Вивчення протеїногенних властивостей M. bovis та удосконалення способу виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК

НАЦІОНАЛЬНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР

«ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ І КЛІНІЧНОЇ

ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ»

УДК 619:616:98:579.873.21:631.153.7

ВИВЧЕННЯ ПРОТЕЇНОГЕННИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ КУЛЬТУР M. BOVIS ТА УДОСКОНАЛЕННЯ СПОСОБУ ВИГОТОВЛЕННЯ ТУБЕРКУЛІНУ ОЧИЩЕНОГО (ППД) ДЛЯ ССАВЦІВ

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

ДЕГТЯРЬОВ Ігор Миколайович

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини».

Науковий керівник:доктор ветеринарних наук,

професор, член-кореспондент УААН

Завгородній Андрій Іванович,

Національний науковий центр

«Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини»,

завідувач лабораторії вивчення туберкульозу

Офіційні опоненти:доктор ветеринарних наук,

Кириченко Іван Олександрович,

Національний науковий центр

«Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини»,

головний науковий співробітник сектору

селекції і захисту від хвороб шовкопряда

відділу шовківництва та технічної ентомології;

доктор ветеринарних наук, професор

Кочмарський Віктор Андрійович,

Харківська державна зооветеринарна академія,

професор кафедри епізоотології та ветеринарного менеджменту

Захист відбудеться 09.04.2009 р. о 9 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 у Національному науковому центрі «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» за адресою: 61023, м. Харків, вул. Пушкінська, 83.

Автореферат розісланий 06.03.2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор ветеринарних наук, професорА. Ф. Бабкін

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Основним завданням галузі тваринництва є забезпечення населення продуктами харчування, зокрема м'ясом і молоком. Успішний розвиток тваринництва неможливий без здійснення комплексних протиепізоотичних заходів, які забезпечують підтримування благополуччя поголів'я тварин, а в разі виникнення захворювань - здійснення оздоровчих заходів.

Значних економічних збитків галузі тваринництва завдають інфекційні хвороби, які є загрозою для інших видів тварин та людей. Одним з особливо небезпечних зооантропозоонозних захворювань є туберкульоз, яким найбільше уражена велика рогата худоба (ВРХ).

Останніми роками кількість неблагополучних щодо туберкульозу господарств великої рогатої худоби в Україні зменшилась із 149 у 1996 році до 60 у 2006 році. Разом з цим, під час планових алергічних досліджень у 230 благополучних щодо захворювання на туберкульоз господарствах України виявляють тварин, що реагують на туберкулін, у яких під час розтину у внутрішніх органах не виявляють властивих туберкульозу уражень, і такі господарства зазнають значних економічних збитків через необґрунтований забій здорових тварин.

У системі заходів боротьби та профілактики захворювання на туберкульоз тварин важливе значення має своєчасне виявлення джерела інфекції. Для прижиттєвої діагностики цього захворювання в Україні та за кордоном застосовують алергічний метод - із застосуванням туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців (Овдієнко М. П., Найманов А. Х., 1998; Бусол В. О., 2002; Завгородній А. І., Тихонов П. М., 2006).

Застосування туберкуліну дозволяє виявляти інфікованих та хворих на туберкульоз тварин на різних стадіях інфекційного та епізоотичного процесів. Проте слід зазначити, що реакції на туберкулін у тварин можуть бути зумовлені не тільки збудниками туберкульозу, але й атиповими мікобактеріями за деяких гельмінтозних захворювань та білкового перекорму (Мартма О. В., 1989; Кассіч Ю. Я., Завгородній А. І., 1996, 2000).

Для виготовлення туберкуліну (ППД) у стандартному розчині застосовують хімічні сполуки з метою осадження туберкулопротеїну з культурального фільтрату. Згідно з літературними даними та власними дослідженнями, при цьому глибокої очистки туберкуліну (ППД) не відбувається (Безгін В. М., Козлов В. Е., 2002).

Використання на різних етапах осадження протеїну забезпечує стандартизацію туберкуліну, але підвищує собівартість препарату, а також зумовлює денатурацію молекул білка, що спричиняє зменшення виходу кінцевого продукту.

За даними В. М. Безгіна (1999), використання методів фракціонування біологічних макромолекул дозволяє виділити з туберкуліну баластні крупномолекулярні полісахариди та ліпопротеїдні фракції, що забезпечує отримання неімуногенних туберкулінів, стандартизованих за молекулярною вагою, які містять у своєму складі найбільш специфічні фракції протеїнів.

Тому пошук шляхів удосконалення схеми біофабричного виготовлення та підвищення якості туберкуліну є актуальною проблемою.

У зв'язку з цим, для підтримки благополуччя та контролю епізоотичної ситуації щодо туберкульозу в Україні необхідно здійснювати планові діагностичні дослідження ВРХ в господарствах різних форм власності, що обумовлює необхідність виготовлення вітчизняного високоспецифічного нереактогенного та біологічно активного туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планами науково-дослідних робіт Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» на 2001-2005 рр. за завданням «Розробити систему заходів боротьби з туберкульозом сільськогосподарських тварин в умовах реформування тваринництва» (номер державної реєстрації 0101U001615) та за завданням на 2006-2010 рр. «Вивчити поширення, адаптивну мінливість мікобактерій, особливості інфекційного та епізоотичного процесів у тварин, уражених різними видами мікобактерій, і вдосконалити заходи профілактики та боротьби з туберкульозом тварин» (номер державної реєстрації 0106U000351).

Мета і завдання дослідження. Мета досліджень - вивчити епізоотичну ситуацію щодо туберкульозу ВРХ в господарствах України й удосконалити спосіб виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців. Для досягнення мети були поставленні такі завдання:

- проаналізувати епізоотичну ситуацію щодо туберкульозу ВРХ в господарствах України;

- виділити культури мікобактерій з патологічного матеріалу ВРХ та вивчити їх протеїногенні властивості;

- виготовити з культурального фільтрату та бактеріальної маси протеїногенних культур M. bovis туберкулін очищений (ППД) для ссавців та вивчити його властивості;

- оптимізувати технологічну схему виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців, зокрема ВРХ;

- удосконалити методику визначення повноти інактивації M. bovis та біологічної активності туберкуліну для ссавців відповідно до міжнародних вимог.

