Вплив кріоконсервованих фібробластів на репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри в експерименті

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК 615.361.018.21.014.41:616.5- 002 - 003.93

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Вплив кріоконсервованих фібробластів на репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри в експерименті

14.01.35 - кріомедицина

Абрафікова Лілія Геннадіївна

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України.

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук, професор Грищенко Валентин Іванович Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків.

Офіційні опоненти:

Доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки, завідувач відділу експериментальної кріомедицини, Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, м. Харків;

Доктор медичних наук, професор кафедри клінічної лабораторної діагностики ХМАПО, Якимова Тамара Петрівна, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, м. Харків.

Захист відбудеться "19" квітня 2011 р. о 13³⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, за адресою: 61015, м.Харків, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий "18" березня 2011 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, професор Л.Ф. Розанов.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Поверхневі рани, термічні та хімічні опіки шкіри, а також підшкірно-жирової клітковини складають 5-12 % від загальної кількості побутових та виробничих травм. Існуючі протоколи та методичні рекомендації з надання спеціалізованої та медичної допомоги при цій патології передбачають інфузійну, детоксикаційну, дегідратаційну, антибіотико- та гормонотерапію. Закриття ран і глибоких ушкоджень шкірних поверхонь пов'язано з цілим переліком ускладнень (Сандомирский Б.П., 1992), які затримують загоєння ран, що не виключає порушення формування грануляційної тканини та епітелізації з розвитком косметичного дефекту або виразок (В.П. Туманов, Г. Герман, 2000; В.Н. Видении, 2004; А.В.Варданян, 2004).

На даний час дослідники приділяють велику увагу можливості стимулювання репаративних процесів у рановій поверхні та осередках запалення за допомогою фібробластів (А.И. Ерохин, 2002; А.Н. Петров, 2005). Це обумовлено здатністю цих клітин продукувати компоненти позаклітинного матриксу, які приймають участь у репаративних процесах (А.Г. Попандопуло зі співавт., 2003; Aoki S. еt аl., 2004). У більшості робіт автори використовували або первинно культивовані фібробласти, або фібробласти, які культивували після кріоконсервування (В.Д. Федоров зі співавт., 1996; Л.І. Будкевич зі співавт., 2000). Питання ефективного клінічного застосування кріоконсервованих фібробластів безпосередньо після відігріву вивчено недостатньо. Це пов'язано з тим, що стрес, викликаний процесом кріоконсервування, призводить до тимчасового порушення ряду функцій клітин (А.О. Цуцаєва зі співавт., 1991).

У клінічній практиці доволі часто виникає необхідність гіпотермічного зберігання фібробластів перед застосуванням, а в технологіях отримання фібробластів - зберігання біоптатів шкіри перед культивуванням.

Отже, використання культивованих фібробластів при різних поверхневих ранах, особливо при опікових травмах різного генезу, являється актуальною проблемою сучасної медицини. А використання з цією метою фібробластів безпосередньо після кріоконсервування та можливість гіпотермічного зберігання біоптатів шкіри для отримання фібробластів, потребують експериментального вивчення.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках планової НДР ІПКіК НАН України №20: «Вивчення впливу умов кріоконсервування і зберігання на дріжджоподібні гриби, постнатальні фібробласти і культуру клітин, що перевиваються», № держреєстрації 0104U003919.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було порівняльне дослідження впливу кріоконсервованих та нативних фібробластів на репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри у щурів та вивчення можливості отримання фібробластів з біоптатів шкіри після кріоконсервування та гіпотермічного зберігання.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

1. Провести порівняльне вивчення ефективності методів отримання фібробластів після ферментативної обробки біоптатів та культивування механічно подрібнених біоптатів.

2. Дослідити можливість отримання фібробластів із біоптатів шкіри після зберігання в умовах гіпотермії і кріоконсервування.

3. Провести порівняльне вивчення динаміки репаративних процесів у шкірі після нанесення у зони дефекту кріоконсервованих і нативних фібробластів, іммобілізованих у метилцелюлозному гелі (МЦ) та колагеновій губці «Геласпон».

4. Вивчити динаміку змін показників гострої фази запалення (ПГФЗ) у сироватці крові щурів після нанесення у зону дефекту кріоконсервованих і нативних фібробластів.

Об'єкт дослідження - репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри у щурів після нанесення у зону дефекту кріоконсервованих і нативних фібробластів.

Предмет дослідження - кріоконсервовані фібробласти щурів та біоптати шкіри щурів після гіпотермічного зберігання.

Методи дослідження - кріобіологічні, морфологічні, біохімічні, гістоморфологічні, культивування клітин in vitro, моделювання асептичного запалення шкіри, методи статистичної обробки отриманих результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше показано, що внесення в область дефекту кріоконсервованих фібробластів, без додаткового культивування, забезпечує вірогідне скорочення термінів його загоєння. Різниця у стимулюючій дії на реперативні процеси фібробластів до та після кріоконсервування відсутня. Експериментально обгрунтовані переваги іммобілізації фібробластів в МЦ гелі при нанесенні їх на дефект шкіри.

Виявлено, що динаміка зміни ПГФЗ корелює з гістоморфологічними змінами в тканинах після нанесення на дефект кріоконсервованих та нативних фібробластів. Найбільшу стимулюючу дію на репаративні процеси чинять життєздатні клітини фібробластів. Препарати з маси зруйнованих фібробластів виявляє менш виражену стимулюючу дію.

Показана можливість отримання фібробластів з біоптатів шкіри після їх гіпотермічного зберігання протягом 14 діб. Експериментально обгрунтовано склад середовищ для гіпотермічного зберігання біоптатів шкіри з метою наступного отримання фібробластів.

