Регенерація травмованого периферичного нерва під впливом біофлавоноїдів (експериментально-морфологічне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 616.833-089.85-003.93:|615.31:577.115.3

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

РЕГЕНЕРАЦІЯ ТРАВМОВАНОГО ПЕРИФЕРІЙНОГО НЕРВА ПІД ВПЛИВОМ БІОФЛАВОНОЇДІВ (ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-МОРФОЛОГІЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ)

14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія

ХРАПАЙ ОЛЕНА ВОЛОДИМИРІВНА

КИЇВ 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України

Науковий керівник: член-кореспондент НАМН України, доктор медичних наук, професор Чайковський Юрій Богданович, завідувач кафедри гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України

Офіційні опоненти:

Геращенко С.Б., доктор медичних наук, професор, завідувач кафедри гістології, цитології та ембріології Івано-Франківського національного медичного університету МОЗ України.

Квітницька-Рижова Т.Ю., доктор біологічних наук, професор, зав.лабораторією морфології та цитології Інституту геронтології НАМН України.

Захист відбудеться “______”_______________2011р. о ________годині на засіданні спеціалізованої ради при Національному медичному університеті імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, пр-т Перемоги, 34, морфологічний корпус).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного медичного університету імені О.О. Богомольця МОЗ України (03057, м. Київ, вул.. Зоологічна, 1)

Автореферат розіслано “______”_______________2011р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. Порушення функціонування органів внаслідок травмування периферичний нервів, проблема їх хірургічного та терапевтичного лікування залишаються актуальними та значущими в сучасній неврології. Важливість цієї великої медико-соціальної проблеми пояснюється тимчасовою, а в деяких випадках і повною втратою працездатності осіб молодого і середнього віку [Бабиченко Е.И., 1984; Говенько Ф.С., 1995; Богов А.А., 1997; Дергачев В.В., 1998; Гусейнова С.Г., 2000; Алексеева Е.Б., 2003; Цимбалюк Ю.В., 2005; Гончарук О.О., 2005; Гусева В.И., 2005; Хамзаев Р.И., 2009; Buhroo A.M., 2003; Kim D.H., 2003, 2004; Garosso D., 2004].

Протягом останніх десятиріч безперервно зростає інтерес до дослідження механізмів і закономірностей де- і регенерації ушкоджених периферичних нервів [Акоев Г.Н., 1989; Грабовий О.М., 2000; Головченко Ю.И., 2002; Щудло Н.А., 2001; Вахненко Д.С. 2002; Алексеева Е.Б., 2003; Науменко Л.Ю., 2010; Stephanian E., 1992; Samii M., 1994]. При вивченні цієї проблеми існує два основні аспекти, які стосуються ушкодження переферійних нервів. Перший полягає у вивченні факторів і чинників, які прискорюють процеси відновлення нерва, особливо в гострому періоді травми. Другий підхід полягає в пошуку і дослідженні факторів, що сповільняють або затримують розвиток процесів ушкодження, одночасно з цим суттєво прискорюючи процеси відновлення травмованих нервів [Hoke A., 2006].

На цей час розроблено кілька принципових шляхів впливу на регенерацію периферичного нерва після його травматичного ушкодження (хірургічні, терапевтичні, фізіотерапевтичні та інші) [Чайковський Ю.Б., 1988; Морозов И.С., 1994; Дергачев В.В., 1998; Фомин Г.Н., 1999; Горелова Ю.В., 1999; Пазиняк В., 2000; Козлов А.В., 2001; Цимбалюк Ю.В., 2005; Stephanian E., 1992; Haase S.C., 2000; Adelson P.D., 2004].

Не зважаючи на те, що застосування мікрохірургічної техніки та лікарських препаратів з різними механізмами дії дозволило досягти прогресу в лікуванні ушкоджень периферичних нервів, проте спостерігаються випадки не повного відновлення нервових стовбурів [Чистиченко С. А., 2005; Валерко В.Г., 2006; Федяков А.Г., 2009; Palatinsky E.A., 2001].

Існуючі методи лікування травматичного ушкодження периферичних нервів різноманітні, характеризуються недостатньою ефективністю і складають основу для подальшого пошуку нових і розробки інноваційних засобів лікування. Одним з таких засобів, на нашу думку, є кверцетин, ефективність якого була раніше показана при використанні в ранньому післяопераційному періоді травматичного ушкодження периферичного нерва [Чайковский Ю.Б., 1994].

Морфологічні дослідження дозволили встановити, що критичним фактором для регенерації нервів є формування сполучнотканинного рубця в ділянці травми нерва [Ломако Л.А., 1993; Цымбалюк В.И., 1998; Сокуренко Л.М., 2003; Валерко В.Г., 2006; Корсак А.В., 2008; Pleasure D., 1974; Hoke A., 2006; Alovskaya A., 2007]. Сполучна тканин, яка утворює і формує його основу, гальмує, ускладнює, або унеможливлює невротизацію дистального відрізка і відновлення функції тканин і органів. Це створило передумову пошуку фармакологічних засобів з направленим інгібуючим впливом на його утворення, що в свою чергу мало б сприяти регенерації та ремієлінізації осьових циліндрів.

