Структурно-функціональні та лектиногістохімічні особливості органів жіночої репродуктивної системи за умов гіпо- та гіпертироїдизму в експерименті

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНИЙ ВИЩИЙ НАВЧАЛЬНИЙ ЗАКЛАД

ІВАНО-ФРАНКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Согомонян Єлізавета Анатоліївна

УДК 611.65+618.1-06:616.441]-018:547.96

СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНІ ТА ЛЕКТИНОГІСТОХІМІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ОРГАНІВ ЖІНОЧОЇ РЕПРОДУКТИВНОЇ СИСТЕМИ ЗА УМОВ ГІПО- ТА ГІПЕРТИРОЇДИЗМУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Івано-Франківськ - 2011



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Луцик Олександр Дмитрович, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач кафедри.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Шепітько Володимир Іванович, ВДНЗ “Українська медична стоматологічна академія” МОЗ України, кафедра гістології, цитології та ембріології, завідувач кафедри;

доктор медичних наук, професор Волошин Микола Анатолійович, Запорізький державний медичний університет МОЗ України, кафедра анатомії людини.

Захист відбудеться “12” травня 2011 року об 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 при ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет” МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 2).

Із дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет” МОЗ України (76018, м. Івано-Франківськ, вул. Галицька, 7).

Автореферат розісланий “11” квітня 2011 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 20.601.02 кандидат медичних наук, доцент О.Г. Попадинець.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Порушення функції щитоподібної залози посідають одне з перших місць серед ендокринної патології. Ними уражено не менш як 3% населення світу і швидкість зростання кількості цих хворих упродовж минулих 10 років залишається незмінно високою (Левченко И.А. и др., 2002; Малова Н.Г. и др., 2006). В Україні число випадків тироїдної патології за останнє десятиліття зросло більш, ніж утричі. Карпатський регіон, відомий достатньо високим ступенем йодного дефіциту, є внаслідок цього ендемічним щодо захворювань щитоподібної залози з оцінкою ендемії як важкої (Паньків В.І. та ін., 2006; Боцюрко В.І. та ін., 2006). Заслуговує на увагу також той факт, що покоління дітей із постчорнобильськими ураженнями щитоподібної залози нині досягло репродуктивного віку (Муравлева О.Д. та ін., 2004).

Щитоподібна залоза є важливою ланкою нейроендокринної системи, що здійснює суттєвий вплив на жіночу репродуктивну функцію (Doufas A.G. et al., 2000; Тупикина Е.Б., 2000; Пятибратова Е.В., 2003). За даними багатьох експериментальних та клінічних досліджень, дисбаланс тироїдних гормонів може обумовлювати низку патологічних відхилень у діяльності органів жіночої репродуктивної системи. Так, зокрема, гіпо- та гіпертироїдизм можуть слугувати причиною порушень статевого дозрівання та менструальної функції, зниження фертильності, зростання частоти гінекологічної патології, самовільних абортів і мертвонароджень (Abe Y.et al., 1997; Бирюкова М.С. и др., 2003; Тітенко Т.М., 2006).

Аналіз доступної фахової літератури показав, що при наявності значної кількості клінічних спостережень стосовно негативного впливу дисфункції щитоподібної залози на жіночу репродуктивну систему, недостатньо праць, присвячених експериментальному вивченню тонких патомеханізмів цього впливу. Зокрема, в літературі мало даних стосовно змін мікроморфології жіночих репродуктивних органів на тлі гіпо- та гіпертироїдизму. Практично відсутні публікації, присвячені дослідженню змін вуглеводних детермінант (рецепторів лектинів) органів жіночої репродуктивної системи під дією дисбалансу тироїдних гормонів. Поряд із цим, численні публікації (Луцик А.Д. и др., 1989; Parillo F. еt al., 2001, 2003; Волошин Н.А. и др., 2004) свідчать про важливу роль вуглеводовмісних біополімерів як у функціонуванні нормальних структур організму, так і їх залученні до механізмів розвитку різноманітних форм патології.

Серед структур яєчників глікопротеїнами та протеогліканами багата прозора зона овоцита, клітини гранульози фолікулів, лютеоцити жовтих тіл. Високим вмістом і різноманіттям глікополімерів характеризуються секреторні продукти маткових залоз, клітини епітеліального вистелення порожнини матки. Олігосахаридним ланцюгам глікокон'югатів належить визначальна роль у забезпеченні видоспецифічності та моноспермності запліднення, адгезії та наступної інвазії бластоцисти в ендометрій (Луцик А.Д. и др.,1989; Aviles М. et al., 1997), тому вивчення змін глікому жіночих репродуктивних органів при тироїдній патології може становити значний інтерес як для теоретичної, так і клінічної медицини.

Достатньо чутливими та селективними маркерами вуглеводних детермінант біополімерів є лектини. Незважаючи на їх достатньо тривале застосування у різних ділянках гісто- та цитохімії (Nicolson G.L. 1971; Roth J., 1978; Луцик М.Д. и др., 1980), пошук і характеристика нових препаратів лектинів, розширення можливостей їх використання в якості інструментів дослідження характеру змін глікокон'югатів органів і тканин у нормі та при різних формах патології продовжує залишатися актуальним завданням (Антонюк В.О., 2005; Корсун В.Ф. и др., 2007).

На основі попередніх досліджень (Луцик А.Д. и др., 1987) було сформульовано гіпотезу щодо незавершеності процесів кінцевого глікозилювання біополімерів слинних залоз під впливом експериментального гіпо- та гіпертироїдизму. Серед пріоритетів цієї дисертаційної роботи було поглиблення уявлень щодо впливу тироїдної патології на глікополімери органів жіночої репродуктивної системи, а також апробація нових препаратів лектинів різної вуглеводної специфічності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.. Дисертаційна робота є фрагментом планової наукової теми кафедри гістології, цитології та ембріології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького “Пошук нових препаратів лектинів із сировини Карпатського регіону та можливості їх застосування у біології і медицині” (номер державної реєстрації 0107U001048). Тема дисертації затверджена Проблемною комісією “Морфологія людини” 24.05.2007 р., протокол № 78.