Об'єкт дослідження: туберкульоз, туберкулін.

Предмет дослідження: епізоотологічна ситуація щодо туберкульозу ВРХ в Україні, діагностика, протеїногенні властивості мікобактерій M. bovis, поживні середовища.

Методи дослідження: епізоотологічний, алергічний, біохімічний, клінічний, патологоанатомічний, бактеріологічний та статистичний.

Наукова новизна одержаних результатів. Із біоматеріалу виділено та селекційовано протеїногенний штам M. bovis, удосконалено спосіб висіву й адаптації його та вирощування на синтетичному поживному середовищі;

- установлено, що туберкулін, виготовлений методом ультрафільтрації з використанням мембранного фракціювання молекул туберкулопротеїну з молекулярною вагою від 10 до 300 кДа, за біологічними властивостями не поступається туберкуліну (ППД) для ссавців у стандартному розчині;

- удосконалено технологічну схему біофабричного виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців;

- уперше отримано та вивчено біологічні властивості туберкуліну з дезінтегрованої бактеріальної маси протеїногенної культури M. bovis ІЕКВМ_1 і доведено, що цей туберкулін не має сенсибілізуючих властивостей, є специфічним, з високою біологічною активністю. Доведено, що зі 100 г дезінтегрованої бактеріальної маси можна додатково вилучати 78,5 см3 високоспецифічного туберкуліну;

- розроблено методику визначення повноти інактивації та біологічної активності туберкуліну (ППД) для ссавців згідно з міжнародними вимогами.

Новизна розробок підтверджена патентом України № 25807 на корисну модель «Туберкуліногенний штам M. bovis № 4» та свідоцтвом Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів № 425.

Практичне значення одержаних результатів. Удосконалено технологічну схему біофабричного виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців з використанням порожнистих мембран, що дозволяє в біофабричних умовах отримати специфічний та високоактивний алерген.

Отриманий шляхом селекції протеїногенний штам збудника туберкульозу M. bovis придатний для виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців, який депоновано до ДНКІБШМ та отримано свідоцтво № 425 від 13.06.2007 р.

Розроблено методику визначення повноти інактивації туберкуліну для ссавців, яка увійшла до ТУ У 24.4-00497087-645-2001 (зміна № 1 від 23.12.2004 р.).

Дані щодо використання порожнистих волокон під час виготовлення туберкуліну увійшли до інструкції з виготовлення туберкуліну.

Розроблено методику визначення біологічної активності туберкуліну (ППД) для ссавців, яка включена до ДСТУ «Препарати ветеринарні. Стандартний зразок туберкуліну для ссавців. Метод контролювання біологічної активності», що застосовується як національний стандарт туберкуліну відповідно і до вимог ЄФ та МЕБ.

Особистий внесок здобувача. Автор дисертаційної роботи самостійно виконав основний обсяг експериментальних досліджень, їх статистичну обробку та узагальнення отриманих результатів. Визначення кількості загального білка в туберкуліні проводилось спільно з провідним науковим співробітником лабораторії біохімії ННЦ «ІЕКВМ», кандидатом біологічних наук С. А. Михайловою.

Виготовлення експериментальних серій за вдосконаленою технологією здійснювали в умовах лабораторії вивчення туберкульозу ННЦ «ІЕКВМ» та вивчення його біологічних властивостей здійснювали спільно з провідним науковим співробітником лабораторії вивчення туберкульозу, кандидатом ветеринарних наук В. В. Білушко.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались, обговорювались і були схвалені на звітних сесіях вченої ради ННЦ «ІЕКВМ» (Харків, 2005-2007 рр.); міжнародній науковій конференції «Актуальні питання боротьби з інфекційними захворюваннями в гуманній і ветеринарній медицині» (Харків, 2005 р.); науково-практичній конференції, присвяченій 75_річчю Новогалещинської біофабрики «Проблеми епізоотології, імунології та біотехнології у ветеринарній медицині» (Полтава, 2006 р.); міжнародній науково-практичній конференції «Молоді вчені у вирішенні проблем аграрної науки і практики» (Львів, 2006 р.); науково-практичній конференції, присвяченій 85_річчю Луганського національного аграрного університету (Луганськ, 2006 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи викладено в 9 друкованих працях у фахових виданнях, перелік яких затверджено ВАК України, з них в 1 статті, опублікованій одноосібно здобувачем, а також у патенті України на штам M. bovis.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках комп'ютерного друку та складається з переліку умовних позначень, вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, опису власних досліджень, узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури, додатків. Роботу проілюстровано 27 таблицями, 13 рисунками. Список використаної літератури містить 271 джерело, серед яких 56 праць закордонних авторів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Роботу виконували протягом 2004-2006 років у лабораторії вивчення туберкульозу Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини», у благополучному щодо туберкульозу ВРХ тваринницькому господарстві СТОВ «Будильське» Лебединського району Сумської області.

При вивченні морфологічних, культуральних і протеїногенних властивостей у мікобактерій ми використовували виробничий референтний штам M. bovis ІЕКВМ_1 та епізоотичні культури M. bovis № 4, M. bovis № 23, M. bovis № 17, M. bovis № 27, M. bovis № 100, виділені з патологічного матеріалу від хворої на туберкульоз ВРХ в неблагополучних щодо захворювання на туберкульоз господарствах України.

Для сенсибілізації лабораторних та сільськогосподарських тварин використовували живу бактеріальну масу вакцинного штаму BCG у вигляді зависі. Культури мікобактерій для виконання роботи були отримані з колекції лабораторії вивчення туберкульозу ННЦ «ІЕКВМ».

Під час здійснення досліджень ми використали такі поживні середовища:

- середовище Сабуро;

- середовище Кітт-Тароці;

- картопляно-гліцеринове середовище Павловського;

- сухе поживне середовище для культивування мікобактерій;

- середовище Сотона;

- синтетичне поживне середовище з глікоколом;

- картопляний відвар;

- середовище Сотона з вмістом картопляного відвару (1:1), (1:4);

- м'ясо-пептонний агар (МПА);

- м'ясо-пептонно-печіночний бульйон (МППБ);

- м'ясо-пептонний бульйон (МПБ).