Практичне значення одержаних результатів. Експериментально обгрунтовано використання кріоконсервованих фібробластів без додаткового культивування для стимуляції репаративних процесів у зоні дефекту шкіри, викликаного асептичним запаленням, що може бути використано після клінічних випробувань у практичній медицині. Одержані дані дозволяють внести в існуючі протоколи отримання, культивування та використання фібробластів можливість гіпотермічного зберігання біоптатів шкіри протягом 14 діб, а суспензій фібробластів - протягом 3 діб.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом вивчено і узагальнено дані вітчизняної та закордонної літератури за темою дисертаційної роботи, здійснено експериментальну частину роботи, проведено аналіз отриманих даних та їх статистичну обробку. В опублікованих із співавторами працях особистий внесок здобувача полягає:

у роботі [1] - вивчено біологічні властивості фібробластів (адгезивні, проліферативні можливості та здатність до формування моношарового зросту) після кріоконсервування;

у роботах [2, 15, 16] - показана можливість отримання фібробластів після гіпотермічного зберігання біоптатів шкіри людини та щурів у різних середовищах;

у роботах [3, 4, 18] - змодельовано асептичне запалення шкіри щурів; обчислена площа загоєння поверхні ран та вивчені в динаміці ПГФЗ крові тварин; підібрано носії для аплікації фібробластів на ранову поверхню; приготовано та вивчено морфогістологічні препарати з біоптатів шкіри щурів;

у роботах [5, 19] - проведено порівняльне дослідження впливу нативних, кріоконсервованих фібробластів і маси зруйнованих фібробластів на загоєння дефектів шкіри щурів;

у роботі [6] - досліджено вплив екстракту плаценти на кріорезистентність клітин фібробластів;

у роботах [7 - 13] - відпрацьовано методи одержання фібробластів із шкірних біоптатів. Проведено порівняльне вивчення збереженості біоптатів і фібробластів, кріоконсервованих в різних середовищах;

у роботі [14] - досліджено вплив фібробластів на продукцію мононуклеарними клітинами цитокінів.

у роботі [17] - вивчено вплив екстракту плаценти людини та кріопротекторів ДМСО і гліцерину на збереженість клітинних мембран фібробластів.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідали та обговорювали на наукових форумах: I та II Міжнародні конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології» (11-14 квітня 2005 р., 21-24 березня 2006 р., м. Львів, Україна); конференція «Сохранение генетических ресурсов» (13-17 листопада 2006 р., м. Москва, Росія); конференція молодих вчених «Медична наука: сучасні досягнення та інновації» (23 листопада, 2006 р., м. Харків, Україна); III Міжнародна медико-фармацевтична конференція студентів і молодих вчених (3-5 квітня, 2006 р., м. Чернівці, Україна); 60 ювілейна науково-практична конференція студентів та молодих вчених «Актуальні проблеми сучасної медицини» (листопад 2006 р., м. Київ, Україна); конференція «Modern problems of Microbiology and Biotehnology» (28-31 травня, 2007 р., м. Одеса, Україна); конференція «Актуальні питання сучасної медицини» (26-28 березня, 2008 р., 24-26 березня 2010 р., м. Харків, Україна); конференція молодих вчених «Холод в биологии и медицине» (29-30 травня 2008 р., м. Харків, Україна); Всеросійська конференція з міжнародною участю «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток» (18-20 червня, 2008 р., м. Самара, Росія); наукова конференція з міжнародною участю «Нові кріобіотехнології для розвґязання фундаментальних і прикладних задач медицини» (26-28 листопада 2008 р., м. Харків, Україна); Всеукраїнська науково-практичній конференція, «Медична наука-2009» (10-11 грудня 2009 р., м. Полтава, Україна).

Публікації. Головні положення дисертації викладено у 19 наукових працях, з яких 5 статей - у фахових журналах, 1 патент на корисну модель, 13 тез - у збірниках національних та міжнародних наукових конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 160 сторінках, з яких 133 сторінки основного змісту та 27 сторінок складає список використаної літератури, який містить 265 джерел. Робота містить вступ, основну частину, яка складається з трьох розділів (огляд літератури за темою дисертації, розділів ”Матеріали і методи дослідження” та “Результати власних досліджень”), висновки, список використаної літератури. Дисертація містить 59 рисунків та 15 таблиць.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. Експерименти виконували на 220 самцях безпорідних щурів, масою 165-175г, віком 4 місяця, на базі віварію ІПКіК НАН України. Маніпуляції з тваринами проводили згідно з „Загальними принципами експериментів на тваринах”, які схвалені III Національним конгресом з біоетики (Київ, 20.09.07 р.), та узгоджені з положеннями «Європейської Конвенції про захист безхребетних тварин, які використовують для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985 р.).

Отримання біоптатів шкіри проводили за стандартним протоколом з внутрішньої поверхні стегна тварин. Біоптати розміром 1х1 см² розміщували у пеніцилінові флакони з розчином Хенкса з додаванням антибіотика (100 ОД/мл канаміцина).

Методи отримання фібробластів з біоптатів шкіри щурів

1. Ферментативний метод. Використовували метод обробки шкірних біоптатів сумішшю розчинів трипсину та колагенази з наступним культивуванням отриманих фрагментів (Freshney, 1987).

2. Метод культивування шкірних біоптатів. Використовували метод описаний А.Г. Попандопуло зі співавторами (2003). Біоптати розміром 1-2 мм² викладали у культуральні флакони і витримували 30 хв у СО₂ - інкубаторі. По закінченню цього часу додавали ростове середовище та інкубували 5-7 діб при температурі 37С до формування моношару.

Зберігання біоптатів шкіри та фібробластів в умовах гіпотермії. Біоптати шкіри розташовували у флаконах з розчином Хенкса, сироваткою крові щурів та середовищем 199 з 10% сироватки крові щурів і зберігали при 4?С.

