Індикація збудників та удосконалення вакцинопрофілактики парвовірусного ентериту і чуми собак

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК УКРАЇНИ

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

УДК 619:578.822/.831:616-07/.084:636.7

ІНДИКАЦІЯ ЗБУДНИКІВ ТА УДОСКОНАЛЕННЯ ВАКЦИНОПРОФІЛАКТИКИ ПАРВОВІРУСНОГО ЕНТЕРИТУ І ЧУМИ СОБАК

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія,

епізоотологія, інфекційні хвороби та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

ІЛЬІНА Оксана Валеріївна

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Луганському національному аграрному університеті Міністерства аграрної політики України.

Науковий керівник: кандидат ветеринарних наук

Пархоменко Людмила Іванівна,

Луганський національний аграрний університет,

доцент кафедри фізіології і мікробіології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук

Ничик Сергій Анатолійович,

Головне управління державної ветеринарної медицини в Сумської області, начальник;

доктор ветеринарних наук, професор

Ковальов Василь Львович,

Південний філіал Національного університету біоресурсів і природокористування України «Кримський агротехнологічний університет», завідувач кафедри мікробіології, епізоотології і ветеринарно-санітарної експертизи

Захист відбудеться «20» квітня 2011 р. о 13-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий «_____» ____________________ 2011 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради,

кандидат ветеринарних наук П. О. Шутченко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки в Україні інтенсивно розвивається службове, декоративне та мисливське собаківництво. Щорічно збільшується поголів'я собак, сприйнятливих до різних інфекційних захворювань, серед яких особливе занепокоєння викликають хвороби змішаної етіології, що перебігають з нетиповим проявом клінічних ознак для відповідних інфекцій (Березина Е. С., 2002; Медова Е. В., 2005).

Вакцинопрофілактика сприяє зниженню захворюваності тварин. Проте існують труднощі щодо імунопрофілактики, пов'язані з якістю вакцин. Особливо це стосується антигенної однорідності вакцинних і циркулюючих серед собак епізоотичних штамів збудників, перш за все, досить поширених інфекційних хвороб, зокрема парвовірусного ентериту (ПЕ) та чуми собак.

Безсистемне використання вакцин не забезпечує формування стійкого імунітету, чим сприяє циркуляції вірусу (Трухманов Б. Г., 1964; Mori T., 1994; Верховский О. А., 1999; Battilani M., 2001; Yong-Hwan Kim, 2001; Bischof R., 2005).

Для вакцинації тварин бажано використовувати препарати, які б стабілізували імунну відповідь на введення антигену. Як відомо, їх застосовують не тільки з профілактичною, але й з лікувальною метою в якості імунокоректорів первинних і вторинних імунодефіцитів та противірусних засобів прямої дії на ранніх стадіях вірусного інфекційного процесу (Philips T. R., 1989; Прудников В. С., 2000; Сливка Г. В., 2003; Іванченко І. М., 2004; Деєва А. В., 2005; Ожерелков С. В., 2005).

Сучасні потреби ветеринарної медицини вимагають розробки нових фармакологічних препаратів, які б забезпечили не тільки ефективність лікування захворювання, але й проявляли імунокорегуючий вплив на клітинну та гуморальну ланки імунітету цуценят при щепленні вакцинами, що є актуальним напрямом наукових досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у період 2006-2010 рр. на кафедрі мікробіології та вірусології Луганського національного аграрного університету відповідно до наукових програм факультету ветеринарної медицини у рамках завдань «Вивчення інфекційної патології молодняка сільськогосподарських тварин і птиці, розробка ефективних заходів боротьби в господарствах південно-східної частини України» (№ держреєстрації 0104U005403, 2005-2007 рр.) та «Розробити та впровадити засоби противірусної терапії птиці, ссавців при моно- та асоційованих інфекціях» (№ держреєстрації 0108U006380, 2008-2010 рр.).

Мета і задачі дослідження. Мета досліджень - з'ясувати епізоотичну ситуацію з парвовірусного ентериту та чуми собак за індикації збудників, удосконалити вакцинопрофілактику цих інфекцій з використанням антивірусних препаратів.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні задачі:

провести епізоотологічний і вірусологічний моніторинги парвовірусного ентериту та чуми собак у м. Луганську;

вивчити біологічні властивості збудників парвовірусного ентериту та чуми собак у різних біологічних системах;

визначити противірусну активність нових препаратів триазолінового ряду (ВПК_108 і румосол) щодо вірусу чуми та парвовірусу в культурі клітин і курячих ембріонах;

оцінити вплив румосолу на імунний стан цуценят до та після вакцинації проти парвовірусного ентериту та чуми собак порівняно до фоспренілу.

Об'єкт дослідження: парвовірусний ентерит і чума собак, ізоляти парвовірусу та асоціації вірусу чуми з парвовірусом, препарати триазолінового ряду (ВПК-108, румосол), фоспреніл.

Предмет дослідження: циркуляція вірусу чуми та парвовірусу, біологічні властивості епізоотичних ізолятів і вакцинних штамів, противірусні властивості препаратів румосол та ВПК_108, вплив препаратів на гематологічні та імунологічні показники цуценят при вакцинації та після інфікування парвовірусом у щеплених цуценят.

Методи дослідження: епізоотологічний, серологічний, клінічний, гематологічний, вірусологічний, бактеріологічний, молекулярно-генетичний, електронної мікроскопії, імунологічні та статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. За результатами дослідження отримано нові дані щодо поширення та спалахів захворювання на парвовірусний ентерит і чуму серед імунізованих проти цих інфекцій собак, клінічний прояв яких підтверджено за індикації збудників у патологічному матеріалі при зараженні курячих ембріонів (КЕ) і культури перещеплюваних клітин Vero та ідентифікації ізолятів за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), реакції дифузійної преципітації (РДП), реакції гемаглютинації (РГА), імуноферментного аналізу (ІФА) та електронної мікроскопії (ЕМ). Уперше встановлено пригнічення репродукції збудників парвовірусного ентериту та чуми собак in vitro (у культурі фібробластів КЕ), in ovo (КЕ) та in vivo (у біопробі на цуценятах) у разі використання препаратів триазолінового ряду (ВПК_108 і румосол) у порівнянні з фоспренілом. На підставі встановлених імуномодулюючих властивостей препаратів триазолінового ряду обґрунтовано і запропоновано нову схему профілактики парвовірусного ентериту та чуми собак, що передбачає одноразове введення румосолу протягом 3 діб поспіль з наступним щепленням вакцинами.

Результати з вивчення антигенних властивостей епізоотичного ізоляту ЄН_5/2 парвовірусу та противірусних властивостей похідних 1,2,4_триазолу освідчені відповідно деклараційними патентами на корисну модель України.

Практичне значення одержаних результатів. За результатами дослідження запропоновано для використання епізоотичний ізолят ЄН_5/2 парвовірусу в якості продуцента антигену для виготовлення типоспецифічної сироватки (деклараційний патент на корисну модель України № 44402, 2009 р.) та похідні 1,2,4_триазолу як противірусні препарати до вірусу чуми та парвовірусу (деклараційний патент на корисну модель України № 36330, 2008 р.). Окремі результати та положення увійшли до методичних рекомендацій «Застосування препарату румосол для підвищення поствакцинального імунітету цуценят», затверджених Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 2 від 25 грудня 2008 р.). Матеріали дисертаційної роботи використовуються у навчальній програмі курсу вірусології, епізоотології, імунології і фармакології факультету ветеринарної медицини ЛНАУ.

