Культура клітин людини як альтернативний метод в комплексній токсиколого-гігієнічній оцінці сполук важких металів

17

Размещено на http://www.allbest.ru

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ МЕДИЦИНИ ПРАЦІ

НАМН УКРАЇНИ»

МАРЧЕНКО Марина Леонідівна

УДК 519.6+546.3+576.345

КУЛЬТУРА КЛІТИН ЛЮДИНИ ЯК АЛЬТЕРНАТИВНИЙ МЕТОД В КОМПЛЕКСНІЙ ТОКСИКОЛОГО-ГІГІЄНІЧНІЙ ОЦІНЦІ СПОЛУК ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

14.02.01 - гігієна та професійна патологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в ДУ «Інститут медицини праці НАМН України».

Наукові керівники:

доктор медичних наук, професор, академік НАМН України, член-кореспондент НАН України Трахтенберг Ісак Михайлович, ДУ «Інститут медицини праці НАМН України», завідувач лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Кудрявець Юрій Йосипович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу експериментальних клітинних систем.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Шафран Леонід Мойсейович, ДП «Український НДІ медицини транспорту МОЗ України», керівник відділу гігієни та токсикології;

кандидат медичних наук, доцент Паустовський Юрій Олександрович, доцент кафедри гігієни праці і професійних хвороб Національного медичного університету імені О. О. Богомольця МОЗ України.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ДУ «Інститут медицини праці НАМН України» (м. Київ, вул. Саксаганського, 75).

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

доктор медичних наук Д. В. Варивончик

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В сучасних токсикологічних та фармакологічних лабораторіях нашої країни застосовують переважно in vivo методи дослідження хімічних речовин з експериментами на тваринах. Більше того, як підкреслювалось на сесії загальних зборів Академії медичних наук колишнього СРСР, а пізніше на ряді інших наукових форумів, що досліди на тваринах залишаються в наш час найкращим, а часто єдиними допустимим методом виявлення токсичного ефекту і зміна такої практики у майбутньому є маловірогідною [І.М. Трахтенберг, 1991]. Але зростання обсягів виробництва хімічних речовин, які відповідають потребам різних галузей народного господарства, і недостатня ефективність класичних методів дослідження їх токсичності та небезпечності, виступи захисників тварин за скорочення використання тварин в наукових експериментах - фактори, що обумовили розвиток нових напрямків у санітарно-гігієнічній оцінці хімічних речовин [Ю.О. Паустовський, 1996, 2001; Ю.І. Кундієв, 2003]. Цьому також сприяв стрімкий розвиток таких медико-біологічних наук, як біохімія, молекулярна біологія та генна інженерія. Таким чином, останніми роками в світі все помітнішою стає тенденція якщо не до переважного, то до значно більшого використання в практиці токсикологічного експерименту дослідів in vitro [А.Г. Рєзников та співавт., 2003; Н.М. Дмитруха та співавт., 2007]. Це можна пояснити не тільки тим, що дослідження токсичності речовин in vitro повністю відповідають сучасним моральним та етичним нормам, але й тим, що вони є більш економічними, потребують менше часу та розкривають багато процесів, які залишаються непомітними в умовах досліду in vivo [J. Fentem et al., 2001]. клітина людина органний важкий метал

Вищезазначене обумовило зростання інтересу токсикологів, гігієністів, фармакологів до дослідження токсичності хімічних речовин в умовах in vitro, вдосконалення методології цих досліджень, математично-статистичної обробки результатів та способів їх екстраполяції на живий організм [Ю.Й. Кудрявець, 2007; Н.О. Бездєнєжних, 2010].

В лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин ДУ «Інститут медицини праці НАМН України» вже протягом трьох десятиліть активно досліджується та вирішується проблема токсичності важких металів та їх сполук, оскільки саме вони представляють постійну небезпеку в зв'язку з тим, що являються найпоширенішими забруднювачами навколишнього середовища, здатними надовго накопичуватись у ґрунті, воді, живих організмах [І.М. Трахтенберг та співавт., 1998; Л.М. Шафран, 2002; Н.М. Дмитруха, 2010]. Раніше експериментальні дослідження токсичності важких металів проводилися на різних лабораторних тваринах, але останнім часом в наукових працях співробітників цієї лабораторії, де вивчались механізм токсичної дії металів та роль цитопротекторів, були використані і окремі експерименти на моделях культур клітин in vitro [К.П. Козлов, 2004; Н.М. Дмитруха, 2007].

В найближчому майбутньому значно зросте потенційний вплив синтетичних наноматеріалів на людину, як за умов виробництва, так і в повсякденному житті, що пов'язано зі стрімким зростанням їх застосування на виробництві, в народному господарстві та побуті, а також з розвитком медичних технологій та досліджень, які використовують нанотехнології. На сьогоднішній день значно бракує інформації, яка б характеризувала потенційні ризики, що можуть бути пов'язані із застосуванням синтетичних наночастинок та наноматеріалів для здоров'я людини та навколишнього середовища. В зв'язку з цим все більшу увагу токсикологів та гігієністів привертає проблема розробки підходів та методів токсиколого-гігієнічної оцінки наночастинок [S. Kaluza et al., 2009]. Наночастинки та наноматеріали різняться за розмірами та морфологією частинок, дисперсією, питомою поверхнею, магнітними властивостями, поверхневим зарядом, провідністю, поверхневим шаром, що безпосередньо впливає на ступінь їх токсичності [І.С. Чекман, 2010]. Це є приводом для розробки диференційних підходів до оцінки токсичної дії наночастинок та наноматеріалів на етапі запобіжного санітарного нагляду. За таких умов методи дослідження токсичності в культурі клітин дають можливість швидко отримати попередні дані про механізми дії наночастинок, загальну та органну токсичність в залежності від їхніх характеристик. Про необхідність попередньої оцінки властивостей наночастинок та наноматеріалів на біологічних моделях in vitrо підкреслюють і російські науковці [Г.Г. Онищенко, 2007; А.В. Глушкова, 2010].