Суспензію дермальних фібробластів з концентрацією 1х10⁶ кл/мл зберігали при температурі 4С у розчині Хенкса або середовищі 199. Їх збереженість визначали методом суправітального фарбування трипановим синім (Stolarek R et al., 1998).

Функціональну активність біоптатів шкіри щурів вивчали за здатністю міграції фібробластів з дерми. Збереженість фібробластів у суспензії визначали методом суправітального фарбування за допомогою трипанового синього, за адгезивною здатністю (Кузнецов С. Л. зі співавт., 2004) та швидкістю формування моношару (O. Hayes et al., 2005).

Культивували фібробласти при температурі 37?С у живильному середовищі 199 з додаванням ембріональної сироватки великої рогатої худоби (ВРХ) та 100 ОД/мл канаміцина.

З поверхні культуральних флаконів фібробласти знімали сумішшю 0,02% розчину Версена та 0,25% трипсина у співвідношенні 4:1 (Ночевой В.Т зі співавт., 2000). Клітини пасивували кожні 5-7 діб.

Кріоконсервування біоптатів шкіри та фібробластів щурів. Шкірні біоптати кріоконсервували у ембріональній сироватці ВРХ; ембріональній сироватці з 10% ДМСО (диметилсульфоксид) або середовищі 199. Час інкубації шкірних біоптатів з ДМСО до охолодження складав 30 хв (А.В. Пахомов зі співавт., 2007).

Суспензію фібробластів заморожували у ембріональній сироватці ВРХ та 10% розчині ДМСО на ембріональній сироватці ВРХ. Заморожування біоптатів та суспензії фібробластів проводили на програмному заморожувачі «Cryosan» з початковою швидкістю 1?С/хв від кімнатної температури до -40?С, потім 10?С/хв від температури -40?С до -80?С з наступним зануренням у рідкий азот. Шкірні біоптати та фібробласти щурів зберігали при температурі -196?С. Відігрівали зразки на водяній бані при температурі 41 ?С протягом 3-4 хв.

Оцінка можливої цитотоксичної дії носіїв. В якості носіїв для фібробластів були використані колагенова губка «Геласпон» (A.M. Хилькин зі співавт., 1974) та МЦ гель (О.І. Гончарук зі співавт., 2004). Суспензію клітин фібробластів змішували у відношенні 1:1 з 3% розчином МЦ гелю або наносили на шматочки губки «Геласпон» розміром 1х1 см. Зразки інкубували у ростовому середовищі при 37С. Збереженість фібробластів, які інкубували протягом доби з МЦ гелем та протягом 3 діб на губці «Геласпон», визначали по здатності клітин формувати моношар при подальшому культивуванні у ростовому середовищі.

Нанесення фібробластів, іммобілізованих на носіях, на дефект шкіри. Суспензію клітин у розчині Хенкса змішували з 3% МЦ у співвідношенні 1:1 та наносили на область дефекту шкіри з розрахунку 1х10⁵ кл/см², що складало 0,3 мл готового препарату. На губку «Геласпон» також наносили суспензію фібробластів у розчині Хенкса з розрахунку 1х10⁵ кл/см². Губку інкубували протягом години при температурі 37?С, після чого переносили на поверхню дефекту.

Асептичне запалення шкіри моделювали шляхом підшкірного введення 0,5 мл 9% розчину оцтової кислоти (О.В. Стефанов, 2001). На 7 добу, з моменту введення оцтової кислоти, формувався дефект шкіри, який залишався відкритим протягом усього експерименту.

Визначення площі некрозу дефектів шкіри щурів проводили за методом Л.Н. Попової (Л.П. Попова, 1970; Л.В. Беркало зі співавт., 2003). Отримані дані щодо площі дефектів сканували та розраховували за допомогою комп'ютерної програми Axio Vision Rel 4.7. Планіметрію рани здійснювали до початку лікування, а також на 7, 14 та 21 добу експерименту.

Безклітинну масу зруйнованих фібробластів отримували шляхом трьохкратного занурення ампул із суспензією фібробластів в середовищі 199 у рідкий азот з наступним відігрівом при температурі 41^?С.

Отримання сироватки крові безпорідних щурів проводили за стандартними методиками, які описані у посібнику (І.П. Западнюк зі співавт., 1983).

Дослідження ПГФЗ у сироватці крові щурів проводили на 1, 7, 14 та 21 добу розвитку дефекту. Контролем були аналогічні показники сироватки крові інтактних тварин. Вміст сіромукоїдів, церулоплазміну, глікопротеїдів, циркулюючих імунних комплексів (ЦІК), С-реактивного білку (СРБ) досліджували за уніфікованими методами лабораторної діагностики (Наказ МЗ СРСР № 1175 від 21.11.1979 р. «Об унифицировании клинических лабораторных методов исследования»). Дослідження проводили на базі акредитованих лабораторій Харківської міської дитячої лікарні (ХМДБ) №16 та Харківського міського центру клінічної імунології (ХМЦКІ). Використовували стандартні комерційні набори реактивів і контрольних сироваток.

Для гістоморфологічних досліджень на 1, 7, 14, 21 добу після формування дефекту проводили забір зразків шкіри у тварин з ранового та прилеглого простору. Шкірні лоскути фіксували у 10%-му нейтральному формаліні з наступною заливкою у целоїдин-парафіновій суміші (О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий 1971). Аналіз гістологічних зразків проводили у світловому мікроскопі Jenaval (Carl Zeiss, Jena, GDR). Ступінь зрілості грануляційної тканини та інтенсивність епітелізації ранового дефекту оцінювали за загально прийнятою 5-бальною шкалою: 0 - відсутня ознака; 1 - слабка; 2 - помірна; 3 - ярко виявлена; 4 - різко виявлена ознака (В.В. Соколовський, 1971).