Тинкторіальні властивості культур мікобактерій досліджували шляхом мікроскопії мазків, пофарбованих за методом Циля-Нільсена.

Осадження протеїну в культуральному фільтраті здійснювали 50 %_м водним розчином трихлороцтової кислоти (ТХО) до кінцевого вмісту у фільтраті 4-6 %. У виготовлених напівфабрикатах алергенів визначали вміст загального білка (мг/см3) за методом К'єльдаля (1960).

У процесі визначення біологічної активності, реактогенності, сенсибілізуючих властивостей і виготовлення серій туберкуліну для контролю використовували «Туберкулін очищений (ППД) для ссавців у стандартному розчині» (серії №№ 60, 64, 66, 80, 86, 87) виробництва Сумської біофабрики; «Сухий очищений комплексний алерген з атипових мікобактерій» (КАМ) (серії №№ 20, 26), виготовлений Курською біофабрикою; «Сухий очищений алерген з атипових мікобактерій» (ААМ), виготовлений Сумською біофабрикою (серії №№ 7, 14); «Розчинник мікобактеріальних алергенів» (серія № 14, контроль № 14), а також міжнародні стандартні зразки туберкуліну (PPD) bovine з Національного інституту біологічних стандартів і контролю (NIBCSE, Вейбридж, Великобританія) та туберкулін виробництва фірми «Десау» (Німеччина), які були отримані з Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів.

Під час проведення роботи в лабораторії вивчення туберкульозу ННЦ «ІЕКВМ» було виготовлено 23 мікросерії туберкуліну (ППД) у стандартному розчині за вдосконаленою технологією по 150 см3, і 2 серії цього алергену за запропонованою технологічною схемою, яку використовують на Сумській державній біофабриці.

У процесі визначення реактогенності, біологічної активності, специфічності та сенсибілізуючих властивостей дослідних мікросерій туберкулінів (ППД) для ссавців було використано 384 морські свинки, вагою 300-450 г і 75 телят симентальської та чорно-рябої порід віком 12-18 місяців з вагою тіла 220-250 кг, які до початку досліду не реагували на туберкулін для ссавців. Сенсибілізуючі властивості виготовлених туберкулінів вивчали в дослідах після триразового внутрішньошкірного введення клінічно здоровим морським свинкам у дозі 0,1 см3/гол. з інтервалом 5 діб та через 15 діб після останнього введення туберкуліну. На дослідження кожної мікросерії препарату було використано по три дослідні, а також три контрольні морські свинки. Облік реакції на місці введення туберкуліну визначали через 24 години після останнього введення. Визначення реактогенності дослідних серій алергенів здійснювали на клінічно здорових морських свинках-альбіносах, або з білими боками, яким внутрішньошкірно вводили 500 ТО алергену. Облік реакцій враховували через 24 години.

Специфічність алергенів вивчали на морських свинках, яких сенсибілізували за 30 діб до початку досліду введенням зависі живих культур атипових мікобактерій (штами M. intracellularae № 78/98 і M. scrofulaceum № 31/82). Морським свинкам з лівого боку внутрішньошкірно вводили туберкулін виготовленої серії у дозі 0,1 см3, а з правого боку - контрольний алерген (КАМ або ААМ). Облік реакції враховували через 24 години після введення алергенів.

Визначення біологічної активності виготовлених алергенів у туберкулінових одиницях (ТО) здійснювали на морських свинках через 30 діб після щеплення зависсю живої культури вакцинного штаму BCG. Із дослідних та контрольних серій готували розведення, що вміщували 100 і 1 000 ТО. Кожне розведення дослідного та контрольного туберкуліну вводили окремим шприцом, номер якого відповідав номеру розведення препарату. Інтенсивність прояву внутрішньошкірних реакцій на туберкулін, визначали у мм через 24 години за формулою:

,

деd1 - сума середніх діаметрів папул на дослідну серію;

d2 - сума середніх діаметрів папул на контрольну серію туберкуліну;

50000 - вміст ТО в 1 см3 основного розчину контрольної серії туберкуліну.

Крім того, вивчення активності та реактогенності дослідних алергенів здійснювали на ВРХ в благополучному щодо туберкульозу господарстві (СТОВ «Будильське» Лебединського району Сумської області). Для здійснення досліду використовували бичків, віком від 12 до 18 місяців, яким попередньо вводили завись вакцинного штаму BCG. Сенсибілізованим тваринам внутрішньошкірно в область середньої третини шиї безголковим ін'єктором БІ_7 вводили дослідну серію алергену з лівого, а контрольну - з правого боків у дозі 0,1 см3 у попередньо вистрижене та оброблене 70 °_м етиловим спиртом. Облік реакції на дослідну та контрольну серії туберкуліну здійснювали через 72 години шляхом порівняння товщини шкірної складки в місці введення алергенів.

Здійснення дослідів з визначення біологічної активності національного зразка туберкуліну (ППД) для ссавців за вдосконаленою методикою проводили згідно з рекомендаціями МЕБ щодо визначення біологічної активності туберкулінів.

Біологічну активність розраховували з використанням довірчих інтервалів на рівні вірогідності 95 % приросту реакції на одиницю підвищення логарифма дози препарату і F-співвідношення для відхилення від паралелізму. Для цього використовували методи для паралельних спостережень у біології, серед яких були:

- співвідношення середніх діаметрів еритем (d/D), де d - діаметр у досліді, D - діаметр у стандарті (еталонний метод);

- коефіцієнт кореляції двох вибірок (r);

- F-критерій Фішера-Снедекора (відношення більшої дисперсії до меншої (F);

- Ф-тест: алгоритм, який характеризує вірогідність збігу парних даних у двох вибірках згідно з комп'ютерною програмою Microsoft Excel;

- співвідношення сум коефіцієнтів лінійної регресії у рівняннях.

Автоклавовану бактеріальну масу збудника туберкульозу M. bovis дезінтегрували на установці УЗДН_1 у режимі 20 кГц протягом 30 хвилин.

Визначення стерильності туберкулінів здійснювали на таких поживних середовищах: МПБ, МПА, МППБ, середовищі Сабуро.