Сказане свідчить про актуальність досліджень, присвячених визначенню ефективності використання методу культури клітин на етапах токсиколого-гігієнічної оцінки та інформативності даних, отриманих в токсикологічних експериментах in vitrо, для прогнозування ступеня токсичного ефекту при дії сполук важких металів та наночастинок металів на рівні цілісного організму людини та тварин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у лабораторії промислової токсикології та гігієни праці при використанні хімічних речовин ДУ «Інститут медицини праці НАМН України» у відповідності до плану науково-дослідних робіт Інституту за фундаментальними темами «Альтернативні методи в сучасній токсикології та їх використання в комплексній оцінці токсичної дії сполук важких металів» (2007-2009 рр., державний реєстраційний № 0107U000838), де пошукувач була виконавцем фрагменту роботи з визначення цитотоксичної дії сполук важких металів на культурі клітин та «Порівняльна токсичність мікро- і наночастинок свинцю в експериментах in vitro та in vivo (до проблеми удосконалення принципів і методів токсиколого-гігієнічних досліджень важких металів)» (2010-2012 рр., державний реєстраційний номер № 0107U000838), де виконувала фрагмент стосовно визначення впливу наночастинок сульфіду свинцю на клітини людини різного органного походження in vitro.

Мета дослідження: наукове обґрунтування застосування моделі культур клітин людини в системі комплексної токсиколого-гігієнічної оцінки сполук важких металів.

Завдання дослідження: за умов гострої експозиції культур клітин людини in vitro сполуками важких металів:

1. Дослідити загальну цитотоксичну дію сполук важких металів (хлориду ртуті - HgCl₂, сульфату кадмію - CdSO₄, сульфату марганцю - MnSO₄ та ацетату свинцю - Pb (CH₃COO)₂·3H₂O із застосуванням методу культури клітин людини in vitro.

2. Визначити цитологічні тести, при комбінуванні яких можна достовірно розрахувати основні показники цитотоксичного впливу in vitrо сполук важких металів.

3. Обґрунтувати адекватність культур клітин людини, вибраних для дослідження органної токсичності сполук важких металів in vitro та оцінити отримані результати.

4. Дослідити цитотоксичні властивості сполук важких металів в моделі ко-культур клітин людини.

5. Визначити максимальні концентрації солей важких металів, які не викликають цитотоксичного ефекту, із застосуванням моделі культури клітин людини.

6. Оцінити ступінь цитотоксичності наночастинок металів (срібла, міді, молібдену) та сульфіду свинцю із застосуванням методу культури клітин.

7. Провести аналіз порівняння результатів досліджень цитотоксичного впливу сполук важких металів на культури клітин in vitro з показниками токсичної дії для щурів in vivo та обґрунтувати можливість застосування альтернативних методів досліджень в токсиколого-гігієнічній оцінці хімічних речовин.

Об'єкт дослідження: клітини недрібноклітинного раку легені людини - лінія А-549, імморталізовані нормальні кератиноцити людини - лінія HaCaТ, нормальні фібробласти людини, епітеліальні клітини карциноми печінки людини - лінія клітин HepG2, клітини епітеліальної морфології колоректального раку людини - лінія Colo-205, ембріональні клітини нирки людини - лінія 293, нейробласти нейробластоми людини - лінія клітин IMR-32, клітини гліобластоми-астроцитоми людини - лінія клітин U-373.

Предмет дослідження: показники цитотоксичної дії при гострій експозиції солями важких металів (хлорид ртуті, сульфат кадмію, сульфат марганцю, ацетат свинцю) та наночастинками металів (молібдену, міді, срібла) культур клітин людини in vitro.

Методи дослідження: культивування клітин, цитологічні, цитогенетичні, токсикологічні, статистичні.

Основними джерелами інформації були: наукові публікації, ресурси Internet, міжнародні інформаційні та медико-статистичні бази даних «PubMed», в яких викладені результати досліджень токсичної дії сполук важких металів в умовах in vivo та in vitro; дані ECVAM, де описані протоколи методів дослідження токсичності хімічних речовин in vitro, EPA щодо характеристики токсичної дії сполук важких металів, US Research Nanomaterials Inc., RAIS USA (Toxicity profiles), NIOSH USA щодо токсичного профілю наночатинок металів, дані Федеральної агенції охорони здоров'я США щодо баз даних токсичних речовин та їх дії на організм людини, результати досліджень цитотоксичної дії солей важких металів на культури клітин людини ліній: А-549, HaCaT, Colo-205, HepG2, 293, IMR-32 та нормальних фібробластів людини; вивчення цитотоксичної дії солей важких металів в моделі ко-культур (лінії клітин А-549, HaCaT, HepG2, IMR-32); вивчення генотоксичної дії солей важких металів на культурі клітин лінії А-549; дослідження цитотоксичної дії наночастинок металів в культурі клітин людини (лінії клітин А-549, HaCaT, Colo-205, U-373, дослідження гострої токсичності для щурів при внутрішньочеревному введенні їм солей важких металів, матеріали математично-статистичної і аналітичної обробки результатів досліджень

Наукова новизна результатів досліджень полягає в тому, що вперше в Україні:

– науково обґрунтована та експериментально доведена можливість, доцільність та ефективність застосування культури клітин людини як тест-об'єкту при санітарно-гігієнічній оцінці токсичності хімічних речовин на прикладі солей - HgCl₂, CdSO₄, MnSO₄, Pb (CH₃COO)₂·3H₂O та наночастинок металів - Mo, Cu, Ag;

– проведено порівняльний аналіз показників цитотоксичності важких металів для різних культур клітин, у тому числі первинних ліній клітин ретикуло-ендотеліальної системи та органотипових культур з показниками токсичності, отриманими в експерименті in vivo на щурах, в результаті чого показана їх відповідність величинам, що характеризують цитотоксичний вплив in vitrо;

– уперше продемонстрована можливість використання органоспецифічних культур клітин людини в системі ко-культур, що дозволяє дослідити органи-мішені, взаємодію органів та систем при експозиції важкими металами;

– за допомогою комбінування мікроядерного тесту з тестами, що визначають загальну цитотоксичну дію, знайдені максимальні концентрації солей важких металів in vitro, які не викликають цитотоксичного ефекту за умов гострої експозиції.

Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що:

– отримані результати досліджень можуть бути використані токсикологами, фармакологами, а також фахівцями-гігієністами для визначення орієнтовних величин ЛД₅₀ при проведенні токсикологічного експерименту із застосуванням тварин, що дозволяє значно скоротити кількість тварин в експерименті та час досліджень на етапі токсиколого-гігієнічної оцінки речовин;

– запропонована модель культур органоспецифічних клітин людини дозволяє вивчення органної токсичності ксенобіотиків;

– можливо в короткі строки оцінити токсичну дію нових сумішей вже відомих речовин із застосуванням культури клітин людини на етапі їх токсиколого-гігієнічної оцінки;

– використання моделі культури клітин людини в токсиколого-гігієнічній оцінці дозволяє швидко та ефективно провести моніторинг хімічних речовин.