Мета і задачі дослідження. В експерименті на щурах дослідити вплив гіпо- та гіпертироїдизму на статеві цикли, а також мікроморфологію та вуглеводні детермінанти яєчників і ендометрію, використавши з цією метою набір лектинів різної вуглеводної специфічності, серед них 5 нових лектинів, очищених з представників підцарства грибів-базидіоміцетів.

Завдання дослідження:

З використанням експериментально-біологічних (аналіз статевих циклів), загальноморфологічних і лектиногістохімічних методів дослідити характер змін у яєчниках та ендометрії щура при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі, а також при корекції гіпотироїдизму тироксином.

Bивчити гістотопографію манозо-, фукозо- та сіалогліканів, вуглеводних детермінант DGlcNAc, DGal і DGalNAc у структурних компонентах яєчників та матки щура в нормі.

Порівняти якісний характер перерозподілу глікокон'югатів у яєчнику і матці при гіпо- та гіпертироїдизмі, а також ступінь уражень означених органів, зумовлених дисбалансом тироїдних гормонів.

Порівняти вираженість впливу гіпо- та гіпертироїдизму на органи жіночої репродуктивної системи, а також ефективність корекції експериментального гіпотироїдизму тироксином.

Дослідити специфічність зв'язування з тканинними глікополімерами та перспективи використання в гістохімічних дослідженнях 5 нових препаратів лектинів, очищених з грибів-базидіоміцетів.

Оцінити інформативну вартісність методів лектинової гістохімії для поглиблення уявлень стосовно патомеханізмів впливу гіпо- та гіпертироїдизму на органи жіночої репродуктивної системи.

Виявити нові можливості використання лектинів в якості селективних гістохімічних маркерів структурних компонентів яєчників та ендометрію щура в нормі і патології.

Об'єкт дослідження: мікроструктура та вуглеводні детермінанти яєчників та ендометрію щура на тлі експериментального гіпо- та гіпертироїдизму.

Предмет дослідження: вплив гіпо- та гіпертироїдизму на статеві цикли, мікроморфологію та експресію рецепторів лектинів різної вуглеводної специфічності структурними компонентами яєчників та матки щура.

Методи дослідження: експериментально-біологічний, загальноморфологічний, лектиногістохімічний, метод статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що експериментальний гіпотироїдизм викликає гальмування статевого циклу в щурів. Як гіпо-, так і гіпертироїдизм викликають у щурів порушення кількісного співвідношення між основними структурними компонентами яєчника - фолікулами і жовтими тілами, причому при гіпотироїдизмі ідентифіковано посилення фолікулогенезу та виражену лейкоцитарну інфільтрацію мозкової речовини яєчника, а за умов експериментального гіпертироїдизму - сповільнення фолікулогенезу, збільшення кількості та гіпертрофію жовтих тіл. Дисбаланс тироїдних гормонів супроводжується в щурів змінами кількісного складу клітинних і стромальних структур ендометрію, а саме, нагромадженням лейкоцитів при гіпотироїдизмі, децидуальних клітин, колагенових волокон - при гіпертироїдизмі.

Уперше з використанням набору лектинів різної вуглеводної специфічності, очищених із сировини Карпатського регіону, охарактеризовано особливості складу вуглеводних детермінант структурних компонентів яєчників і матки щура в нормі, а також їх зміни, індуковані експериментальним гіпо- та гіпертироїдизмом. У роботі вперше в практиці гістохімічних досліджень органів жіночої репродуктивної системи використано 5 нових лектинів, отриманих із представників підцарства грибів-базидіоміцетів, досліджено специфіку їх зв'язування зі структурними компонентами яєчників та ендометрію щура в нормі і в умовах тироїдної патології, показана перспективність подальшого застосування у гістохімії.

Використання мічених лектинів продемонструвало, що тироїдна патологія супроводжувалась якісними змінами та перерозподілом вуглеводних детермінант біополімерів у структурах яєчників та ендометрію, при цьому зміни лектинових рецепторів були більш вираженими у тварин із гіпертироїдизмом. Уперше встановлено, що лектини можуть слугувати маркерами лейкоцитів ендометрію, а в умовах гіпертироїдизму деякі лектини (зокрема, MPFA )можуть слугувати маркерами видозмінених колагенових волокон. Найбільш селективними гістохімічними маркерами глікополімерів прозорої зони та клітин променистого вінця яєчникових фолікулів щура як у нормі, так і при тироїдній патології можуть слугувати лектини SBA, HPA,WGA.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати поглиблююють існуючі уявлення стосовно впливу гіпо- та гіпертироїдизму на структурно-функціональні особливості яєчників і ендометрію, розширюють можливості використання лектинів як селективних гістохімічних маркерів окремих структурних компонентів яєчників і ендометрію. Отримані нові дані стосовно перебудови глікокон'югатів жіночих репродуктивних органів на тлі гіпо- та гіпертироїдизму можуть бути використані при опрацюванні нових патогенетично обгрунтованих методів лікування і контролю за ефективністю корекції цих форм патології.

Апробовано нові препарати лектинів з грибів-базидіоміцетів та продемонстровано перспективність їх подальшого застосування для гістохімічного дослідження нормальних і патологічно змінених тканин. У процесі виконання дисертації удосконалено спосіб очистки лектину бруслини європейської, а також досліджено гістохімічну специфічність цього лектину до структурних компонентів яєчників та ендометрію щура.

Впровадження результатів дослідження. Матеріали дисертації впроваджені і використовуються в навчальному процесі на кафедрах гістології, цитології та ембріології Донецького національного медичного університету імені М. Горького, Запорізького державного медичного університету, Луганського державного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, Харківського національного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно зібрала та проаналізувала наукову літературу і патентну інформацію, особисто провела експеримент та дослідження статевих циклів, забір гістологічного матеріалу та виготовлення гістологічних препаратів з використанням методів класичної гістології та лектинової гістохімії. Статистична обробка даних, їх науковий аналіз, оформлення дисертаційної роботи виконані здобувачем самостійно. Основні положення, що виносяться на захист, висновки та практичні рекомендації дисертації сформульовані автором спільно з науковим керівником. У наукових роботах, надрукованих у співавторстві, автору належить фактичний матеріал і участь здобувача є визначальною.

