Обгрунтування можливості використання культивованих клітин міжхребцевого диска для лікування хворих з дегенеративними захворюваннями хребта

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа "Інститут патології хребта та суглобів імені професора М.І. Ситенка Академії медичних наук України"

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Обгрунтування можливості використання культивованих клітин міжхребцевого диска для лікування хворих з дегенеративними захворюваннями хребта

Костицька О.М.

14.01.21 - травматологія та ортопедія

Харків - 2011

Вступ

Актуальність дослідження. Лікування дегенеративних захворювань хребта є важливою проблемою як теоретичної, так і практичної ортопедії та травматології (А.И. Продан, В.А. Радченко, Н.А. Корж, 2007; T. Iwashina et al., 2006). Біль у поперековому відділі хребта змушує звертатися до лікаря близько 80 % дорослого населення у країнах Західної Європи, що призводить до значних економічних втрат, зниження продуктивності праці та інвалідизації (M.H. Kong et al., 2008; S.M. Richardson et al., 2006). Причини болю багатофакторні, проте майже у 90 % випадків мають місце ознаки дегенерації міжхребцевого диска - одного з найбільш важливих компонентів хребтового сегмента (T. Liebscher et al., 2010).

Вважається, що здатність до репарації тканин диска, у зв'язку з низькою васкуляризацією, обмежена й навіть нижча за таку суглобового хряща (T. Ganey et al., 2009). Тому невеликі за об'ємом щілини у міжхребцевому диску не загоюються і служать шляхом для міграції драглистого ядра, що обумовлює згодом розвиток значних порушень у структурі фіброзного кільця та формування гриж (S. Pattison et al., 2001; Z. Sun et al., 2008). Існує чимало способів попередження дегенеративних змін у міжхребцевому диску, проте причини розвитку дегенерації та репаративні можливості міжхребцевого диска не розкриті повністю. У зв'язку з цим розробка нових методів лікування, спрямованих на відновлення структури міжхребцевого диска та на оптимізацію його регенерації, залишається актуальною.

У останні 10 років у "регенеративній" медицині активізувались розробки біологічної спрямованості, засновані на досягненнях тканинної та клітинної інженерії, молекулярної біології, генної терапії (A. Hiyama et al., 2008, 2010; M. Pecina et al., 2002). Однак у цьому напрямку поки що переважають експериментальні розробки. Деякі автори свідчать про позитивні результати у разі трансплантації у міжхребцеві диски фіброхондробластів (T. Ganey et al., 2009), хрящових клітин (M. Gorensek et al., 2004), мезенхімальних стовбурових клітин (V.Y. Leung et al., 2006). Є роботи, які стосуються труднощів культивування клітин міжхребцевого диска, внаслідок їх низької проліферативної та біосинтетичної активності (G. Cs-Szabo et al., 2002). Клітини у міжхребцевому диску займають лише 1 % від його загального об'єму, однак їх роль у підтриманні складу міжклітинного матриксу та метаболізму диска важлива (T. Ganey et al., 2003).

Незважаючи на значний обсяг експериментальних робіт, до цього часу не розроблена оптимальна технологія одержання культури клітин міжхребцевого диска, не вивчена спроможність мезенхімальних клітин диференціюватись у хрящові за різних умов культивування та після трансплантації у травмований міжхребцевий диск, не доведена перевага застосування для трансплантації клітин того чи іншого диферону, а також складу та структури матриці, яка б створювала умови, близькі до існування клітин in vivo. Невирішеність даної проблеми на цей час не дозволяє у повній мірі використовувати культивовані клітини у лікуванні дегенеративних захворювань хребта. Тому низка зазначених питань знаходиться у полі зору фахівців і свідчить про важливість та актуальність досліджень у цьому напрямку.

Зв'язок дисертації з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідних робіт Державної установи "Інститут патології хребта та суглобів імені професора М.І. Ситенка Академії медичний наук України" ("Розробити трансплантати з клітин сполучної тканини, культивованих на біодеградуючих матрицях для оптимізації репаративного процесу міжхребцевого диска". Шифр теми ЦФ.2004.1.АМНУ, держреєстрація № 0104U002087. Автором особисто виконана постановка культур клітин міжхребцевого диска щурів різного віку на матрицях та без них, проведена цитологічна оцінка стану клітин, визначена проліферативна активність на етапах культивування; виконано моделювання дефекту міжхребцевого диска, трансплантація клітин у дефект; проведена гістологічна оцінка перебігу репаративного процесу у міжхребцевому диску. Автор самостійно узагальнила результати та сформувала висновки. "Вивчити стан суміжних рухових хребтових сегментів після спондилодезу". Шифр теми ЦФ.2010.1.АМНУ, держреєстрація № 0110U002085. Автор проаналізувала літературу щодо порушень репаративного потенціалу пацієнтів після реконструктивно-відновних операцій на хребті та методів визначення репаративного потенціалу; та провела експериментальні дослідження репарації диска).

Мета роботи: обґрунтувати на основі експериментальних досліджень можливість використання культивованих клітин міжхребцевого диска у лікуванні хворих з дегенеративними захворюваннями хребта.

Завдання дослідження:

Дослідити тенденції розвитку проблеми лікування хворих з дегенеративними захворюваннями хребта при використанні клітинних технологій на основі узагальнення результатів аналізу інформаційно-патентних джерел.