Багато робіт присвячено вивченню механізму дії і ефективності клінічного використання різних груп медикаментозних засобів, які стимулюють ріст регенеруючих аксонів та відновлення нерва [Головченко Ю.И., 2002; Геращенко С.Б., 2005; Губенко В.П., 2005; Гусева В.И., 2005; Щедрина М.А., 2006; Мохамад К.Б., 2009]. Разом з тим, залишаються недостатньо вивченими особливості перебігу процесів запалення і утворення сполучної тканини при травмі периферичного нерва.

Це поставило перед дослідниками завдання пошуку нових способів вирішення цієї проблеми, та розробку сучасних методів доставки лікарських засобів в різні відділи регенеруючого нерва. Показано ефективність застосування кверцетину [Чайковський Ю.Б., 1994], ліпосомних препаратів [Губенко В.П., 2005], ліпіну [Сокуренко Л.М., 2003], поліненасичених жирних кислот [Корсак А.В., 2008]. Проте комбінованого застосування цих засобів та препаратів не виконували. Тому дослідження впливу препарату ліпофлавон, який представлений ліпосомною формою кверцетину є актуальним.

Оскільки для флавоноїдів (кверцетин та ін.) відомий механізм протизапальної та антиоксидантної дії та високий рівень безпеки, було доречно вивчити вплив кверцетину у ліпосомальній формі (препарат ліпофлавон), що забезпечує розчинність, біодоступність комплексу та можливість застосування при травмі периферичного нерва. Але ця проблема досить мало вивчена, існуючі літературні дані носять фрагментарний характер, що вимагає поглибленого і системного вивчення. Ці питання стали предметом дослідження нашої дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертацію виконано на кафедрі гістології та ембріології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця у відповідності до основного плану науково-дослідних робіт кафедри “Вивчення нервової, імунної систем та серця за умов дії екзогенних та ендогенних факторів ”, № держреєстрації 0109U000091.

Мета дослідження. Метою дослідження було встановлення особливостей регенерації нервових волокон травмованого нерва під впливом ліпофлавону та їх порівняльна характеристика із сумісним застосуванням корвітину з ліпіном за умов застосування власної моделі травматичного ушкодження нерва. Досягнення поставленої мети базувалось на вирішенні наступних головних задач:

1. Розробити експериментальну модель тяжкого ушкодження периферичного нерва, що супроводжується збільшенням розвитку сполучнотканинного рубця в ділянці травмування.

2. Вивчити особливості регенерації сідничого нерва щурів через 3, 6 та 12 тижнів після ушкодження за умов відтворення запропонованої експериментальної травми та наступного введення корвітину (К) з ліпіном (Л).

3. Вивчити особливості регенерації сідничого нерва щурів через 3, 6 та 12 тижнів після ушкодження за умов відтворення запропонованої експериментальної травми та наступного введення ліпофлавону (Лф).

4. Порівняти особливості регенерації сідничого нерва щурів через 3, 6 та 12 тижнів після ушкодження та експериментальної фармакотерапії К з Л та Лф. Визначити найбільш ефективний спосіб фармакологічної корекції відновлення травмованого нерва.

Об'єкт дослідження: регенерація трамвтично ушкодженого периферичного нерва та відновлення за умов застосування біофлавоноїдів.

Предмет дослідження: морфологічні зміни в сідничих нервах щурів за умов відтворення запропонованої експериментальної травми периферичного нерва, та при експериментальній фармакотерапії корвітином з ліпіном та ліпофлавоном.

Методи дослідження: нейрогістологічні (імпрегнація сріблом, забарвлення за Шпільмейєром), електронномікроскопічні, морфометричні та статистичні, що дало змогу дослідити особливості розвитку регенерації травмованого нерва та проаналізувати ефективність експериментальної фармакотерапії.

Наукова новизна одержаних результатів. Запропоновано модель тяжкого травматичного ушкодження периферичного нерва. Вперше вивчено та проаналізовано регенерацію нервових волокон в трьох відділах травмованого нерва (проксимальному, ділянці травматичного ушкодження, дистальному) за умов запропонованої експериментальної моделі.

Вперше в умовах запропонованої експериментальної моделі тяжкого травматичного ушкодження периферичного нерва було вивчено особливості регенерації нервових волокон у відділах травмованого нерва під впливом К з Л та Лф.

Практичне значення одержаних результатів.

