовідношеннями між названими елементами.