Вивчити у культурі клітин проліферативну та біосинтетичну активність фіброхондроцитів, вилучених із міжхребцевого диска тварин різного віку.

Дослідити регенерацію ушкодженого міжхребцевого диска молодих та старих тварин при використанні різної кількості автологічних та алогенних клітин, культивованих на колагеновій матриці та без них, а також при використанні метода динамічної нейтралізації хребтового сегмента.

Дослідити в культурі високої щільності стан культивованих клітин вилучених з міжхребцевого диска пацієнтів після виконання спондилодезу.

Узагальнити результати експериментальних досліджень щодо використання культивованих авто- та алогенних клітин для репарації міжхребцевого диска. Провести апробацію запропонованих рекомендацій у клінічних умовах.

Об'єкт дослідження - регенерація міжхребцевого диска при використанні культивованих клітин.

Предмет дослідження - міжхребцевий диск із змодельованим травматичним ушкодженням та трансплантацією культивованих клітин, культура клітин міжхребцевого диска тварин та людини, хворі з дегенеративними захворюваннями поперекового відділу хребта.

Методи дослідження: клінічні, магнітно-резонансно томографічний, комп'ютерно томографічний та рентгенографічний методи - для оцінки стану хребта пацієнтів; культивування клітин - для отримання культур клітин міжхребцевого диска; цитологічні та гістологічні методи - для вивчення стану культивованих клітин, аналізу стану культур на матрицях та без них, для дослідження перебігу репаративного процесу в ушкоджених міжхребцевих дисках після трансплантації клітин; електронно-мікроскопічний метод - для вивчення ультраструктури культивованих клітин; статистичний - для оцінки вірогідності цифрових даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Обґрунтована і експериментально доведена можливість використання культивованих автологічних та алогенних клітин міжхребцевого диска для оптимізації репарації. Доведено, що трансплантація автологічних клітин, отриманих з міжхребцевого диска молодих щурів у ділянки його ушкодження супроводжується активізацією репаративних процесів і формуванням хондроїду, який контактує з прилеглим фіброзним кільцем без чіткої межі. Ультраструктура клітин регенерату свідчить про їх хрящовий фенотип і високу біосинтетичну активність. Репаративні процеси у міжхребцевих дисках старих щурів, у разі трансплантації автологічних клітин, не забезпечують повного відновлення структури ушкодженого міжхребцевого диска, що пов'язано як із впливом вікових змін у ньому, так і низькими проліферативними і біосинтетичними можливостями клітин. Вперше доведено, що трансплантація культивованих алогенних клітин міжхребцевого диска молодих тварин у ділянку ушкодження диска старих тварин зупиняє розвиток деструктивних змін і оптимізує його репарацію. Виявлено, що при трансплантації культивованих клітин у ділянку ушкодженого диска велике значення має кількість введених клітин та створення додаткових умов рестабілізації при динамічній нейтралізації сегмента хребта.

Одержані нові знання стосовно особливостей диференціації, проліферації та біосинтезу клітин фіброзного кільця та драглистого ядра міжхребцевого диска при їх сумісному культивуванні у різних типах культур, а також при культивуванні клітин молодих та старих щурів. Встановлено, що високу проліферативну та біосинтетичну активність клітин у культурі, збереження ними фенотипу забезпечує значна щільність клітин при висіванні та мікрооточення у формі макромолекул матриксу, сформованого при культивуванні. Вперше доведено, що клітини міжхребцевих дисків щурів старечого віку характеризуються низьким ступенем проліферації та слабкою біосинтетичною активністю. Формування компонентів міжклітинного матриксу в однакових умовах культивування відмічено тільки у культурах клітин молодих тварин. Встановлено, що колагенове мікрооточення клітин міжхребцевого диска при культивуванні на матрицях створює умови, подібні до існування клітин in vіvo, що забезпечує збереження життєздатності клітин, їх фенотипу та активної проліферації. Ультраструктурна організація клітин свідчить про їх суттєвий метаболічний потенціал: у міжклітинному просторі накопичуються гранули протеогліканів та фібрили колагену II типу при сумісному культивуванні клітин фіброзного кільця та драглистого ядра, а при культивуванні клітин фіброзного кільця міжхребцевого диска - колагену I та II типів. Саме це є перевагою створених клітинних трансплантатів над подібними, представленими у літературі.

Практичне значення одержаних результатів. Застосування культивованих автологічних та алогених клітин міжхребцевого диску покращить стан диску та результати лікування хворих за рахунок оптимізації репаративних процесів. Використання запропонованого метода культивування клітин (патент України № 24201) дало змогу одержувати достатню кількість їх для імплантації на колагенової матриці. Додержання вимог щодо застосування даного метода в клінічній практиці забезпечить максимальний ефект трансплантації клітин в диск у хворих з дегенеративними ушкодженнями хребта.