Апробація результатів дисертації. Результати та основні наукові положення дисертації оприлюднені на засіданнях кафедри гістології, цитології та ембріології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького; науково-практичних конференціях: “Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень” (Тернопіль, 29-30 травня 2008 р.), “Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології” (Вінниця, 20-21 травня 2009 р.), “Прикладні аспекти морфології” (Івано-Франківськ, 20-21 травня 2010 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 наукових праць, з яких 5 - журнальні статті у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України (1 одноосібна), 3 - у матеріалах науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена українською мовою на 167 сторінках машинописного тексту (основний текст роботи становить 134 сторінки) і складається зі вступу, літературного огляду, опису матеріалів і методів дослідження, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, додатків. Список літератури включає 244 джерела, із них 150 праць вчених країн СНД та 94 праці іноземних авторів. Робота ілюстрована 90 рисунками та 6 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

щур енрдометрій лектин гіпертироїдизм

Матеріали та методи дослідження. Дослід виконано на 65 статевозрілих самках білих щурів лінії Вістар масою 200-250 г. Усі тварини були поділені на 5 груп: контроль, гіпо- та гіпертироїдизм (по 15 тварин у групі), а також 2 групи з корекцією гіпотироїдизму (по 10 тварин у групі).

Гіпотироїдний стан моделювали за допомогою мерказолілу (“Здоров'я”, Харків) у добовій дозі 10 мг/кг. Корекцію гіпотироїдизму проводили тироксином, який вводили одночасно із мерказолілом. У першій групі корекції доза тироксину становила 1,6 мкг/кг маси. У другій групі корекції замісна доза тироксину становила 30 мкг/кг маси. Гіпертироїдизм викликали L-тироксином (“Фармак”, Київ) у добовій дозі 100 мкг/кг маси тіла тварин.

В усіх дослідних групах мерказоліл і тироксин у вигляді порошку додавали у їжу щоденно впродовж 14 діб. Після цього, не припиняючи згодовування мерказолілу і/або тироксину, починали дослідження статевого циклу самок шляхом щоденного мікроскопічного аналізу вагінальних мазків упродовж 21 доби.

Тварин піддавали евтаназії на стадії “діеструс”. Під час розтину забирали яєчники, матку та щитоподібні залози (з обох боків). Яєчники та матку фіксували у 4% нейтральному формаліні (яєчники - цілими, в матці висікали середню частину рогів). Щитоподібні залози фіксували в суміші Буена. Після зневоднення матеріал заливали у парафін за стандартною методикою. Для отримання оглядових препаратів зрізи яєчників, матки та щитоподібних залоз товщиною 5-7 мкм зафарбовували гематоксиліном і еозином.

Контроль ефективності моделювання гіпо- та гіпертироїдизму, а також корекції гіпотироїдизму, проводили шляхом вивчення макро- та мікроморфології щитоподібних залоз, враховуючи наявність “струмогенної” реакції при введенні мерказолілу, її відсутність при корекції замісними дозами тироксину та морфологічні ознаки зниження функції залози при введенні гіпертироїдних доз тироксину.

Аналіз естральних циклів проводили з урахуванням наступних показників (Літвінова Л.Б., 2001): 1) частота настання естральних періодів; 2) тривалість еструсу; 3) тривалість міжестрального періоду. Цифрові дані обробляли варіаційно-статистичним методом, враховуючи середнє арифметичне з його середньою похибкою, коефіцієнт t Ст'юдента-Фішера, а також р - процент вірогідності різниці між величинами, що порівнювалися.

Вуглеводні детермінанти структур ендометрію та яєчників досліджували з використанням 20 лектинів різної вуглеводної специфічності, у тому числі 15 конвенціональних - Con A, LCA, NPA (специфічні до залишків DMan); PFA, LLA, LABA, LASA, EEA (специфічні до LFuc); SNA, RCA, WGA (специфічні до NeuNAc); UDA, PNA, SBA, HPA (маркери незрілих олігосахаридних детермінант) та 5 нових препаратів лектинів складної олігосахаридної специфічності, очищених з грибів-базидіоміцетів (MPFA, LPFA, LTFA, PAFA, LSFA). Усі використані у роботі лектини були очищені та кон'юговані з пероксидазою хрону д. фарм. н. Антонюком В.О.

Візуалізацію місць зв'язування лектинів досягали з використанням в якості хромогена діамінобензидину тетрагідрохлориду (Sigma, США) у присутності перекису водню як описано раніше (Луцик А.Д. и др., 1989).

Мікроскопію і фотографування проводили з використанням мікроскопа Carl Zeiss Jena Ng, доукомплектованого цифровою камерою Canon IXUS 700.

Результати дослідження та їх обговорення.

Морфо-функціональні маніфестації гіпо- та гіпертироїдизму.

У самок із модельованим гіпотироїдизмом кількість естральних періодів упродовж 3 тижнів спостереження виявилася достовірно меншою, ніж у контрольній групі (відповідно 3,5 ± 0,24 і 4,7 ± 0,24; t = 3,5; р< 0,01). Тривалість еструсу при введенні мерказолілу також зменшувалася порівняно з контролем (5,9 ± 1,5 та 10,7 ± 0,62 доби; t = 2,96; р< 0,01), а тривалість міжестрального періоду відповідно зростала (10,3 ± 0,62 та 15,1 ± 1,5 доби; р< 0,01). Із наведених даних можна зробити висновок, що кількість овуляторних періодів у гіпотироїдних тварин була меншою порівняно з нормою, що свідчить про гальмування статевого циклу та порушення функції репродуктивної системи.