Щурів розподіляли на 8 груп по 26 тварин у кожній: 1- процес загоєння дефекту протікав природним шляхом (контроль); 2 - нанесення на дефект МЦ гелю; 3 - нанесення нативних фібробластів в МЦ гелі; 4 - нанесення кріоконсервованих фібробластів в МЦ гелі; 5 - нанесення безклітинної маси зруйнованих фібробластів в МЦ гелі; 6 - нанесення колагенової губки «Геласпон»; 7 - нанесення нативних фібробластів на колагеновій губці «Геласпон»; 8 - нанесення кріоконсервованих фібробластів на колагеновій губці «Геласпон».

Статистичну обробку отриманих результатів проводили з використанням компьютерноъ програми «Statistica v6.0». Значення р<0,05 вважались статистично вірогідними.

Результати власних досліджень та їх аналіз

Отримання фібробластів з біоптатів шкіри після ферментативної обробки та механічного подрібнення з наступним культивуванням. Після дезагрегації біоптатів шкіри ферментами лише 1/3 отриманих клітин адгезувала до поверхні культурального матраса. Ріст фібробластів з адгезованих клітин не спостерігали.

При культивуванні фрагментів механічно подрібнених біоптатів шкіри спостерігали адгезію, проліферацію і формування моношару з виходом фібробластів на 6-7 добу. У всіх наступних експериментах фібробласти отримували шляхом культивування механічно подрібнених біоптатів шкіри.

Вивчення впливу гіпотермічного зберігання і кріоконсервування на вихід фібробластів з біоптатів шкіри. Встановлено, що біоптати шкіри, які зберігали при 4?С протягом 14 діб у розчині Хенкса та сироватці крові щурів, не втрачали здатності до формування зони росту фібробластів. При цьому здатність до виселення фібробластів залежала від середовища та терміну зберігання. Біоптати після зберігання у сироватці крові щурів протягом 7 діб давали вихід фібробластів на 7-9 добу наступного культивування, а протягом 14 діб - на 16-18 добу. При гіпотермічному зберіганні шкірних біоптатів у розчині Хенкса протягом 7 діб виселення фібробластів починалося на 9-10 добу, а протягом 14 діб - на 14-15 добу. При цьому фібробласти, отримані з біоптатів, які зберігалися у розчині Хенкса протягом 14 діб, мали слабку адгезію та розпластування і не формували моношар. При зберіганні біоптатів шкіри в середовищі 199 з 10% сироватки крові щурів виходу клітин не спостерігали.

При культивуванні шкірних біоптатів, попередньо заморожених при -196?С у всіх використаних консервуючих середовищах, фібробласти не формувались.

Збереженість фібробластів після гіпотермічного зберігання та кріоконсервування. При гіпотермічному зберіганні фібробластів у середовищі 199 на 3 добу збереженими залишалися 42,12% клітин, а в розчині Хенкса - 36% клітин. Через 96 годин в обох середовищах клітини гинули (табл.).

Кількість життєздатних фібробластів після зберігання в різних середовищах в умовах гіпотермії

Середовище зберігання	Термін зберігання при 4° С (години)	Кількість збережених клітин, % від загальної кількості
		±	Р1	Р2
Середовище 199	Контроль	90,52±1,90	-	-
	24	78,76±5,51	<0,05	-
	48	67,20±4,49	<0,05	<0,05
	72	42,12±3,49	<0,05	<0,05
	96	0	-	-
Розчин Хенкса	Контроль	92,8±1,60	-	-
	24	70,10±4,5	<0,05	-
	48	58,01±3,89	<0,05	<0,05
	72	36,07±2,7	<0,05	<0,05
	96	0	-	-

Примітка: P₁ - рівень довірчої вірогідності відмінностей між контролем і експериментом; Р₂ - рівень довірчої вірогідності відмінностей між збереженістю протягом 24 та 48, 72 і 96 годин.

Встановлено, що у зразках з фібробластами, суспендованими в середовищі 199, при заморожуванні до -196?С, всі клітини гинули, в ембріональній сироватці збереженість складала 66,4%, у ембріональній сироватці з 10% ДМСО - 84,7%. При зберіганні протягом 2 років (термін зберігання) в 2 останніх середовищах додаткової загибелі клітин не виявлено.

При інкубуванні фібробластів протягом 24 годин в ростовому середовищі з додаванням 1,5% МЦ гелю або спільно з губкою «Геласпон» цитотоксична дія носіїв була відсутня. Після пересіву клітини давали моношаровий ріст. Строки формування моношару не відрізнялись від контрольних зразків.

Вивчення впливу нативних та кріоконсервованих фібробластів на процеси регенерації шкірних дефектів. Середня площа дефекта в день його формування у всіх щурів складала 341мм². Повне загоєння і закриття дефекту шкіри у тварин контрольної групи з природним загоєнням спостерігали на 25-28 добу. На 1 добу утворення ранового дефекту у цій групі він був заповнений некротичною масою, густо інфільтрованою нейтрофільними лейкоцитами. У глибині дефекту виявляли залишки сполучнотканих волокон дерми і м'язів. На 7 добу на поверхні дефекту зберігалась сукровато-фібринозна кірка. Одна третина центральної частини дефекту була заповнена грануляційною тканиною з хаотично розташованими молодими фібробластами, диференційованими лімфоцитами, нечисленними нейтрофілами. На 14 добу поверхня дефекту була більш часто покрита кіркою. Крайова ділянка дефекту була представлена достатньо зрілою грануляційною тканиною у поверхневому шарі.