У дисертаційній роботі були використані матеріали звітів за 1996-2006 рр. Державного комітету ветеринарної медицини України з епізоотичної ситуації щодо туберкульозу ВРХ в господарствах України.

Експериментальні дані піддавали статистичній обробці за методом Ст'юдента-Фішера та за допомогою методу критерію знаків (Ашмарін І. П., Воробйов О. О., 1962; Лакін Г. Ф., 1990), а також на персональному комп'ютері з використанням статистичної програми Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Стан епізоотичної ситуації щодо туберкульозу в господарствах України. Аналіз звітних матеріалів свідчить, що найбільша кількість неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ господарств за період із 1996 по 2006 рр. була зареєстрована у 1998 р. та становила 194 господарства. У 2006 р. значно зменшилась кількість неблагополучних пунктів щодо туберкульозу ВРХ - до 29 господарств, що у 6,6 разу менше порівняно з 1999 р. Результати аналізу епізоотичної ситуації щодо захворювання ВРХ на туберкульоз в окремих областях країни свідчать, що найбільшу кількість неблагополучних пунктів за останні 11 років було зареєстровано в Київській області - 238, Черкаській - 123, Сумській - 108 та Запорізькій - 102. У 2005 р. захворювання ВРХ на туберкульоз було зареєстровано в 44 господарствах Київської, 11 - Сумської, 5 - Черкаської і 5 - Запорізької областей.

При вивченні епізоотичної ситуації щодо туберкульозу ВРХ у господарствах України визначено, що в низці господарств, неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ, після їх оздоровлення знову відбувались спалахи туберкульозної інфекції. Незважаючи на велику кількість господарств, неблагополучних щодо захворювання ВРХ на туберкульоз, в окремих областях здійснювали профілактичні та оздоровчі заходи. На кінець 2006 р. були оздоровлені від захворювання на туберкульоз ВРХ тваринницькі господарства Волинської, Закарпатської, Львівської, Рівненської, Івано-Франківської, Тернопільської та Чернівецької областей, а в АР Крим поголів'я ВРХ більше ніж 35 років є благополучним щодо туберкульозу.

За період з 1996 до 2006 рр. лабораторії ветеринарної медицини України виділили з патматеріалу 7 529 культур мікобактерій. З них до збудника туберкульозу M. bovis віднесено 29,8 % культур, M. tuberculosis - 0,6 %, M. avium - 2,2 %, атипові - 67,4 %.

Якщо порівняти кількість патогенних і атипових культур мікобактерій, виділених за останні 11 років, то їх кількість помітно відрізняється. Так, кількість виділених культур збудника туберкульозу M. bovis у 1996 р. становила 28,3 % від загальної кількості виділених культур, а у 2006 р. цей показник збільшився до 41,9 % від загальної кількості ізольованих культур. Кількість виділених атипових культур мікобактерій за останні 11 років збільшилась у 2,2 разу порівняно з кількістю культур збудника туберкульозу M. bovis.

За допомогою алергічного методу в Україні за останні 11 років було виявлено 174 127 хворих на туберкульоз тварин, та за своєчасного здійснення заключних оздоровчих заходів до кінця 2006 р. благополучними щодо туберкульозу було 13 областей. Але гострою залишається проблема параалергічних реакцій на туберкулін, кількість яких становить 0,6-3,0 %. В окремих областях країни частка тварин з неспецифічними реакціями становить 4,7-9,8 %.

Селекція й адаптація культур M. bovis. Селекцію культур збудника туберкульозу M. bovis, ізольованих з патологічного матеріалу, проводили на щільному яєчному середовищі для культивування мікобактерій. З бактеріальної маси кожної окремої культури, яка виросла на середовищі Павловського, готували завись на стерильному фізіологічному розчині в концентрації 1 мг/см3. Потім із цієї зависі методом послідовних розведень було приготовлено шість розведень від 1:10 -1 до 1:10 -6, які окремо висівали на щільне поживне середовище.

Первинний ріст колоній у культур, спостерігали на 21-30 добу в усіх розведеннях. Установлено, що інтенсивність росту колоній була неоднаковою: так, у розведеннях 1:10 -1 і 1:10 -4 кількість колоній культур була від 100 до 200 і більше, а в розведеннях 1:10 -5, 1:10 -6 їх кількість була в межах від 20 до 50 та колонії були світло-сірого кольору, з бугристою шорсткою поверхнею.

Після п'ятого пасажу з поверхні поживного середовища відбирали окремі колонії й висівали на середовище Павловського для накопичення бактеріальної маси та адаптації їх до синтетичних поживних середовищ.

Ураховуючи, що процес адаптації як епізоотичних, так і референтних культур мікобактерій під час виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців є складним, багатостадійним трудомістким процесом, для їх адаптації до синтетичного поживного середовища, дослідні культури висівали на середовище Сотона з вмістом картопляного відвару у співвідношенні відповідно 1:4 і 1:1 та без нього.

Установлено, що на зазначених середовищах ріст у двох культур спостерігався на 10-18 добу у вигляді тонкої прозорої плівки, яка займала ? поверхні середовища.

Результати селекційної роботи та адаптації епізоотичних культур M. bovis свідчать, що не всі культури здатні адаптуватися до рідких поживних середовищ. Так, епізоотичні культури M. bovis № 17 і № 100 давали незначний ріст колоній у вигляді окремих острівців. При 5-6 пасажах на середовищі Сотона спостерігали дисоціацію з R- в S-форму з незначним помутнінням середовища та випадінням плівки на дно флакона. Інші культури M. bovis після 2-3 пасажів формували типову бугристу плівку, рівномірно розташовану на всій поверхні середовища.

Результати порівняльного вивчення елективних властивостей поживних середовищ свідчать, що додавання до середовища Сотона картопляного відвару у співвідношенні 4:1 дозволяє скоротити строки адаптування M. bovis. Установлено, що найбільш придатним способом адаптації та висіву культур M. bovis на середовище Сотона є висів 15-20_добової матричної плівки культури сифонним способом.

Вивчення протеїногенних властивостей культур мікобактерій. У процесі виготовлення туберкуліну основним показником для вибору штамів є їх протеїногенність та висока біологічна активність отриманого алергену.