Практичне значення одержаних результатів полягає в тому, що отримані дані покращення процесів і ефективність відновлення та регенерації периферичних нервів після їх ушкодження можуть бути враховані в клінічній практиці медичних закладів, що займаються проблемами нейропатології. Матеріали досліджень розширюють коло знань щодо процесів регенерації нервових стовбурів та способи впливу на процеси відновлення периферичного нерва.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведено вивчення фахової наукової літератури, визначено напрямок, мету і завдання дослідження, виконано експериментальні, морфологічні, морфометричні та статистичні дослідження. Аналіз отриманих результатів, формулювання висновків та написання рукопису кандидатської дисертації виконано автором самостійно. Автором підготовані статті, тези доповідей та патент на корисну модель.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали та положення дисертації повідомлено, обговорено на засіданні кафедри гістології та ембріології НМУ імені О.О. Богомольця, Всеукраїнській науково-практичній конференції «Інноваційні технології у експериментальній медицині та біології» (м. Полтава, 2010р.); Науково-практичній конференції “YouthNanoBioTech-2010. Молодіжний форум з НаноБіоТехнологій” (м. Київ, 2010р.); Науково-практичній конференції "Прикладні аспекти морфології", присв'ячена памяті проф. Б.В. Шутки (м. Івано-Франківськ, 2010р.); XIII-му Конґресі Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (СФУЛТ) (м. Львів, 2010р.); Сімпозіумі «Морфогенез органів та тканин під впливом екзогенних факторів» (м. Алушта, 2010р.); 64-й міжнародній науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Актуальні проблеми сучасної медицини» (м. Київ, 2010р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених «Медична наука-2010» (м. Полтава, 2010р.); V Міжнародній науковій конференції з питань стану та перспектив розвитку медицини у спорті найвищих «СпортМед-2010» (м. Москва, 2010р); Міжнародній конференції «Высокие технологии, фундаментальные и прикладнные исследования в медицине и физиологии» (м. Санкт-Петербург, 2010р.); журналі «Вісник морфології» (м. Вінниця, 2010р.); журналі «Український морфологічний альманах» (м. Луганськ, 2010р.); журналі «Клінічна анатомія та оперативна хірургія» (м. Чернівці, 2010р.); електронному журналі «Морфологія» (м. Дніпропетровськ, 2010р); І-ій всеукраїнській науково-практичній конференції «Морфологія людини та тварин» (м.Миколаїв, 2011р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 14 наукових праць, з них 8 статей і 6 тез у журналах і збірниках, рекомендованих переліком ВАК України; отримано патент на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 206 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків, списку використаної літератури, а також додатків. Список літератури складає 238 джерел, з них - 110 кирилицею та 128 латиницею.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводились на 84 білих щурах обох статей вагою 180-250г. Експериментальні тварини були розподілені на 10 груп. Тварини утримувались у стандартних умовах віварію, тобто в одному приміщенні і на стандартному брикетованому харчуванні. Обсяг проведених досліджень та їх розподіл по групах наведено в таблиці 1.

Всі досліджувані препарати і лікарські засоби вводили тваринам параневрально в ділянці нижньої третини стегна. Ліпофлавон (“Биолек”, Харків) вводили в дозі 0,1 мг/кг, корвітин (“Борщагівський хіміко-фармацевтичний завод”, Київ) - 0,2 мг/кг, ліпін (“Биолек”, Харків) - 0,1 мг/кг, лідокаїн (“Здоров'я”, Харків) - 0,1 мг/кг.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблиця 1. Загальний план експериментального дослідження.

Світлова мікроскопія. Фрагменти сідничого нерва фіксували в 10% нейтральному формаліні, зрізи нерва виконували на кріотомі МК-25 («Технолог» СССР) та імпрегнували азотнокислим сріблом, фарбували за методом Шпільмейєра та толуїдиновим синім [Коломийцев А.К. 1981; Меркулов Г.А., 1956] із подальшим вивченням на світлооптичному рівні.

Електронномікроскопічне дослідження. Ультратонкі зрізи одержували за загальноприйнятою методикою з невеликих фрагментів нерва на ультра томі Райхарт (Голландія), контрастували в 2% розчині уранілацетату в 70%-му етанолі протягом 30 хвилин і цитратом свинцю (стільки ж часу). Зрізививчали та фотографували в електронному мікроскопі ЕМ-400Т Philips (Голандія).

Морфометричне дослідження. Морфометричне дослідження було проведено за допомогою напівавтоматичного пристрою для обробки графічних зображень (UTHSCSA ImageTool, Version 2.0 (alpha 3) для Microsoft Windows 95, Windows NT). Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери на мікроскопі Olympus BX 51 (Японія).

Визначали такі показники: щільність нервових волокон в одиниці об'єму нерва (в тест-зоні розміром 1 мм³), середню площу поперечного зрізу нервового волокна (мкм²), середню площу поперечного зрізу осьового циліндру (мкм²), середню товщину мієлінової оболонки (мкм), середній кут відхилення нервових волокон від осі нерва (⁰). Препарати тонких і напівтонких зрізів фотографували за допомогою цифрової фотокамери та мікроскопу Olympus BX 51 (Японія).