Результати дослідження впроваджені в практику охорони здоров'я:

1. На галузевому рівні: розроблено інформаційний лист Міністерства освіти і науки України «Культури клітин як «in vitro» - модель для дослідження гострої токсичності важких металів» (№ 07-09, 2009 р.), інформаційні листи МОЗ України «Метод оцінки гострої токсичності наночастинок металів на моделі культур клітин in vitro» (№ 48-2011, 2011 р.), «Метод оцінки гострої токсичності наночастинок металів різних розмірів на моделі культур клітин А-549» (№ 49 - 2011, 2011 рр.), «Метод оцінки гострої токсичності солей важких металів з використанням моделі мультиорганної системи токсичності ксенобіотиків на основі ко-культивування клітин людини in vitro» № 50-2011, 2011 р.).

Матеріали дисертаційної роботи використовуються: Інститутом експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, ДП «УкрНДІ медицини транспорту МОЗ України», Львівським національним медичним університетом (кафедра гігієни праці та профілактичної токсикології), Національним університетом біоресурсів і природокористування України (науково-дослідний інститут здоров'я тварин), Національним медичним університетом імені О.О. Богомольця МОЗ України (кафедра гігієни праці і професійних хвороб), що підтверджується актами впровадження.

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто планувала та виконувала наукові дослідження в рамках зазначеної теми: провела цитологічні дослідження в культурі органоспецифічних клітин людини та встановила показники органної токсичності солей важких металів та наночастинок металів in vitrо; запропонувала і розробила модель ко-культур органоспеціфічних клітин людини для оцінки токсичності сполук важких металів та вивчення впливу взаємозв'язків між клітинами різних органів у відповідь на токсичну дію; провела аналіз первинного матеріалу та статистичну обробку отриманих даних; здійснила теоретичне узагальнення результатів та їх порівняння з даними літератури, підготовку матеріалів результатів досліджень та ілюстративного матеріалу для їх публікації; сформулювала основні наукові положення та висновки дисертації. Разом із керівниками дисертаційної роботи академіком І.М. Трахтенбергом та к. б. н. Ю.Й. Кудрявцем сформулювала основні ідеї та завдання дисертаційної роботи. Разом із Н.О. Бездєнєжних, Н.М. Дмитрухою та Т.М. Короленко було визначено напрямок та проведено частину експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на:

1. Міжнародних симпозіумах і науково практичних конференціях: українсько-німецькому симпозіумі з фізики та хімії наночастинок та нанотехнологій (АР Крим, 2010 р.).

2. Національних конгресах, конференціях, форумах: конференції молодих вчених ДУ «Інститут медицини праці НАМН України» (Київ, 2006 р.), Третьому національному конгресі з біоетики (Київ, 2007 р.), науковому форумі, присвяченому 170-річчю кафедри фармакології та клінічної фармакології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця (Київ, 2011 р.).

3. Засіданнях та нарадах: Вченої ради ДУ «Інститут медицини праці НАМН України» (протокол № 2 від 07.02.2008 р.), Проблемної комісії МОЗ та НАМН України «Гігієна праці та професійні захворювання» (протокол № 4 від 06.02.2008 р.), Комісії з біоетики ДУ «Інститут медицини праці НАМН України» (протоколи № 1 від 14.01.08 р., № 4 від 19.10.2010 р. та № 4 09.06.2011 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з яких 5 статей у фахових виданнях, затверджених ВАК України, 2 статті у інших наукових виданнях та 3 тези доповідей у збірках наукових форумів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 148 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу матеріалів і методів дослідження, 3-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел, який включає 164 посилання, у тому числі 40 - вітчизняних та 124 зарубіжних. Дисертаційна робота ілюстрована 19 рисунками, 7 мікрофотографіями та 18 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження із застосуванням моделі культури клітин людини in vitrо при дії солей важких металів - HgCl₂, CdSO₄, MnSO₄, Pb (CH₃COO)₂·3H₂O та наночастинок сульфіду свинцю та металів - Mo, Cu, Ag, представлені в дисертації, складалися з 5 серій:

1. Порівняння показників цитотоксичності солей важких металів за результатами тестів з метилтіазолілтетразолієм, нейтральним червоним та сульфородоміном-В.

2. Порівняння показників цитотоксичної дії солей важких металів на культури клітин різного органного походження in vitro.

3. Дослідження цитотоксичної дії сполук важких металів із застосуванням моделі мультиорганної системи токсичності ксенобіотиків на основі ко-культивування клітин людини in vitrо.

4. Визначення максимальної концентрації при дії солей важких металів, яка не викликає цитопатичного ефекту в культурі клітин in vitro.

5. Дослідження цитотоксичної дії наночастинок металів в культурі клітин людини.

Сучасні експрес-методи in vitro дають можливість визначити показники цитотоксичного впливу ксенобіотиків, наприклад: кількість мертвих клітин (тест на цитотоксичність), кількість живих клітин (тест на життєздатність), механізм загибелі клітин (пошук маркерів апоптозу). Окрім того, можна вивчати і специфічні показники: здібність живої клітини абсорбувати барвник нейтральний червоний, що безпосередньо демонструє лізосомальну активність (тест з нейтральним червоним) [ECVAM, 2011]; визначати загальний білок, який синтезується живою клітиною за тестом із сульфородаміном В [P. Shekan et al., 1989]; виявляти активність дихальних ферментів мітохондрій за допомогою тесту з метилтіазолілтетразолієм [D. Scudiero et al., 1988; NIEHS, 2001].

Вважається, що необхідно використовувати 2-3 різних тести, щоб з достатньою вірогідністю підтвердити отримані результати [R. Azzi, 2006].

Для багатьох важких металів порушення функцій мітохондрій, лізосом, ендоплазматичного ретикулуму клітини - є одним із перших проявів їхнього цитотоксичного впливу [І.М. Трахтенберг, 2002; E.A. Belyaeva et al., 2004; Л.М. Шафран та співавт., 2004]. З цього погляду для порівняння токсичної дії сполук важких металів на культури клітин людини були обрані три методи оцінки життєздатності та ступеня пошкодження внутрішньоклітинних функцій, які згадувалися вище: тест з метилтіазолілтеразолієм (МТТ), нейтральним червоним (НЧ) та з сульфородаміном В (СРВ).