Особистий внесок здобувача полягає у самостійному виконанні методичних, аналітичних та експериментальних досліджень. Аналіз і узагальнення результатів досліджень та формулювання висновків здійснено спільно з науковим керівником. Частину досліджень з ідентифікації збудників у ПЛР виконано в лабораторії молекулярної епізоотології та діагностики ННЦ «ІЕКВМ» під керівництвом кандидата ветеринарних наук А. П. Геріловича, методом імуноферментного аналізу - у лабораторії з вивчення хвороб дрібних домашніх тварин ННЦ «ІЕКВМ» за участі кандидата ветеринарних наук М.І. Келеберди. Електронно-мікроскопічні дослідження проведено в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України під керівництвом кандидата біологічних наук М. В. Рєпіна.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались, обговорювались і були схвалені на: звітних сесіях ученої ради факультету ветеринарної медицини Луганського національного аграрного університету (2005-2010 р.), науково-практичній конференції «Перспективи розвитку ветеринарної медицини України» (м. Луганськ, 2007 р.), міжнародних науково-практичних конференціях «Регіональні проблеми екології ветеринарної медицини» (м. Житомир, 2007 р.), «Сучасні проблеми ветеринарної медицини з питань епізоотології, біотехнології та імунології» (м. Полтава, 2008 р.) і «Сучасні проблеми біотехнології, стандартизації та забезпечення контролю якості ветеринарних препаратів, кормів та кормових добавок» (м. Київ, 2008 р.), міжнародній науково-практичній і навчально-методичній конференції «Новітні досягнення та перспективи ветеринарної медицини» (м. Харків, 2008 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 13 наукових праць у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, з них 5 - одноосібно, а також два описи деклараційних патентів на корисні моделі.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 145 сторінках комп'ютерного друку, ілюстрована 12 таблицями, 38 рисунками та містить вступ, огляд літератури, матеріали та методи досліджень, результати власних досліджень, висновки, пропозиції виробництву, список літературних джерел, що складається з 325 найменувань, у тому числі 148 закордонних авторів, та додатки.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

У процесі виконання дисертаційної роботи було використано:

- вакцинний штам ЕПМ вірусу чуми собак (титр інфекційності 103,5 ТЦД50/см3), ізоляти парвовірусу ЄН_5/2, БП_8 та асоціації вірусу чуми з парвовірусом БН_3, БП_6 від хворих собак;

- 365 курячих ембріонів 9-11_добової інкубації, первинно-трипсинізована культура ФЕК, культура перещеплюваних клітин Vero, 124 цуценяти різного віку, 12 кроликів, 10 морських свинок і 2 236 собак для оцінки вакцинопрофілактики;

- препарати триазолінового ряду ВПК_108 (піперідіній 2-[5-(2-фуріл)-4-феніл-1,2,4-тріазол-3 ілтіо] ацетат) і румосол (морфоліній 3-(4-піридил)-1,2,4-триазоліл-5-тіоацетат);

- фоспреніл (продукт фосфорилювання поліпренолів хвої, основу якого складає динатрієва сіль фосфату поліпренолів).

Збудників чуми та парвовірусного ентериту виділяли з патологічного матеріалу з використанням КЕ, культури клітин ФЕК та перещеплюваних клітин Vero з подальшою індикацією за допомогою РГА, РДП, ІФА, ПЛР і ЕМ.

У РГА використовували 1 %_ву суспензію еритроцитів півня, морських свинок, свиней, котів і дворазові розведення досліджуваного матеріалу у фізіологічному розчині (рН 7,0-7,2, за температури 37,5 °C для чуми та рН 6,0, за температури 4 °C для парвовірусу) в об'ємі 0,2 см3.

РДП для індикації збудників чуми та парвовірусного ентериту ставили за методу Оухтерлоні з використанням гіперімунної сироватки крові кроликів.

Ідентифікацію польових ізолятів здійснювали методом ІФА за допомогою комерційних наборів для виявлення антигену збудників чуми, парвовірусного ентериту собак, ентериту норок та панлейкопенії котів виробництва НПО «Нарвак» (м. Москва, Російська Федерація). Додатково належність польових ізолятів до родин Parvoviridae та Paramixoviridae визначали за допомогою ПЛР із застосуванням праймерів комерційних наборів «Парвовір» та «Полічум» (м. Москва, Російська Федерація).

Морфоструктуру парвовірусу (ізоляти ЄН_5/2, БП_8) та вірусу чуми (асоційовані ізоляти БН_3, БП_6) вивчали шляхом ультрацентрифугування у градієнті щільності 30 %_ї сахарози та негативного контрастування в електронному мікроскопі ПЕМ_125 К (АТ «SELMI», м. Суми).

Противірусну активність препаратів триазолінового ряду ВПК_108 і румосолу щодо збудників чуми (штам ЕПМ, титр 103,5 ТЦД50/см3) та парвовірусного ентериту (ізолят ЄН_5/2, титр 104,5 ЕІД50/0,2 см3) вивчали за одночасного їх уведення з вірусами у концентраціях 0,02, 0,04, 1 і 2 мг/КЕ в об'ємі 0,2 см3 на хоріоналантоїсну оболонку (ХАО) курячих ембріонів. Антивірусну ефективність препаратів визначали за титру вірусів методом Ріда та Менча й інтенсивності патологічних змін у заражених КЕ.

Антивірусну активність румосолу та ВПК_108 у 0,1 %_й (0,25 мг/кг) концентрації щодо вірусу чуми (штам ЕПМ) та парвовірусу (ізолят ЄН_5/2) у порівнянні до фоспренілу вивчали у культурі клітин ФЕК, яку вирощували у флаконах ємністю 20 см3, з посівною концентрацією клітин 850 тис./см3 у суміші рівних об'ємів поживних середовищ 199, Ігла та 10 % сироватки крові великої рогатої худоби.

Критеріями оцінки дії препаратів щодо вірусів слугували: час прояву цитопатогенної дії (ЦПД), титр вірусу у суміші з препаратами та без них.

Вплив препаратів триазолінового ряду на організм цуценят після триразового їх уведення з подальшою вакцинацією (вакцина Біовак DPA проти чуми, парвовірусного ентериту та аденовірусної інфекції, серія 38, контроль 83) та наступним інфікуванням імунізованих цуценят парвовірусом (ізолят ЄН_5/2) вивчали за гематологічними й імунологічними показниками: вмістом гемоглобіну, кількістю еритроцитів і лейкоцитів, швидкістю осідання еритроцитів (ШОЕ), кольоровим показником, лейкограмою, кількістю Т- і В_лімфоцитів, імунорегуляторним індексом (ІРІ), метаболічною (НСТ-тест, відновлення нітросинього тетразолію) та фагоцитарною активністю нейтрофілів, циркулюючими імунними комплексами (ЦІК). Кількість лейкоцитів та еритроцитів визначали за загальноприйнятими методами з підрахунком у камері Горяєва, ШОЕ - за Т. Г. Панченковим, вміст гемоглобіну - методом Салі, що викладені у довіднику «Лабораторні методи досліджень у клініці» під редакцією В. В. Меншикова (1987). Для визначення фагоцитарної активності нейтрофілів використовували культуру мікрококусу. Тест НСТ проводили в мазках крові за методом М. Е. Виксмана (2001). Імунологічні дослідження крові проводили з визначенням Т- і В_лімфоцитів методом розеткоутворення з еритроцитами барана за Jondal et al. у модифікації А. М. Чередєєва (1988).