Гальмування циклу було ідентифіковано також у групі щурів, яким згодовування мерказолілу поєднували з тироксином у дозі 1,6 мкг/кг (усі показники циклу відрізнялися від контролю з високою достовірністю). Водночас, показники фазності статевого циклу відновлювалися до контрольних величин у групі самок, які разом з мерказолілом отримували достатні замісні дози тироксину (30 мкг/кг). Таким чином, виявлене гальмування статевого циклу під впливом мерказолілу зумовлене саме його антитироїдною активністю, а не потенційно можливою побічною дією.

У самок із гіпертироїдизмом змін показників статевого циклу порівняно з контрольною групою зареєстровано не було.

За результатами використання загальноморфологічних методів у яєчниках гіпотироїдних тварин було виявлено посилення фолікулогенезу, у той час як при гіпертироїдизмі констатовано надмір утворення та гіпертрофію жовтих тіл. Ці морфологічні ознаки свідчать про розбалансованість морфофункціональних характеристик жіночих гонад під впливом тироїдної патології. Переважна більшість літературних джерел (Abe F., 1997; Doufas A.G. et al., 2000; Тітенко Т.М., 2006) переконують у тому, що цей вплив проектується не безпосередньо на яєчник, а через порушення в системі гіпоталамус-гіпофіз-яєчники.

На тлі гіпотироїдизму нами задокументовано збільшення кількості лейкоцитів у стромі едометрію, що може слугувати непрямим свідченням порушення балансу гормонів яєчника при означеній патології. Адже в нормі найвища кількість саме лейкоцитів притаманна естральній, але не діестральній фазі статевого циклу, який, у свою чергу, залежить від збалансованої дії естрогенів і прогестерону. В ендометрії гіпертироїдних тварин було виявлено гіперемію судин, збільшення кількості децидуальних клітин, колагенізацію строми. Означений феномен найімовірніше є наслідком лютеїнізації яєчників за умов гіпертироїдизму.

Таким чином, результати проведених нами досліджень свідчать про вплив тироїдної патології на морфо-функціональні характеристики жіночих гонад, гормональна активність яких, у свою чергу, впливає на мікроморфологію ендометрію, що узгоджується з даними інших авторів (Hatsuta M. et al., 2004; Hapon M.B. et al., 2007; Костів В.Р., 2010).

Лектинова гістохімія яєчників та ендометрію щура в нормі.

При дослідженні яєчників тварин контрольної групи встановлено, що усі використані лектини, крім лектину LSFA, давали позитивну реакцію різного ступеня вираженості з лютеоцитами, клітинами фолікулів (переважно в складі яйценосного горбка і променистого вінця), прозорою зоною та цитоплазматичною зернистістю овоцитів. У фолікулярній рідині ростучих фолікулів було виявлено рецептори лектинів NPA, PNA, MPFA та LTFA. Вивчення гістотопографії глікокон'югатів у складі ендометрію щурів у нормі показало, що всі використані лектини давали позитивну реакцію зі структурними компонентами ендометрію, а саме: з епітелієм поверхні і залоз (апікальна частина клітин), секретом окремих залоз, цитоплазматичними глікополімерами децидуальних клітин, колагеновими волокнами і лейкоцитами, у складі яких переважали ядерні глікокон'югати.

Описаний вище характер зв'язування лектинів використаного нами набору зі структурними компонентами яєчників і матки, очевидно, обумовлений високим вмістом та різноманіттям, і, відповідно, важливою фізіологічною роллю притаманних цим органам глікополімерів. Отримані нами результати добре корелюють з даними літератури (Aviles M. et al., 1994; Skutelski E. et al., 1994; Kaneko Y. et al., 1995).

Нами виявлена диференційна реактивність цитоплазматичної зернистості овоцитів, а саме, вибіркова реактивність перинуклеарної зернистості з лектинами Сon A, LCA, NPA; кортикальної зернистості - з лектинами LPFA та PAFA; тотальна реактивність зернистості - з лектинами LABA, PFA, LLA, SNA, WGA, SBA та ін. Означений феномен, правдоподібно, відображає послідовність процесингу олігосахаридних ланцюгів глікополімерів у напрямку від перинуклеарних елементів комплексу Гольджі (експресія залишків DMan) до периферійних кортикальних гранул та їх наступного дозрівання (експресія залишків LFuc, DGal, DGlcNAc, DGalNAc та NeuNAc). Ідентифікація цитоплазматичних гранул овоцитів із різними вуглеводними детермінантами доповнює дані (Aviles M. et al., 1996) стосовно існування окремих популяцій кортикальних гранул, що вирізняються своєю реактивністю до лектинів.

Виявлені у нашому дослідженні відмінності зв'язування зі структурними компонентами яєчника манозоспецифічних лектинів LCA та MPFA, рівно ж як і відмінності між афінними до залишків D-галактози лектинами, отриманими з представників чотирьох інших грибів-базидіоміцетів - LPFA, PAFA, LTFA та LSFA, очевидно, обумовлені тонкими відмінностями у будові активних центрів вищеозначених лектинів. При виконанні дисертаційного дослідження було також показано, що лектини з кори та насіння бруслини (ЕЕА) виявляли ідентичну гістохімічну специфічність, у той час як лектини з кори та насіння золотого дощу (LABA та LASA) за своєю афінністю до гістоструктур досить істотно відрізнялися.

Вплив гіпо- та гіпертироїдизму на експресію рецепторів лектинів мікроструктурами яєчників та ендометрію.

Аналіз гістотопографії рецепторів лектинів на тлі гіпо- та гіпертироїдизму в структурах яєчника показав, що гіпертироїдизм супроводжується більш вираженим впливом на вуглеводні детермінанти у порівнянні з гіпотироїдним станом. Разом із тим, останній характеризувався вираженою лейкоцитарною інфільтрацією мозкової речовини яєчника. Наслідком нестачі тироїдного гормону було також деяке зменшення кількості рецепторів лектинів UDA та PAFA і посилення експресії у них SBA-реактивних глікокон'югатів у цитоплазмі фолікулярних клітин.

