Морфофункціональні особливості клітин вихідної та резистентної лінії раку молочної залози людини під впливом доксорубіцину та його ліпосомної форми

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність проблеми. На сьогодні накопичено достатньо науково обгрунтованих аргументів, які свідчать, що успіх лікування хворих на рак залежить не лише від клінічних показників та морфологічних особливостей новоутворень, але і від сукупності молекулярно-біологічних характеристик пухлинних клітин.

Завдяки досягненням молекулярної генетики встановлено, що в основі злоякісної трансформації клітин лежить активація великої кількості генів, у тому числі онкогенів, внаслідок чого відбувається зміна експресії кодованих ними білків, більшість з яких в нормі забезпечують в клітинах структурно-функціональний гомеостаз. В той же час гальмування експресії ключових антиапоптичних білків, таких як Bcl-2, підвищення експресії проапоптичних білків, зокрема Вах, порушують рівновагу між процесами апоптозу та проліферації у бік збільшення кількості злоякісно трансформованих клітин, а зміна експресії компонентів системи міжклітинної адгезії - Е-кадгерину, б-, в-катеніну, CD54, може призводити до зміни біологічних властивостей клітин та сприяти пухлинній прогресії (Kymionis G. D., 2001; Rahn J.J., 2005). Сучасні наукові дослідження та спостереження клініцистів переконливо свідчать про те, що за комплексом молекулярно-біологічних характеристик, тобто за молекулярним фенотипом клітин, злоякісні новоутворення можуть суттєво відрізнятись між собою не тільки агресивністю росту, але і чутливістю до цитостатиків.

Питання підвищення чутливості пухлинних клітин до протипухлинних препаратів (ППП) є одним з найбільш актуальних як в експериментальній, так і особливо клінічній онкології, оскільки в наш час серед існуючих методів лікування онкологічних хворих провідне місце займає медикаментозна терапія, ефективність якої не досягає мети через лікарську резистентність пухлин до більшості цитостатиків. Резистентність до ППП є пріоритетним напрямком наукових досліджень Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, започаткованих ще у 70-ті роки ХХ сторіччя і спрямованих на визначення біологічної сутності та розробку науково обґрунтованих підходів щодо подолання стійкості пухлин до медикаментозних засобів, які на сьогоднішній день знайшли подальший розвиток у світлі сучасних біо- та нанотехнологій.

Зрозуміло, що у розв'язанні проблеми резистентності першочергові позиції повинні займати фундаментальні дослідження, оскільки лише на експериментальних моделях з використанням сучасних наукових розробок та технологій можна з'ясувати ту безліч досі невідомих фенотипових особливостей пухлинних клітин, які є перешкодою до подолання лікарської резистентності. Доцільність стратегії таких досліджень обумовлена особливостями формування лікарської резистентності, де задіяні чисельні механізми, пов'язані зі зменшенням накопичення препаратів у пухлинних клітинах, з посиленням видалення їх з клітин, активацією систем детоксикації та механізмів відновлення пошкодженої ДНК, ухиленням клітин від апоптозу, індукованого ППП.

Серед сучасних протипухлинних засобів все більшого визнання набувають ліпосомні форми препаратів, оскільки вважається, що ліпосоми, завдяки спорідненості із ліпідними компонентами плазматичних мембран, здатні без перешкод переносити активні речовини у клітини до мішеней їх дії. Одним із таких препаратів є доксорубіцин, який за результатами емпіричного застосування дає позитивний ефект. Разом з тим, на сучасному етапі розвитку науки показання, щодо призначення ППП, повинні бути всебічно обґрунтовані результатами експериментальних досліджень стосовно біологічної сутності їх терапевтичного ефекту. Проте до цього часу не існує систематизованих відомостей про відмінності змін молекулярного фенотипу чутливих та резистентних клітин внаслідок дії доксорубіцину та його ліпосомної форми, не з'ясовані особливості акумуляції та розподілу у різних за чутливістю клітинах цих препаратів, а також механізми, що лежать в їх основі. Розуміння цих механізмів може стати науковим підґрунтям для створення нових модифікованих форм ППП, які дозволять оптимізувати медикаментозну терапію та наблизити час подолання лікарської резистентності.