Результати дослідження впроваджено у навчальний процес і науково-дослідну роботу на кафедрі анатомії людини Луганського державного медичного університету; кафедрі загальної хірургії з курсами травматології, оперативної хірургії та судової медицини ДВНЗ "Ужгородський національний університет"; кафедрі травматології та ортопедії ХМАПО; кафедрі невропатології та нейрохірургії Львівського національного медичного університету ім. Д. Галицького, кафедрі травматології та ортопедії Івано-Франківського національного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Наведені в роботі матеріали наукових досліджень є особистим внеском автора у досліджувану проблему. Автор приймала участь у постановці експериментів щодо культивування клітин за різними методиками за консультативною допомогою к.б.н. Малишкіної С.В. Автором особисто проведено експериментальне моделювання на тваринах щодо відтворення дефекту міжхребцевого диска та трансплантації культивованих клітин, яке було здійснено в експериментально-біологічній клініці ДУ "Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМН України". Автор приймала участь у аналізі гістологічних препаратів при дослідженні перебігу репаративного процесу у міжхребцевих дисках щурів з трансплантованими культивованими клітинами за консультативною допомогою д.б.н. професора Дєдух Н.В. Автор самостійно виконала статистичну обробку цифрових показників, узагальнення отриманих даних та обґрунтування висновків дослідження.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень викладені на Міжнародній конференції "Гистогенез и регенерация тканей" (Санкт-Петербург, 2004); III з'їзді трансплантологів України (Донецьк, 2004), Всеукраїнській школі з міжнародною участю "Біологія опорно-рухового апарату" (Сімферополь, 2004), симпозіумі "4-th Global Congress Minimally Invasive Spinal Surgery and Medicine" (California, 2004); симпозіумі SICOT/SIROT XXIII World Congress (Turkey, 2005), ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції "Актуальні проблеми біомінералогії" (Луганськ, 2006), ІІ з'їзді Українського товариства клітинної біології (Київ, 2007), ІІ Всеукраїнській школі з міжнародною участю "Фізіологія та морфологія тканин опорно-рухової системи в нормі і при ішемічних ушкодженнях" (Київ-Черкаси, 2007), V з'їзді анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Вінниця, 2010), науково-практичній конференції "Генетична і регенеративна медицина: проблеми та перспективи" (Київ, 2010), XIV з'їзді ортопедів-травматологів України (Одеса, 2006); XV з'їзді ортопедів-травматологів України (Дніпропетровськ, 2010).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 9 наукових праць, з них 5 статей у наукових фахових виданнях, 1 деклараційний патент України на корисну модель, 3 роботи в матеріалах з'їзду, конгресу, наукової конференції.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація викладена на 163 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, п'яти розділів власних досліджень, висновків, додатків. Роботу ілюстровано 83 рисунками, цифровий матеріал подано у 7 таблицях. Список використаних джерел містить 154 найменування, у тому числі 21 українсько-російськомовну роботу та 133 джерела зарубіжних авторів.

1. Основний зміст роботи

Матеріал та методи досліджень. Матеріалом роботи служили культивовані клітини міжхребцевих дисків 3-місячних та 12-місячних щурів у моношаровій та високого ступеня щільності культурах; культивовані на колагеновій матриці клітини 3-місячних щурів (35 щурів), а також культивовані клітини міжхребцевих дисків пацієнтів із дегенеративними захворюваннями хребта (4 пацієнти). Досліджувались міжхребцеві диски 3, 9 та 18-місячних щурів після моделювання дефекту та трансплантації різної кількості культивованих клітин на матрицях та без них. Експериментальні дослідження виконані на 230 білих лабораторних щурах популяції експериментально-біологічної клініки ДУ "ІПХС ім. проф. М.І. Ситенка АМН України". Протокол експериментів та відповідність проведених досліджень сучасним вимогам біоетики затверджені Комітетом з біоетики ДУ "ІПХС ім. проф. М.І. Ситенка АМН України" (протокол № 40 від 18.06.2007 р. та № 85 від 7.02.2011 р.) відповідно до правил Європейської конвенції захисту хребетних тварин (Страсбург, 1986) та Закону України "Про захист тварин від жорстокого поводження" (2006, ст. 26).

Проведено 5 серій експериментів: моделювання дефекту (розміром 2Ч2 мм) міжхребцевих дисків поперекового відділу хребта (LIV-LV) 3-місячних та 12-місячних щурів, який нічим не заповнювали - контроль (42 тварини); аналогічні дефекти міжхребцевих дисків, у котрі вносили суспензію культивованих автологічних клітин міжхребцевих дисків хвостового відділу хребта у різних кількостях - 3Ч105 та 3Ч107 - дослід (84 тварини); дефекти міжхребцевих дисків 6 місячних щурів, у котрі вносили культивовані автологічні клітини на колагеновій матриці - дослід (28 тварин); дефекти міжхребцевих дисків 12 місячних щурів, у котрі на 14 добу після операції вносили культивовані алогенні клітини - дослід (28 тварин); дефекти міжхребцевих дисків 6 місячних щурів, у котрі вносили культивовані автологічні клітини та виконували динамічну нейтралізацію для рестабілізації хребта - дослід (28 щурів).

Для порівняння висоти міжхребцевого диска після трансплантації клітин були використані інтактні щури аналогічного віку та маси - 10 щурів (9-місячного віку) та 10 щурів (18-місячного віку).

Клітини міжхребцевого диска культивували як у моношаровій культурі (4Ч105 клітин/мл), так і у культурі високого ступеня щільності (2Ч106 клітин/мл) за методом (Н.В. Дєдух та ін., 2003), а також на колагеновій матриці, котрі розташовували на покривних скельцях у чашках Петрі.

Моделювання дефекту у міжхребцевих дисках (діаметром 2 мм на глибину 2 мм) виконували зубним бором під загальним наркозом в умовах асептики. Руйнували драглисте ядро та внутрішні ділянки фіброзного кільця. У змодельовані дефекти безпосередньо після операції, а в серії з трансплантацією алогенних клітин - на 14 добу після операції вносили суспензію клітин чи клітини на матриці. Дефект закривали абсорбуючим колагеново-фібриновим покриттям для ран та виконували динамічну нейтралізацію хребта.