Статистичну обробку результатів вимірів структур сідничого нерва проводили з використанням MS Excell (2007) та STATISTIKA 6.0. Порівняння отриманих результатів проводили за допомогою параметричного критерію Стьюдента. З метою порівняння кількості ламел в мієлінових оболонках використовували непараметричний критерій Вілкоксона.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дослідження змін сідничого нерва при використанні запропонованої моделі травмування. При дослідженні морфологічних змін в сідничому нерві щурів встановлено порушення регенерації нервових волокон на 12 тиждень після ушкодження. Зміни морфометричних показників відзначались зменшенням кількості регенеруючих нервових волокон до дистального відділу нерва. Щільність нервових волокон в дистальному відділі становила 4728,7±74,6 шт/мм³, в той час як в проксимальному 6699,7±78,2 шт/мм³ (де контроль 10505,0±109,2 шт/мм³, р<0,05). Це пов'язано із розвитком фіброзу в ділянках травматичного ушкодження. На периферії таких ділянок зустрічали один або декілька крупних пучків мієлінових волокон. В них нервові волокна були орієнтовані досить щільно, проходили вздовж осі нерва, проте мали звивисту форму і відхилялись від напрямку нерву. В ділянках фіброзу спостерігались спіралі Перрончіто, що свідчить про затримку та порушення регенерації нервових волокон. В дистальному відділі ушкодженого нерва навколо нервових волокон реєстрували окремі нейролемоцити та кровоносні судини. Нервові волокна були розташовані не щільно, а їхній поперечний переріз мав меншу площу в порівнянні з іншими (в дистальному 26,6±2,01 мкм², в проксимальному 54,2±2,62 мкм², де контроль 84,7±4,09 мкм², р<0,05), що також свідчить про порушення процесів регенерації. При електронномікроскопічному вивченні нервових волокно встановлено зміни ультраструктурної організації волокон, що характеризувались деформацією волокон та розшарування ламел мієліну. Встановлено суттєве зменшення кількості ламел мієлінових оболонок з 36,0±2,7 шт в проксимальному відділі до 29,2±2,5 шт в дистальному (де контроль 65,3±6,9 шт, р<0,05). В ділянці травмування та дистальному відділі відмічено ділянки із значною кількістю фібробластів та пучків колагенових волокон значних розмірів.

Отже, отримані результати свідчать, що невротомія сідничого нерва із додатковим розчавленням проксимального відділу суттєво пригнічує невротизації його периферійного відрізка. Осьові циліндри в більшій кількості регенерують в периферійний відрізок ушкодженого нерва біля поверхні зони травмування. В ділянках ушкодження розвивається сполучнотканинний рубець, що ускладнює, а в деяких випадках унеможливлює регенерацію нервових волокон в дистальний відділ, що знайшло своє відображення в морфометричних показниках.

Дослідження ефективності впливу комбінованого застосування Корвітину (К) із Ліпіном (Л). За умов застосування К з Л відбувалось збільшення регенерації нервових волокон на 12 тиждень порівняно з контрольними тваринами. В проксимальному відділі щільність нервових волокон становила 9596,4±84,2 шт/мм³ (р<0,05), а без лікування 6699,7±78,2 шт/мм³. У проксимальному відрізку нерва волокна були локалізовані більш рівномірно, проте також зустрічались спіралі Перрончіто, що свідчить про порушення регенерації окремих нервових волокон. В ділянці травмування встановлено збільшення щільності нервових волокон, але основна маса волокон регенерувала біля поверхні ушкодженого нерва. В місці невротомії утворились окремі сполучнотканинні рубці, що ускладнили проростання регенеруючих волокон, тому реєструвались поперечні та рекурентні волокна. Поліпшення процесів відновлення в цій зоні сприяли кращій регенерації дистального відділу. Щільність волокон в дистальному відділі становила 8547,46±113,8 шт/мм³ (р<0,05), в той час як у контрольних тварин 4728,7±74,6 шт/мм³. Регенеруючі осьові циліндри в більшій кількості проникають в периферійний відрізок, спостерігали більше зрілих нервових волокон, їх більш упорядковане розміщення, порівняно з групами без введення К з Л. регенерація нерв травмований ліпофлавон

При морфометричному вивченні збільшення площі поперечного зрізу мієлінових волокон і кількості ламел мієліну не відмічали. В проксимальному відділі площа нервових волокон становила 65,7±3,07 мкм², а без лікування 54,2±2,62 мкм², одночасно з цим в дистальному - 33,0±1,21 мкм² і 26,6±2,01 мкм² відповідно. Кількість ламел мієлінових волокон в дистальному відділі становила 30,20±4,0 шт, а без введення К з Л - 29,20±2,5 шт. При ультраструктурному вивченні фрагментів сідничого нерва також реєстрували розшарування ламел мієліну, відшарування мієлінових оболонок від осьових циліндрів та деформацію нервових волокон.