Визначення протеїногенних властивостей ми здійснили у п'яти культур мікобактерій M. bovis (№№ 4, 17, 23, 27, 100)

Для прискорення формування поверхневої плівки, яка вміщує необхідну кількість бактеріальної маси, ми зробили прискорені пасажування

10-15_добової первинної тонкої плівки на елективні середовища. Через 60 діб культивування у вирощених культур визначали накопичення бактеріальної маси та вихід протеїну.

Результати здійснених досліджень свідчать про те, що накопичення бактеріальної маси у культури M bovis № 4 через 60 діб культивування дорівнювало 0,55 ± 0,02 %, культури № 23 - 0,36 ± 0,05 %, № 17 - 0,29 ± 0,03 %, № 27 - 0,24 ± 0,02 %, № 100 - 0,26 ± 0,03 % відповідно.

Разом із цим, під час визначення виходу білка з культурального фільтрату цей показник у культур M. bovis був неоднаковим. Так, у культуральному фільтраті з M. bovis № 4 кількість білка становила 4,8 ± 0,13 мг/см3, щодо культури M. bovis № 23 - 2,0 ± 0,12 мг/см3, № 17 - 1,8 ± 0,19 мг/см3, № 27 - 1,7 ± 0,17 мг/см3, № 100 - 1,5 ± 0,2 мг/см3.

На підставі здійснених досліджень установлено, що культури мікобактерій №№ 4 і 23, порівняно з іншими культурами, мали більший вихід бактеріальної маси в середньому на 0,29 і 0,1 %, а також мали більший вихід загального білка в середньому на 3,2 і 0,4 мг/см3 відповідно.

Під час визначення біологічних властивостей туберкуліну, виготовленого з культурального фільтрату M. bovis № 4, установлено, що його активність 50 955 ТО/см3, а з культури M. bovis № 23 цей показник не перевищував 41 031 ТО/см3.

На отриманий шляхом селекції протеїногенний штам M. bovis № 4 одержано патент України № 25807 на корисну модель та реєстраційне свідоцтво № 425 Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів.

Виготовлення туберкуліну для ссавців за допомогою мікропористих мембран. Для виготовлення експериментальних мікросерій туберкуліну використовували виробничий туберкуліногенний штам M. bovis ІЕКВМ_1. Відокремлення білків у культуральному фільтраті здійснювали на фільтраційній установці УФМ_3_1 з використанням мікропористих мембран, які затримували білки з молекулярною вагою 10, 100, 10-300 кДа і більше 300 кДа. Біологічні властивості дослідних туберкулінів в розведеннях 100 і 1 000 ТО вивчали на морських свинках, сенсибілізованих вакцинним штамом BCG, у порівнянні з контролем. Результати наведені в таблиці 1.

Таблиця 1

Вивчення біологічної активності, реактогенності та сенсибілізуючих властивостей туберкулінів у дослідах на морських свинках

№ з/п	Туберкулін із вмістом білка	Біологічна активність, ТО	Сенсибілізуючі властивості	Реактогенність
1	до 10 кДа	39 246	Відсутні	Нереактогенний
2	до 100 кДа	50 789	Відсутні	Нереактогенний
3	від 10 до 300 кДа	51 031	Відсутні	Нереактогенний
4	більше 300 кДа	51 603	Відсутні	Нереактогенний

З матеріалів, наведених у таблиці, видно, що триразове внутрішньошкірне введення алергенів з молекулярною вагою білків 10, 100, 10-300 кДа та більше 300 кДа не зумовлювало сенсибілізації у здорових морських свинок. Разом із цим, у здорових морських свинок за введення виготовлених алергенів у дозі 500 ТО на місці введення внутрішньошкірних реакцій не спостерігали, що свідчить про відсутність реактогенних властивостей у цих алергенів.

Біологічна активність туберкуліну (ППД) для ссавців, що вміщував протеїни до 10 кДа, становила 39,2 тис. ТО, 100 кДа - 50,8 тис. ТО, від 10 до 300 кДа - 51,0 тис. ТО, більше 300 кДа - 51 603 ТО.

Результати досліджень свідчать, що у туберкуліну, який вміщував протеїни до 10 кДа, біологічна активність була на 12,356 ТО менше, що не відповідає вимогам стандарту.

Установлено, що туберкулін, який у своєму складі вміщував білки від 10 до 300 кДа, мав високу біологічну активність, а рівень прояву перехресних алергічних реакцій був менш виражений порівняно з туберкуліном контрольної серії, що й було підставою для вдосконалення технологічної схеми виготовлення туберкуліну для ссавців.

Виготовлення туберкуліну методом ультрафільтрації в умовах біофабрики. На Сумській біофабриці туберкулін очищений (ППД) для ссавців виготовляють у стандартному розчині. Але технологічні процеси його виготовлення трудомісткі, що суттєво впливає на кількісні показники готового продукту та його собівартість.

Ураховуючи вищезазначені дані, ми вдосконалили схему технологічних процесів, насамперед використання сифонного способу висіву матричної культури, концентрацію культурального фільтрату на фільтраційній установці УПВ_6 з порожнистими волокнами з пропускною здатністю білків 10-300 кДа за температури розчину 10 °С та концентрації розчину до 1:10 загального об'єму, осадження та переосадження протеїну трихлороцтовою кислотою та сірчаним амонієм, стерилізуючу фільтрацію алергену на установці Sartorius. Технологічна схема виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині наведена на рисунку 1.

Рис. 1. Схема виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців.

За вдосконаленою схемою ми виготовили дві серії туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців (вміст протеїну 10-300 кДа і більше 300 кДа) та здійснили визначення їх біологічних властивостей згідно з ТУ У 24.4-00497087-2001. У дослідах на лабораторних тваринах і ВРХ встановлено, що туберкуліни, які виготовлені за вдосконаленою схемою, були нешкідливими, специфічними, а біологічна активність становила в серії № 1 - 50 459 ТО/см3, серії № 2 - 51 031 ТО/см3, а в здорових тварин вони не викликали підвищеної чутливості сповільненого типу після їх введення.