Було відмічено розростання епідермісу з контракцією-інвагінацією країв здорової шкіри у крайовій зоні дефекту. На 21 добу у 50% щурів поверхня рани була повністю закрита потовщеним епітелієм з диференціюванням шарів. У верхніх шарах центрального відділу дефекту тканина мала вигляд клітинного детриту, у нижніх - волокнистого рубця. У другої половини щурів новоутворений епітелій не повністю покривав ранову поверхню. На 28 добу у всіх щурів на місці дефекту шкіри спостерігався добре сформований волокнистий рубець.

У групі щурів, яким на дефект шкіри наносили МЦ гель на 7 добу площа закриття ран була вірогідно більшою, ніж у контрольній групі, та складала 62,2% від початкової площі шкірного дефекту, а на 14 добу - 92,8%. На 21 добу ранова поверхня повністю загоювалася. Гістоморфологічні показники також свідчили про більш швидке формування грануляційної тканини та рост новоутвореного епітелію у порівнянні з контрольною групою. На 25 добу у 100% щурів був сформований рубець.

При нанесенні на поверхню рани губки «Геласпон» на початкових строках процес закриття ран уповільнювався порівняно з попередньою групою. На 7 добу площа загоєння ран складала 4,65%, на 14 добу - 57%. Потім процесс закриття ран прискорювався і до 21 доби площа закриття ран складала 96,6%, на 25 добу рани повністю загоювались. На 7 добу у цій групі щурів стан тканин у дефекті відрізнявся від стану тканин у контрольній групі. Значна частина дефекту була заповнена фібриноїдно-некротичною масою з нейтрофільними лейкоцитами. Під нею розташовувалась грануляційна тканина з поодинокими фібробластами, макрофагами, лімфоцитами та низькодиференційованими клітинами і поодинокими кровоносними судинами. У крайових ділянках дефекту грануляційна тканина мала підвищену васкуляризацію та містила фібробластоподібні клітини. На 14 добу крайові ділянки дефекту мали достатньо зрілу грануляційну тканину з меншим вмістом у ній макрофагів та лімфоцитів. Поверхня дефекту покрита кірковим шаром. Виявлена помірна крайова епітелізація дефекту. З'являлись ділянки здорової шкіри з інвагінацією по краю зони дефекту. На 21 добу дефекти загоювались у 100% щурів. На ранових поверхнях формувався волокнистий рубець, прикритий епітеліальним пластом з чітким диференціюванням шарів.

У групі щурів, яким на дефект шкіри наносили нативні фібробласти, іммобілізовані у МЦ гелі, на 7 добу площа закриття ран складала 64,9%, а на 14 добу - 98,1%. На 21 добу у 100% щурів шкірний дефект загоювався. Відповідно динаміці площі закриття ран вже на 7 добу у центральному відділі дефекту сформувався фібріноїдно-детритний шар, до якого примикала помірна за ступенем зрілості грануляційна тканина з новозформованими кровоносними судинами, ознаками волокноутворення. Спостерігали сформовану, але недозрілу сполучну тканину та початок контракції плаского епітелія на рановий дефект. На 14 добу у 66,7% щурів було відмічена повна епітелізація шкірного дефекту. У 33,3% щурів зберігався невеликий дефект з активним ростом зновзформованого епітелію. На місці грануляційної тканини була зріла та зформована зновутворена сполучена тканина. На 21 добу у всіх щурів дефект шкіри загоювався, на місці репарації рани була молода сполучена тканина, але без додатків шкіри.

У групі щурів, яким на поверхню рани наносили нативні фібробласти іммобілізовані на колагеновій губці «Геласпон», площа закриття ран на 7 добу складала 20,8%, на 14 добу -74,5%, на 21 добу - 99,18%. Поверхня шкірного дефекту була покрита щільною кіркою, під якою розташовувався фібринозно-некротичний шар, а під ним - грануляційна тканина, яка мала помірну кількість кровоносних судин і багато хаотично орієнтованих фібробластів. фібробласт біоптат кріоконсервування

На 14 добу об'єм фібринозно-детритного шару зменшувався, зрілість грануляційної тканини змінювалась залежно від місця локалізації у дефекті. Спостерігалась помірна крайова епітелізація. На 21 добу дефект загоювався з формуванням волокнистого рубця.

В групі щурів, яким на поверхню рани наносили кріоконсервовані фібробласти, іммобілізовані в МЦ гелі, площа закриття ран на 7 добу складала 71,5%, на 14 добу - 98,1%. На 21 добу рани загоювались у 100% тварин.

У тварин цієї групи також на 7 добу в зоні дефекту спостерігали зрілу грануляційну тканину з ознаками волокноутворення та крайовим ростом епітелію. На 14 добу закінчувалася епітелізація зони дефекту з формуванням волокнистої структури та чітким диференціюванням шарів. На 21 добу у 100% щурів спостерігали повне загоєння дефекту з формуванням волокнистого рубця.

У группі щурів, яким на поверхню рани наносили кріоконсервовані фібробласти на колагеновій губці «Геласпон», площа закриття ран на 7 добу складала 26,1%, на 14 добу -75,4%, на 21 добу рани загоювались у 100% щурів. На початкових строках загоєння губка «Геласпон» міцно прикріпилась до ранової поверхні, що призводило до додаткової травматизації ранового дефекту, а в ряді випадків - до виділення ексудату. На 7 добу відносно помірний фібринозно-некротичний шар розташовувався по всій ширині дефекту, який був покритий щільною кіркою. Під ним розташовувалась сполучена тканина з помірною кількістю фібробластів і молодих кровоносних судин.

На 14 добу об'єм фібринозно-некротичного шару в зоні дефекту складав 1/4 від загального об'єму ранової поверхні. На межі дефекту з прилеглою тканиною була помітна контракція здорової шкіри в зону дефекту. На 21 добу рани загоювались у 100% щурів із формуванням волокнистого молодого рубця. Ранову поверхню покривав знов зформований багатошаровий плаский епітелій.