Мета дослідження. Визначити особливості морфофункціональних змін у вихідних та резистентних клітинах раку молочної залози людини лінії MCF-7 під впливом доксорубіцину і його ліпосомної форми та встановити закономірності та характерні відмінності клітинної фармакокінетики та фармакодинаміки цих препаратів.

Задачі дослідження.

1. Визначити молекулярний профіль клітин сублінії MCF-7/Dox з фенотипом лікарської резистентності за показниками проліферативної активності (PCNA), експресії білків, асоційованих з апоптозом (p53, Вcl-2, Вax, CD95), рецепторів прогестерону (РП) та естрогенів (РЕ), молекул міжклітинної адгезії (E-кадгерин, CD54), білків, пов`язаних з множинною лікарською резистентністю (GST, Pgp), та зіставити його з аналогічними показниками у клітинах вихідної лінії MCF-7.

2. Дослідити особливості клітинного циклу та експресії асоційованих з ним регуляторних білків (c-myc, рRb, циклін D1, р21) у пухлинних клітинах MCF-7 та MCF-7/Dox.

3. Провести порівняльне дослідження клітинної фармакокінетики доксорубіцину в ліпосомній та основній формах за рівнем накопичення та внутрішньоклітинним розподілом у пухлинних клітинах MCF-7 та MCF-7/Dox.

4. Охарактеризувати клітинну фармакодинаміку доксорубіцину і його ліпосомної форми за морфофункціональними та молекулярно-біологічними показниками цитостатичної і проапоптичної активності у пухлинних клітинах вихідної лінії MCF-7 та MCF-7/Dox.

1. Матеріали і методи досліджень

Об'єктами досліджень були клітинна лінія раку молочної залози людини MCF-7, чутлива до цитотоксичної дії доксорубіцину, та її сублінія, резистентна до цього препарату - MCF-7/Dox. Резистентну сублінію було отримано у відділі механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України шляхом довготривалого культивування клітин вихідної лінії в культуральному середовищі з додаванням наростаючих концентрацій доксорубіцину. На момент проведення досліджень рівень резистентності до доксорубіцину становив 8 (Lukyanova N.Yu., 2009). Обидва варіанти пухлинних клітин підтримували in vitro у поживному середовищі ISCOV з додаванням 10% ембріональної сироватки телят у вологій атмосфері з 5% СО2 при 37С.

При проведенні досліджень були використані основна (Dox) (Біолек, Україна) та ліпосомна форма доксорубіцину (Lip Dox) (Біолек, Україна).

Кількість живих і мертвих клітин оцінювали рутинним методом за допомогою 0,4% розчину вітального барвника трипанового синього. Для визначення цитотоксичної/цитостатичної активності препаратів (Dox та LipDox) на клітини ліній MCF-7 та MCF-7/Dox застосовували МТТ-тест. Дослідження по вивченню дії доксорубіцину та доксорубіцину в ліпосомній формі на клітини MCF-7 та MCF-7/Dox проводили, використовуючи показник IC30 (концентрація препарату, яка викликає 30% загибель клітин по відношенню до контролю).

Морфологічні дослідження проводили за допомогою світлооптичної та електронної мікроскопії. Електронномікроскопічні дослідження виконані спільно з к.б.н. О.В. Юрченко.

За допомогою імуноцитохімічного методу в клітинах MCF-7 та MCF-7/Dox вивчена експресія білків, пов'язаних з множинною лікарською резистентністю (МЛР) - Pgp (клон C494), GST (клон 353-10); білків, асоційованих з апоптозом - р53 (клон DO-7), Вcl-2 (клон:124), Вax (Polyclonal Rabbit Anti-Human Antibody), CD95 (клон DX2); рецепторів стероїдних гормонів - рецепторів естрогенів (клон D5) та прогестерону (клон PgR 636); молекул міжклітинної адгезії - E-кадгерину (клон NCH-38), CD54 (клон 15,2), а також ядерного антигену проліферативних клітин PCNA (клон С494) та білків-регуляторів клітинного циклу - pRb (клон Rb1), c-myc (клон 9E10), цикліну D1 (клон DCS-6), р21 (клон HZ52). Для імунофенотипування клітин були використані моноклональні антитіла фірми Dako Cytomation (Denmark). Для детекції продукта реакції в імуноцитохімічних дослідженнях застосовували ПАП-метод або систему візуалізації EnVision (Dako Сytomation, Denmark), кон'юговану з лужною фосфатазою або пероксидазою.