Таким чином, застосовуючи К з Л можна досягти позитивного результату в лікуванні травматичного ушкодження нерва. Ці лікарські засоби суттєво не вплинули на ступінь відновлення нервових волокон в травмованому нерва, оскільки особливості їх будови істотно не відрізнялись від нелікованих тварин, хоча кількість неушкоджених волокон була більшою. Позитивного впливу на сполучну тканину, а саме пригнічення утворення щільного рубця також не було досягнуто. Проте регенерація нервових волокон була пришвидшена.

Дослідження ефективності впливу застосування Ліпофлавону (Лф).

При використанні Лф встановлено суттєве збільшення регенерації нервових волокон в травматично ушкодженому нерві на 12 тиждень після ушкодження. Щільність розташування волокон в проксимальному та дистальному відділах досягала нормальних значень (в проксимальному 10891,0±140,2 шт/мм³ (р<0,05) і 10532,7±106,5 шт/мм³ (р<0,05) в дистальному, в той час як в контролі 6699,7±78,2 шт/мм³і 4728,7±74,6 шт/мм³ відповідно) (рис.1, 2). В проксимальному відрізку нерва волокна локалізовувались більш рівномірно, спіралей Перрончіто та затриманих колб росту не реєстрували, що свідчить про нормальний процес регенерації нервових волокон. В ділянці травмування суттєво збільшувалась щільність регенерації нервових волокон, що пов'язано із зменшенням фіброзу та формування сполучнотканинних рубців після травмування. Зменшення перешкод у вигляді рубців та процесів неоколагеногенезу поліпшувало регенерацію осьових циліндрів із проксимального в дистальний відділ.

Рис. 1. Зміна щільності розташування нервових волокон в проксимальному відділі ушкодженого нерва щура (12 тижнів). По осі абсцис - групи, по осі ординат - щільність нервових волокон в 1мм³.

Умовні позначення: 1 - травмований нерв, 2 - травма+лідокаін, 3 - травма+ліпін+корвітин, 4 - ліпофлавон. * - достовірно по відношенню до травми без лікування (p<0,05).

Рис. 2. Зміна щільності розташування нервових волокон в дистальному відділі ушкодженого нерва щура (12 тижнів). По осі абсцис - групи, по осі ординат - щільність нервових волокон в 1мм³.

Умовні позначення: 1 - травмований нерв, 2 - травма+лідокаін, 3 - травма+ліпін+корвітин, 4 - ліпофлавон. * - достовірно по відношенню до травми без лікування (p<0,05).

Електронномікроскопічне дослідження свідчили, що у тварин із використанням Лф збільшувалась кількість неушкоджених нервових волокон, відбувалось відновлення мієлінових оболонок та осьових циліндрів. Проте аналіз отриманих даних свідчив, що при високому ступеню регенерації нервових волокно не відбувалось повного відновлення морфометричних показників мієлінових волокон, які за показниками наближались до значень тварин, які не отримували фармакотерапію. Так кількість ламел мієліну в дистальному відділі становила 34,20±3,7 шт, а у контрольних тварин - 29,20±2,5 шт, проте достовірних відмінностей не встановлено.

Порівняльне дослідження регенерації сідничого нерва щурів на ранніх термінах (через 3 та 6 тижнів) після ушкодження із застосуванням К з Л та Лф.

При вивченні ушкодженого нерва на 3 тижні після ушкодження та застосування К з Л та Лф по всій довжині спостерігали процеси регенерації нервових волокон. В проксимальному відділі реєстрували регенеруючі нервові волокна, що були локалізовані між групами осьових циліндрів та окремих шванівських клітин. Аналіз результатів досліджень показав, що інтенсивність цього процесу відбувалась активніше при застосуванні Лф, оскільки щільність нервових волокон становила 10450,1±81,4 шт/мм³ (p<0,05), а при введенні К з Л 9250,6±121,3 шт/мм³. Одночасно з цим в дистальному відділі реєстрували подібну тенденцію (щільність волокон при застосуванні Лф становила 6948,0±145,1 шт/мм³ (p<0,05), а при К з Л - 6024,4±63,2 шт/мм³). Ефективність відновлення була пов'язана із пригніченням розвитку фіброзу в ділянці невротомії. Збільшення кількості сполучнотканинних елементів, окремих шванівських клітин та судин реєстрували в обох випадках фармакотерапії, проте при застосуванні Лф зменшувалось формування сполучнотканинних рубців, фіброзна тканина була більш ніжною. Це сприяло пенетрацї зони травмування та проростанню осьових циліндрів в дистальний відділ, що знайшло своє відображення у відхиленні регенеруючих волокон від вісі нерва. Так, в зоні травмування кут відхилення осьових циліндрів при введенні К з Л становив 30,9±1,3⁰, а після Лф - 22,1±1,7⁰(p<0,05), в дистальному відділі реєстрували подібну тенденцію (27,8±1,7⁰ і 15,3±0,8⁰ (p<0,05) відповідно).