Рівень антитіл до парвовірусу та вірусу чуми у сироватці крові цуценят на 14-ту і 21-шу доби після щеплення вакцини та на 9_ту добу після інфікування ізолятом парвовірусу ЄН_5/2 визначали за реакції затримки гемаглютинації (РЗГА) з 1 %-ою суспензією еритроцитів свиней і РДП зі специфічним антигеном до вакцинації.

Статистичну обробку даних здійснювали з використанням комп'ютерної програми Excel XP Professional і пакету Statistica v. 6.1.

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Оцінка епізоотичної ситуації щодо парвовірусного ентериту та чуми собак. Аналіз епізоотичної ситуації щодо парвовірусного ентериту та чуми собак упродовж 2006-2008 рр. свідчить про значне поширення цих інфекцій, що підтверджується клінічним проявом захворювань, індикацією збудників і як моноінфекції, так і при асоціативному перебігу захворювання. З метою профілактики цих хвороб у чотирьох лікарнях ветеринарної медицини м. Луганська з використанням вакцин різних фірм-виробників було щеплено 2 236 собак, з них у 2006 р. - 816, у 2007 р. - 756, у 2008 р. - 664. Найчастіше для щеплення собак використовували вакцини Вангард, Нобівак, Дурамун. Значно рідше застосовували вакцини Діпентовак, Біовак DPAL та Мультікан_4,8 російського виробництва.

Найбільша кількість (72,2 %) хворих собак реєструвалась навесні (квітень-травень), а восени захворюваність становила 27,8 %.

При дослідженні хворих собак (n = 115), як щеплених, так і не щеплених вакцинами, у період з 2006 по 2008 рр. у 85 тварин підтвердили етіологічну роль парвовірусу та вірусу чуми у розвитку захворювання. За асоціативного перебігу чуми з ПЕ у 26 % хворих собак переважали ураження кишечнику, у 13 % - легенів, у 7 % - шкіри і нервової системи. У разі захворювання на ПЕ домінували клінічні ознаки ураження кишечнику у 20 % тварин, а змішаний комплекс клінічних ознак спостерігали лише у 14 % хворих собак. У 4,7 % хворих на чуму собак захворювання перебігало з ураженням шкіри, у 2,4 % - легенів. З досліджених хворих собак 38,3 % були щеплені проти ПЕ та чуми, з них тільки у 16,7 % не було встановлено збудників цих інфекцій.

Захворювання на чуму та ПЕ реєструвались серед 4,7 і 13 % безпородних собак віком до 6 місяців, а асоційований перебіг цих інфекцій встановлено у 33 % цуценят. З породистих собак найбільш сприйнятливими були німецькі вівчарки, ротвейлери і добермани.

Під час проведення вірусологічного дослідження патологічного матеріалу збудники чуми та ПЕ було виділено з крові у 60 і 49,4 % собак відповідно, тоді як із змивів слизових оболонок лише у 27 і 26 %. Парвовірус було також виділено із зразків внутрішніх органів у 13 % досліджуваних тварин.

За результатами РДП з типоспецифічними сироватками підтверджено наявність у зразках досліджуваного матеріалу парвовірусу у 33,3 % тварин, вірусу чуми - у 6,7 % та їх асоціації - у 60 %.

Біологічні властивості ізолятів парвовірусу ЄН_5/2, БП_8 та асоціації вірусу чуми з парвовірусом БН_3, БП_6. Від собак з різними проявами захворювання виділено польові ізоляти збудників, які позначені як ЄН_5/2, БП_8, БН_3 та БП_6. Ізоляти ЄН_5/2 та БП_8 типовані як парвовірус. Ізоляти БН_3 та БП_6 вміщували асоціацію вірусу чуми з парвовірусом.

Первинну індикацію збудників здійснювали шляхом інфікування КЕ, в яких у першому пасажі спостерігали набряк і гіперемію ХАО (50-100 %) та крововиливи на ній (33-60 %), гіперемію зародка (33-100 %), помутніння екстраембріональної рідини та присутність уремічних солей (17-67 %), глинистий колір печінки та збільшення нирок (17-100 %). У 33-50 % ембріонів ізоляти БН_3 й БП_6 викликали помутніння ХАО з утворенням у 10 % бляшок на ХАО.

Ізоляти парвовірусу ЄН_5/2 та БП_8 зумовлювали крововиливи тільки на шкірі голови, тоді як для БН_3 та БП_6 (асоціати вірусу чуми з парвовірусом) характерними були крововиливи як на голові, так і на тілі ембріона. Інфекційність ізолятів парвовірусу ЄН_5/2 та БП_8 після другого пасажу в КЕ складала 4,5 та 3,0 lg ЕІД50/0,2 см3 відповідно.

Належність ізолятів БП_8 та ЄН_5/2 до парвовірусу встановлено за ідентифікації після культивування у КЕ за допомогою РДП з типоспецифічною сироваткою крові, отриманою шляхом гіперімунізації кроликів, яка у титрі 4,5 log2 реагувала з досліджуваним антигеном у розведенні 1:64-1:128. У складі ізолятів БН_3 та БП_6 за допомогою РДП було виявлено антигени ПЕ та чуми, які відповідно у розведеннях 1:64 та 1:16-1:64 реагували з типоспецифічними сироватками (4,5 і 5,5 log2 відповідно) до цих вірусів з утворенням двох ліній преципітації.

Таким чином шляхом індикації вірусів чуми та ПЕ і вивчення їх патогенності для КЕ доведено наявність цих збудників у патологічному матеріалі від хворих собак.

За результатами ІФА ембріональних зразків ізолятів на 100 % було підтверджено дані РДП щодо наявності у цих зразках парвовірусу (ізоляти ЄН_5/2, БП_8, БН_3, БП_6), а також вірусу чуми в ізолятах БН_3 та БП_6.

Усі досліджувані ізоляти парвовірусу після пасажування у КЕ зберігали гемаглютинуючу активність у розведенні 1:64 до 1 %_ї суспензії еритроцитів свиней та у розведенні 1:4-1:16 - до еритроцитів котів. Ізоляти БН_3 та БП_6, що вміщували вірус чуми собак, мали нестабільну гемаглютинуючу здатність по відношенню до 1 %_ї суспензії еритроцитів морської свинки та півня, що є характерною властивістю цього збудника. Підтвердженням цьому є виявлення також у біопробі на морських свинках за умов зараження ізолятами БН_3 та БП_6, що вміщують окрім парвовірусу збудник чуми, підвищення температури тіла до 39,3-39,6 °С, лейкоцитозу, базо- та нейтрофілії, лімфоцито- та моноцитопенії.