Розподіл клітин за фазами клітинного циклу досліджували на проточному цитофлуориметрі (Partec, Germany).

Кількісну оцінку накопичення Dox та LipDox клітинами лінії MCF-7 та її сублінії MCF-7/Dох проводили методом високоефективної рідинної хроматографії. Розрахунки концентрації проводили методом абсолютного стандарту - за площею піку стандартного розчину доксорубіцину. Дослідження виконано за участю провідного інженера Н.Г. Харитон.

Кінетику розподілення різних форм доксорубіцину в клітинах MCF-7 та MCF-7/Dох оцінювали за флуоресценцією доксорубіцину з використанням лазерного конфокального мікроскопа LSM 510 META (CARL ZEISS, Germany). Дослідження проводились при довжині хвилі збудження лex=540 nm та хвилі емісії лem=590 nm.

Дослідження ендоцитозу проводили, культивуючи клітини протягом години з цитохолазином В (Dako Сytomation, Denmark), після чого проводили заміну поживного середовища, і подальше 4 годинне культивування клітин з розчинами Dox та LipDox при температурі 37оС у зволоженій атмосфері з 5% СО2. У подальшому клітини фіксували за допомогою 4% розчину параформальдегіду та заключали у Faramount Aqueous Mounting Medium (Dako Сytomation, Denmark). Дослідження флуоресценції доксорубіцину також проводили за допомогою лазерного конфокального мікроскопа LSM 510 META (CARL ZEISS, Germany).

Статистична обробка отриманих результатів проводилась за допомогою математичної програми медико-біологічної статистики STATISTICA 6,0. Обчислення і порівняння достовірності відмінностей середніх величин проводили з використанням t-критерію Ст'юдента для множинних порівнянь. Достовірними вважались відмінності з вірогідністю не менше 95% (p<0,05).

2. Результати досліджень та їх обговорення

Морфологічні, ультраструктурні та фенотипові особливості клітин резистентної до дії доксорубіцину лінії раку молочної залози людини.

Відомо, що резистентні за морфологічними та ультраструктурними властивостями клітини характеризуються досить високою метаболічною активністю, яка переважно пов`язана з синтезом та транспортом протеїнів (Molodykh О.Р. et al., 2007). При електронномікроскопічному дослідженні клітин резистентнoї сублінії MCF-7/Dox встановлено збільшення кількості внутрішньоклітинних органел, особливо чисельних довгих канальців гранулярного ендоплазматичного ретикулуму із збільшеною кількістю рибосом на зовнішніх мембранах та поява добре розвинутого багатолокусного комплексу Гольджі (рис.1). Натомість в цитоплазмі вихідних клітин визначається невелика кількість органел, які рівномірно розподіляються по всій площині цитоплазми. Кількість вільних рибосом незначна, в зв'язку з чим цитоплазма характеризується низькою електронною щільністю (рис. 2). В цілому для резистентних клітин сублінії MCF-7/Dох характерним є ускладнена ультраструктурна організація, що пов`язано з підвищенням ступеня диференціювання у порівнянні з вихідними клітинами MCF-7.

В резистентних клітинах виявлено значну кількість електроннопрозорих везикул, які формуються в районі комплексу Гольджі, що свідчить про посилене виведення з них ППП шляхом екзоцитозу, і, таким чином, може призводити до зменшення накопичення препарату в цих клітинах.

Відомо, що набуття пухлинними клітинами резистентності до ППП супроводжується змінами фенотипового профілю клітин (McClelland S.E., 2009). Резистентність до дії доксорубіцину, в першу чергу, пов`язана з функціонуванням у клітинах систем зворотнього транспорту лікарських препаратів внаслідок синтезу АТФ-залежного транспортера Pgp/АВСВ1 (Higgins C.F., 1995). При проведенні імуноцитохімічного аналізу нами виявлено, що 85% клітин сублінії MCF-7/Dox експресують Pgp. Аналогічні результати отримані за допомогою цитофлуориметричного методу. Встановлено відсутність експресії Pgp в чутливих клітинах лінії MCF-7, в той час як 80% резистентних клітин були позитивними за даним маркером. Натомість, відсутність змін у кількості GST позитивних MCF-7 та MCF-7/Dox клітин, дає можливість припустити, що GST не задіяна в механізмах набуття резистентності до доксорубіцину клітинами MCF-7/Dox.