При аналізі результатів дослідження фармакотерапії на 6 тижні спостерігався розвиток подібних процесів, що і на ранніх етапах. Збільшувалась регенерація осьових циліндрів в проксимальному відділі та ділянці невротомії під впливом Лф, що суттєво вплинуло на відновлення дистального відділу (щільність волокон становить 9071,2±90,4 шт/мм³ (p<0,05), а при застосуванні К з Л - 8188,8±58,1 шт/мм³). Візуально збільшувалась кількість кровоносних судин в ділянці ушкодження та прилеглих до дистального відділу ділянок, що сприяло регенерації нервових волокон.

Таким чином, використання на ранніх етапах регенерації (3 тижні) фармакотерапії поліпшує і забезпечує регенерацію нервових волокон ушкодженого нерва, що у віддаленні періоди (12 тижнів) обумовлює морфологічну будову та характер відновлення травмованого нерва. Параневральне застосування Лф на 3 тиждень після травмування в більшій мірі сприяє проростанню осьових циліндрів в дистальний відрізок, ніж при введенні К з Л. Це пов'язано із більшим пригнічення розвитку фіброзу в місцях ушкодження нерва, що забезпечує пенетрацію нервовими волокнами ніжної щільної тканини невроми та їх подальшу регенерацію до дистального відрізка нерва.

ВИСНОВКИ

У дисертації, відповідно до поставленої мети, подано теоретичне обґрунтування та вирішення актуальної наукової задачі - поліпшення результатів регенерації сідничого нерва після травматичного ушкодження шляхом використання біофлавоноїдів.

1. Розроблено експериментальну модель тяжкого ушкодження периферичного нерва та досліджено особливості регенерації нервових волокон. У тварин із тяжкою травмою сідничого нерва в дистальний відділ регенерує 4728,7±74,6 нервових волокон (в 1мм³), що становить 45% від показників контрольної групи тварин. Причиною низької регенерації є розвиток значного фіброзу в ділянці невротомії.

2. Результати електронномікроскопічного дослідження показали, що регенеровані нервові волокна на 12 тиждень після травмування суттєво відрізняються від контрольних. Кількість ламел в мієлінових оболонках нервових волокон проксимального відділу становила 36,0±2,7, в дистальному відділі - 29,2±2,5, в той час як у контрольних - 65,3±6,9 ламел. При цьому мієлінові оболонки нервових волокон мали локальні розшарування ламел.

3. У тварин, яким після виконання експериментальної моделі тяжкого травматичного ушкодження нерва вводили корвітин з ліпіном спостерігали кращі результати регенерації сідничого нерва. Це характеризується достовірним збільшенням кількості нервових волокон. Через 12 тижнів встановлено достовірне збільшення щільності нервових волокон в проксимальному відділі (9596,4±84,2 шт/мм³, на 43,2%), зоні травматичного ушкодження (9810,8±196,3 шт/мм³, на 55,5%) та дистальному відрізку ушкодженого нерва (8547,4±113,8 шт/мм³, на 80,7%).

4. Регенерація нервових волокон під впливом корвітину з ліпіном є більш ефективною. Кількість ламел мієліну в нервових волокнах проксимального відділу склала 44,2±1,0, а в дистальному відділі - 30,2±4,0, проте ультраструктура волокон не відрізняється від такої оперованих тварин, що не отримували лікарських засобів.

5. У тварин, яким після виконання експериментальної моделі тяжкого травматичного ушкодження нерва вводили ліпофлавон, процеси регенерації ушкодженого сідничого нерва були більш вираженими. Через 12 тижнів встановлено достовірне збільшення щільності нервових волокон в проксимальному відділі (10891,0±140,2 шт/мм³, на 62,5%), зоні травматичного ушкодження (10352,1±209,3 шт/мм³, на 64,1%) та дистальному відрізку ушкодженого нерва (10532,7±106,5 шт/мм³, на 122,7%).

6. Використання ліпофлавону супроводжувалось регенерацією більшої кількості нервових волокон. Кількість ламел в нервових волокнах проксимального відділу становила 42,8±3,0, а в дистальному - 34,2±3,7.

7. Порівняльний аналіз результатів впливу корвітину з ліпіном та ліпофлавону свідчить, що застосування ліпофлавону в більшій мірі підвищує регенерацію нервових волокон в усьому ушкодженому нерві. Дія ліпофлавону характеризується зменшенням утворення щільного сполучнотканинного рубця в ділянці невротомії. Це сприяє прискоренню регенерації нервових волокон, проте такий ефект не характеризується істотним відновлювальним процесом щодо мієлінових нервових волокон.