Гіпертироїдизм супроводжувався збільшенням у складі фолікулів яєчника вмісту рецепторів лектинів UDA, MPFA та LPFA і редукуванням вмісту рецепторів лектинів LTFA та PAFA. Лютеоцити жовтих тіл гіпертироїдних тварин демонстрували підвищення реактивності з переважною більшістю використаних лектинів. Ідентифіковане в групі гіпертироїдних тварин збільшення кількості рецепторів лектину NPA в центрі жовтих тіл, в ділянці рубця, можна пояснити посиленням апоптозу лютеоцитів, що узгоджується з властивістю цього лектину служити маркером апоптозу (Bilyy R. et al., 2005). Зазначимо, однак, що подібне підвищення реактивності центральної частини жовтих тіл при гіпертироїдизмі було задокументовано і з використанням низки інших лектинів, а саме, Сon A, LCA, SBA, WGA. Виявлений феномен потребує додаткового дослідження та гістофізіологічної інтерпретації.

У складі структурних компонентів ендометрію щурів із експериментальним гіпотироїдизмом у порівнянні з контролем було виявлено редукцію вуглеводних детермінант із термінальними залишками DGal та DGalNAc (рецепторів лектинів PNA, SBA, HPA, LPFA, PAFA та LTFA) у поєднанні з нагромадженням глікополімерів із термінальними залишками LFuc (рецепторів лектинів LABA, LLA та PFA). Водночас реакція з лектином LASA, який взаємодіє не лише з залишками LFuc, але й DGal, лишалася у гіпотироїдних тварин на контрольному рівні. Очевидно, редукція детермінант DGal у цьому випадку компенсувалася підвищеною експресією залишків LFuc.

Стосовно манозогліканів були отримані дані щодо зростання реактивності структур ендометрію з лектином NPA при одночасній редукції їх реактивності з лектином MPFA. Це може бути обумовлено різною конфігурацією олігосахаридних ланцюгів, до яких спрямована афінність означених лектинів. Для групи гіпотироїдних тварин характерною була також інтенсивна реакція лейкоцитів із переважною більшістю лектинів навіть за умов одночасного зниження реактивності усіх інших структур (зокрема, з лектинами WGA, HPA, MPFA, PAFA, LTFA).

Отримані нами результати лектиногістохімічних досліджень мікроструктур ендометрію при корекції гіпотироїдизму замісними дозами тироксину добре корелювали із загальноморфологічними даними: масивна лейкоцитарна інфільтрація строми ендометрію поверталася до контрольних показників при застосуванні 30 мкг/кг. Нормалізувалася також експресія лектинових рецепторів як колагеновими волокнами, так і люменальними та залозистими епітеліоцитами. Що стосується тканин яєчника, то у них після корекції також істотно зменшувалась інфільтрація лейкоцитами.

У групі тварин із гіпертироїдизмом реактивність структур ендометрію з переважною більшістю використаних лектинів зростала. Особливо це стосувалося потовщених та інтенсивно реактивних колагенових волокон, пучки яких локалізувалися переважно на периферії ендометрію. Отримані нами дані доповнюють результати Saha S.K. et al. (2005, 2007), які описали порушення біосинтезу та посилену деградацію колагену в яєчниках щурів на тлі гіпотироїдизму. Очевидно, у своєму дослідженні ми отримали протилежний ефект - індуковане гіпертироїдизмом порушення процесів фізіологічної деградації колагену.

Виявлене накопичення сіалогліканів, а також глікополімерів з детермінантами DGal, DGalNAc та DGlcNAc можна пояснити незавершеністю кінцевих етапів глікозування різноманітних за складом глікополімерів жіночих репродуктивних органів, а також можливістю як сповільнення їх секреції, так і пригнічення фізіологічної деградації на тлі тироїдної патології.

Як загальноморфологічні, так і виявлені методами лектинової гістохімії зміни ендометрію при дисбалансі тироїдних гормонів були більш виражені, аніж відповідь на моделювання цих патологічних станів структурами яєчників. Це проявлялося, зокрема, у посиленій колагенізації ендометрію.

Результати апробації нових препаратів лектинів.

У дисертаційній роботі уперше в практиці гістохімічних досліджень органів жіночої репродуктивної системи використано 5 нових препаратів лектинів, отриманих з представників грибів-базидіоміцетів - міцени чистої (MPFA), хряща-молочника пергаментного (LPFA), мохначки (LTFA), свинушки товстої (PAFA) та трутовика сірчано-жовтого (LSFA). Вивчена специфічність зв'язування вищеозначених лектинів зі структурними компонентами яєчників і ендометрію щура як в умовах норми, так і при дисбалансі тироїдних гормонів та показана перспективність їх застосування у гістохімії вуглеводовмісних біополімерів жіночих репродуктивних органів.

При цьому, зокрема, було встановлено, що близькі за вуглеводною специфічністю до залишків DGal лектини LPFA, LTFA, PAFA та LSFA істотно відрізняються своєю афінністю до мікроструктур яєчників та ендометрію. Показано можливості застосування лектину MPFA в якості селективного маркера прозорої зони і плазмолеми овоцитів атретичних фолікулів; лектину PAFA в якості раннього маркера прозорої зони і клітин променистого вінця ростучих фолікулів як у нормі, так і на тлі гіпотироїдизму, а також колагенових волокон ендометрію при гіпертироїдизмі. Задокументоване нами зростання реактивності структур ендометрію з манозоспецифічним лектином NPA при дисбалансі тироїдних гормонів поєднувалося з редукцією рецепторів лектину MPFA, афінність якого спрямована до залишків DMan та DGlcNAc. Правдоподібно, причиною цього феномену є редукція останніх, внаслідок чого маскується підвищення експресії манозильних детермінант.

Нові можливості використання лектинів як селективних гістохімічних маркерів у нормі і патології.