Культивування ізолятів парвовірусу ЄН_5/2 та БП_8 у первинній культурі ФЕК супроводжувалось округленням клітин з подальшою деструкцією моношару через 24-36 годин після інфікування. Інфекційна активність вірусів після другого пасажу у ФЕК становила 105,25 та 103,2 ТЦД50/0,5 см3. Ізоляти БН_3, БП_6 проявляли ЦПД через 48 годин, яка характеризувалась округленням клітин і симпластоутворенням через 96 годин. Активність вірусу чуми та парвовірусу в асоціаціях БП_6 та БН_3, культивованих у ФЕК впродовж двох пасажів, у перехресній РДП з гіперімунними сироватками до штаму ЕПМ (вірус чуми) та ЄН_5/2 (парвовірус) становила 1:16-1:32 та 1:8 відповідно.

Ізоляти парвовірусу БП_8, ЄН_5/2 при адаптації до перещеплюваної культури клітин Vero спричиняли розвиток ЦПД через 24-72 години з округленням та вакуолізацією клітин, локальною деструкцією моношару. ЦПД ізоляту БН_3 (асоціат) проявлялась у першому пасажі через 48 годин заокругленням, зморщеністю клітин, вакуолізацією цитоплазми з подальшим симпластоутворенням.

Після другого пасажу у клітинах Vero титр ізоляту ЄН_5/2 становив 104,8 ТЦД50/0,5 см3 та ізоляту БП_8 - 103,25 ТЦД50/0,5 см3. Антигенна активність ізолятів з типоспецифічною сироваткою в РДП була 1:64 та 1:8 відповідно, а цей показник у адаптованого до клітин Vero ізоляту БН_3 (асоціат) в РДП з типоспецифічною сироваткою до парвовірусу становив 1:16 та 1:4 до вірусу чуми.

Після адаптації ізолятів до культур клітин Vero та ФЕК на рівні другого пасажу ізоляти ЄН_5/2 і БП_8 парвовірусу та БН_3 і БП_6 (асоціати) втратили гемаглютинуючі властивості щодо 1 %_ї суспензії еритроцитів свиней і котів.

За допомогою ПЛР встановлено, що ізолят БН_3 містив генетичний матеріал збудників чуми та парвовірусу, а ізолят ЄН_5/2 - парвовірусу собак.

Методом негативного контрастування за електронної мікроскопії в ізолятів БН_3 та БП_6 встановлено наявність віріонів збудників чуми та ПЕ. Віріони чуми мали сферичну форму, розмір 150-220 нм, із зовнішньою оболонкою та виступами, парвовірусу собак - округлу форму розміром 20-25 нм, без капсидної оболонки. В ізолятах парвовірусу ЄН_5/2 та БП_8 спостерігали віріони овальної форми розміром від 22 до 30 нм без капсидної мембрани.

Антивірусна активність препаратів триазолінового ряду щодо парвовірусу та вірусу чуми собак у курячих ембріонах та у клітинах ФЕК. Для визначення противірусної активності при інфікуванні культури клітин ФЕК та ХАО КЕ вакцинним штамом ЕПМ вірусу чуми та ізолятом ЄН_5/2 парвовірусу випробували різні дози препаратів: 0,02-0,04 мг/КЕ (0,01-0,02 %), 1-2 мг/КЕ (0,5-1%), 0,25 мг/см3 (0,1 %).

За одночасного введення у КЕ суміші вірусу чуми (штам ЕПМ) з ВПК_108 у концентрації від 0,02 до 0,04 мг/КЕ зменшувались гіперемія та набряк ХАО у 8-42 % ембріонів, крововиливи на тілі зародка - у 33-67 %, глинистий колір печінки - у 67 %. Окрім того, ВПК_108 у концентрації 0,04 мг/КЕ знижував кількість з відставанням у рості інфікованих КЕ у два рази порівняно з 0,02 мг/КЕ. Блокування репродукції вірусу в КЕ зумовлювало введення суміші ВПК_108 у концентрації 2 мг/КЕ з вірусом, і, як наслідок, були відсутні ознаки ураження зародків, за винятком гіперемії і набряку ХАО, що пояснюється токсичністю препарату в цій концентрації і підтверджується її наявністю в КЕ за інокуляції лише ВПК_108 у цій дозі.

Уведення ВПК_108 з розрахунку 1 мг/КЕ у суміші з ізолятом ЄН_5/2 парвовірусу зменшувало на 25 % крововиливи порівняно до КЕ, інфікованих без препаратів, а румосол (1 мг/КЕ) запобігав розвитку крововиливів. Відсутність неправильного положення та відставання у рості КЕ, поява уремічних солей відрізняли КЕ, які були інфіковані сумішшю вірусу з препаратами, від КЕ, заражених вірусом без препаратів. Кількість КЕ з глинистим кольором печінки знижувалась на 25 % під впливом ВПК_108 у концентрації 1 мг/КЕ.

Титр вірусу чуми (штам ЕПМ) знижувався на 1,25; 1,7 і 1,5 lg ЕІД50/0,2 см3 від початкового у результаті введення відповідно 0,02; 0,04 і 2 мг/КЕ препарату ВПК_108. Румосол і ВПК_108 з розрахунку 1 мг/КЕ знижували інфекційну активність парвовірусу (ізолят ЄН_5/2) на 1,5 і 2,2 lg ЕІД50/0,2 см3 відповідно.

Препарати триазолінового ряду ВПК_108 і румосол у дозі 0,25 мг/см3 зумовлювали затримку ЦПД вірусу чуми та парвовірусу собак у культурі клітин ФЕК упродовж 24-48 годин, тоді як фоспреніл у тій же дозі не гальмував прояв ЦПД, яка виявлялась уже через 24 години після інфікування.

Установлено відповідне зниження титру вірусу чуми (штам ЕПМ) у результаті застосування суміші з фоспренілом і румосолом на 1,3 і 1,5 lg ТЦД50/0,5 см3 від початкового. Титр парвовірусу (ізолят ЄН_5/2) у присутності ВПК_108, румосолу і фоспренілу зменшувався на 1,2; 1,0 і 1,5 lg ТЦД50/0,5 см3 відповідно.

Порівняльна оцінка препарату триазолінового ряду і фоспренілу щодо впливу на післявакцинальний імунітет при щепленні цуценят. Вплив 0,5 % (0,5 мг/кг) румосолу порівняно до 0,4 % фоспренілу (0,4 мг/кг, виробнича концентрація) на організм цуценят вивчали після триразового введення один раз на добу з розрахунку 1 см3/10 кг маси тіла.

Установлено, що триразове введення румосолу порівняно до фоспренілу призводило до активного підвищення вмісту у крові гемоглобіну, еритроцитів і лейкоцитів, ШОЕ, еозинофілів, моноцитів, Т- і В_клітин, ІРІ, ЦІК і фагоцитарної активності.

Щеплення цуценят проводили на тлі триразового введення 0,5 %_го румосолу та 0,4 %_го фоспренілу, для чого було сформовано дослідні групи: І - цуценята, щеплені на тлі введення румосолу, ІІ - цуценята, щеплені на тлі введення фоспренілу, ІІІ - цуценята, щеплені без хіміопрепаратів.

Установлено, що румосол найбільш активно впливає на гематологічні показники (табл. 1).