Результати здійснених досліджень серії туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині, що виготовлені в умовах Сумської біофабрики за удосконаленою схемою, відповідають вимогам ТУ У 24.4-00497087-2001 і міжнародним вимогам для цього препарату.

Виготовлення ППД-туберкуліну з дезінтегрованої бактеріальної маси M. bovis. У дослідженнях використовували бактеріальну масу культури мікобактерій штаму M. bovis ІЕКВМ_1, вирощену на рідкому поживному середовищі Сотона протягом 60 діб за температури 37 ± 0,5 °С. Інактивовану бактеріальну масу відокремлювали шляхом фільтрування, яку дезінтегрували на ультразвуковій установці (УЗДН_1) за 22 кГц протягом 30 хвилин. Отриману надосадову рідину фільтрували через мікропористі капронові мембрани на установці УФМ_3_1, а з отриманого фільтрату виготовляли туберкулін.

Активність дослідних мікросерій туберкулінів у туберкулінових одиницях (ТО) визначали на сенсибілізованих вакцинним штамом BCG морських свинках живою вагою 400-500 г. Результати алергічних реакцій порівнювали з контрольними зразками туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців (серія № 69), виготовленого на Сумській біофабриці. Установлено, що біологічна активність туберкуліну, виготовленого з дезінтегрованих мікробних клітин M. bovis,становила 55 546 ± 10 000 ТО/см3.

У процесі випробування експериментальних мікросерій туберкулінів на великій рогатій худобі, сенсибілізованій культурою вакцинного штаму BCG, доведена їх висока біологічна активність. При цьому, середня інтенсивність алергічних реакції на туберкулін (у дозі 5 000 ТО в 0,1 см3), виготовлений з бактеріальної маси, становила 10,3 ± 1,1 мм, а щодо контрольної серії туберкуліну (серія № 69), то цей показник становив 9,8 ± 1,0 мм. Крім того, встановлено, що дослідні туберкуліни були нереактогенними й не зумовлювали сенсибілізацію у клінічно здорових тварин.

Використання методу ультразвукової дезінтеграції бактеріальної маси дозволило додатково отримати 78,5 см3 туберкуліну (ППД) для ссавців зі 100 г бактеріальної маси, який можна ефективно застосовувати для прижиттєвої алергічної діагностики туберкульозу в сільськогосподарських тварин.

Порівняльне випробування туберкулінів, виготовлених за різними технологіями, із закордонними алергенами. Дослідження біологічної активності туберкулінів здійснювали на 3_х групах тварин ВРХ (по 10 голів), щеплених культурою BCG у дозі 5 мг/см3. Було відібрано дві серії туберкулінів: № 1 та № 2, виготовлених за удосконаленою схемою, у порівнянні з Європейським стандартним зразком виробництва NIBSCE (Великобританія), а також з туберкуліном, виготовленим у Німеччині (фірма «Десау»). Активність дослідних серій туберкулінів вивчали в 3_х розведеннях - 1:200, 1:1 000 і 1:5 000 ТО. Облік реакцій здійснювали через 72 години після введення туберкулінів (табл. 2).

Данні, наведені в таблиці 2 свідчать, що середньостатистичні показники інтенсивності внутрішньошкірних алергічних реакцій у ВРХ на введення туберкуліну серії № 1 у дозі 200 ТО становили 3,3 ± 0,5 мм, 1 000 ТО - 3,6 ± 0,3, 5 000 ТО - 6,3 ± 0,9, у той час як на Європейський стандартний зразок туберкуліну NIBSCE ці показники становили відповідно 4,0 ± 0,5 мм, 4,3 ± 1,1 мм та 7,5 ± 1,2 мм.

Таблиця 2

Результати порівняльного вивчення активності туберкуліну в дослідах на ВРХ

Група тварин	Середня інтенсивність реакцій (мм) на введення туберкулінів (М±m)
	Серії, виготовлені за вдосконаленою технологією	Міжнародний стандарт (NIBSCE)
	200 ТО	1 000 ТО	5 000 ТО	200 ТО	1 000 ТО	5 000 ТО
С №-1 (n = 10)	3,3 ± 0,5	3,6 ± 0,3	6,3 ± 0,9	4,0 ± 0,5	4,3 ± 1,1	7,5 ±1,2
С №-2 (n = 10)	3,7 ± 0,5	4,3 ± 0,4	6,2 ± 0,5	3,8 ± 0,7	4,2 ± 1,0	8,7 ± 0,6

Інтенсивність прояву алергічних реакцій на введення експериментальної серії № 2 була дещо меншою, ніж на введення туберкуліну NIBSСE. Так, на перше розведення (200 ТО) середня інтенсивність прояву алергічних реакцій становила 3,7 ± 0,5 мм, на 1 000 ТО - 4,3 мм, на 5 000 ТО - 6,2 мм. Реакції на Європейський стандартний зразок виробництва NIBSСE (Великобританія) становили відповідно 3,8 ± 0,7, 4,2 ± 1,0 і 8,7 ± 0,6 мм.

У результаті порівняння інтенсивності прояву алергічних реакцій дослідних серій туберкуліну (№ 1 і № 2) з показниками на туберкулін NIBSСE (Великобританія) була засвідчена відповідність вітчизняного туберкуліну Європейському стандарту.

Під час проведення порівняльного випробування активності туберкулінів, що ми виготовили за вдосконаленою технологією (серії № 1 і № 2), та стандартної серії цього алергену, який був виготовлений на Сумській біофабриці (серія № 64), з туберкуліном, виготовленим фірмою «Десау» встановлено, що середня інтенсивність алергічних реакцій становила: на серію № 1 (10-300 кДа) - 5,7 ± 0,5 мм, серію № 2 (більше 300 кДа) - 5,0 ± 0,4 мм, серію № 64 - 5,3 ± 0,6 мм, а на туберкулін виробництва фірми «Десау» - 4,75 ± 0,6 мм. Отримані дані свідчать, що алергени, які виготовлені в умовах Сумської біофабрики за різними технологіями, у порівнянні із закордонними зразками алергенів, за біологічною активністю не поступались туберкуліну (ППД) для ссавців, виготовленому в Німеччині.