При нанесенні на ранову поверхню маси зруйнованих фібробластів на 7 добу площа закриття ран складала всього 0,13%, на 14 добу - 27,48%, на 21 добу - 65,5%. Повне загоєння відбувалось на 25-26 добу. На 7 добу верхні шари дефекту являли собою некротично-детритну масу, що покривала незрілу грануляційну тканину, яка розташувалась замість підшкірно-жирової тканини. У суміжних з дефектом ділянках шкіри спостерігали процес запалення тканин. На 14 добу у тканині, яка заповнювала зону дефекту, зберігався поверхневий деструктивний шар. Крайовий ріст новоутвореного епітелію був помірним. На 21 добу більшу частину центральної зони дефекту заповнювала грануляційна тканина, збагачена кровоносними судинами, горизонтально орієнтованими тонкими колагеновими волокнами та множинними фібробластами.

При вивченні динаміки змін ПГФЗ було встановлено, що на 1 добу виникнення дефекту рівень Гл зростав у 1,6 раза, Ц - у 1,8 раза, С - у 5,5 раза, ЦІК - у 3,4 раза, СРБ - у 3,6 раза. Усі ПГФЗ в контрольній групі з природним загоєнням дефекту відновлювались до показників норми на 14-21 добу. Зростання концентрації ПГФЗ у всіх дослідних групах корелювало з динамікою процесів регенерації.

Таким чином, проведені дослідження свідчать про те, що нанесення на ранову поверхню фібробластів призводить до вираженої стимулюючої дії репаративних процесів. Вперше показано, що вираженість стимулюючої дії на ранові процеси фібробластів безпосередньо після кріоконсервування не відрізняється від стимулюючої дії культивованих фібробластів. Особливо важливі для клінічної практики прояви цієї стимулюючої дії на 7 добу спостереження. Якщо після нанесення нативних та кріоконсервованих фібробластів в цей термін вже починався процес утворення пласту плаского епітелію на поверхні дефекту, то в групі з природним загоюванням цього не спостерігали. Також в зазначених дослідних групах щурів була більш виражена динаміка інших гістологічних ознак загоєння.

Повне загоювання ран в ціх групах відбувалося раніше (на 21 добу). Про однаково виражену стимулюючу дію на репаративні процеси нативних та кріоконсервованих фібробластів свідчать кореляція зростання та відновлення показників концентрації позитивних реактантів гострої фази запалення.

Висновки

Актуальною задачею медицини є обгрунтування можливості використання кріоконсервованих фібробластів для стимуляції репаративних процесів у ранових поверхнях з метою скорочення строків їх загоєння та зменшення ризику утворення косметичних дефектів або виразок. В роботі проведені експериментальні дослідження, в яких була показана терапевтична ефективність кріоконсервованих алогенних фібробластів без додаткового культивування на моделі асептичного запалення шкіри у щурів. Була встановлена відсутність достовірної різниці у стимулюючій дії нативних та кріоконсервованих фібробластів на процеси загоєння шкірних дефектів.

1. Нативні та кріоконсервовані фібробласти, які наносили на шкірний дефект при експериментальному асептичному запаленні шкіри у щурів, виявляли вірогідну стимулюючу дію на репаративні процеси. Ця дія проявлялася у більш швидкому загоєнні ран, зменшенні фібриноїдно-некротичного шару в дефектах шкіри, швидкості формування грануляційної тканини та інтенсивності росту епітелію на поверхні дефекту. Різниці між стимулюючою дією на репаративні процеси нативних і кріоконсервованих фібробластів відсутні.

2. Метилцелюлозний гель виявляє помірно виражений терапевтичний ефект при нанесенні на ранову поверхню. Процеси регенерації у шкірних дефектах були більш виражені при нанесенні на ранову поверхню препаратів кріоконсервованих та нативних фібробластів, іммобілізованих у МЦ гелі, у порівнянні з препаратами фібробластів, іммобілізованими на колагеновій губці «Геласпон».

3. Зростання концентрації позитивних реактантів гострої фази запалення при утворенні шкірних дефектів та їх подальше відновлення до норми корелюють з динамікою процесів регенерації в ушкоджених тканинах у всіх експериментальних групах щурів. Відновлення вмісту цих білків найбільш виражено при нанесенні на рани препаратів нативних та кріоконсервованих фібробластів.

4. Отримання фібробластів шляхом культивування механічно подрібнених біоптатів шкіри щурів більш ефективне, ніж отримання фібробластів методом ферментативної обробки.

5. Отримання фібробластів з біоптатів шкіри щурів можливе після їх гіпотермічного зберігання протягом 14 діб у сироватці крові щурів. Вихід фібробластів з біоптатів шкіри щурів, які зберігали при температурі 4°С, у сироватці крові щурів, а також подальше формування моношару спостерігали пізніше, ніж при культивуванні біоптатів, які не піддавали зберіганню. На відміну від гіпотермічного зберігання, вихід фібробластів з кріоконсервованих біоптатів шкіри щурів не відбувався.

6. Фібробласти, отримані з біоптатів шкіри щурів, зберігали життєздатність при гіпотермічному зберіганні у розчині Хенкса та у середовищі 199 протягом 48 годин. Після зберігання протягом 72 годин у вище згаданих середовищах фібробласти гинули. Кріоконсервування фібробластів у ембріональній сироватці ВРХ та в ембріональній сироватці ВРХ з 10 % ДМСО забезпечувало високу збереженість фібробластів.

Перелік опублікованих робіт

1. Абрафикова Л.Г. Влияние условий криоконсервирования на сохранность кожи и фибробластов человека / Абрафикова Л.Г, Петренко Т.Ф., Высеканцев И.П // «Проблемы криобиологии» - Харьков.- 2008. - Т. 18, №3, С. 275 - 278.