Об'єктами дослідження були: 1. Клітини недрібноклітинного раку легені людини - лінія А-549. 2. Імморталізовані нормальні кератиноцити людини - лінія HaCaТ. 3. Нормальні фібробласти людини. 4. Епітеліальні клітини карциноми печінки людини - лінія HepG2. 5. Клітини епітеліальної морфології колоректального раку людини - лінія Colo-205. 6. Ембріональні клітини нирки людини - лінія 293. 7. Нейробласти нейробластоми людини - лінія IMR-32. 8. Клітини гліобластоми-астроцитоми людини - лінія U-373. Всі клітинні лінії отримані з клітинного банку ліній Інституту експериментальної патології, онкології та радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України.

Досліджували цитотоксичну дію таких солей та наночастинок металів: CdSO₄хН₂О (масова доля основної речовини - 98,18 %), MnSO₄хН₂О (масова доля основної речовини - 99,6 %), HgCl₂ (масова доля основної речовини - 99,6 %) та Pb (СН₃СОО)₂х3Н₂О (ацетат, масова доля основної речовини - 99,78 %) («Хімлабореактив», Україна); колоїдні розчини наночастинок металів (розмір - 70-100 нм) в деіонізованій воді: срібла, міді, молібдену, колоїдні розчини наночастинок та мікрочастинок сульфіду свинцю (PbS) розмірами: від 26 до 34 нм, від 50 до 80 нм, 100 та 200 нм в поліфосфатному буфері, які отримані методом ерозивно-вибухового диспергування (ТОВ «Наноматеріали і нанотехнології», Україна). Розміри наночастинок були встановлені методом лазерної кореляційної спектроскопії в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України науковим співробітником Горчевим В.Ф.

Для дослідження чутливості клітин до впливу солей та наночатинок важких металів суспензію клітин висаджували на 96-лункові пластикові планшети в концентрації 5х10³ - 1х10⁴ клітин/лунка в 100 мкл середовища RPMI-1640 з глютаміном 2мМоль /л (SIGMA, USA), що містило 10 % ембріональної сироватки теляти (SIGMA, USA) та 40 мкг/мл гентаміцину (Біофарма, Україна). Через 24 години інкубації в стандартних умовах при температурі 37^оС та 5 % вмістом СО₂ в повітрі вносили досліджувані речовини в широкому діапазоні концентрацій методом 2-кратних розведень: солі металів (CdSO₄, MnSO₄, HgCl₂ та Pb (СН₃СОО)₂х3Н₂О), наночастинки (срібла, міді, молібдену та сульфіду свинцю). Знову інкубували клітини за стандартних умов 24 години, після чого проводили тести з метилтіазолілтетразолієм [D. Scudiero et al., 1988], сульфородаміном B [P. Shekan et al., 1989] та барвником нейтральним червоним [ECVAM, 2011].

Цитотоксичну дію досліджуваних речовин для кожної концентрації оцінювали по виживаності клітин (у % до контрольних клітин, життєздатність яких приймалась за 100 %).

Мікроядерний тест. Мікроядерний тест проводили з метою визначення генотоксиної дії досліджуваних солей металів [А.И. Свирновский c соавт., 1998]. Цитогенетичні препарати аналізували за допомогою бінокулярного мікроскопу Сarl Zeiss при збільшенні у 1000 разів. Ядерні аномалії фотографували за допомогою цифрового фотоапарата Canon (PowerShot G6, Great Britain). Частоту виявлення пседвометафазних клітин, клітин на стадії поділу, клітин з мікроядрами, апоптозних клітин, ядер з різноманітними ядерними протрузіями і «хвостатих» ядер розраховували на 1000 клітин в промілях (‰). Статистичну достовірність відмінностей оцінювали за критерієм (t_S) Ст'юдента [А.И. Свирновский, 1998].

З метою відтворення клініки гострого отруєння і для визначення ЛД₅₀ безпородним білим щурам обох статей масою 190 - 230 г внутрішньочеревно вводили вибрані концентрації розчинів солей важких металів (у деіонізованій воді). Групі контрольних щурів вводили 0,9 % розчин натрію хлориду. Спостереження за тваринами проводили протягом 14 днів. Ступінь токсичності вказаних хімічних речовин в залежності від введених концентрацій оцінювали за зміною загального стану тварин та летальністю. Усі експерименти проводили у віварії ДУ «Інститут медицини праці» НАМНУ, який обладнаний відповідно існуючих санітарно-гігієнічних норм. Усіх дослідних тварин утримували в стандартних санітарних умовах при t = 20-24 ^oС, вологості 50-55 %, природному світловому режимі «день-ніч», на збалансованому харчовому раціоні відповідно до діючих норм. Усі дослідження проводили з дотриманням правил «Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей».

Статистична обробка: результати виконаних досліджень обраховані з використанням загальновизнаних методів статистичної обробки даних медико-біологічних досліджень за допомогою Microsoft Office Excel 2007.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Визначення показників цитотоксичної дії солей важких металів із застосуванням моделі культури клітин. При визначенні показників цитотоксичної дії солей важких металів, встановлених за допомогою тестів з метилтіазолілтетразолієм, нейтральним червоним та сульфородіміном В для культур епітеліоподібних клітин аденокарциноми легень людини - А-549, нормальних кератиноцитів - HaCaT та клітин нервової тканини - IMR-32 було показано, що хлорид ртуті та ацетат свинцю порівняно більше знижували активність мітохондріальних дегідрогеназ досліджуваних клітин, сульфат кадмію зменшував рівень синтезу в них білка, сульфат марганцю порушував структуру мембран лізосом.

В цілому за допомогою кореляційного аналізу виявлено, що тести, за допомогою яких встановлені показники цитотоксичного впливу сполук важких металів в культурі клітин і, які визначають ступінь порушення функцій дихальних ферментів мітохондрій, мембран лізосом та синтезу загального білка в клітині, не відрізняються між собою за чутливістю, демонструючи однаковий дозо-залежний ефект на культуру клітин при експозиції солями важких металів (табл. 1).