Відмінності селективного маркування мікроструктур можуть бути використані як один із вагомих показників, що відрізняють лектини близької вуглеводної специфічності. Такі відмінності були нами встановлені, зокрема, між окремими представниками використаних у роботі груп манозо-, фукозо-, сіало- та галактозо-специфічних лектинів.

Серед структурних компонентів яєчника селективним маркером прозорої зони та клітин променистого вінця овоцитів ростучих фолікулів, лютеоцитів жовтих тіл виявився лектин SBA, гіалінізованої прозорої зони атретичних фолікулів - лектин WGA. Лектин PAFA демонстрував підвищену спорідненість до клітин променистого вінця ростучих фолікулів; лектини UDA, MPFA та LSFA виявляли виражену афінність до базальної мембрани і залишків прозорої зони в складі атретичних фолікулів.

Переважна більшість використаних нами лектинів проявляла підвищену афінність до окремих фракцій глікокон'югатів у складі люменальної поверхні епітелію ендометрію, апікальних частин епітеліоцитів і секрету маткових залоз. Поряд із цим, лектини WGA, PNA, SBA, НРА та UDA виявилися селективними маркерами лейкоцитів як в умовах норми, так і при тироїдній патології. Отримані дані узгоджуються з описаною в літературі підвищеною експресією різними видами лейкоцитів термінальних залишків DGal та DGlcNAc (Parmley R.T. et al., 1973; Lee M.C. et al., 1987; VanWinkle W.B., 1991). У нормі колагенові волокна ендометрію демонстрували підвищену реактивність з лектинами SNA та SBA, у той час як на тлі гіпертироїдизму ці ж структури, додатково до вищеозначених, виявлялися також лектинами NPA, UDA, LASA, MPFA, LPFA, LTFA та PAFA. Цей феномен можна пояснити як збільшенням кількості колагенових волокон, так і частковою зміною їх вуглеводних детермінант.

Отримані результати продемонстрували нові можливості використання лектинів в якості селективних гістохімічних маркерів структурних компонентів яєчника та ендометрію як в умовах фізіологічної норми, так і при модельованих патологічних станах.



ВИСНОВКИ

У дисертаційній праці наведено теоретичне узагальнення та нове вирішення актуального наукового завдання - з використанням 20 лектинів різної вуглеводної специфічності, у тому числі 5 нових препаратів лектинів, очищених з грибів-базидіоміцетів, досліджено глікокон'югати яєчників та ендометрію щура в нормі, їх перебудову при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі, а також при корекції гіпотироїдизму тироксином. Отримані результати доповнюють існуючі дані стосовно вуглеводних детермінант яєчників та ендометрію щура, розширюють уявлення щодо патомеханізмів порушень діяльності жіночих гонад та ендометрію за умов дисбалансу тироїдних гормонів в організмі, демонструють перспективність застосування нових препаратів лектинів для вивчення вуглеводовмісних біополімерів у нормі та їх перерозподілу при патології.

1. Експериментальний гіпотироїдизм викликав у щурів гальмування статевого циклу. Показники фазності статевого циклу відновлювалися до контрольних величин у групі самок, які отримували разом з мерказолілом адекватні замісні дози тироксину (30 мкг/кг маси).

2. В умовах фізіологічної норми усі використані лектини, крім лектину LSFA, давали позитивну реакцію різного ступеня вираженості з наступними структурними компонентами яєчників: лютеоцитами, фолікулоцитами (переважно в складі кумулюса і променистого вінця), прозорою зоною та цитоплазматичною зернистістю овоцитів.

3. У складі ендометрію ідентифікована реактивність з усіма використаними лектинами люменальної поверхні і залоз (апікальна частина клітин), секрету окремих залоз, цитоплазматичних глікополімерів децидуальних клітин, колагенових волокон і лейкоцитів з переважанням у їх складі ядерних глікокон'югатів.

4. Як гіпо-, так і гіпертироїдизм викликали порушення кількісного співвідношення між основними структурними компонентами яєчника - фолікулами і жовтими тілами, причому за умов експериментального гіпотироїдизму ідентифіковано гальмування фолікулогенезу, тоді як гіпертироїдизм супроводжувався гіпертрофією та збільшенням кількості жовтих тіл (лютеїнізацією яєчника).

5. Дисбаланс тироїдних гормонів викликав у щурів зміни кількісного складу клітинних і стромальних структур ендометрію, а саме: нагромадження лейкоцитів - при гіпотироїдизмі, децидуальних клітин, потовщених пучків колагенових волокон з підвищеною лектиновою реактивністю - при гіпертироїдизмі.

6. Як гіпо-, так і гіпертироїдизм мали суттєвий вплив на глікополімери яєчників та матки, що в умовах експерименту проявлялося у різноспрямованій і суто специфічній для кожної вивченої мікроструктури зміні манозо-, фукозо- та сіалогліканів, а також вуглеводних детермінант DGlcNAc, DGal та DGalNAc, що може свідчити як про розбалансованість (незавершеність) процесів кінцевого глікозилювання глікокон'югатів, так і про посилення або пригнічення їх секреції на тлі дисбалансу тироїдних гормонів.

7. Порівняння двох модельованих патологічних станів показало, що гіпертироїдизм чинить більш виражений вплив на органи жіночої репродуктивної системи. При порівнянні яєчників та ендометрію встановлено, що останній має вищу чутливість до дисбалансу тироїдних гормонів, свідченням чого служили, зокрема, масивна лейкоцитарна інфільтрація та колагенізація строми. Корекція гіпотироїдизму тироксином сприяла певній нормалізації як загальноморфологічних (лейкоцити, колагенові волокна), так і гістохімічних характеристик (манозо-, фукозо- та сіалоглікани), однак нормалізації рецепторів лектинів SBA, НРА та PNA за час проведення експерименту досягнуто не було.

8. Продемонстровано перспективи використання у гістохімії вуглеводів п'яти нових препаратів лектинів, очищених із грибів-базидіоміцетів, досліджено специфіку їх зв'язування зі структурними компонентами яєчників та ендометрію в нормі і при тироїдній патології.