2. Абрафикова Л.Г. Гипотермическое хранение и криоконсервирование в технологии получения фибробластов из кожи человека / Абрафикова Л.Г, Высеканцев И.П., Петренко Т.Ф. // Проблемы криобиологии.- Харьков.-2008.- №1.-Т.18.- С. 91-95.

3. Абрафикова Л.Г/ Роль аллофибробластов в процессах регенерации ран / Абрафикова Л.Г, Петренко Т.Ф., Кощий С.В., Гончарук Е.И. // Журнал «Актуальні проблеми сучасної медицини: Вестник Украинской медицинской стоматологической академии», Полтава. - Т. 9.- выпуск 4 (28).- 2009 - часть 3 - С. 11-15.

4. Абрафикова Л.Г. Влияние нативних и криоконсервированных аллофибробластов на процессы регенерации кожных язв у крыс / Абрафикова Л.Г, Петренко Т.Ф., Высеканцев И.П., Грищенко В.И. // «Запорожский медицинский журнал».- Запорожье. - Т. 12.- 2010.- С. 5-8.

5. Абрафикова Л.Г. Морфологическая оценка процесса заживления экспериментальных кожных язв у крыс после внесения криоконсервированных фибробластов / Абрафикова Л.Г.// «Патология». - Запорожье. - Т.7.- №3.- 2010.-С. 113-115.

6. Пат. 92678 UA Україна, МПК А01N 1/02, С 12N 1/01, С 12N 5/02. Спосіб підвищення резистентності клітин до заморожування-відігріву / Висеканцев І.П., Нардід О.А., Кудокоцева О.В., Кощій С.В., Розанова С.Л., Абрафікова Л.Г.; заявник і патентовласник ІПКіК НАН України.- заявл. 05.05.2010; опубл. 25.11.2010, Бюл. № 22.

7. Абрафікова Л.Г. Одержання постнатальних фібробластів людини з використанням кріогенних технологій / Абрафікова Л.Г., Висеканцев І.П., Петренко Т.П., Гончарук О.І. // Збірник тез 1 Міжнародної конференції студентів та аспірантів «Молодь і поступ в біології».- Львів, 2005, С. 218.

8. Абрафикова Л.Г. Сравнительное изучение сохранности фибробластов человека криоконсервированных под защитой и без криопротектора / Абрафикова Л.Г. // Сборник тезисов конференции «Сохранение генетических ресурсов» - Москва. 2006.- С.229-230.

9. Абрафикова Л.Г. Вивчення проліферативних властивостей фібробластів людини після кріоконсервування без кріопротектора / Абрафикова Л.Г // Збірник тез конференції молодих вчених «Медична наука: сучасні досягнення та інновації»- Харків.- 2006.- С.3

10. Абрафикова Л.Г. Вплив температурних режимів зберігання на життєздатність кріоконсервованих фібробластів / Абрафикова Л.Г // Збірник тез 2 міжнародної наукової конференції студентів та аспірантів «Молодь та поступ в біології»- Львів.-2006.- С.332

11. Абрафикова Л.Г. Кріоконсервування, як етап одержання та практичного використання фібробластів / Абрафикова Л.Г // Збірник тез 3 Міжнародної медико - фармацевтичної конференції студентів і молодих вчених. «Хист»-Чернівці.- 2006.- С.9

12. Абрафикова Л.Г. Кріоконсервування аутофібробластів у середовищах без кріопротектора /Абрафикова Л.Г // «Український науково - медичний молодіжний журнал»- Київ.- 2006.- С. 49

13. Abrafikova L.G. Biological activity of frozen- thawed autofibroblasts / AbrafikovaL.G.// Сборник тезисов конференции «Modern problems of Microbiology and Biotehnology». Одесса - 2007.- Р.119

14. Абрафикова Л.Г. Продукция цитокинов мононуклеарными клетками при культивировании с аллогенными фибробластами «in vitro» / Абрафикова Л.Г., Власов А.А.// Сборник тезисов конференции «Актуальні питання сучасної медицини».- Харьков. - 2008. - С. 13

15. Абрафикова Л.Г. Изучение влияния гипотермии на пролиферацию фиброластов из кожных биоптатов лабораторных животных / Абрафикова Л.Г // Всеукраїнський медичний журнал молодих вчених «Хист».- Чернівці.- 2008.- вип.10. - С. 193

16. Абрафикова Л.Г. Криоконсервирование и гипотермическое хранение кожных биоптатов и аутофибробластов человека / Абрафикова Л.Г, Высеканцев И.П., Петренко Т.Ф., Гончарук Е.И. // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клітин».- Самара.- 2008.- С. 134.

17. Абрафикова Л.Г. Влияние экстракта плаценты человека и криопротекторов на сохранность мембраны фибробластов человека / Абрафикова Л.Г, Розанова Е.Д., Высеканцев И.П., Нардид О.А// Проблемы криобиологии.- Харьков.- Т.18.- №2.- 2008.-С. 228.

18. Рossible application of native and cryopreserved allofibroblasts for recovery of integral skin integument in experimental animals / AbrafikovaL.G., Petrenko T., Batsunova L.// Український біохімічний журнал.- Ялта.- Т. 81. - №4 - 2009 - С.283

19. Абрафикова Л.Г Влияние нативних, криоконсервированных и разрушенных фибробластов на процесс заживления експериментальных ран у крыс / Абрафикова Л.Г, Шевчук С.Н., Буденный А.П.// Сборник тезисов конференции «Актуальні питання сучасної медицини».- Харьков.- 2010.- С. 13-14

Анотації

Абрафікова Л.Г. Вплив кріоконсервованих фібробластів на репаративні процеси при асептичному запаленні шкіри в експерименті. Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю - 14.01.35 крімедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2011.