Для вирішення питання застосування найпростіших клітинних моделей in vitro, завдяки яким можна було б швидко та достовірно з'ясувати, які органи в першу чергу піддаються ураженню в умовах гострої експозиції солями важких металів, підбиралися культури клітин тих органів та систем, які представляють шляхи можливого надходження ксенобіотика в живий організм та тих, що першими приймають участь у детоксикації та елімінації речовини [Б.А. Курляндський, 2002]. З погляду на зазначене, для дослідження були відібрані лінії клітин людини - легенів, шкіри, товстої кишки, печінки, нирок, нервової тканини та нормальні фібробласти (останні знаходяться в сполучній тканині усіх органів та систем організму).

Таблиця 1

Коефіцієнти кореляції (r) між показниками тестів з СРВ, МТТ та НЧ для клітин ліній А-549, HaCaT, IMR-32 після впливу на них солей важких металів

Солі металів	Лінії клітин	Тести
		СРВ та МТТ	МТТ та НЧ	СРВ та НЧ
Хлорид ртуті (ІІ)	А-549	0,97	0,99	0,98
	HaCaT	0,96	0,72	0,78
	IMR-32	0,77	0,9	0,84
Сульфат кадмію	А-549	0,95	0,92	0,87
	HaCaT	0,96	0,98	0,97
	IMR-32	0,85	0,98	0,9
Сульфат марганцю	А-549	0,97	0,86	0,9
	HaCaT	0,93	0,91	0,93
	IMR-32	0,95	0,93	0,97
Ацетат свинцю	А-549	0,98	0,94	0,9
	HaCaT	0,77	0,8	0,89
	IMR-32	0,92	0,92	1

Примітки: коефіцієнти кореляції достовірні при р < 0,05; тести з СРВ - тест з сульфородаміном В; МТТ - тест з метилтиазолілтетразолієм; НЧ - тест з нейтральним червоним.

При порівнянні середніх показників ЕС₅₀, отриманих для досліджуваних культур клітин, після впливу хлориду ртуті, було виявлено, що при гострій експозиції на протязі 24 годин, найбільшу чутливість до вказаного чинника проявили клітини: нирок, ЕС₅₀ - 0,005±0,0007 мг/мл (лінія клітин 293); печінки, ЕС₅₀ - 0,006±0,0008 мг/мл (лінія клітин HepG2); шкіри, ЕС₅₀ - 0,01±0,002 мг/мл (лінія клітин HaCaТ) та легенів, ЕС₅₀ - 0,012±0,001 мг/мл (лінія клітин - А-549). У гострому досліді в культурі клітин хлорид ртуті проявляв найменший цитоксичний вплив щодо клітин нервової системи (ЕС₅₀ - 0,16±0,01 мг/мл). Результати, отримані в дослідах in vitrо, підтвердились і даними наукової літератури, де вказано, що при гострій інтоксикації хлоридом ртуті in vivo спостерігаються масивні некрози тканин шлунку, товстого кишечника, гострий тубулярний некроз нирок, ураження печінки, дерматит, пари ртуті викликають пошкодження слизової оболонки носу та легень. У тканинах головного мозку характерних змін при гострому отруєнні не знаходили, в деяких випадках відмічали набряк [І.М. Трахтенберг, 1996; М.Н. Коршун, 1998; А.Л. Бандман, 1998].

Дослідження цитотоксичної дії сульфату кадмію in vitro показали, що його токсичний вплив проявляється практично на однаковому рівні для усіх культур клітин. Найбільшу чутливість до солі кадмію виявили клітини печінки (лінія клітин HepG2) та нирок (лінія клітин 293). Показник ЕС₅₀ для них склав - 0,01±0,002 мг/мл, найменшою цитотоксичноста дія сульфату кадмію була по відношенню до культур клітин шкіри та кишечника (лінії клітин HaСaТ, Colo-205): ЕС₅₀ - 0,03±0,002 мг/мл та 0,03±0,004 мг/мл, відповідно. Експерименти іn vivo, в цьому випадку, також повністю підтверджують дані, що отримані в культурі клітин. Сульфат кадмію має тенденцію до довготривалого накопичення саме в печінці та нирках організму людини [Р. Лудевиг, 1983; А.Л. Бандман, 1998]. При гострому отруєнні сполуками кадмію виявляють ознаки гострого гастроентериту, пригнічується діяльність нервової системи, швидкого ураження всіх органів та систем [Р. Лудевиг, 1983; А.Л. Бандман, 1998; ЕРА, 2010]. При вивченні подразнюючої дії 2 % розчину хлориду кадмію на шкіру, було встановлено, що він практично не виявляє негативного впливу на шкірні покриви [WHO, 1992].

Аналіз результатів досліджень цитотоксичності сульфату марганцю в гострому ескперименті in vitro показав, що вказана сполука має виражену органоспецифічну дію. Так, найбільша токсичність сульфату марганцю в досліді in vitro виявлена щодо нормальних фібробластів людини (ЕС₅₀ = 0,03±0,004 мг/мл). Достатньо виразна пошкоджуюча дія сульфату марганцю проявилася і по відношенню до культури клітин нирок (лінія клітин 293), де ЕС₅₀ = 0,17±0,01 мг/мл, культури клітин нервової тканини (ІMR-32), де показник ЕС₅₀ склав 0,16±0,004 мг/мл та кишечника (Colo-205), ЕС₅₀ - 0,19±0,02 мг/мл. Меншого впливу при гострій експозиції сульфатом марганцю зазнали клітини легенів (А-549), ЕС₅₀ - 0,3±0,05 мг/мл та печінки (HepG2), ЕС₅₀ - 0,4±0,04 мг/мл. Клітини шкіри людини виявилися найбільш стійкими до дії сульфату марганцю (ЕС50 - 0,5±0,05 мг/мл). Аналізуючі ці дані, можна зробити попередній висновок про те, що крізьшкірний шлях надходження сульфату марганцю до організму при цілісних шкірних покровах не є першочерговим. Дані клінічних обстежень також показують, що при гострих отруєннях сульфатом марганцю у хворого виявляють різке запаморочення свідомості як результат токсичної дії на ЦНС, задуху, подразнення слизових оболонок дихальних шляхів (може розвиватися легенева лихоманка) та очей, болі в животі, блювання, діарею (симптоми ураження шлунково-кишково тракту) [D.C. Dorman et al., 2004]. З експериментів на щурах відомо, що сульфат марганцю швидко пошкоджує клубочки нирок [D.C. Dorman et al., 2004].