Для визначення загальної кількості клітин та клітин з фігурами мітозу, їх фіксували розчином Карнуа, фарбували азур-еозином за Романовським.

Для ультраструктурного дослідження суспензію клітин фіксували у розчині з глютаральдегіду з обємною часткою 25 % з додаванням рівного об'єму сироватки крові, а потім у розчині чотирьохокису осмію з обємною часткою 1 %. Після дегідратації матеріал заключали у суміш епоксидних смол. Ультратонкі зрізи контрастували за E.S. Reynolds і досліджували у трансмісійному електронному мікроскопі ЕВМ-100БР (E.S. Reynolds, 1963). Глікозаміноглікани (ГАГ) виявляли після забарвлення ультратонких зрізів альціановим синім 8GS.

Для гістологічних досліджень культивовані клітини, зняті зі скелець, та фрагменти хребта з ушкодженими міжхребцевими дисками, фіксували у 10 % нейтральному формаліні, фрагменти хребта піддавали декальцінації у 4 % розчині азотної кислоти, зневоднювали у спиртах зростаючої міцності і заключали у целоїдин. Гістологічні зрізи товщиною від 7 до 9 мкм забарвлювали гематоксиліном і еозином, за ван Гізон, толуїдиновим синім для характеристики ГАГ (Л. Модиш и соавт., 1985) та пікросіріусом червоним для виявлення типів колагену у міжклітинному просторі культивованих клітин (B.L. Figuiredo et al., 2007). Фрагменти хребта для виготовлення гістологічних зрізів орієнтували у фронтальній площині.

Висоту міжхребцевих дисків у тварин вимірювали на гістологічних препаратах при використанні окуляр-мікрометра МОВ-1-15х (Г.Г. Автандилов, 1990). Дослідження виконували у світловому (Axio Star Plus, "Carl Zeiss") та поляризаційному (Polmy-A) мікроскопах, а фотографували препарати цифровою фотокамерою Canon EOS 30D. Виміри параметри наведено відповідно до міжнародно системи одиниць, отриман цифров показники опрацювали методами варацйно статистики із використанням прикладного пакету STATISTICA 5.11 for Windows. Рівень вірогідності прийнятий 95 %.

Для обстеження пацієнтів та оцінки стану хребта було використано клінічні та рентгенологічні методи (магнітно-резонансна томографія, комп'ютерна томографія, рентгенографія).

Результати досліджень та їх обговорення.

Характеристика культивованих клітин міжхребцевого диска молодих та старих щурів. При сумісному культивуванні клітин міжхребцевого диска (фіброзного кільця та драглистого ядра) виявлялася виражена проліферація клітин, однак моношарова культура не забезпечувала збереження клітинами хрящового фенотипу. На терміни культивування переважали клітини фібробластичного диферону, а у міжклітинному просторі не формувались макромолекули матриксу (ГАГ та колаген). Культивування клітин міжхребцевого диска за методом культури високої щільності дозволило одержати клітини хрящового диферону. Проте клітини міжхребцевого диска старих щурів у культурі характеризувались низьким ступенем проліферації та слабким біосинтезом, на що вказує не тільки їх ультраструктурна організація, але й слабка метахромазія ГАГ. Ультраструктурна організація культивованих клітин від молодих щурів свідчить про їх суттєвий метаболічний потенціал. Метахромазія була яскравою як у клітинах, так і навколо них. Зафіксовано також формування колагенових фібрил.

При культивуванні клітин міжхребцевого диска на колагенових матрицях відмічено поступове заповнення матриць клітинами, переважно хрящового диферону. Відмічено значний приріст клітин (в 35 разів) на кінцевий термін культивування.

Репарація ушкодженого міжхребцевого диска при трансплантації культивованих клітин. У травмованому міжхребцевому диску без подальшого його заміщення розвиваються значні деструктивні зміни. Особливо виражені структурні порушення були у міжхребцевих дисках старих тварин. У молодих щурів висота міжхребцевого диска через 180 діб у I та II зонах була нижчою за показники у інтактних тварин, відповідно, на 13,2 % та 16,7 %, а у старих тварин - на 23,8 % та 19,7 %. Встановлені через шість місяців деструктивні зміни у структурній організації ушкоджених міжхребцевих дисків молодих та старих тварин свідчать про "неспроможність" репаративного процесу.

У змодельовані дефекти міжхребцевих дисків трансплантували автологічні клітини, які культивували впродовж 9 діб. Після культивування виявлено, що переважна більшість клітин у культурах представлена пре- та хондробластами. Лише подекуди розташовувались клітини фібробластичного диферону. Місцями зустрічались клітини з ознаками некрозу, або фрагменти клітин. Більшість хондробластів була середніх розмірів з крупним ядрами овальної форми з ділянками мілко дисперсного та конденсованого хроматину. У цитоплазмі виявлялась велика кількість вільних рибосом та полісом. Комплекс Гольджі визначався поблизу ядра і був порівняно невеликим. Між клітинами (від молодих тварин) відмічені гранули ГАГ, які розташовувались як вільно, так і на численних мікрофібрилах.