8. Отримані результати демонструють, що застосування ліпофлавону після травматичного ушкодження периферичного нерва покращує результати регенерації останнього і розширює уявлення про можливість фармакологічної стимуляції регенерації нервових волокон.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Для більш обґрунтованого пошуку лікарських засобів для відновлення травматично ушкоджених периферичних нервів рекомендується застосування запропонованої експериментальної моделі тяжкого ушкодження периферичного нерва.

2. Проведені дослідження дозволяють вважати за доцільне подальше вивчення впливу ліпофлавону як потенційного антиоксидантроного засобу, який сприяє відновним процесам в травмованому нерві.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пат. 35417 України МПК (2006.01) G09B 23/28. Спосіб моделювання травми периферійного нерва у щурів / О.В. Храпай, Ю.Б. Чайковський, А.В. Корсак; заявник та патентовласник НМУ імені О.О. Богомольця. - № u2008 08503; заявл. 26.06.2008; опубл. 10.09.2008, Бюл. № 17. Здобувач самостійно отримував первинну документацію, оформлював заявку на патент).

2. Храпай Е.В. Липофлавон повышает регенерацию нервных волокон в условиях экспериментальной модели травмы периферического нерва / Е.В. Храпай // Актуальні проблеми сучасної медицини. - 2010. - Т. 10, № 1(29). - С. 116-120. (Здобувач самостійно проводив експеримент, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів).

3. Храпай О.В. Використання ліпофлавону як продукту нанобіотехнології кверцетину в регенеративній неврології / О.В. Храпай, С.І. Савосько // Український науково-медичний молодіжний журнал. - 2010. - № 3. - С. 66-67. (Здобувач самостійно проводив експеримент, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

4. Храпай Е.В. Ультраструктурные особенности восстановления миелинизированных нервных волокон периферического нерва в условиях экспериментальной невротомии и при использовании Липофлавона / Е.В. Храпай // Мат-ли наук.-практ. конф. "Прикладні аспекти морфології", присв'ячена пам'яті проф. Б.В.Шутки, 20-21 травня 2010 р., м. Івано-Франківськ. - С.155-157. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

5. Храпай О.В. Ефективність використання ліпофлавону в експериментальній регенеративній неврології / О.В. Храпай // Мат-ли XIII-й конґресу Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (СФУЛТ), 30 вересня - 3 жовтня 2010, м. Львів. - С. 674-675. (Здобувач самостійно проводив експеримент, забір матеріалу, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

6. Храпай Е.В. Сравнительная эффективность липофлавона и липина с корвитином при лечении травмы периферического нерва в эксперименте // Е.В. Храпай, Ю.Б. Чайковский // Вісник морфології. - 2010. - № 16(4). - С. 765-770. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

7. Храпай О.В. Регенерація нервових волокон в регенераційній невромі сідничого нерва щурів після травмування та її фармакокорекція / О.В. Храпай // Мат-ли конф. "Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения", м. Алушта. - 2010. - С. 163-167. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

8. Храпай О.В. Використання ліпофлавону у відновлювальній неврології / О.В. Храпай, Х.В.Храпай // Мат-ли 64 міжнар. наук.-практ конф. «Актуальні проблеми сучасної медицини», 3-4 листопада 2010 р., м. Київ. -- С. 283-284. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

9. Храпай Е.В. Ультраструктурные особенности влияния Липофлавона на восстановление травмированного периферического нерва // Е.В. Храпай, Ю.Б. Чайковский // Український морфологічний альманах. - 2010. - С. 95-99. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

10. Храпай Е.В. Восстановительная фармакотерапия травмы периферического нерва в эксперименте // Е.В. Храпай, Ю.Б. Чайковский // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2010. - Т. 9, № 4. - С. 6-11. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

11. Храпай Е.В. Вплив ліпофлавону на регенерацію травмованого сідничого нерва при різних схемах введення // Е.В. Храпай // Морфологія. - 2010. - Т. 4, № 3. - С. 67-71. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

12. Храпай Е.В. Регенерация травмированного периферического нерва под действием биофлавоноидов на ранних этапах в эксперименте // Е.В. Храпай, Ю.Б. Чайковский // Актуальні проблеми сучасної медицини. - 2010. - Т. 10, № 4(32). - С. 168-171. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

13. Храпай Е.В. Структурные нарушения при повреждении периферического нерва // Е.В. Храпай // Мат-ли Першої міжнар. наук.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии», 23-26 листопада, 2010, м. Санкт-Петербург - С. 190-196. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

14. Храпай Е.В. Способ повышения регенерации периферического нерва после травмы // Е.В. Храпай // Мат-ли V Міжнародної наук. конф. з питань стану та перспектив розвитку медицини у спорті найвищих «СпортМед-2010», 9-10 грудня 2010, м. Москва - С. 335. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

15. Храпай Е.В. Влияние липофлавона на регенерацию периферического нерва в эксперименте // Е.В. Храпай // Мат-ли V Міжнародної наук. конф. з питань стану та перспектив розвитку медицини у спорті найвищих «СпортМед-2010», 9-10 грудня 2010, м. Москва - С. 366-367. (Здобувач самостійно проводив експеримент, аналіз та узагальнення отриманих результатів, підготував статтю до друку).