9. Як у нормі, так і при модельованих патологічних станах окремі лектини виявилися селективними гістохімічними маркерами структурних компонентів яєчника та ендометрію: лектин SBA - прозорої зони та променистого вінця овоцитів ростучих фолікулів, лютеоцитів жовтих тіл; лектин WGA - гіалінізованої прозорої зони атретичних фолікулів; лектини WGA, PNA, UDA та НРА - лейкоцитів; лектини SNA та MPFA- колагенових волокон ендометрію.



СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Согомонян Є. А. Особливості гістоструктури та лектинової гістохімії яєчників самок щура при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі / Є. А. Согомонян, О. Д. Луцик // Світ медицини та біології. - 2009. - №2. - С. 116 - 124.

2. Здобувач провела експеримент, здійснила забір матеріалу, виконала дослідження яєчника, мікроскопію та фотографування препаратів.

3. Согомонян Є. А. Аналіз мікроморфології та розподілу рецепторів лектинів у ендометрії щурів за умов експериментального гіпо- та гіпертироїдизму / Є. А. Согомонян, О. Д. Луцик // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2010. - Т.9, №3. - С. 58 - 64.

4. Здобувач провела експеримент і виконала гістохімічні дослідження.

5. Согомонян Є. А. Гістоструктура та характер перерозподілу рецепторів лектинів ендометрія щурів при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі / Є. А. Согомонян, О. Д. Луцик // Вісник морфології. - 2010. - №16 (3). - С. 558 - 564.

6. Здобувач провела експеримент, здійснила забір матеріалу, виконала дослідження ендометрію, мікроскопію та фотографування препаратів.

7. Согомонян Є. А. Аналіз статевих циклів, гістоструктурних та лектиногістохімічних особливостей ендометрія щурів при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі / Є. А. Согомонян, О. Д. Луцик // Науковий вісник Ужгородського університету, Серія медицина. - 2010. - Т.38. - С. 52 - 59.

8. Здобувач провела експеримент і гістохімічні дослідження .

9. Согомонян Є. А. Вплив експериментального гіпо- та гіпертироїдизму на експресію сіалогліканів органами жіночої репродуктивної системи щура / Є. А. Согомонян // Морфологія. - 2010. - Т.ІV, №4. - С. 46 - 56.

10. Согомонян Є. А. Статевий цикл та лектиногістохімічні особливості матки білих щурів за умов експериментального гіпо- та гіпертиреозу / Є. А. Согомонян // Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень: наук.-практ. конф., 29-30 травня 2008 р.: тези доп. - Тернопіль, 2008. - С. 130 - 131.

11. Согомонян Є. А. Морфологічні та лектиногістохімічні особливості яєчників білих щурів в умовах експериментального гіпо- та гіпертиреозу / Є. А. Согомонян // Актуальні проблеми функціональної морфології та інтегративної антропології: наук.-практ. конф., 20-21 травня 2009 р.: тези доп. - Вінниця, 2009. - С. 264 - 266.

12. Согомонян Є. А. Особливості гістоструктури та лектинової гістохімії матки білих щурів при експериментальному гіпо- та гіпертироїдизмі / Є. А. Согомонян // Прикладні аспекти морфології: наук.-практ. конф., 20-21 травня 2010 р.: тези доп. - Івано-Франківськ, 2010. - С. 140 - 142.



АНОТАЦІЯ

Согомонян Є.А. Структурно-функціональні та лектиногістохімічні особливості органів жіночої репродуктивної системи за умов гіпо- та гіпертироїдизму в експерименті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.09 - гістологія, цитологія, ембріологія. ДВНЗ “Івано-Франківський національний медичний університет”, Івано-Франківськ, 2011.

Із використанням 20 лектинів різної вуглеводної специфічності, серед них 5 нових лектинів з грибів-базидіоміцетів, проведено гістохімічне дослідження олігосахаридних детермінант глікополімерів структурних компонентів яєчників та ендометрію щура в нормі, а також під впливом експериментального гіпо- та гіпертироїдизму. Встановлено, що як гіпо-, так і гіпертироїдизм мають суттєвий вплив на глікополімери яєчників та матки. Гіпотироїдизм викликав гальмування статевого циклу, лейкоцитарну інфільтрацію яєчників і ендометрію. Гіпертироїдизм спричиняв лютеїнізацію яєчників і колагенізацію ендометрію. Корекція гіпотироїдизму тироксином сприяла нормалізації загальноморфологічних і гістохімічних характеристик.

Ключові слова: лектинова гістохімія, яєчники та ендометрій щура, гіпо- та гіпертироїдизм.



АННОТАЦИЯ

Согомонян Е.А. Структурно-функциональные и лектино-гистохимические особенности органов женской репродуктивной системы в условиях гипо- и гипертироидизма в эксперименте. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.09 - гистология, цитология, эмбриология. ГВУЗ “Ивано-Франковский национальный медицинский университет”, Ивано-Франковск, 2011.

С использованием 20 лектинов различной углеводной специфичности, в том числе 15 конвенциональных (Con A, LCA, NPA, PFA, LLA, LABA, LASA, EEA, SNA, RCA, WGA, UDA, PNA, SBA, HPA), и 5 новых лектинов, очищенных из грибов-базидиомицетов (MPFA, LPFA, LTFA, PAFA, LSFA), исследовано влияние экспериментального гипо- и гипертиреоза на олигосахаридные детерминанты гликополимеров яичников и эндометрия крысы. Гистологический материал фиксировали в 4% нейтральном формалине, заключали в парафин. Препараты обрабатывали конъюгатами лектинов с пероксидазой, визуализацию рецепторов осуществляли диаминобензидином. Методы лектиновой гистохимии были дополнены общеморфологическим исследованием, а также изучением эстральных циклов.