На підставі отриманих результатів досліджень установлено, що серії туберкулінів, які виготовлені за вдосконаленою технологією в умовах Сумської біофабрики, є нереактогенними, активними, не володіють сенсибілізуючими властивостями і можуть застосовуватись для проведення алергічного дослідження ВРХ на туберкульоз.

Удосконалення методу визначення біологічної активності туберкуліну (ППД) для ссавців. Основною вимогою якості мікобактеріальних алергенів, які застосовуються для прижиттєвої діагностики туберкульозу, є їх відповідність міжнародним стандартам.

У дослідах було використано туберкулін очищений (ППД) для ссавців, виготовлений за вдосконаленою технологією, та контрольну комерційну серію туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині (серія № 66), виготовлену на Сумській біофабриці. Для визначення активності туберкулінів із дослідної й контрольної серій алергенів готували розведення, що містили 50, 100, 500 ТО. Кожне розведення туберкуліну вводили сенсибілізованим морським свинкам внутрішньошкірно за схемою «неповного латинського квадрата». Облік реакцій здійснювали через 24 години після введення алергенів. Спочатку дослідні серії туберкуліну обчислювали за ступенем розкиду даних реакцій у тварин на дози введення порівняно зі стандартним зразком за F_критерієм. Для здійснення розрахунку середню величину шкірних реакцій по кожній дозі, а потім по серії, обчислювали за допомогою десяткових логарифмів. Для зменшення похибки під час розрахунку лінії регресії використовували три значення, величину реакцій на 1, 2, 3 розведення, крім експериментально одержаних значень (сумарна інтенсивність реакцій, мм), використовували четверте значення «нуль» (табл. 3).

Таблиця 3

Результати визначення співвідношення біологічної активності дослідної та контрольної серій туберкуліну

Показники	Розведення
	ІІІ	ІІ	І	0
Lg D	3,76	2,76	1,76	0
Х (дослід), мм	18,0	20,0	20,5	0
Х (контроль), мм	18,5	21,0	21,0	0

Аналіз результатів таблиці свідчить, що для 1_го розведення дослідної серії середній розмір реакцій становив 20,5 мм3, 2_го розведення - 20 мм3, 3_го - 18 мм3. На введення 1_го розведення контрольної серії цей показник становив 21 мм3, 2_го - 21 мм3, 3_го - 18,5 мм3. Після проведення розрахунку F-критерію для кожного розведення дослідної та контрольної серій установлено, що F-критерій 1_го розведення становив 0,56, 2_го - 0,41, а на 3_тє цей показник дорівнював 1,62. Для побудови лінії тренда при графічному вираженні біологічної активності отриманих результатів за трьома розведеннями дослідної серії відносно показників контрольної серії туберкуліну використовували комп'ютерну програму Microsoft Excel (рис. 2).

Розрахунок біологічної активності дослідної серії туберкуліну для ссавців:

А = 0,97 Ч 50 000 = 48 500 ТО,

де 50 000 - активність контрольної серії туберкуліну, ТО;

ДІ = 48 500 Ч 0,0225 = 1 091 ТО;

А = 48 500 ± 1 091 ТО.

На підставі аналізу отриманих результатів установлено, що розбіжність активності дослідної серії туберкуліну зі стандартним зразком не перевищувала допустимі значення та була найбільш близькою до одиниці (0,97), кут лінії у графіку був мінімальним. Це свідчить, що серії мали практично однакову біологічну активність.

Lg.Д

-- лінійний ряд 1 (дослідної серії),

---- лінійний ряд 2 (контрольної серії),

к/к=0,97.

Рис. 2. Співвідношення біологічної активності дослідної та контрольної серій туберкуліну для ссавців.

Результати проведеної оцінки серії національного стандарту свідчать, що величина відносного коефіцієнту у/У становила в дослідної серії у = 6,5972, у контрольної серії цей показник становив у = 6,8194, що вкладається в параметри (від 80 до 120 %), які відповідають вимогам для туберкуліну (ППД) для ссавців. На підставі здійснених досліджень розроблено нову схему визначення біологічної активності туберкуліну з метою визначення національного стандарту, який відповідає вимогам ЄС. Це також дозволило спільно з Державним науково-контрольним інститутом біотехнології і штамів мікроорганізмів розробити ДСТУ «Препарати ветеринарні. Стандартний зразок туберкуліну для ссавців. Метод контролювання біологічної активності».

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведено дані з вивчення епізоотичної ситуації щодо туберкульозу великої рогатої худоби в господарствах України та виділення культур мікобактерій з патологічного матеріалу. Ідентифіковано протеїногенний штам M. bovis № 4, придатний для виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців. Розроблено спосіб виробничого висіву матричної розплодки на синтетичне поживне середовище, отримано протеїн з бактеріальної маси M. bovis, удосконалено технологічну схему біофабричного виготовлення туберкуліну (ППД) для ссавців, методику визначення повноти інактивації та біологічної активності туберкуліну відповідно до міжнародного стандарту.

2. За 11_річний період (1996-2006 рр.) зареєстровано захворювання великої рогатої худоби на туберкульоз у 238 господарствах Київської, 123 - Черкаської, 108 - Сумської і 102 - Запорізької областей. Установлено також спорадичні випадки цього захворювання в господарствах Львівської, Полтавської, Одеської та Івано-Франківської областей. Із загальної кількості досліджених культур збудника туберкульозу ідентифіковано 29,8 % - M. bovis, 2,2 % - M. avium, 0,6 % - M. tuberculosis та 67,4 % - атипових мікобактерій.

3. Доведено, що епізоотичні культури мікобактерій M. bovis мають неоднакові протеїногенні властивості. Продукція білка за їх вирощування в синтетичному поживному середовищі коливається в межах від 1,7 до 4,8 мг/см3.

4. Культивування на синтетичному поживному середовищі штаму M. bovis № 4 протягом 60 діб забезпечує накопичення загального білка 4,8 ± 0,13 мг/см3, біологічна активність виготовленого туберкуліну становить 50 952 ТО/см3.

5. Розроблено спосіб адаптації, висіву та культивування 20-25_добової матричної розплодки виробничого штаму M. bovis на синтетичне поживне середовище, який дозволяє вдосконалити процес виробничого висіву, зменшити вибраковку виробничих висівів на 8-10 %, а також він є більш безпечним у протиепідемічному та протиепізоотичному відношеннях.