Трансплантація у дефекти міжхребцевих дисків культивованих клітин у низькій кількості 3Ч105 була неефективна. Через 180 діб у міжхребцевих дисках як молодих, так і старих щурів із трансплантованими клітинами спостерігались деструктивні зміни, які охоплювали зовнішні і внутрішні відділи фіброзного кільця, апофізи та наросткові хрящові пластинки. Деструктивні зміни переважали у старих тварин.

У разі трансплантації у дефект міжхребцевого диска молодих тварин більшої кількості клітин (3Ч107) через 14 діб ділянка драглистого ядра була практично повністю заповнена молодим хондроїдом, в якому розташовувались хрящові клітини різної зрілості. Хондроїд щільно оточував поодинокі фрагменти драглистого ядра. Клітини хрящового диферону спостерігались між пучками колагенових волокон фіброзного кільця. Відмічено формування міжтериторіального матриксу, де виявлялись численні тонкі мікрофібрили колагену та гранули ГАГ. У поляризованому світлі відмічена метахромазія та рефракція ГАГ, що вказує не тільки на наявність, але й на орієнтаційну упорядкованість макромолекул, характерну для хрящової тканини. Реакція з пікросіріусом червоним свідчить про наявність колагену II типу.

У зоні драглистого ядра старих тварин ділянки сформованої фіброзної тканини чергувались із клітинами хрящового диферону, які оточували фрагменти драглистого ядра. Місцями невеличкі осередки хондроїду проростали у фіброзне кільце. Проте, на відміну від молодих тварин, виявлялись значні території не заповнені клітинним регенератом. У пластинах колагенових волокон фіброзного кільця спостерігались глибокі поздовжні та поперечні тріщини, клітини з пікнотичними ядрами та ділянки без клітин. У апофізах та наросткових пластинках зафіксовані незначні деструктивні зміни.

На 180 добу у молодих тварин ділянка ушкодженого драглистого ядра була виповнена хондроїдом із високою щільністю клітин хрящового диферону. Хрящові проліферати розповсюджувались між пластинами фіброзного кільця, яке зберігало шаруватість за рахунок концентричної орієнтації пучків колагенових волокон. По території хрящового регенерату рефракція була яскравою, що свідчить про упорядковане, характерне для хрящової тканини, розташування ГАГ. Забарвлення колагену пікросіріусом червоним було жовто-зеленим, що вказує на наявність колагену I та IІ типів. Ультраструктурна організація клітин регенерату характеризувалася наявністю цитоплазматичних органел, що відповідають за біосинтетичну активність. Клітини були оточені великою кількістю гранул ГАГ. На межі хондроїду та пластин фіброзного кільця визначались овальні клітини з невеликими округлими ядрами. У перицелюлярній зоні таких клітин спостерігались окремі товсті колагенові фібрили з добре помітною поперековою смугастістю. Такі фібрили були характерні для колагену І типу.

У старих тварин в ділянці трансплантації клітин також розташовувалась хрящова тканина, проте її території були значно меншими порівняно з молодими тваринами. У ділянках зруйнованого драглистого ядра переважала фіброзна тканина. Клітини хондроїду мали характерну для хрящових клітин ультраструктурну організацію. У хрящовому матриксі виявлялись тоненькі мікрофібрили колагену та гранули ГАГ. Характерним для старих тварин була відсутність на значних територіях контакту новоутворених тканин із колагеновими волокнами пластин фіброзного кільця, а також наявність деструктивних змін у ділянках фіброзного кільця - зменшення щільності клітин, тріщини, ділянки гіалінізації. Деструктивні зміни були відмічені і в апофізах та наросткових хрящових пластинках. Висота міжхребцевих дисків молодих щурів у I та II зонах була вищою за контрольні значення на 13,7 % та 19,2 %, відповідно, а у старих щурів це підвищення було меншим і складало, відповідно до I та II зони, 11,6 % та 12,8 %. Тобто, трансплантація у дефект міжхребцевого диска клітин у кількості 3Ч107 оптимізує репаративний процес, що супроводжується формуванням у зоні ушкодження великих територій хондроїду, який заповнює всі деструктивні порожнини в ушкодженій ділянці.

Через 6 місяців після трансплантації клітин на колагеновій матриці у центральних відділах міжхребцевого диска молодих щурів розташовувався хондроїд. Метахромазія та рефракція ГАГ, а також рефракція колагену у матриксі хондроїду були значними. Електронно-мікроскопічний аналіз підтвердив наявність у регенераті клітин хрящового диферону, ультраструктурна організація котрих, свідчить про їх виражену біосинтетичну активність. Хондроїд щільно контактував з внутрішніми відділами фіброзного кільця, яке на таких ділянках характеризувалось концентричним розташуванням пучків колагенових волокон. Щільність фіброхондроцитів, розташованих вздовж колагенових волокон, була висока. Шарувата організація фіброзного кільця у зовнішніх відділах практично не була порушена. У апофізах та наросткових пластинках відмічені незначні деструктивні зміни.

У зоні зруйнованого драглистого ядра старих щурів виявлялись ділянки хондроїду у вигляді вузликових проліфератів, які розташовувались поблизу деструктивних щілин, проте повністю не заповнювали їх. Спостерігались деструктивні щілини і по території сформованої хрящової тканини. Внутрішні ділянки фіброзного кільця мали гомогенний матрикс з тріщинами різної величини та конфігурації. Клітини по крайовій поверхні тріщин не визначались. Шарувата організація фіброзного кільця відмічена лише у зовнішніх відділах. Виявлялась значна кількість клітин з пікнотичними ядрами. У апофізах та наростковій хрящовій пластинці деструктивні зміни були більш вираженими, ніж у молодих щурів. Висота міжхребцевих дисків у молодих тварин у I та II зонах була на 15,8 та 17 % вищою за показники у контролі. У старих тварин різниця у висоті дисків у вказаних зонах становила 11,8 % та 10,3 %.