Найбільш чутливими до дії ацетату свинцю виявилися клітини кишечника (лінія клітин Colo-205), ЕС50 - 0,38±0,004 мг/мл та печінки (лінія клітин HepG2), ЕС₅₀ - 0,5±0,02 мг/мл. За даними клінічних обстежень сполука в першу чергу ушкоджує печінку, шлунково-кишковий тракт (cвинцеві коліки) та ЦНС [J.I. Rader et al., 1981; А.Л. Бандман, 1988].

Таким чином, за величиною цитопатичної дії на культури клітин досліджувані солі металів можна ранжирувати у такому порядку НgCl₂ > СdSO₄ > MnSO₄ > > Pb (CH₃COO)₂.

У наступній серії експериментів було відтворення моделі міжорганної системи токсичності (МОСТ) на основі ко-культивування in vitro органоспецифічних клітин стандартизованих ліній. Використання описаної МОСТ дає можливість порівняти показники токсичності в моделі, подібній до умов цілісного організму. В основі реалізації МОСТ лежить ко-культивування клітин в луночках планшет, які поєднані між собою отворами, що виключає можливість прямого контакту між клітинами різних тканин, але при цьому всі види клітин в системі об'єднані одним поживним середовищем.

Було встановлено, що при вмісті сульфату кадмію в концентрації 0,025±0,002 мг/мл у необ'єднаних лунках, найбільш чутливими до цитотоксичної дії цієї сполуки виявились гепатоцити (HepG2), загибель яких у культурі досягала 75 %, і нейробласти (IMR-32). В той же час клітини легенів і шкіри були відносно резистентні. При ко-культивуванні токсичність сульфату кадмію залишалась подібною для всіх клітин окрім кератиноцитів (HaCaT), чутливість яких достовірно зростала.

На відміну від сульфату кадмію, сульфат марганцю у концентрації 0,2±0,03 мг/мл викликав загибель 50±5 % нервових клітин та 29±4 % клітин печінки в необ'єднаних лунках. У випадку з сульфатом марганцю спостерігається незначне зниження життєздатності клітин легенів і шкіри та помітне збільшення життєздатності клітин в культурах нервової тканини і печінки (більше 75 % клітин) в моделі ко-культур порівняно з культурами клітин, що знаходились окремо. Очевидно, що більш стійкі клітини легені і шкіри, життєздатність яких незначно знижувалась при вказаній концентрації солі марганцю, розподілили між собою детоксикаційну функцію, внаслідок чого гепатоцити змогли повністю подолати токсичне навантаження в системі та відновитися.

В експерименті in vivo дуже актуальним питанням залишається не тільки визначення показника токсичності ЛД₅₀, але й порогової дози, яка не викликає токсичних ефектів. Тому подібне дослідження було проведене in vitro на культурах клітин з метою отримання показника NOEC (максимальна концентрація речовини в поживному середовищі, яка не викликає токсичних ефектів). Ця концентрація була встановлена для клітин лінії А-549 за допомогою тестів на загальну цитотоксичну дію та мікроядерного тесту, який дає можливість характеризувати загальну токсичну та генотоксичну активність речовини [О.В. Турченюк, 2006].

Концентрації солей важких металів, які викликали 30 % загибелі клітин (за результатами тестів на загальну цитотоксичність), впливали на стабільність хромосомного апарату досліджуваних клітин (табл. 2).

Всі солі металів інгібували проліферацію клітин і викликали збільшення виявлення частоти клітин з мікроядрами у порівнянні з контролем, що свідчить про генотоксичність досліджуваних речовин (табл. 2). Останнє узгоджується з даними Л.Ю. Жулева (2000) та Л.П. Січева (2007). Під час експозиції солями важких металів максимальними концентраціями (для хлориду ртуті (ІІ), сульфату кадмію, сульфату марганцю та ацетату свинцю - 0,001±0,0001 мг/мл; 0,004±0,0006 мг/мл; 0,008±0,0004 мг/мл; 0,016±0,002 мг/мл, відповідно), при яких не проявлялася їхня загальна цитотоксичність, не відбувалося достовірних змін в ядерному апараті та порушень проліферації клітинної лінії А-549.

Таблиця 2

Цитогенетичний аналіз клітин лінії А-549 після 24-часової експозиції солями металів в концентраціях ЕС₃₀ (‰) (M+m)

Досліджувані солі металів	Псевдометафазні клітини	Клітини з мікроядрами	Апоптоз	Мітоз	Ядерні протрузії	Хвостаті ядра
Контрольні клітини	1,0±0,06	8,3±1,2	0,3±0,03	4,0±0,2	8,6±1,7	5,3±0,3
Сульфат марганцю	0,7±0,03	15,3±0,9*	1,7±0,3*	1,3±0,3*	10,7±0,9	21,3±0,9*
Хлорид ртуті	0,7±0,03	13,0±1,0*	0,7±0,04	2,7±0,3**	11,0±2,0	5,3±0,3
Ацетат свинцю	1,7±0,2**	13,3±3,2**	9,7±0,9*	1,7±0,3*	33,0±2,0*	7,0±1,0
Сульфат кадмію	0	9,0±2,0	5,3±0,3*	0,3±0,3*	17,0±1,5*	33,0±5,8*

Примітки: * - рівень достовірних змін р < 0,01 порівняно з клітинами в контролі; ** - рівень достовірних змін р < 0,05; без зірочки - немає достовірних змін порівняно з контролем.

Дослідження цитотоксичної дії наночастинок металів на культури клітин людини. Дослідження цитотоксичності наночастинок міді в культурі клітин показали, що вони викликали найбільшу загибель альвеліоцитів (лінія клітин А-549) в концентраціях від 0,0032 до 0,063 мг/мл та епітеліоподібних клітин кишечника (лінія клітин Colo-205) в концентраціях від 0,0125 до 0,063 мг/мл, що узгоджується з даними вивчення гострого токсичного ефекту наночастинок міді на мишах [Zhen Chen et al., 2006], де було виявлено, що вони мають високу подразнюючу дію на слизові оболонки шлунково-кишкового та респіраторного трактів, викликають метаболічний алкалоз.

Вивчення цитотоксичності наночастинок срібла показало, що вони проявляли найменший пошкоджуючий ефект на клітини лінії U-373 (нервової тканини), а в концентраціях від 0,004 до 0,016 мг/мл спостерігався навіть достовірно стимулюючий вплив на вказані клітини при порівнянні з контролем. Дія наночастинок срібла призводила до негативного впливу на клітини лінії А-549 та Colo-205 (легенів та кишечника) в концентраціях від 0,016 до 0,125 мг/мл. По відношенню до кератиноцитів (лінія HaCaT) наночастинки срібла проявляли помірний цитотоксичний ефект.