Зміни експресії білків, асоційованих з апоптозом, можуть суттєво впливати на чутливість клітин до ППП, що показано на деяких експериментальних моделях (Zhang L. et al., 2000). Результати власних досліджень свідчать, що майже половина клітин, як вихідної лінії MCF-7, так і резистентної сублінії MCF-7/Dox, експресують р53. Останнє свідчить про те, що білок р53 не обумовлює набуття клітинами MCF-7 фенотипу лікарської резистентності. Це можна пояснити присутністю в чутливих клітинах вихідної лінії мутантної форми цього протеїну, який не здатний активувати загибель клітин шляхом апоптозу, чи зупиняти клітинний цикл після пошкодження ДНК.

Для резистентної до дії доксорубіцину сублінії MCF-7/Dox характерним є зменшення кількості клітин, які експресують Bcl-2, але поряд з цим спостерігається збільшення числа клітин з експресією іншого білка, асоційованого з апоптозом, а саме Bax.

Доведено, що стероїдні гормони та відповідні рецептори діють як фактори стимуляції транскрипції, активують клітинні сигнальні каскади, а також сприяють фізіологічному проходженню клітин за фазами клітинного циклу (Lange C.A., 2008). За допомогою імуноцитохімічного аналізу було встановлено, що набуття резистентності супроводжується значним зниженням кількості резистентних клітин з експресією РЕ та РП. Встановлене нами зменшення Bcl-2 позитивних клітин в резистентній культурі може бути пов`язано саме з відсутністю РЕ, оскільки відомо, що в тканинах молочної залози регулювання активності Bcl-2 здійснюється за естроген-залежним транскрипційним шляхом (Leek R. D. et al, 1994). Результати імуноцитохімічних досліджень представлені в таблиці 1.

Таблиця 1. Кількість клітин вихідної та резистентної лінії раку молочної залози MCF-7, позитивних за експресією маркерів, які асоційовані з апоптозом, та рецепторів стероїдних гормонів

За даними літератури, відсутність експресії рецепторів стероїдних гормонів може призводити до зменшення кількості клітин з експресією цикліну D1, що і обумовлює уповільнення проходження клітинного циклу (Skildum A. et al., 2005). При дослідженні клітин резистентної до дії доксорубіцину сублінії MCF-7/Dox нами встановлено відсутність експресії РП та РЕ, що асоціюється зі зниженням рівня проліферації клітин та затримкою клітин в G0/G1 фазах клітинного циклу. При вивченні експресії білків, пов`язаних з клітинним циклом, показано збільшення кількості резистентних клітин з експресією білка-інгібітора клітинного циклу р21 та зменшення таких, що експреcують циклін D1, pRb та c-myc. Поряд з цим визначено, що час подвоєння резистентних клітин MCF-7/Dox є більшим і складає 23+0,5 години, тоді як час подвоєння кількості вихідних клітин MCF-7 - 19+0,5 годин. Це також узгоджується з даними електронномікроскопічних досліджень, які свідчать, що резистентні клітини є більш диференційованими у порівнянні з клітинами вихідної лінії, і тому характеризуються зростанням кількості клітин в G0/G1 фазі та зменшенням у G2/M фазі (табл. 2).

Таблиця 2. Розподіл за фазами клітинного циклу клітин вихідної лінії MCF-7 та сублінії з індукованою резистентністю до доксорубіцину MCF-7/Dox

Дослідження експресії молекул, асоційованих з клітинною адгезією, показало, що набуття клітинами лінії MCF-7 резистентного фенотипу супроводжується збільшенням кількості клітин з експресією таких молекул, як Е-кадгерин та CD54. Згідно даних літератури, збільшення рівня експресії Е-кадгерину свідчить про зростання адгезивних властивостей цих клітин (Falk M.M., 2010).

При ультраструктурному аналізі клітин резистентної сублінії MCF-7/Dox виявлена значна кількість адгезивних та щільних контактів, що підтверджує результати імуноцитохімічних досліджень.

Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що набуття резистентності до цитотоксичної дії доксорубіцину клітинами лінії MCF-7 супроводжується значними змінами їх фенотипових характеристик. Визначені нами особливості ультраструктурної організації, велика кількість клітин, що експресують Рgp, зміни в експресії білків, пов`язаних з апоптозом, уповільнення проходження клітинного циклу та посилення адгезивних властивостей спрямовані на забезпечення життєдіяльності клітин під впливом цитотоксичної дії ППП.

Особливості клітинної фармакокінетики різних форм доксорубіцину.

Нами проведено дослідження щодо визначення цитотоксичної дії основної та ліпосомної форми доксорубіцину на клітини вихідної та резистентної лінії MCF-7. Встановлено, що ліпосомна форма доксорубіцину має більший цитотоксичний вплив на клітини обох досліджуваних ліній. В той же час ліпосомна форма доксорубіцину мала дещо більший цитотоксичний ефект на резистентні клітини сублінії MCF-7/Dох, що визначалось більшим відсотком загиблих клітин, у порівнянні з клітинами вихідної лінії MCF-7.

За допомогою високоефективної рідинної хроматографії було показано, що Dox в клітинах лінії MCF-7 накопичується в значній кількості вже через 30 хвилин інкубації та досягає максимуму через 4 години. Резистентні до дії доксорубіцину клітини MCF-7/Dox накопичують в даних часових точках набагато менше доксорубіцину у порівнянні з вихідними клітинами. Отже, зменшення акумуляції ППП є домінантною особливістю резистентних клітин. Вже через 24 години присутність препарату в обох типах клітин не визначається або його кількість настільки знижується, що знаходиться за межами детекції застосованого нами методу (табл. 3). З таблиці 3 видно, що LipDox накопичується в більшій кількості в клітинах резистентної сублінії MCF-7/Dox у порівнянні з Dox. Це призводить до більш вираженого цитотоксичного впливу препарату, що за даними морфологічного та електронномікроскопічного дослідження характеризується некротичною загибеллю клітин та збільшенням кількості клітин у стані апоптозу.

Таблиця 3. Динаміка накопичення Dox та LipDox в клітинах ліній MCF-7 та MCF-7/Dox (%)

Застосування лазерної конфокальної мікроскопії дозволило встановити, що внутрішньоклітинний розподіл LipDox та Dox відрізняється в клітинах вихідної лінії MCF-7 та резистентної сублінії MCF-7/Dox. В клітинах вихідної лінії Dox має переважно ядерну локалізацію препарату, тобто безпосередньо в основному місці його цитотоксичної дії, в той час як накопичення препарату в резистентних клітинах відмічається переважно в цитоплазмі і лише після одного часу інкубації з`являється в ядрі. Більш низька акумуляція Dox у резистентних клітинах обумовлена системою зворотного транспорту ППП з клітин внаслідок експресії Pgp, а також присутністю добре розвинутої везикулярної системи, елементи якої здатні виводити ППП.

Визначення розподілу Dox та LipDox при дослідженні клітин MCF-7 і MCF-7/Dox показало різницю у характері флуоресценції. Так, на відміну від Dox, флуоресценція якого через 30 хвилин інкубації спостерігається у ядрах багатьох клітин вихідної лінії MCF-7, флуоресценція LipDox відмічається лише в цитоплазмі. У клітин сублінії MCF-7/Dox після 30 хвилинного культивування з обома формами препарату флуоресценція спостерігається тільки в цитоплазмі. Слід зазначити, що рівень флуоресценції LipDox в клітинах через 30 хвилин інкубації нижчий, у порівнянні з Dox, і визначається в меншій кількості клітин, що може свідчити про більш повільне входження LipDox в клітину. Через 1 годину Dox проникає в ядра переважної більшості клітин вихідної лінії MCF-7, флуоресценція стає більш яскравою, особливо по периферії ядра. За таких же умов, в резистентних клітинах флуоресценція Dox, визначається переважно в перинуклеарній зоні цитоплазми та відмічається слабка флуоресценція ядер. Слід зауважити, що через 1 годину інкубації, LipDox спостерігається як в цитоплазмі клітин вихідної лінії, так і з`являється в ядрах. В той час як для клітин MCF-7/Dox характерне збільшення дифузної флуоресценції цитоплазми та більш яскраві флуоресцентні утворення у перинуклеарному просторі. Інтенсивне випромінення у перинуклеарній зоні може відповідати накопиченню препарату у компонентах комплексу Гольджи, що було показано Gong зі спів. (Gong Y. et al, 2003). Подальші дослідження показали, що після 4 годин культивування клітин з LipDox, виявляється досить висока інтенсивність флуоресценції в резистентних клітинах MCF-7/Dox, при цьому вона спостерігається як в ядрах, займаючи дискретні ділянки, так і у вигляді локальних скупчень у цитоплазмі. Дослідження резистентних клітин MCF-7/Dox за тих же умов культивування з Dox дозволило спостерігати перехід флуоресценції з перинуклеарної зони до дифузного або крапкоподібного яскравого світіння цитоплазми та появи невеликого світіння в ядрі. У вихідних клітин, при 4-х годинному культивуванні з Dох, флуоресценція все ще має ядерну локалізацію, а у цитоплазмі досліджених клітин з`являються яскраві поодинокі флуоресцентні цятки.