Таблиця 1

Динаміка гематологічних показників цуценят, щеплених вакциною Біовак DPA (М ± m, n = 3)

Показ- ники	Група І (з румосолом)	Група ІІ (з фоспренілом)	Група ІІІ (без препаратів)
	нор- ма§	до щеп- лення	7 доба	21 доба	до щеп- лення	7 доба	21 доба	до щеп- лення	7 доба	21 доба
Гемогло- бін, г/л	110- 170	140 ±0	113,3 ±1,7 ***	130 ±0 **	143 ±1,7	121,7 ±1,7 **	130 ±0 *** **	136,7 ±3,3	118,3 ±1,7 **	125 ±2,89
Еритро- цити, Т/л	5,2- 8,4	5,4 ±0,06	4,9 ±0,03 ***	5,3 ±0,03 * ***	5,4 ±0,03	5,1 ± 0,07 **	5,2 ±0,05 **	5,3 ±0,03	5,1 ±0,03 **	5,2 ±0,06
Лейко- цити, Г/л	8,5- 10,5	8,8 ±0,2	9,2 ±0,1 *	6,7 ±0,1 *** ***	8,7 ±0,1	9,8 ±0,03 ***	7,4 ±0,3 *	8,3 ±0,4	8,4 ±0,2	7,2 ±0,1 ** **
Кольоро- вий інд.	0,8- 1,2	0,82 ±0,02	0,8 ±0,02 *	0,81 ±0 ***	0,9 ±0,01	0,8 ±0 ***	0,9 ±0,02 ***	0,9 ±0,01	0,8 ±0,01 **	0,8 ±0,01 **
ШОЕ, мм/год.	2-6	3,7 ±0,3	6 ±0,6 **	4,7 ±0,3 * *	4 ±0,5	5 ±0,6	3,7 ±0,3 *	2 ±0	2,7 ±0,3 **	3,7 ±0,3 ** *

Примітки: * - Р<0,05, ** - Р<0,01, *** - Р<0,001 (достовірність різниці показників на 7_му та 21_шу доби після щеплення по відношенню до тих, що були до щеплення); * - Р<0,05, ** - Р<0,01, *** - Р<0,001 (достовірність різниці показників на 7_му та 21_шу доби); § - норма за А. М. Смирновым (1981).

На 7_му добу після першого щеплення вакцини на тлі триразового введення румосолу та фоспренілу знижувались: вміст гемоглобіну на 24 і 18 %, кількість еритроцитів - на 10,2 і 5,9 %, кольоровий індекс - на 0,02 і 0,1, а кількість лейкоцитів підвищувалась на 4,3 і 11,2 %, ШОЕ - на 2,3 і 1 мм/год. відповідно у межах фізіологічних норм. У групі цуценят, щеплених вакциною без препаратів, також спостерігали зниження гемоглобіну на 15,6 %, еритроцитів - на 4 %, кольорового індексу - на 0,1 та підвищення ШОЕ - на 0,7 мм/год. Інші гематологічні показники коливались, залишаючись у межах фізіологічної норми.

На 21_шу добу після ревакцинації, у порівнянні з аналогічними показниками на 7_му добу, у цуценят І_ї і ІІ_ї груп відповідно підвищувався вміст гемоглобіну на 13 і 6,4 %, знижувався рівень ШОЕ на 1,3 мм/год. і лейкоцитів - на 37 і 33 %, але у групі щеплених на тлі румосолу підвищувалась кількість еритроцитів на 7,5 % та кольоровий індекс - на 0,01.

У групі цуценят, щеплених проти чуми і ПЕ без препаратів, на 21_шу добу порівняно до 7_ї доби після вакцинації підвищувався показник ШОЕ на 1 мм/год. та зменшувалась кількість лейкоцитів на 16,7 %. Інші показники не мали достовірних змін.

Аналіз лейкограми крові щеплених цуценят на тлі застосування румосолу та фоспренілу показав достовірне зниження кількості еозинофілів упродовж усього періоду спостереження на 2 (Р < 0,01) і 1 (Р < 0,05) та 2,3 (Р < 0,001) і 2,4 % (Р < 0,01, Р < 0,05) відповідно, а у цуценят, щеплених без препаратів, цей показник зменшувався на 1,7 і 0,3 %.

Кількість сегментоядерних нейтрофілів збільшувалась на 2,6 % (Р < 0,05) у цуценят І_ї і ІІ_ї груп на 21_шу добу після ревакцинації. У цуценят, щеплених вакциною DPA без препаратів, реєстрували зниження сегментоядерних нейтрофілів на 2,4 % (Р < 0,01) порівняно до 7_ї доби.

У цуценят, щеплених вакциною на тлі румосолу та фоспренілу, збільшувалась кількість паличкоядерних нейтрофілів на 21_шу добу після щеплення відповідно на 1,3 % (Р < 0,01) та 2 % (Р < 0,05), а у цуценят, щеплених без препаратів, знижувалась кількість лімфоцитів на 7_му та 21_шу доби на 4 та 3 % (Р < 0,01) відповідно.

На 7_му добу після першої вакцинації проти чуми та ПЕ на тлі румосолу у цуценят реєстрували підвищення кількості моноцитів на 2,4 % (Р < 0,05), а на тлі фоспренілу та без препаратів - зниження на 1 % (Р < 0,01) і 1,3 % (Р < 0,05) відповідно. Підвищення моноцитів на 2 % (Р < 0,01) у цуценят ІІІ_ї групи (контроль) та відповідне зниження у І_й і ІІ_й групах на 2,4 та 1,3 % (Р < 0,05) виявляли на 21_шу добу порівняно до 7_ї доби. Однак, кількість моноцитів нормалізувалась у цуценят І_ї і ІІІ_ї груп (Р < 0,05, Р < 0,01), а у групі щеплених на тлі фоспренілу - знижувалась на 2,3 % (Р < 0,001).

Фагоцитарна активність нейтрофілів значно зростала у групах щеплених цуценят з румосолом (8,4 % (Р < 0,01)) і фоспренілом (6,7 % (Р < 0,01)) на 7_му добу після вакцинації, тоді як у групі щеплених цуценят без препаратів цей показник становив 3,3 % (Р < 0,05).

Імунологічні показники щеплених цуценят на тлі триразового введення румосолу та фоспренілу вказують на стимуляцію післявакцинального імунітету порівняно до цуценят, імунізованих без препаратів (табл. 2).

На 7_му добу після вакцинації із застосуванням досліджуваних хіміопрепаратів у цуценят І_ї групи знижувався рівень Т- і В_клітин на 1,3 і 1,7 % (Р < 0,05), у цуценят ІІ_ї групи - на 3,5 і 1,6 % (Р < 0,05) відповідно, у цуценят контрольної групи, щеплених лише вакциною, кількість Т_хелперів підвищувалась на 1,7 % (Р < 0,05), а Т-супресорів - знижувалась на 2 % (Р < 0,05).