6. Виготовлений з дезінтегрованої бактеріальної маси M. bovis туберкулін є специфічним, активним, нереактогенним. За триразового (інтервал 5 діб) внутрішньошкірного введення він не викликає алергічних реакцій у здорових тварин.

7. Інтенсивність внутрішньошкірних реакцій у морських свинок в гетерологічній системі на введення туберкуліну з вмістом білкових фракцій 10 кДа не перевищують у сумі 125,5 мм, 100 кДа - 148,0 мм, 300 кДа - 158,0 мм, більше 300 кДа - 190 мм. Найбільш виражену специфічну активність має туберкулін, що містить фракції білків 10-300 кДа.

8. Удосконалено технологічну схему виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині, що дозволяє в біофабричних умовах виготовляти алерген, який за біологічною активністю не поступається національному та міжнародному стандартам. У дослідах на сприйнятливих тваринах реакції збігаються у 100 % випадків з туберкуліном NIBSCE (Великобританія).

9. Розроблено методику визначення біологічної активності туберкуліну, яка основана на напівлогарифмічній залежності інтенсивності прояву реакцій від введеної дози алергену та визначення величини відносного коефіцієнту, що дозволяє достовірно встановити активність туберкуліну, створити національний стандарт цього алергену та здійснювати контроль якості виробничих серій туберкуліну відповідно до вимог ЄФ і МЕБ.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

1. Для виробництва туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців запропоновано протеїногенний штам M. bovis № 4, який депоновано до ДНКІБШМ України (реєстраційне свідоцтво № 425).

2. Запропоновано вдосконалену схему виготовлення туберкуліну для ссавців, ТУ У 24.4-00497087-2001 «Туберкулін очищений (ППД) для ссавців у стандартному розчині» (зміни № 1 і № 2).

3. Основні теоретичні положення та результати експериментальних досліджень використовуються в навчальному процесі студентів факультетів ветеринарної медицини вищих навчальних закладів.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Завгородній А. І. Оцінка ефективності експериментальних мікросерій туберкуліну для ссавців [Текст] / А. І. Завгородній, В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов // Зб. наук. праць Полтавської держ. аграр. акад. - 2006. - С. 110-115. (Дисертант здійснив дослідження та взяв участь в узагальненні, обробці та оформленні отриманих результатів).

2. ППД-туберкулін для ссавців виробництва Сумської біофабрики [Текст] / А. І. Завгородній, П. М. Тихонов, В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов, В. Г. Скрипник // Вет. медицина України. - 2006. - № 2. - С. 34-35. (Дисертант зібрав та узагальнив фактичний матеріал, підібрав та проаналізував літературні джерела).

3. Білушко В. В. Отримання очищених туберкулінів для алергічної діагностики туберкульозу тварин [Текст] / В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов // Вісник Сумського нац. аграр. ун_ту. Серія «Вет. медицина» : наук.-метод. журн. - 2006. - Вип. 1-2 (15-16). - С. 19-22. (Дисертант підібрав і проаналізував літературу, виготовив туберкулін та вивчив його активність і специфічність).

4. Білушко В. В. Порівняльне вивчення властивостей туберкулінів для ссавців, виготовлених за різними технологіями [Текст] / В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов // Пробл. зооінженерії та вет. медицини : зб. наук. праць Харківської держ. зооветеринарної акад. - Х., 2006. - Вип. 13, ч. 2: Матеріали міжнарод. наук. конф. «Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине», посвящ. 160_летию со дня рождения лауреата Нобелевской премии И. И. Мечникова (27-30 нояб. 2005 г.). - С. 51-55. (Дисертант спланував досліди, виконав експериментальні дослідження та взяв участь у написанні статті).

5. Білушко В. В. Вдосконалення засобів алергічної діагностики туберкульозу у ссавців [Текст] / В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов // Пробл. зооінженерії та вет. медицини : зб. наук. праць Харківської держ. зооветеринарної акад. - Х., 2006. - Вип. 13, ч. 2: Матеріали міжнарод. наук. конф. «Актуальные вопросы борьбы с инфекционными заболеваниями в гуманной и ветеринарной медицине», посвящ. 160_летию со дня рождения лауреата Нобелевской премии И. И. Мечникова (27-30 нояб. 2005 г.). - С. 119-122. (Дисертант здійснив дослідження та взяв участь в узагальненні й оформленні матеріалів).

6. Завгородній А. І. Діагностична ефективність туберкулінів, що виготовлені за різними технологіями [Текст] / А. І. Завгородній, В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов // Зб. наук. праць Луганського нац. аграр. ун_ту. - Луганськ, 2006. - № 69 (92) . - С. 164-168. (Дисертант підібрав і проаналізував літературу, виготовив туберкулін для ссавців різними способами та здійснив порівняльне вивчення його біологічних властивостей).

7. Дегтярьов І. М. Випробування експериментального туберкуліну для ссавців [Текст] / І. М. Дегтярьов // Наук. вісник Львівської нац. акад. вет. медицини ім. С. З. Гжицького. - Львів, 2006. - Т. 8, № 3 (30), ч. 1. - С. 27-30.

8. Завгородній А. І. Виготовлення туберкуліну для ссавців із дезінтегрованої бактеріальної маси мікобактерій [Текст] / А. І. Завгородній, В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов // Зб. наук. праць Луганського нац. аграр. ун_ту. - Луганськ, 2007. - № 78/101. - С. 218-222. (Дисертант здійснив дослідження, узагальнив та оформив матеріали статті).

9. Пошук протеїногенних штамів мікобактерій M. bovis для виготовлення туберкуліну (ППД) для ссавців [Текст] / А. І. Завгородній, П. М. Тихонов, В. В. Білушко, І. М. Дегтярьов, С. А. Позмогова / Вет. медицина : міжвід. темат. наук. зб. - Х., 2008. - Вип. 89. - С. 184-189. (Дисертант особисто виконав експериментальну роботу з культивування мікобактерій M. bovis на поживних середовищах, підбір і аналіз літератури та написання статті).

...