Також встановлено збільшення тривалості акумуляції в клітинах LipDox порівняно з Dox. При подальшому культивуванні з LipDox виявлено, що через 24 години в клітинах вихідної лінії MCF-7 визначається дуже слабка дифузна флуоресценція в ядрі та цитоплазмі, в цей же час в клітинах MCF-7/Dox, флуоресценція, як показник концентрації ППП, спостерігається не тільки в цитоплазмі, але і в ядрах у вигляді дифузної та крапкоподібної флуоресценції, тоді як флуоресценція Dox вже не визначається в даних клітинах. Таким чином, LipDox відповідає одній з основних вимог ефективної протипухлинної терапії - висока акумуляція ППП в пухлинних клітинах, що корелює з його більш високою цитотоксичною дією.

Відомо, що основним шляхом надходження Dox у клітини є дифузія крізь плазматичну мембрану, але більшість його виводиться з клітини через плазматичну мембрану за участю Pgp. Особливістю LipDox є її певна спорідненість з ліпідними компонентами плазматичної мембрани, що може змінювати характеристики прямого і зворотного транспорту ППП. Для визначення механізму транспорту LipDox в клітини було проведено дослідження по блокуванню ендоцитозу, оскільки існують припущення, що ліпосоми та речовини, які вони переносять, потрапляють в клітини саме цим шляхом (Lee K.D. et al., 1992; Soma C.E. et al., 1999). В результаті проведеного за допомогою конфокальної мікроскопії дослідження з використанням в якості блокатора ендоцитозу цитохолазіну В показано, що, на відміну від Dox, рівень флуоресценції якого в клітинах не змінюється, світіння LipDox у вихідних і резистентних клітинах різко зменшується, а в деяких клітинах майже не спостерігається. Таким чином, нами з'ясовано, що більша ефективність цитотоксичної дії ліпосомного препарату пояснюється швидшим його надходження в клітини шляхом ендоцитозу. Що стосується резистентних клітин, то саме надходження доксорубіцину в ліпосомній формі дає змогу уникнути взаємодії з Pgp.

Отже, доведено, що LipDox ефективно “обходить” резистентність до доксорубіцину в клітинах сублінії MCF-7/Dox. Феномен визначенної нами модуляції МЛР можна пояснити, перш за все, надходженням препарату шляхом ендоцитозу, збільшенням акумуляції препарату та більш тривалим часом знаходження в резистентних клітинах.

Вплив доксорубіцину у різних формах на біологічні особливості резистентих клітин сублінії MCF-7/Dox. Порівняльні дослідження показали, що під впливом доксорубіцину та його ліпосомної форми відбуваються зміни біологічних властивостей резистентних пухлинних клітин, які стосуються морфологічних, фенотипових та функціональних характеристик. Саме цим можна пояснити збільшення накопичення LipDox резистентними клітинами, що посилює його цитотоксичну дію, у порівнянні з Dox.