Після трансплантації культивованих алогенних клітин, отриманих від молодих щурів, на 14 добу у дефектах міжхребцевих дисків старих щурів спостерігались крупні осередки хондроїду, а у подальшому і повне щільне заповнення ділянок деструкції клітинами хрящового диферону. У міжклітинному просторі виявлялись упорядковано орієнтовані ГАГ та колаген II типу. Структура фіброзного кільця та тіл хребців на 180 добу дослідження, практично відповідала нормі. Висота міжхребцевого диска була вірогідно (Р<0,05) вищою за показники висоти диска у контролі. Так, середні значення (складені із трьох показників по крайнім та середній частині диска) у досліді складають 1347,5±47,8 мкм, а в контролі - 1198,5±39,6 мкм.

При додатковому застосуванні рестабілізації хребтового сегмента з динамічною нейтралізацією та трансплантацією культивованих автологічних клітин на 90 добу у дослідних тварин зона зруйнованого драглистого ядра була повністю заповнена хондроїдом. Хрящові проліферати спостерігалися і між пластинами фіброзного кільця, заповнюючи деструктивні щілини та тріщини. Щільність клітин була високою як у хрящовому регенераті, так і у пластинах фіброзного кільця. Місцями хрящові клітини формували ізогенні групи від 2 до 5 хондроцитів. Лише подекуди у фіброзному кільці виявлялись невеличкі тріщини, базофільно забарвлені ділянки без клітин та пікнотичні клітини. Серед клітин хондроїду розташовувались кровоносні судини, навколо яких формувалась кісткова тканина. Кісткові трабекули апофізів та наросткові хрящові пластинки мали незначні зміни, характерні для після травматичної перебудови. Висота диска щурів у цій серії була вищою за контрольні на 8,9 %, 20,7 % та 21,1 %, відповідно, для I, II та III зон. Таким чином, застосування додаткових умов стабілізації хребтового сегмента при ушкодженні міжхребцевого диска позитивно впливає на репаративний процес.

Культура клітин міжхребцевого диска людини. Фрагменти міжхребцевих дисків, видалені у пацієнтів при виконанні спондиодезу, були представлені ділянками драглистого ядра та фіброзного кільця. У полі зору мікроскопа на зрізі виявлялось від 20 до 80 клітин (зб. Ч400), проте були відмічені і території без клітин. Ультраструктурна організація клітин була різною. Цитоплазма деяких клітин містила слаборозвинуту ендоплазматичну сітку, лізосоми і продукти деградації. Проте переважна більшість клітин мала ультраструктуру, характерну для клітин у нормі. Такі клітини мали крупні ядра з еухроматином, а у цитоплазмі - добре розвинуту ендоплазматичну сітку з великою кількістю рибосом та вільних полісом. У ділянках фрагментів з перевагою фіброзного кільця виявлялись фіброхондроцити. Наявними були тріщини та розволокнення колагенових волокон. У полі зору спостерігалось від 13 до 35 клітин. При електронно-мікроскопічному дослідженні встановлено, що клітини мали видовжену форму, невеликі гіперхромні круглясті, інколи овальні, ядра та цитоплазму з помірним вмістом мембранних органел. Тобто, при наявних деструктивних змінах у фрагментах міжхребцевих дисків клітинний склад фрагментів відповідає складу клітин у нормі, а ультраструктурна організація, переважної більшості клітин, свідчить про наявність клітинних органел, котрі можуть забезпечити характерний для даних клітин біосинтез.

При культивуванні клітин міжхребцевих дисків людини через 5 діб на скельці виявлявся пласт клітин, який займав майже половину території скельця. Відмічені також щільні скупчення клітин. Клітини поза скупченнями мали овальну та видовжену форму з чітко визначеним ядром середніх розмірів, овальної та округлої форми. Вони контактували між собою невеликими відростками цитоплазми. За фенотипом такі клітини були віднесені до фіброхондробластів. Клітини у скупченні були, переважно, округлої форми з вузькою облямівкою цитоплазми, гіпохромними округлими ядрами, розташованими у центрі. Місцями виявлялось нашарування клітин у два-три шари. Такі клітини за фенотипом були віднесені до клітин хрящового диферону. Відмічались клітини з фігурами мітозу. Мітотичний індекс становив - 14 ‰. Кількість клітин, знятих з одного скельця дорівнювала 7,12Ч105±0,47Ч105, кількість деструктивних клітин дорівнювала 0,48Ч105±0,02Ч105 (6,8 %).