У науковій літературі описано факт, що у індійських робітників, які працювали з дорогоцінними металами (в повітрі робочої зони були присутні в значній кількості наночастинки срібла) знаходили виражене запалення слизової оболонки кишечника [R.P. Nagender, 2008].

У експерименті по дослідженню впливу на культури клітин наночастинок молібдену виявлено, що найбільший цитотоксичний ефект був по відношенню до клітин шкіри та легенів (HaCaT та А-549). Однак, дія наночастинок молібдену у концентраціях від 0,0004 до 0,19 мг/мл на клітини кишечника та нервові (Colo-205 та U-373) не вела до цитотоксичного ефекту. Навпаки, в концентраціях від 0,006 до 0,095 мг/мл відзначався достовірно стимулюючий вплив наночастинок молібдену на епітеліоцити кишечника та нервової тканини.

Наночастинки молібдену відомі подразнюючою дією на шкірні покрови, слизові оболонки респіраторного шляху та очей при інгаляційному надходженні з повітрям у концентраціях більше 5 мг/дм³ в робочій зоні [US Research nanomaterials Inc., 2011].

Дослідження цитотоксичності наночастинок сульфіду свинцю в залежності від їхнього розміру в культурі клітин А-549 показали, що в концентраціях від 0,0001 до 0,024 мг/мл найбільший пошкождуючий вплив на клітини чинили частинки розміром від 26 до 34 нм, порівняно менший токсичний ефект проявляли наночастинки розміром від 50 до 80 нм. Частинки сульфіду свинцю, які мали розміри 100 нм та 200 нм, практично не відрізнялися за показниками цитотоксичного впливу, і ці показники були значно нижчими у порівнянні з частинками менших розмірів. Рівень цитотоксичного впливу наночастинок був обернено пропорційний їхнім розмірам (рис. 1).



Рис. 1. Порівняння показників цитотоксичності наночастинок сульфіду свинцю розміром 26-34, 50-80, 100, 200 нм та мікрочастинок ацетату свинцю розміром 3,3-4,5 мкм по відношенню до клітин ліній А-549

Використання показників цитотоксичності, отриманих в культурі клітин in vitrо, при прогнозуванні показників токсичного впливу in vivo для цілісного організму. Завершальним етапом роботи став аналіз та порівняння даних токсикологічних та клінічних обстежень in vivo з даними отриманими в культурі клітин in vitro. Порівняння показників цитотоксичності солей важких металів для культур клітин людини, величини ЛД₅₀ для щурів та летальних концентрацій для людини свідчить, що показники токсичності in vivo відповідають показнику ЕС₅₀ для клітин in vitro, які відносяться до тих органів та систем організму, які приймають участь в процесах детоксикації та метаболізму (печінки, нирки, легень), а також тих, що мають функції регуляції життєдіяльності всього організму (нервова тканина) (табл. 3). Встановлено, що реакція клітинних ліній різного тканинного походження на дію ксенобіотиків in vitro в цілому відповідає такій, що спостерігається у відповідних органах і тканинах організму людини in vivo.

Таблиця 3

Показники ЛД₅₀ для щурів при внутрішньочеревному введені, ЕС₅₀ для культур клітин людини та смертельні концентрації для людини при дії солей важких металів (М+m)

Солі металів	Лінії клітин людини	ЛД50, мг/кг (щури)	ЛК для людини, мг/кг*, **
	А-549	HaCaT	Colo-205	Фібробласти	HepG2	293	IMR-32
	ЕС50, мг/л (дм3)
Хлорид ртуті	12±1	10±2	34±4	45±3	6±0,8	5±0,7	160±10	4,8±0,9	8-42
Сульфат кадмію	25±3	30±2	30±4	12±3	10±2	10±2	20±3	13±4	20-30
Сульфат марганцю	300±50	500±50	190±3	30±4	400±40	170±30	160±4	204±36	100-150
Ацетат свинцю	1000±200	2000±300	380±4	1000± 100	500±20	3000±300	1800±200	446±66	650-740

Примітки: * - дані Agency for Toxic Substances and Disease Registry, (USA, 1989); ** - «Острые отравления: руководство для врачей» (Е.А. Лужников и соавт., 1989).

Показники токсичності наночастинок металів in vivo, також відповідали величинам ЕС₅₀ для клітин культур найбільш чутливих до впливу досліджуваних речовин in vitro (табл. 4).

Таблиця 4

Показники токсичності наночастинок металів in vivo та ЕС50 для культур клітин людини in vitro після їх експозиції наночастинками металів (М+m)

Наночастинки металів	Срібло	Мідь	Молібден
Лінія клітин HaCaT, EC50, мг/л	80±4	30±5	160±5
Лінія клітин А-549, EC50, мг/л	27±5	11±0,8	200±5
Лінія клітин Colo- 205, EC50, мг/л	13±1	22±3	більше 200
Лінія клітин U- 373, EC50, мг/л	97±4	40±5	більше 200
Показники токсичності in vivo	10 мг/л *	7-15 мг/кг**	125-370 Мо мг/кг ***

Примітки: ^*- небезпечна для життя або здоров'я концентрація наночастинок срібла у повітрі за умов одноразової дії (IDLH - immediately dangerous for life or heealth concentration) за даними NIOSH (Національного інституту безпеки праці та охорони здоров'я США); ^** - ЛД50 для мишей при внутрішньоперитоніальному введені наночастинок міді з різними характеристиками поверхні від 33 до 100 нм за даними Богословської О.А. та співавт. (2009); ^*** - ЛД50 для щурів за даними інформаційної системи з оцінки ризику університету Теннесу (США).

Це клітини лінії А-549 (легені) та Colo-205 (кишечник) при дії наночастинок срібла та міді, а також клітини лінії HaCaT (шкіра), які були найбільш вразливими при експозиції наночастинками молібдену (табл. 4).

Таким чином, при оцінці цитотоксичної дії солей важких та наночастинок металів з використанням культур клітин як методу, який є альтернативним експериментам на тваринах, була виявлена відповідність отриманих результатів показникам токсичного впливу цих речовин, визначених в дослідах на тваринах in vivo та даним клінічної практики.