Таблиця 2

Динаміка імунологічних показників крові цуценят, щеплених вакциною DPA (М ± m, n = 3)

Показники, %	Група І (з румосолом)	Група ІІ (з фоспренілом)	Група ІІІ (без препаратів)
	до щеп- лення	7 доба	21 доба	до щеп- лення	7 доба	21 доба	до щеп- лення	7 доба	21 доба
Т-загальні клітини	53 ±1,0	51,7 ±0,3 *	52,7 ±0,3 *	53,5 ±0,3	50 ±0,6 **	51,7 ±0,3 * **	52,3 ±0,3	51,7 ±0,9	52 ±0,6
Т-хелпери	34,3 ±0,9	35,3 ±1,2	36,7 ±0,3 *	35,3 ±0,3	29,3 ±2,7	35,3 ±0,7	34,3 ±0,3	36 ±0,6 *	37 ±0,6 **
Т-супре-сори	17 ±0,6	16,3 ± 0,9	15,7 ± 0,7 *	17,3 ±0,3	19 ±3,2	16,3 ±0,3 *	18 ±0,6	16 ±0,6 *	16,3 ±0,3 *
Т-активні	3 ±0	1 ±0 ***	2,3 ±0,3 ** *	3 ±0	1,3 ±0,3 ***	2,7 ±0,3 * *	2,7 ±0,3	1,3 ±0,3 *	3,3 ±0,3 **
Т-термо- стабільні	4,3 ±0,3	2,7 ±0,3 **	3,3 ±0,3 *	4,3 ±0,3	2 ±0 ***	4 ±0 ***	4,3 ±0,3	2,7 ±0,3 **	3,3 ±0,3 **
Т-0	25,7 ±1,8	27,3 ±0,3	25,3 ±0,7 *	25,3 ±0,3	30 ±0,6	24,7 ±0,7 **	26,3 ±0,9	25,7 ±0,3	25,3 ±0,3
В-загальні клітини	23 ±0,1	21,3 ±0,3 *	22,3 ±0,3 **	22,3 ±0,3	20,7 ±0,3 **	23,7 ±0,3 ** *	21,0 ±0,6	21,3 ±0,7	22 ±0,6
НСТ	+	5 ±0	10 ±1,2 **	3 ±0 ** ***	5,3 ±0,88	10,3 ±0,3 **	4,7 ±0,3 ***	6 ±1,2	6,3 ±0,9	4 ±1,2
	++	7 ±0	13,3 ±0,3 ***	9,7 ±1,3 *	8 ±0,6	12,7 ±2,3	8,3 ±0,3	7,7 ±1,7	12,3 ±0,8	6 ±1,5 *
	+++	3 ±0,6	3,7 ±0,3	1 ±0 *** ***	2 ±0	2 ±0	1,3 ±0,3	2,7 ±0,3	1,7 ±0,3	2 ±0 *

Примітки: див. до табл. 1.

Уже на 21_шу добу після ревакцинації на момент формування вторинної імунної відповіді підвищувались імунологічні показники у цуценят, щеплених вакциною з препаратами, відносно 7_ї доби. Кількість Т- і В_клітин зростала на 1 і 1,7 % (Р < 0,05, Р < 0,01) та 1 і 3 % (Р < 0,01) відповідно, а також нормалізувалось співвідношення Тх/Тс. Кількість Т-хелперів збільшувалась на 1,4 і 6 % (Р < 0,01), а Т-супресорів знижувалась на 0,6 і 2,7 % (Р < 0,01) відповідно, що свідчить про стимуляцію імунної системи.

У цуценят, щеплених вакциною без препаратів, на 21_шу добу недостовірно змінювалися імунологічні показники, окрім Т_активних клітин, які були вищими на 2 % (Р < 0,01) відносно 7_ї доби.

Активність нейтрофілів у цуценят першої групи змінювалась за рахунок збільшення показників НСТ+ і НСТ++ відповідно на 5 і 6,3 % (Р < 0,01, Р < 0,001), у другої НСТ+ - на 5 % (Р < 0,01) на 7_му добу, тоді як у цуценят, щеплених вакциною без препаратів, цей показник не мав достовірних змін.

На рис. 1 наведені показники ІРІ та ЦІК у щеплених вакциною цуценят з препаратами порівняно до групи цуценят, вакцинованих без препаратів.

Рис. 1. Динаміка ІРІ та ЦІК у цуценят, щеплених проти чуми та ПЕ на тлі досліджуваних хіміопрепаратів.

Реєстрували достовірне підвищення ІРІ у групі І на 0,2 од. (Р < 0,05) на 7_му добу після щеплення та на 0,1 од. (Р < 0,05) - на 21_шу. У групі щеплених цуценят на тлі фоспренілу ІРІ спочатку зменшувався на 0,3 од. з подальшим збільшенням на 0,4 од. (Р < 0,01), що підтверджує стимулюючу дію румосолу та фоспренілу за вакцинації. У цуценят ІІІ_ї групи ІРІ спочатку збільшився на 0,2 од. (Р < 0,01), а на 21 добу - лише на 0,06 од. (Р < 0,01).

Рівень ЦІК підвищувався в усіх дослідних групах на 3, 29 і 3,0 од. екст. (Р < 0,05) на 7_му добу, а на 21_шу добу спостерігали зниження на 22, 32,4 і 10,6 од. екст. відповідно до груп.

Внутрішньом'язове зараження ізолятом парвовірусу ЄН_5/2 (ембріональний матеріал ІІ_го пасажу) на 14_ту добу цуценят, щеплених вакциною на тлі препаратів, зумовило зниження вмісту гемоглобіну на 13 і 10 %, кількості еритроцитів на 10,4 і 6,1 % та підвищення лейкоцитів на 26 і 24 %, ШОЕ - на 6,6 і 5,3 мм/год. на 3_тю добу (табл. 3).

На 9_ту добу у цуценят дослідних груп, інфікованих парвовірусом, гематологічні показники нормалізувались. Показник ШОЕ набував початкового значення тільки у цуценят, щеплених вакциною на фоні румосолу.

Таблиця 3

Динаміка гематологічних показників цуценят, щеплених вакциною

DPA після інфікування ізолятом парвовірусу ЄН_5/2 (М ± m, n = 3)

Показники	Група І (з румосолом)	Група ІІ (з фоспренілом)	Група ІІІ (без препаратів)
	до зара-ження	3 доба	9 доба	до зара-ження	3 доба	9 доба	до зара-ження	3 доба	9 доба
Гемоглобін, г/л	130 ±0	115 ±2,89 **	123,3 ±3,3 *	130 ±0	118 ±1,7 ***	130 ±0	125 ±2,9	113 ±1,7 *	125 ±2,9
Еритроцити, Т/л	5,3 ±0,03	4,8 ±0,06 ***	5,2 ±0,03	5,2 ±0,05	4,9 ±0,03 ***	5,1 ±0,03	5,2 ±0,06	4,9 ±0,03 ***	5,1 ±0,03
Лейкоцити, Г/л	6,7 ±0,18	9 ±0,09 ***	7,1 ±0,07 ****	7,4 ±0,3	9,7 ±0,3 **	7,3 ±0,3 *	7,2 ± 0,19	9,7 ±0,3 ***	8 ±0,2 **
Кольоровий індекс	0,81 ±0	0,75 ±0,02 **	0,8 ±0,02	0,9 ±0,02	0,8 ±0,01 **	0,83 ±0 **	0,79 ±0,01	0,8 ±0,02 **	0,8 ±0,02
ШОЕ, мм/год.	4,7 ±0,33	11,3 ±0,33 ***	4,7 ±0,3	3,7 ±0,3	9 ±0,6 ***	5,3 ±0,3 **	3,7 ±0,33	7,7 ±0,3 ***	5,7 ±1,2

Примітки: * - Р<0,05, ** - Р<0,01, *** - Р<0,001 (достовірність різниці показників на 3_тю та 9_ту доби після зараження по відношенню до тих, що були до зараження); * - Р<0,05, ** - Р<0,01, *** - Р<0,001 (достовірність різниці показників на 3_тю та 9_ту доби).