Результати електронномікроскопічних та морфологічних досліджень свідчать, що токсичний ефект Dox проявляється дистрофічними змінами клітин, а також загибеллю частини клітин шляхом некрозу (23%) та апоптозу (7%). Слід зазначити, що дія LipDox призводила до збільшення на 7% кількості клітин з характерними ознаками апоптозу як у клітин вихідної, так і резистентної лінії MCF-7. При цьому в клітинах спостерігались всі етапи апоптозу, починаючи від конденсації цитоплазми і ядра до утворення апоптичних тілець.

Під впливом LipDox як в резистентних, так і вихідних лініях MCF-7, збільшується кількість клітин, які експресують білок-інгібітор клітинного циклу р21, та зменшується кількість клітин з експресією pRb, c-myc та цикліна D1. Такі зміни призводять до збільшення кількості клітин в G0/G1 фазі і свідчать про здатність LipDox впливати на клітинний цикл вихідних і резистентних клітин (табл. 4).

Таблиця 4. Зміна розподілу клітин ліній MCF-7 та MCF-7/Dox за фазами клітинного циклу під впливом доксорубіцину та його ліпосомної форми (%)

Дослідження виявили, що Dox, на відміну від доксорубіцину в ліпосомній формі, не впливає на клітинний цикл резистентної до дії доксорубіцину сублінії MCF-7/Dox. Слід зауважити, що серед резистентних клітин, які зазнали впливу LipDox, кількість тих, що входять в S фазу, значно зменшується, при цьому спостерігається збільшення кількості клітин в G0/G1 фазі.

Більшість ППП сприяють загибелі клітин, переважно індукуючи в них апоптоз (Sjostrom J. et al, 2002). Встановлено, що під дією Dox більш виразні зміни рівня експресії білків, асоційованих з апоптозом, відбуваються в клітинах вихідної лінії MCF-7. Культивування з Dox та LipDox не змінює кількості Bcl-2 позитивних клітин лінії MCF-7/Dox, але збільшує їх кількість у вихідній лінії. Кількість Вах позитивних клітин при дії на клітини вихідної лінії MCF-7 доксорубіцину у різних формах суттєво збільшується. Що стосується резистентних клітин, то лише LipDox призводить до такого ефекту, тоді як під впливом Dox відбувалося зменшення кількості Вах позитивних клітин (табл. 5).

Таблиця 5. Експресія маркерів, асоційованих з апоптозом, при дії Dox та LipDox на клітини вихідної та резистентної лінії MCF-7

В результаті імуноцитохімічного дослідження встановлено, що при дії LipDox на клітини лінії MCF-7 та резистентної сублінії MCF-7/Dox відбувається зменшення кількості клітин, що експресують Е-кадгерин: на 30% (р< 0,01) в клітинах вихідної лінії MCF-7 та на 22% (р<0,01) в клітинах резистентної сублінії MСF-7/Dox. Під впливом LipDox в резистентній сублінії MСF-7/Dox також спостерігається зменшення кількості клітин які експресують CD54. Оскільки Е-кадгерин та CD54 є маркерами адгезії, отримані дані дозволяють стверджувати, що при дії LipDox на клітини вихідної та резистентної лінії відбувається зниження кількості клітин з експресією молекул адгезії, і це може бути сприятливим фактором для полегшеного надходження препарату в даній формі у клітини. В той же час, культивування в присутності Dox майже не впливало на відсоток клітин сублінії MCF-7/Dox, що експресують Е-кадгерин.

Таким чином, накопичення LipDox в резистентних клітинах в кількості, достатній для цитотоксичної дії, з одного боку, пов`язано із здатністю препарату у ліпосомній формі долати дію функціональних транспортерів ППП, а з другого супроводжується збільшенням кількості Вах позитивних клітин, що впливає на активацію апоптозу при дії препарату, суттєвим зменшенням кількості міжклітинних контактів, на що вказує зниження числа клітин, що експресують молекули, асоційовані з адгезією, і з чим, в свою чергу, пов`язана біодоступність ліків. Повільне входження LipDox та тривала його акумуляція в резистентних клітинах може пояснюватись різними шляхами потрапляння препарату в клітину, а саме, переважно ендоцитозом, , та простою дифузією, що більш притаманна Dox.