16. Пат. 57217 України МПК (2011.01) A61K 31/00. Спосіб оцінки ефективності регенерації травмованого периферійного нерва під впливом біофлавоноїдів на ранніх етапах (в експерименті) / О.В. Храпай, Ю.Б. Чайковський; заявник та патентовласник НМУ імені О.О. Богомольця. - № u201012359; заявл.20.10.2010; опубл. 10.02.2011, Бюл. № 3. (Здобувач самостійно отримував первинну документацію, оформлював заявку на патент).

17. Пат. 50618 України МПК (2011.01) G09B 23/00. Спосіб моделювання травми периферійного нерва у щурів / О.В. Храпай; заявник та патентовласник НМУ імені О.О. Богомольця. - № u201002123; заявл. 26.02.2010; опубл. 10.06.2010, Бюл. № 11. (Здобувач самостійно отримував первинну документацію, оформлював заявку на патент).

18. Пат. 50619 України МПК (2011.01) A61K 31/00. Спосіб лікування травмованого ушкодження периферійних нервів у щурів / О.В. Храпай; заявник та патентовласник НМУ імені О.О. Богомольця. - № u201002124; заявл. 26.02.2010; опубл. 10.06.2010, Бюл. № 11. (Здобувач самостійно отримував первинну документацію, оформлював заявку на патент).

АНОТАЦІЯ

Храпай О.В. Регенерація травмованого периферичного нерва під впливом біофлавоноїдів (експериментально-морфологічне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія. - Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, Київ, 2011.

Розроблена нова експериментальна модель травматичного ушкодження периферичного нерва. Експериментально досліджено вплив комбінованої дії корвітину з ліпіном та монотерапії ліпофлавоном на процеси регенерації в проксимальному відділі, ділянці невротомії та дистальному відрізку травмованого сідничого нерва щурів. Виявлені морфологічні порушення регенерації нервових волокон внаслідок розвитку фіброзу та сполучнотканинних рубців в ділянці невротомії. Застосування досліджуваних лікарських засобів сприяє регенерації нервових волокон в дистальний відділ травмованого нерва. Ліпофлавон пригнічує формування сполучнотканинних рубців після невротомії, що сприяє інтенсивній пенетрації осьовими циліндрами зони ушкодження, що дозволяє рекомендувати його до вивчення в клінічних умовах.

Ключові слова: периферичний нерв, травма, корвітин, ліпін, ліпофлавон.

АННОТАЦИЯ

Храпай О.В. Регенерация травмированного периферического нерва под воздействием биофлавоноидов (експериментально-морфологическое исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук за специальностью 14.03.09 - гистология, цитология, эмбриология. - Национальный медицинский университет имени А.А. Богомольца, Киев, 2011.

Разработана новая экспериментальная модель травматического повреждения периферического нерва. Экспериментально исследовано влияние комбинированного действия корвитина с липином и монотерапии липофлавоном на процессы регенерации в проксимальном отделе, участке невротомии и дистальном отрезке травмированного ягодичного нерва крыс. Обнаружены морфологические нарушения регенерации нервных волокон в результате развития фиброза и соединительнотканных рубцов в участке невротомии. Применение исследуемых лекарственных средств способствует регенерации нервных волокон в дистальный отдел травмированного нерва. Липофлавон подавляет формирование соединительнотканных рубцов после невротомии, способствуя интенсивной пенетрации осевыми цилиндрами зоны повреждения, что позволяет рекомендовать его к изучению в клинических условиях.

Ключевые слова: периферический нерв, травма, корвитин, липин, липофлавон.

SUMMARY

Кhrapay E.V. Regeneration of traumatized peripheral nerve under the influence of bioflavonoids (experimental and morphological research). Manuscript.

Dissertation for a degree of the candidate in medical sciences by speciality 14.03.09 - histology, cytology, embryology. O.O. Bogomolets' National Medical University, Kiev, 2011.

The new experimental model of traumatic damage of peripheral nerve has been developed. Influence of the combined action of corvitin is experimentally investigational with lipin and monotherapies of lipoflavon on the processes of regeneration in a proximal segment, area of neurotomy and distal segment of trauma buttock nerve of rats. Found morphological violations of regeneration of nervous fibers as a result of development of fibrosis and scars in the area of neurotomy. Application of the medications is activated the regeneration of nervous fibers in the distal segment of traumatized nerve. Lipoflavon represses forming of scars after a neurotomy, activated intensive penetration the axial cylinders of area of damage, which allows to recommend it for the study in clinical terms.

Keywords: peripheral nerve, trauma, corvitin, lipin, lipoflavon.

Размещено на Allbest.ru