За аналізу лейкограми на 3_тю добу після зараження в усіх групах встановлено достовірне підвищення еозинофілів (Р < 0,01, Р < 0,001), паличкоядерних нейтрофілів (Р < 0,01, Р < 0,05), моноцитів на 2,4 і 1,6 % (Р < 0,001, Р < 0,01, Р < 0,05) та зниження кількості лімфоцитів і сегментоядерних нейтрофілів відповідно до груп.

ЦІК підвищувались в усіх дослідних групах на 3_тю та 9_ту доби відповідно у 3,5 і 3,2 (Р < 0,001, Р < 0,05), 1,5 і 2 (Р < 0,001, Р < 0,01) та 1,7 і 2,6 (Р < 0,001, Р < 0,01) разу, що свідчить про антигенний стимул імунної системи та активацію імунної відповіді, спрямованої на вилучення з організму чужорідних чинників.

Як свідчать результати, на 3_тю добу після інфікування ізолятом парвовірусу ЄН_5/2 реєстрували достовірне зниження Т- і В-клітин у цуценят І_ї та ІІІ_ї груп, щеплених на тлі румосолу та без препаратів (табл. 4).

У цуценят І_ї групи спостерігали зниження Т-клітин на 1,4 % і В-клітин на 1 %. У цуценят ІІ_ї групи кількість Т_клітин залишалась без змін, а В_клітин зменшилась на 2 %. Зниження рівня Т- і В_клітин на 1,7 і 0,7 % відповідно спостерігали у ІІІ_й групі інфікованих цуценят. На 9_ту добу після зараження нормалізувались показники Т-і В_клітин у І_й і ІІ_й групах, тоді як у ІІІ_й групі рівень Т- і В_клітин не змінювався.

На 3_тю добу після зараження порушувалась регуляторна система Т_хелперів і Т_супресорів. У цуценят І_ї і ІІ_ї груп реєстрували зниження Т_хелперів на 7 і 7,3 % та підвищення Т_супресорів на 5,3 і 6,4 % відповідно. У ІІІ_й групі кількість Т_хелперів зменшувалась на 8,3 %, Т_супресорів - на 7,7 %.

Таблиця 4

Показники клітинного імунітету після зараження ізолятом ЄН_5/2 цуценят, імунізованих проти парвовірусного ентериту і чуми на тлі румосолу й фоспренілу (М ± m, n = 3)

Показники, %	Група І (з румосолом)	Група ІІ (з фоспренілом)	Група ІІІ (без препаратів)
	до зара-ження	3 доба	9 доба	до зара-ження	3 доба	9 доба	до зара-ження	3 доба	9 доба
Т-загальні клітини	52,7 ±0,3	51,3 ±0,3 **	52,3 ±0,3 *	51,7 ±0,3	51,7 ±0,3	52,3 ±0,3	52 ±0,58	50,3 ±0,8 *	50,3 ±0,8
Т-хелпери	36,7 ±0,33	29,7 ±0,3 ***	36,3 ±0,3 **	35,3 ±0,7	28 ±0,6 ***	35,7 ±0,3 *	37 ±0,6	28,7± 1,8 **	34 ±0,6 **
Т-супре-сори	15,7 ±0,67	21 ±0,58 ***	15,7 ±0,3 *	16,3 ±0,3	22,7 ±0,3 ***	17 ±0,58	16,3 ±0,3	24 ±1,53 **	16,7 ±0,33
Т-активні	2,3 ±0,3	1,3 ±0,3 *	2 ±0 ** **	2,7 ±0,3	1 ±0 ***	1,7 ±0,3 *	3,3 ±0,3	1,3 ±0,3 **	1,3 ±0,3 **
Т-термо-стабільні	3,3 ±0,3	6,7 ±0,3 ***	3,7 ±0,3 **	4 ±0	6 ±0,58 **	4,3 ±0,3 ****	3,3 ±0,33	5,7 ±1,2 **	4,7 ±0,33 **
Т-0	25,3 ±0,67	27 ±0,58 *	26 ±0,6	24,7 ±0,6	26 ±0,58	25,7 ±0,3	25,3 ±0,3	27 ±0,58 **	27,3 ±1,2
В-загальні клітини	22,3 ±0,33	21,3 ±0,33 *	22,7 ±0,33 **	23,7 ±0,3	21,7 ±0,3 **	21,3 ±0,3 ***	22 ±0,58	21,3 ± 0,67	21,3 ±0,88

Примітки: див. до табл. 3.

На 3_тю добу в усіх групах відбувалось зниження ІРІ на 0,9, 1 і 1,1 од. (Р < 0,001) відповідно (рис. 2). На 9_ту добу ІРІ у дослідних групах збільшився за рахунок нормалізації співвідношення Т_хелперів і Т_супресорів. У щеплених вакциною з румосолом цуценят ІРІ відповідав нормальному значенню (2,3 од.). У другій групі (з фоспренілом) ІРІ знизився на 0,1 од., а у ІІІ_й групі - зменшився на 0,3 од.(Р < 0,001).

Фагоцитарна активність значно посилювалась на 3_тю добу після зараження у щеплених цуценят з румосолом та фоспренілом на 8,3 і 1,7 % (Р < 0,01) відповідно, що свідчить про активацію клітинної ланки імунітету, обумовлену введенням антигену. У цуценят, щеплених без препаратів, цей показник збільшився на 6,7 % (Р < 0,05). На 9_ту добу фагоцитарна активність у цуценят набувала вихідного значення на момент зараження.

Рис. 2. Результати досліджень ІРІ та фагоцитарної активності у щеплених цуценят після введення ізоляту парвовірусу ЄН_5/2.

У цуценят після інфікування парвовірусом ЄН_5/2 не спостерігали клінічного прояву хвороби, за винятком підвищення температури тіла на 0,5, 0,6 і 1,1 °С у 33, 33 і 67 % інфікованих цуценят І_ї, ІІ_ї і ІІІ_ї груп відповідно.

Титр антитіл у групах щеплених цуценят на тлі румосолу та фоспренілу був вищим на 1 і 1,3 log2 до парвовірусу та на 0,6 і 1,0 log2 до вірусу чуми порівняно до групи цуценят, щеплених без препаратів. А при подальшому інфікуванні рівень захисних антитіл до парвовірусу у щеплених цуценят на тлі препаратів зменшувався на 0,7 log2, а у цуценят, щеплених без препаратів - на 1,4 log2.

ВИСНОВКИ

У дисертації наведені дані щодо поширення у межах мегаполісу парвовірусного ентериту, чуми собак і їх асоційованого перебігу. Узагальнено результати з індикації, визначення біологічних властивостей та ідентифікації за допомогою РГА, РДП, ІФА, ПЛР і ЕМ зі встановленням етіологічного значення епізоотичних ізолятів збудників цих інфекцій, вивчення противірусної дії препаратів триазолінового ряду (ВПК_108 і румосол) й оптимізації щеплення цуценят з використанням румосолу.