На 9-у добу клітинний пласт займав всю територію скельця, а клітинні скупчення збільшились у розмірі майже втричі. Щільність клітин у скупченнях була значною. При електронно-мікороскопічному та електронно-гістохімічному дослідженнях клітинних скупчень було встановлено, що клітини мали округлу та овальну форму з незначним об'ємом цитоплазми, у якій розташовувались канальці ендоплазматичної сітки з численними рибосомами на їх поверхні. У ядерній мембрані значної частини клітин виявлялись численні пори, а у цитоплазмі - поодинокі мітохондрії та невеликі крапельки глікогену, що свідчить про хрящовий фенотип клітин. У цитоплазмі клітин та у позаклітинному оточенні спостерігались гранули ГАГ. Мітотичний індекс зменшився при порівнянні з 5 добою і становив 11 ‰. Загальна кількість клітин, знятих з одного скельця дорівнювала 8,45Ч106±0,67Ч106, тобто з одного скельця одержано у 80 разів більшу кількість клітин. Таким чином, культивовані клітини, вилучені із фрагментів міжхребцевих дисків пацієнтів, оперованих з приводу дегенеративних захворювань хребта, активно ділились і зберігали високу біосинтетичну активність. Це свідчить про можливість їх активного росту і проліферації в умовах трансплантації в ушкоджені ділянки міжхребцевого диска для оптимізації процесу регенерації.

Культивовані клітини чотирьох пацієнтів були підготовлені для трансплантації. До клітин було додано живильне середовище із інактивованою сироваткою конкретного пацієнта та антибіотиками (кількість суспензії становила 1,0 мл, із визначеною кількістю клітин (від 4,2Ч107 до 5Ч107 клітин у інокуляті). Проба підготовленого інокуляту була передана у клініку для трансплантації пацієнтам, котрі дали на це письмову згоду. Була також одержана згода Комітету з питань біоетики (протокол № 40 від 18.06.2007 ). У зв'язку з тим, що в результаті експериментальних досліджень було з'ясовано факт переваги трансплантації культивованих клітин з динамічною нейтралізацією сегмента хребта було вирішено застосувати трансплантацію клітин у поєднанні з динамічним імплантатом "Coflex" (Німеччина), який дозволяє з одного боку стабілізувати сегмент хребта, а з іншого - зберегти рухомість у фізіологічних параметрах. Одним із критеріїв відбору пацієнтів для виконання хірургічних втручань із трансплантацією клітин є вік, який згідно експериментальним дослідженням безпосередньо впливає на перебіг дегенеративного процесу та можливості репарації міжхребцевого диска.

Для оцінки стану хребта використовували клінічні методи, МРТ, КT, рентгенографію хребта з застосуванням функціональної рентгенометрії за методом О.І. Продана (А.И. Продан, 2007). Всі прооперовані пацієнти почували себе добре. Через тиждень після трансплантації клітин пацієнти були виписані для амбулаторного лікування.

Запропоновано основні принципи використання нової методики оптимізації репарації міжхребцевого диска при дегенеративних захворюваннях хребта та травматичних ушкодженнях:

Застосування культивованих клітин міжхребцевого диска для оптимізації його репарації показано при хірургічному лікуванні молодих пацієнтів з дегенеративними захворюваннями хребта та травматичними ушкодженнями міжхребцевого диска.

Для оптимізації репарації міжхребцевого диска застосовуються як автологічні, так і алогенні клітини міжхребцевого диска (тканини міжхребцевого диска, вилучені під час хірургічних втручань у пацієнтів з дегенеративними захворюваннями хребта та травматичними ушкодженнями міжхребцевого диска).

Вилучення клітини із міжхребцевих дисків виконується в стерильних умовах за спеціальною методикою. Клітини культивуються у культурі високої щільності без матриць або на об'ємних матрицях (альгінат, колаген) (Н.В. Дєдух і ін., 2003). Переважними для культивування та трансплантації з метою оптимізації репарації міжхребцевого диска є клітини молодих донорів.

Мінімальна кількість трансплантованих клітин для дефекту розміром 15 мм3 становить 3Ч107.. При наявності значного за розміром дефекту міжхребцевого диска доцільним є пропорціональне збільшення кількості трансплантованих клітин та застосування культивованих клітин на матрицях.

При необхідності трансплантації клітин старим реципієнтам рекомендується збільшувати кількість трансплантованих клітин, або використовувати алогенні клітини молодих донорів.

Переважним для оптимізації репарації міжхребцевого диска з застосуванням трансплантації культивованих клітин є використання спеціального колагеново-фібринового покриття та стабілізації хребтового сегмента динамічним імплантатом.

Протипоказань до застосування культивованих клітин з метою оптимізації репарації міжхребцевого диска в разі дегенеративних захворювань та травматичних ушкодженнях диску не виявлено.

Висновки

Досліджена можливість культивування клітин міжхребцевого диска щурів та людини із забезпеченням їх життєздатності, проліферації та біосинтезу специфічних макромолекул матриксу хрящової тканини, а також вивчено вплив на процес репарації ушкодженого міжхребцевого диска кількості трансплантованих клітин, застосованої матриці, а також авто- і алогенних клітин, отриманих від донорів різного віку.

Культивування клітин міжхребцевого диска щурів за методом моношарової культури не забезпечує збереження клітинами хрящового фенотипу. Метод культури високої щільності дозволяє одержати клітини хрящового диферону, а також формування матриксу з макромолекулами глікозаміногліканів та колагену. Переважними для культивування є клітини, які вилучені з дисків молодих тварин.

При культивуванні клітин міжхребцевого диска щурів на колагенових матрицях, за методом культури високої щільності, відмічена висока адгезивність фіброхондроцитів та приріст клітин за термінами культивування. При цьому клітини зберігають життєздатність та фенотип. Ультраструктурна організація клітин свідчить про їх високий метаболічний потенціал, а в матриксі виявляються макромолекули глікозаміногліканів та колагенові фібрили.