ВИСНОВКИ

На прикладі сполук важких металів у дисертації розв'язана одна із актуальних проблем токсиколого-гігієнічної оцінки - застосування моделі культури клітин людини як методу, що є альтернативою дослідженням токсичності хімічних речовин на тваринах:

1. Науково обґрунтована та експериментально доведена можливість, доцільність та ефективність застосування моделі культури клітин людини для визначення показників загальної токсичної дії в практиці токсиколого-гігієнічної оцінки солей важких металів - HgCl₂, CdSO₄, MnSO₄, Pb (CH₃COO)2·3H₂O та наночастинок металів - Mo, Cu, Ag.

2. Встановлено, що тести на визначення показників цитотоксичного впливу сполук важких металів в культурі клітин in vitrо за ступенем порушення функцій дихальних ферментів мітохондрій, мембран лізосом та синтезу загального білка в клітині, не відрізняються між собою за чутливістю. Це доводить можливість та доцільність комбінування вказаних тестів для отримання достовірної інформації про токсичний вплив речовин із застосуванням моделі оцінки токсичності в культурі клітин in vitro.

3. Доведено, що показники цитотоксичної дії солей важких металів по відношенню до органоспецифічних клітин, отримані в дослідах in vitro, відповідають даним органної токсичності цих речовин в експериментах на тваринах in vivo та клінічної практики.

4. Застосування якісно нової моделі ко-культивування клітин різного тканинного походження для оцінки токсичної дії солей важких металів продемонструвало, що при значному ураженні клітин печінки (більше 70 %) знижувалась життєздатність культур клітин інших органів в досліджуваній системі при дії сульфату кадмію. При гострій експозиції культур органоспецифічних клітин сульфатом марганцю в моделі ко-культур, коли кількість життєздатних клітин печінки була більшою 70 %, зростала стабільність усієї системи ко-культур. Використання мультиорганної моделі ко-культур клітин на етапі токсиколого-гігієнічної оцінки речовин дає можливість дослідити взаємодію органів і систем та визначати органи-мішені при експозиції хімічними речовинами.

5. Показано, що солі важких металів в концентраціях, які викликають 30 % загибелі клітин, проявляють генотоксичний ефект за показниками мікроядерного тесту: кількість клітин з мікроядрами, апоптичних клітин, ядерних протрузій, хвостатих ядер. Досліджені сполуки важких металів інгібують проліферацію клітин і викликають збільшення частоти клітин з мікроядрами у порівнянні з контролем, що свідчить про генотоксичність досліджуваних речовин. Комбінування тестів, що дозволяють встановити загальну цитотоксичну та генотоксичну активність хімічної речовини в культурі клітин in vitro дає можливість визначити спрямованість дії сполук металів та установити їх максимальні концентрації, які не викликають цитопатичного впливу в умовах гострої експозиції - для хлориду ртуті (ІІ), сульфату кадмію, сульфату марганцю та ацетату свинцю - 0,001±0,0001 мг/мл; 0,004±0,0006 мг/мл; 0,008±0,0004 мг/мл; 0,016±0,002 мг/мл, відповідно.

6. Вивчення цитотоксичної дії наночастинок металів в культурі органоспецифічних клітин людини показало, що найбільший пошкоджуючий вплив наночастинки міді, срібла та молібдену чинили на клітини легенів. Таким чином, можна припустити, що легені є органом-мішенню при експозиції наночастинками металів in vivo. Рівень цитотоксичної дії наночастинок металів зворотно пропорційний величині їх частинок.

7. Результати аналізу та порівняння даних експериментів, проведених in vitro в культурі клітин, in vivo на щурах та клінічної практики, продемонстрували, що показники ЕС50 найбільш чутливих до дії досліджуваних сполук органоспецифічних клітин відповідали показникам ЛД50 для щурів та смертельним концентраціям вказаних речовин для людини. Дослідження цитотоксичної дії сполук важких металів із застосуванням моделі культури клітин людини різного органного походження дозволяє за результатами, визначеними in vitrо, прогнозувати особливості та рівень токсичної дії вказаних речовин для тварин та людини.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Статті в наукових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України:

1. Марченко М. Л. Порівняльна характеристика цитотоксичного впливу сполук важких металів на клітини людини, культивовані in vitrо // М. Л. Марченко, Н. О. Бездєнежних, Ю. Й. Кудрявець // Український журнал з проблем медицини праці. - 2008. - № 3 (15). - С. 27-34. - Марченко М. Л. - проаналізувала дані досліджень цитотоксичного впливу сполук важких металів на культури клітин, написала статтю.

2. Кудрявець Ю. Й. Підвищення чутливості пухлинних клітин людини до цитотоксичних чинників в умовах пролонгованої дії інтерферону in vitro / Ю. Й. Кудрявець, Н. О. Бездєнежних, М. Л. Марченко // Современные проблемы токсикологи. - 2008. - № 4. - С. 20-26. - Марченко М. Л. - проаналізувала дані цитотоксичного впливу сполук важких металів на клітини лінії А-549, модифіковану тривалою дією інтерферону.

3. Переваги методу дослідження токсичного впливу сполук важких металів в культурі клітин людини in vitro порівняно з традиційним методом in vivo на тваринах як більш достовірного та адекватного / І. М. Трахтенберг, М. Л. Марченко, Н. О. Бездєнєжних, Ю. Й. Кудрявець // Современные проблемы токсикологи. - 2010. - № 2-3. - С. 69-73. - Марченко М. Л. - проаналізувала результати дослідження цитотоксичного впливу сполук важких металів на культури клітин людини та порівняла їх з показниками гострої токсичності для щурів, провела пошук літератури.

4. Марченко М. Л. Вивчення цитотоксичної дії наночастинок металів на культурі клітин людини в експериментах in vitro / М. Л. Марченко, Н. О. Бездєнєжних, М. Фахмі // Український журнал з проблем медицини праці. - 2011. - № 1 (25). - С. 63-70. - Марченко М. Л. - проаналізувала результати дослідження цитотоксичного впливу наночастинок металів на культури клітин людини.

5. Удосконалена модель мультиорганної системи токсичності ксенобіотиків на основі ко-культивування клітин людини in vitro / І. М. Трахтенберг, Ю. Й. Кудрявець, М. Л. Марченко, Н. О. Бездєнєжних, М. Фахмі // Современные проблемы токсикологии. - 2011. - № 1-2. - С. 60-64. Марченко М. Л. - проаналізувала результати дослідження цитотоксичної дії сполук важких металів в ко-культурі клітин людини.

...