Дисертаційна робота присвячена вивченню можливості використання кріоконсервованих фібробластів без послідуючого культивування для стимуляції репаративних процесів при асептичному запаленні шкіри у щурів. Також вивчена можливість отримання фібробластів з біоптатів шкіри, які зберігалися в умовах гіпотермії.

Експериментально показано, що біоптати шкіри щурів, які зберігалися при температурі 4°С у розчині Хенкса, або у сироватці крові щурів протягом 14 діб, не втрачали здатність до виходу фібробластів.

Показано, що нанесення кріоконсервованих фібробластів в область дефекту тканин без додаткового культивування викликає достовірне скорочення строків його загоєння.

Вивчені динаміка зміни площі загоєння ран, гістологічні характеристики тканин в області дефекту, неспецифічні показники гострої фази запалення (глюкопротеїди, сіромукоїди, церулоплазмін, ЦІК, СРБ) у щурів з асептичним запаленням шкіри після нанесення на раньову поверхню метилцеллюлозного гелю і колагенової губки «Геласпон», безклітинної маси зруйнованих фібробластів на метилцеллюлозному гелі, нативних та кріоконсервованих фібробластів, іммобілізованих на метилцеллюлозному гелі та колагеновій губці «Геласпон».

Отримані результати можуть бути використані після клінічних випробувань у практичній медицині.

Ключові слова: кріоконсервування, фібробласти, шкірний біоптат, шкірний дефект, регенерація, показники гострой фази запалення, гіпотермічне зберігання, носій, іммобілізовані клітини.

Абрафикова Л.Г. Влияние криоконсервированных фибробластов на репаративные процессы при асептическом воспалении кожи в эксперименте. Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности - 14.01.35 - криомедицина. Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2011.

Диссертационная работа посвящена исследованию возможности применения криоконсервированных фибробластов без дополнительного последующего культивирования для стимуляции репаративных процессов при асептическом воспалении кожи у крыс. Также изучена возможность получения фибробластов из биоптатов кожи, хранившихся в условиях гипотермии.

Экспериментально показано, что биоптаты кожи крыс, хранившиеся при температуре 4°С в растворе Хенкса или в сыворотке крови крыс в течение 14-ти суток, сохраняют способность к выходу фибробластов с задержкой формирования монослоя по сравнению с исходными биоптатами в среднем в 2 раза. В тоже время, выхода фибробластов из криоконсервированных биоптатов кожи не наблюдали.

Показано, что нанесение криоконсервированных фибробластов в область дефекта тканей без дополнительного культивирования вызывает достоверное сокращение сроков его заживления. Различия в стимулирующем действии нативных и криоконсервированных фибробластов на репаративные процессы при асептическом воспалении кожи отсутствуют. Экспериментально обосновано нанесение на раневую поверхность препаратов фибробластов, иммобилизованных в метилцеллюлозном геле и на коллагеновой губке «Геласпон». Изучены: динамика изменения площади заживления ран, гистологические характеристики тканей в области дефекта, неспецифические показатели острой фазы воспаления (гликопротеиды, серомукоиды, церулоплазмин, ЦИК, СРБ) у крыс с асептическим воспалением кожи после нанесения на раневую поверхность метилцеллюлозного геля и коллагеновой губки «Геласпон», бесклеточной массы разрушенных фибробластов на метилцеллюлозном геле, нативных и криоконсервированных фибробластов, иммобилизованных на метилцеллюлозном геле и коллагеновой губке «Геласпон». Показано, что изменения показателей положительных реактантов острой фазы воспаления коррелирует с динамикой процессов регенерации в поврежденных тканях во всех экспериментальных группах. Восстановление концентрации этих белков до значений нормы наиболее выражено при нанесение на раневую поверхность нативных и криоконсервированных фибробластов.

Полученые результаты могут быть использованы после клинических испытаний в практической медицине.

Ключевые слова: криоконсервирование, фибробласты, кожный биоптат, кожный дефект, регенерация, показатели острой фазы воспаления, гипотермическое хранение, носитель, иммобилизованные клетки.

Abrafikova L.G. Effect of cryopreserved fibroblasts on reparative processes during aseptic skin inflammation in an experiment. Manuscript.

Dissertation for the candidate of medical sciences degree on specialty - 14.01.35 -cryomedicine. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2011.

The thesis is devoted to the study of possible application of cryopreserved fibroblasts with no additional following culturing to stimulate reparative processes during aseptic inflammation of skin in rats. As well there was investigated the possibility of deriving the fibroblasts from skin bioptates, stored under hypothermia conditions.

It has been experimentally shown that rat's skin bioptates stored at 4°С in either Hank's solution or in rat's blood serum for 14 days preserve the ability to fibroblasts' release.

It has been demonstrated that application of cryopreserved fibroblasts into the area of tissues' defect with no additional culturing causes the statistically significant reduction of the terms of its healing. There was substantiated the application on wound surface of the preparations of fibroblasts immobilized in methyl cellulose gel and on collagen sponge “Gelaspon”. There were studied the dynamics of changes of the square of wounds' healing, histological characteristics of tissues in the defect area, non-specific indices of an acute phase of inflammation (glycoproteids, seromucoids, ceruloplasmin, CIC, CRP) in rats with aseptic inflammation of skin after applying to wound surface of methyl cellulose gel and collagen sponge “Gelaspon”, accelular mass of destroyed fibroblasts on methyl cellulose gel, native and cryopreserved fibroblasts, immobilized on methyl cellulose gel and collagen sponge “Gelaspon”. The obtained results may be used after clinical trials in practical medicine.

Key words: cryopreservation, fibroblasts, skin bioptate, skin defect, regeneration, indices of inflammation acute phase, hypothermic storage, carrier, immobilized cells.

Размещено на Allbest.ru

...