Установлено поширення парвовірусного ентериту та чуми у 38,3 % імунізованих та 61,7 % не імунізованих собак, що характеризуються спалахами навесні та восени, віковими, породними та клінічними особливостями. Як моноінфекції парвовірусний ентерит і чума собак реєструються відповідно у 33,3 та 6,7 %, а асоційований перебіг - у 60 % випадків захворювання.

Від хворих собак виділено чотири епізоотичні ізоляти, два з яких (БН_3 та БП_6) за результатами ідентифікації у РДП, ІФА й ЕМ складають асоціацію парвовірусу з вірусом чуми собак. Титр інфекційності ізолятів ЄН_5/2 та БП_8 парвовірусу в курячих ембріонах становить 4,5 і 3,0 lg ЕІД50/0,2 см3, у РДП - 1:128 і 1:64 відповідно, а титр парвовірусу та вірусу чуми асоційованих ізолятів БН_3 і БП_6 у РДП сягає 1:64 та 1:16-1:64 відповідно до ізолятів. Електронною мікроскопією встановлено, що віріони парвовірусу є частками кубічної симетрії без капсидної оболонки, діаметр яких становить 20-30 нм, а віріони чуми собак мають округлу форму, 150-220 нм у діаметрі, вкриті оболонкою з виступами на поверхні.

За результатами ПЛР підтверджено, що ізоляти (ЄН_5/2 та БН_3) містять генетичний матеріал парвовірусу, а ізолят парвовірусу БН_3 додатково включає геном вірусу чуми собак.

Ізоляти парвовірусу та асоціації його з вірусом чуми розрізняються за гемаглютинуючими властивостями в залежності від видової належності еритроцитів. Титр гемаглютининів ізолятів парвовірусу (ЄН_5/2 та БП_8) й асоціації з вірусом чуми (БН_3, БП_6) у РГА з еритроцитами свиней змінюється впродовж пасажування від 1:64 до 1:8, а з еритроцитами котів - від 1:16 до 1:4. Ізолят БН_3, що складається з асоціації парвовірусу і вірусу чуми собак, характеризується нестабільною гемаглютинуючою здатністю до еритроцитів півня (1:32-1:8) і морських свинок (1:16).

Установлено, що препарати триазолінового ряду пригнічують репродукцію парвовірусу та вірусу чуми собак. Одноразове введення суміші вірусу чуми (штам ЕПМ) з ВПК_108 у зростаючих дозах 0,02, 0,04 і 2 мг/КЕ та парвовірусу з ВПК_108 і румосолом у концентрації 1 мг/КЕ знижують їх інфекційність на 1,25; 1,7 і 1,5 lg ЕІД50/0,2 см3 та 1,5 і 2,2 lg ЕІД50/0,2 см3 відповідно до вірусів і препаратів. Концентрація ВПК_108 і румосолу 0,25 мг/см3 на відміну від фоспренілу пригнічує до 48 годин прояв ЦПД у культурі ФЕК та знижує титр інфекційності парвовірусу на 1,2; 1 і 1,5 lg ТЦД50/0,5 см3 і вірусу чуми на 1,5 і 1,3 lg ТЦД50/0,5 см3 у суміші з румосолом і фоспренілом.

Румосол за триразового введення поспіль цуценятам у дозі 0,5 мг/кг вірогідно підвищує рівень гемоглобіну на 8,4 %, Т_клітин - на 3,7 %, ІРІ - на 0,7 од., фагоцитарну активність - на 8,3 %, ЦІК - на 16,1 одиниць екстинції, тоді як фоспреніл зменшує вміст гемоглобіну на 2,6 % і кількість еозинофілів на 1,3 %.

Триразове введення румосолу в дозі 0,5 мг/кг і фоспренілу з розрахунку 0,4 мг/кг маси тіла цуценят перед щепленням проти парвовірусного ентериту та чуми зменшує імуносупресивний вплив вакцинного вірусу, що проявляється підвищенням функціональної активності нейтрофілів на 8,4 і 6,7 %, показників Т- і В_клітин - на 1 і 1,7 % та 1 і 3 %, ІРІ - на 0,1 і 0,4 од. відповідно та стимулює гемо- та лейкопоез на 21_шу добу після щеплення. Титр антитіл до парвовірусу та вірусу чуми у групах цуценят, щеплених на тлі румосолу та фоспренілу, підвищується на 1,0-1,3 log2 та 0,6-1,0 log2 порівняно до групи цуценят, щеплених без препаратів.

У разі зараження імунізованих цуценят ізолятом ЄН_5/2 парвовірусу на тлі триразового введення поспіль румосолу та фоспренілу в дозах 0,5 і 0,4 мг/кг відповідно вірогідно підвищується кількість моноцитів на 2,4 і 1,6 % та ЦІК - у 3,5 і 1,5 разу, фагоцитарна активність - на 8,3 і 1,7 % на 3_тю добу та показники Т- і В_клітин і ІРІ на 9_ту добу порівняно до цуценят, щеплених без препаратів. Румосол і фоспреніл уповільнюють прояв клінічних ознак хвороби та знижують титри антитіл в інфікованих ізолятом парвовірусу ЄН_5/2 цуценят, щеплених на тлі препаратів, удвічі порівняно до щеплених без препаратів.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Запропоновано схему щеплення собак проти парвовірусного ентериту та чуми на тлі попереднього триразового введення поспіль румосолу. Окремі положення результатів цих досліджень увійшли до методичних рекомендацій «Застосування препарату румосол для підвищення поствакцинального імунітету цуценят», які затверджені Науково-методичною радою Державного комітету ветеринарної медицини України (протокол № 2 від 25 грудня 2008 р.).

Застосування препаратів похідних 1,2,4-триазолу (румосол, ВПК_108) у 0,5 %_й концентрації для зниження інфекційної активності вірусу чуми та парвовірусу собак (деклараційний патент на корисну модель України № 36330, 2008 р.).

Запропоновано для використання епізоотичний ізолят ЄН_5/2 парвовірусу в якості продуцента антигену для виготовлення типоспецифічної сироватки (деклараційний патент на корисну модель України № 44402, 2009 р.).

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Полушко, О. В. Мониторинг, специфическая профилактика и методы лечения чумы собак в г. Луганске [Текст] / О. В. Полушко // Зб. наук. праць Луганського нац. аграр. ун-ту : вет. науки. - 2005. - № 50/73. - С. 183-188.

Полушко, О. В. Деякі біологічні властивості вакцинного штаму вірусу чуми м'ясоїдних [Текст] / О. В. Полушко // Зб. наук. праць Луганського нац. аграр. ун-ту : вет. науки. - 2006. - № 63/86. - С. 125-128.

Пархоменко, Л. І. Первинна ізоляція вірусу чуми м'ясоїдних від собак [Текст] / Л. І. Пархоменко, О. В. Ільіна // Вісн. Житомирського держ. аграр. ун-ту. - 2007. - № 2 (19), т. 1. - С. 141-145. (Дисертантка провела дослідження щодо ізоляції вірус...