Структурна організації фрагментів міжхребцевих дисків, видалених при виконанні пацієнтам спондилодезу, свідчить про позитивну можливість їх використання для одержання культивованих клітин у якості трансплантатів для оптимізації репарації дисків. Клітини, які вилучені із фрагментів міжхребцевих дисків (видалених гриж), за фенотипом відповідають фіброхондроцитам, а їх ультраструктурна організація, свідчить про життєздатність та наявність у цитоплазмі мембранних органел, котрі забезпечують характерний для даних клітин біосинтез.

Репаративні прояви у ділянці ушкодженого диска залежать від кількості трансплантованих клітин. У разі дефекту міжхребцевого диска у щурів розміром 15 мм3 мінімальною кількістю клітин є 3Ч107. Застосування колагеново-фібрінового покриття дефекту забезпечує збереження закритого простору для трансплантованих клітин, що є суттєвим при використанні клітин у якості біологічного трансплантата. Додаткове застосування спеціальних умов рестабілізації при динамічній нейтралізації оптимізує умови репаративної регенерації і дозволяє припинити розвиток деструктивних порушень та зберегти висоту міжхребцевого диска.

Алогенні клітини, отримані з міжхребцевих дисків, можуть бути використані для підвищення репаративних потенцій ушкодженого міжхребцевого диску. На ділянках травмованого диска, із трансплантованими в них алогенними клітинами, відмічається формування кістково-хрящового зрощення. Запальних проявів у міжхребцевому диску не відмічено.

Обґрунтована можливість використання автологічних та алогенних культивованих клітин у оптимізації репарації міжхребцевого диска, проведено апробацію та надано основні принципи методики для клінічного застосування.

дегенеративний міжхребцевий фіброхондроцит біосинтетичний

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Малишкіна С.В. клітини міжхребцевого диску, культивовані на колагеновій матриці / С.В. Малишкіна, Л.М. Бенгус, О.М. Костицька, В.В. Вельямінова // Український морфологічний альманах. - 2007. - Т. 5, № 1. - С. 59-63.

2. Радченко В.А. Клеточная инженерия в регенерации хрящевых тканей / В.А. Радченко, С.В. Малышкина, Н.В. Дедух, О.М. Костицкая // Ортопедия, травматология и протезирование. - 2007. - № 2. - С. 115-124.

3. Костицька О.М. Вплив методів вилучення клітин із міжхребцевого диску на їх кількість, стан та проліферативну активність у культурі / С.В. Малишкіна, О.М. Костицька, В.В. Вельямінова, І.В. Бадрадінова, Д.М. Пошелок // Медицина и… - 2007. - № 2 (17). - C. 35-40.

4. Костицька О.М. Морфологія міжхребцевого диска щурів після трансплантації культивованих аутологічних клітин фіброзного кільця / О.М. Костицька, Н.В. Дєдух, С.В. Малишкіна // Вісник ортопедії, травматології та протезування. - 2008. - № 2. - С. 35-39.

5. Костицька О.М. Регенерація ушкодженого між хребцевого диску при трансплантації аутологічних клітин / О.М. Костицька, С.В. Малишкіна, Д.М. Пошелок // Український морфологічний альманах. - 2010. - № 2. - С. 100-104.

6. Патент на корисну модель № 24201 Україна, МПК А61F 2/30, A61F2/44. Трансплантат міжхребцевого диска / Радченко В.О., Малишкіна С.В., Дєдух Н.В., Костицька О.М.; заявник та патентовласник ДУ "Інститут патології хребта та суглобів ім. проф. М.І. Ситенка АМН України". - № u2007 00401; заявл. 15.01.2007; опубл. 25.06.2007; Бюл. № 9.

7. Малишкіна С.В. Вплив кількості трансплантованих аутологічних клітин на перебіг процесу регенерації ушкодженого між хребцевого диску / С.В. Малишкіна, О.М. Костицька, О.А. Нікольченко, І.В. Бадрадінова: збірник тезисів ІІ з'їзду Українського товариства клітинної біології (Київ, 23-26 жовтня 2007) / Українське товариство клітинної біології, Інститут біології клітини НАН України, Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.Є. Кавєцького НАН України, Київський національний університет ім. Т.І. Шевченка. - Київ, 2007. - С. 19.

8. Малишкіна С.В. Морфологія міжхребцевого диску щурів після трансплантації культивованих аутологічних клітин фіброзного кільця / С.В. Малишкіна, О.М. Костицька: матеріали наукового конгресу "ІV Міжнародні Пироговські читання", присвяченого 200-річчю з дня народження М.І. Пирогова, V з'їзд анатомів, гістологів, ембріологів і топографоанатомів України (Вінниця, 2-5 червня 2010 р.) / МОЗ України, Міністерство освіти і науки України, Академія медичних наук України, Академія педагогічних наук України, Вінницька обласна державна адміністрація. - Вінниця, 2010. - С. 73-74.

9. Малышкина С.В. Регенераторные потенции культивированных клеток межпозвонкового диска крыс разного возраста / С.В. Малышкина, О.М. Костицкая, И.В. Вишнякова, О.А. Никольченко: матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю "Генетична і регенераторна медицина: проблеми та перспективи" (Київ, 14-15 жовтня 2010 р.) / Національна академія медичних наук України, Міністерство охорони здоров'я України, ДУ "Інститут генетичної та регенеративної медицини НАМН України". - Київ, 2010. - С. 117-118.

Размещено на Allbest.ru