Висновки

фармакокінетика доксорубіцин ліпосомний пухлинний

На моделі клітин раку молочної залози людини лінії MCF-7 визначені структурно-функціональні та молекулярно-біологічні особливості, що притаманні клітинам при набутті ними резистентного фенотипу, та доведені переваги використання доксорубіцину в ліпосомній формі у порівнянні з основною формою препарату і визначені шляхи, які забезпечують більшу ефективність його дії на резистентні клітини.

1. Пухлинні клітини cублінії MCF-7/Dox мають суттєві відмінності від вихідних за молекулярно-біологічними характеристиками, серед яких: експресія Pgp на більшості клітин, зменшення кількості клітин з експресією антиапоптичного протеїну Bcl-2 і збільшення таких, що експресують проапоптичний білок Вах.

2. Показано, що формування резистентного фенотипу клітин сублінії MCF-7/Dox супроводжується змінами експресії досліджуваних білків-регуляторів клітинного циклу (pRb, циклін D1, c-myc, р21), що призводить до зміни в перерозподілі клітин за фазами клітинного циклу, зокрема до збільшення їх кількості в G0/G1 фазі.

3. Встановлено, що сублінія MCF-7/Dox характеризується збільшенням кількості клітин, які експресують Е-кадгерин та мембранний білок клітинної адгезії CD54, що опосередковує посилення адгезивних властивостей резистентних клітин.

4. Встановлено, що у вихідних клітинах лінії MCF-7 переважає ядерна локалізація доксорубіцину, в той час як в резистентних клітинах сублінії MCF-7/Dox - цитоплазматична, і лише після 1 години інкубації відбувається його транслокація до ядра. Крім того, показано, що клітини сублінії MCF-7/Dox, у порівнянні з вихідними, характеризуються більш активною і тривалою акумуляцією доксорубіцину в ліпосомній формі.

5. Доведено, що переважаючим шляхом проникнення доксорубіцину в ліпосомній формі в клітини вихідної та резистентної лінії MCF-7 є ендоцитоз, що сприяє більшому накопиченню препарату в резистентних клітинах до кількості, необхідної для здійснення цитотоксичного ефекту.

Література

1. Role of DNA hypomethylation in the resistence to doxorubicin in human MCF-7 breast adenocarcinoma cells / V.F. Chekhun, G.I. Kulik, O.V. Yurchenko, V.P. Tryndyak, I.N. Todor, L.S. Luniv, N.A. Tregubova, T.V. Pryzimirska, B. Montgomery, N.V. Rusetskaya, I.P. Pogrebny // Cancer Letters. -2006. - V. 231. - P.87-93.

2. Moleсular profile and cell cycle in MCF-7 cells resistant to cisplatin and doxorubicin / N.Yu. Lukyanova, N.V. Rusetskаya, N.V. Tregubova, V.F. Chekhun // Exp. Oncol. - 2009. - V.31, № 2. - Р.87-92.

3. Rusetskаya N.V. Molecular profile and cell cycle in MCF-7 and MCF-7/Dox cells exposed to conventional and liposomal forms of doxorubicin / N.V. Rusetskаya, N.Yu. Lukyanova, V.F. Chekhun // Exp. Oncol. - 2009. - V. 31, № 3. - Р.140-144.

4. Ultrastructural changes in tumor cells treated with liposomal forms of anticancer drugs / O.V. Yurchenko, N.V. Rusetskаya, L.A. Naleskina, V.F. Chekhun // Exp. Oncol. - 2010. - V. 32, № 1. - P. 23-29.

5. Русецька Н.В. Роль пухлинно-асоційованих молекул як маркерів прогнозу розповсюдження метастазів до реґіонарних лімфатичних вузлів хворих на рак молочної залози / Н.В. Русецька, Е.Д. Волкова // Матеріали IV всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів ”Біологічні дослідження молодих вчених в Україні” , 24-25 квітня 2004 р., Київ, Україна. - C.45.

6. Анализ компонентов протеома рака молочной железы с целью прогнозирования опухолевого процесса и эффективности лечения / Н.В. Русецкая, Е.Д. Волкова, С.И. Шпилевая, Т.Н. Галахина, Г.И. Кулик, В.Ф. Чехун // Материалы III съезда онкологов и радиобиологов СНГ, 25-28 мая 2004 г., - Минск, Беларусь. - C. 319.

Размещено на Allbest.ru