Установили, что экспериментальный гипотиреоз вызывал у крыс торможение эстральных циклов. Цикличность эструсов возвращалась к контрольным показателям у животных, получавших адекватные (30 мкг/кг) заместительные дозы тироксина. Гипертиреоз на фазность эстральных циклов заметного влияния не оказывал. Изучение препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, выявило усиление фолликулогенеза в условиях гипотиреоза, в то время как гипертиреоз сопровождался лютеинизацией яичников (увеличением количества желтых тел и их гипертрофией). В составе яичников и эндометрия обнаружено накопление лейкоцитов на фоне гипотиреоза, децидуальных клеток и утолщенных пучков коллагеновых волокон в эндометрии при гипертиреозе.

Использование методов лектиновой гистохимии продемонстрировало высокое содержание и разнообразие углеводных детерминант биополимеров как в составе микроструктур яичников, так и эндометрия животных контрольной группы. Все использованные в работе лектины, за исключением LSFA, давали положительную реакцию различной степени выраженности с лютеоцитами, фолликулярными клетками (преимущественно в составе яйценосного бугорка и лучистого венца), прозрачной зоной и цитоплазматической зернистостью овоцитов. В составе эндометрия идентифицирована реактивность люменальной поверхности и желез (апикальная часть клеток), секрета отдельных желез, цитоплазматических гликоконъюгатов децидуальных клеток, коллагеновых волокон и лейкоцитов, с доминированием в составе последних реактивности ядер.

Как гипо-, так и гипертиреоз оказывали существенное влияние на гликополимеры яичников и матки, что в условиях эксперимента проявлялось в разнонаправленном и специфическом для каждой изученной микроструктуры изменении экспрессии углеводных детерминант DMan/ DGlc, LFuc, DGal, DGlcNAc, DGalNAc, NeuNAc. Обнаруженный феномен может свидетельствовать как о незавершенности процессов окончательного гликозилирования гликоконъюгатов, так и об усилении либо угнетении их секреции на фоне дисбаланса тиреоидных гормонов.

Сравнение двух моделированных патологических состояний показало, что гипертиреоз оказывает более выраженное воздействие на органы женской репродуктивной системы, нежели гипотиреоз. При сравнении яичников и эндометрия установлено, что последний имеет более высокую чувствительность к дисбалансу тиреоидных гормонов, о чем, в частности, свидетельствовала массивная лейкоцитарная инфильтрация и коллагенизация стромы. Коррекция гипотиреоза тироксином содействовала определенной нормализации как общеморфологических (количество лейкоцитов, коллагеновые волокна), так и лектиногистохимических характеристик яичников и эндометрия (маннозо-, фукозо- и сиалогликаны), однако нормализации состава рецепторов лектинов SBA, HPA и PNA за время проведения эксперимента достигнуто не было.

Продемонстрированы перспективы использования в гистохимии углеводов 5 новых препаратов лектинов, очищенных из грибов базидиомицетов, исследована специфичность их связывания со структурными компонентами яичников и эндометрия крысы в норме и при тироидной патологии. Как в условиях нормы, так и при моделированных патологических состояниях отдельные лектины оказались селективными гистохимическими маркерами структурных компонентов исследованных органов, в частности, лектин SBA - прозрачной зоны и лучистого венца овоцитов в составе растущих фолликулов, лютеоцитов желтых тел; лектин WGA - гиалинизированной прозрачной зоны атретических фолликулов; лектины WGA, PNA, UDA и HPA - лейкоцитов; лектины SNA и SBA - коллагеновых волокон эндометрия.

Получены новые данные относительно селективного взаимодействия использованных лектинов со структурными компонентами яичников и эндометрия крысы, а также апробированы в работе новые оригинальные препараты лектинов, очищенных из грибов базидиомицетов.

Ключевые слова: лектиновая гистохимия, яичники и эндометрий крысы, гипо- и гипертироидизм.



ANNOTATION

Sogomonian E.A. Structural, functional and lectin histochemical peculiarities of female reproductive system in experimental hypo- and hyperthyroidism. - Manuscript.

Thesis for obtaining degree of Candidate of Medical Sciences. Specialty code - 14.03.09 - histology, cytology, embryology. Ivano-Frankivsk National Medical University, Ivano-Frankivsk, 2011.

20 lectins with different carbohydrate affinities, including 5 new lectins, purified from fungi, were used for the histochemical investigation of oligosaccharidic determinants in rat ovary and endometrium under experimental hypo- and hyperthyroidism. Both hypo- and hyperthyroidism significantly influenced ovarian and endometrial glycoconjugates. It was detected that hypothyroidism induced the estrous cycle inhibition, leucocyte infiltration in ovaria and endometrium. Hyperthyroidism provoked ovaria luteinization and endometrium collagen fibres forming. Treatment of hypothyroidism with thyroxin normalized morphfological and histochemical features of the organs.

Key words: lectin histochemistry, rat ovary and endometrium, hypo- and hyperthyroidism.



ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

TРФ тиротропін-рилізинг фактор.

TТГ тиротропний гормон.

Т3 трийодотиронін.

Т4 тетрайодотиронін (тироксин).

Con A конканавалін А.

DGal D-галактоза.

DGalNAc N-ацетил-D-галактозамін.

DGlс D-глюкоза.

DGlcNAc N-ацетил-D-глюкозамін.

DMan D-маноза.

EEA лектин бруслини європейської.

HPA лектин виноградного слимака.

LABA лектин кори золотого дощу.

LASA лектин насіння золотого дощу.

LCA лектин сочевиці.

LFuc L-фукоза.

LLA лектин ікри судака.

LPFA лектин гриба молочника пергаментного.

LSFA лектин гриба трутовика сірчано-жовтого.

LTFA лектин гриба мохначки.

MPFA лектин гриба міцени чистої.

NeuNAc N-ацетил-нейрамінова (сіалова) кислота.

NPA лектин нарциса.

PAFA лектин гриба свинушки товстої.

PFA лектин ікри окуня.

PNA лектин арахісу.

RCA лектин рицини.

SBA лектин сої.

SNA лектин бузини чорної.

UDA лектин кропиви.

WGA лектин зародків пшениці.

Размещено на Allbest.ru

...