Алергічні реакції в організмі собак при згодовуванні білкових кормів (клініко-експериментальні дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ БІОРЕСУРСІВ І ПРИРОДОКОРИСТУВАННЯ УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

16.00.02 - патологія, онкологія і морфологія тварин

Алергічні реакції в організмі собак при згодовуванні білкових кормів (клініко-експериментальні дослідження)

Журавель Олена Миколаївна

Київ 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті біоресурсів і природокористування України Кабінету Міністрів України

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор Сорока Наталія Михайлівна, Національний університет біоресурсів і природокористування України, директор Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Борисевич Борис Володимирович, Національний університет біоресурсів і природокористування України, завідувач кафедри патологічної анатомії

кандидат ветеринарних наук, доцент Тарасевич Вадим Леонідович, Білоцерківський національний аграрний університет, доцент кафедри нормальної і патологічної фізіології тварин

Захист відбудеться 16 грудня 2009 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному університеті біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 15, навчальний корпус № 3, ауд. 65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету біоресурсів і природокористування України за адресою: 03041, м. Київ-41, вул. Героїв Оборони, 13, навчальний корпус № 4, к. 28

Автореферат розісланий “11” листопада 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради С.В. Міськевич

1. Загальна характеристика роботи

спонтанний алергія білок собака

Актуальність теми. Нині значної актуальності у ветеринарній медицині набуває питання своєчасної діагностики та ефективності лікування тварин, хворих на алергію. Як відомо, кількість тварин, схильних до алергічних захворювань, постійно зростає (Поляков І.Д., Іванова Л.Г., 2004). Це пов'язано з неправильною їх діагностикою та лікуванням, підвищенням алергенного навантаження на організм, негативним впливом чинників довкілля на характер імунної відповіді (Горовенко Н.Г., 2003). Серед останніх найбільше значення мають промислові, транспортні та інші викиди, до складу яких входять сполуки, що мають імунотоксичні, імуносупресорні та імуносенсибілізуючі властивості. Це сприяє розвитку в організмі тварин алергічної патології (Kjelmann N., Croner S., 1984; Kjelmann N., 1989). І хоча досягнуті певні успіхи у вивченні алергій, збільшується число ускладнень розвитку цієї групи захворювань (Бєлозеров Є.С., 1991).

Вивченню алергічних станів тварин і людини в Україні і за її межами присвячені роботи Ж.Ж. Раппорта і А.М. Ногаллєра (1990), L.M. Reedy (1997), К.С. Медведєва (2000), Б.М. Пухлика (2002), Г.М. Дранніка (2003) та ін.

У свою чергу вивчення особливостей змін клінічних, морфологічних, біохімічних та імунологічних показників в організмі собак за розвитку алергії, спричиненої згодовуванням білкових кормів та факторів, що є сприятливим фоном для її розвитку, є актуальним для науки та практики лікаря ветеринарної медицини.

Отримані результати дозволять розробити науково обґрунтовані підходи щодо діагностики та лікування собак за виникнення алергії, спричиненої згодовуванням білкових кормів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертаційної роботи є фрагментом науково-дослідної роботи кафедри паразитології та тропічної ветеринарії Національного університету біоресурсів і природокористування України з ініціативної теми “Розробка методів діагностики та профілактики алергії у м'ясоїдних тварин” (номер державної реєстрації - 0108U011144).

Мета і завдання дослідження. Мета дисертаційної роботи полягала у вивченні клініко-гематологічних та імунологічних аспектів патогенезу алергії собак за спонтанного та експериментального білкового навантаження.

Для досягнення мети поставлені такі завдання дослідження:

? встановити клінічний прояв спонтанної та експериментальної алергії у собак;

? визначити білкові корми з найбільшим вмістом алергенів для собак;

? з'ясувати породні, вікові та статеві особливості прояву алергії у собак, спричиненої білковими кормами;

? дослідити зміни клінічних, морфологічних, імунологічних і біохімічних показників крові собак за алергії, спричиненої надмірним згодовуванням білкових кормів;

? вивчити особливості клінічного прояву та імунологічних показників крові цуценят при окремому разовому підшкірному введенні білка курячого яйця та сироватки крові коня;

? з'ясувати особливості змін клінічних, морфологічних, імунологічних і біохімічних показників крові цуценят після повторного внутрішньовенного введення білка курячого яйця та сироватки крові коня;

? на основі результатів клініко-гематологічних та імунологічних досліджень обґрунтувати загальні закономірності перебігу алергії у собак, спричиненої білковим навантаженням на організм.

Об'єкт дослідження: патогенез алергії у собак за білкового навантаження.

Предмет дослідження: клінічні, морфологічні, імунологічні і біохімічні показники крові у собак різного віку за спонтанного та експериментального білкового навантаження.

Методи дослідження: клінічні (вимірювання температури тіла, частатоти серцевих скорочень і підрахунок кількості дихальних рухів), морфологічні (виведення лейкограми крові та визначення швидкості осідання еритроцитів), біохімічні (вміст загального білка, глюкози, загального та прямого білірубіну, активність б-амілази, аспасртат- та аланінамінотрансфераз), імунологічні (рівень імуноглобулінів А, М, G, загального імуноглобуліну Е, алергенспецифічні-Ig Е-антитіла, вміст ЦІК, ФА, ІФ, Т- і В-лімфоцити), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в Україні досліджено закономірності розвитку алергії в організмі собак, спричиненої згодовуванням білкових кормів, шляхом моніторингу змін клінічних, морфологічних, біохімічних та імунологічних показників крові. При цьому встановлено, що курячі яйця та молочні продукти - це найбільш вживані корми, які викликають алергію у собак.

Досліджено, що алергія у собак на білкові корми характеризується підвищенням у сироватці крові вмісту Ig E та циркулюючих імунних комплексів.

Встановлено, що при експериментальному внутрішньовенному введенні цуценятам білка курячого яйця та сироватки крові коня відмічаються зміни клінічних, морфологічних та біохімічних показників крові, подібні до таких, що виникають при згодовуванні дорослим собакам білкових кормів. Але, окрім змін імунологічних показників.

Показано, що при повторному внутрішньовенному введенні білка курячого яйця та сироватки крові коня у цуценят виникає анафілактичний шок. Слід зазначити, що при повторному введенні білка курячого яйця цуценятам спостерігається більш ускладнений перебіг анафілактичного шоку.

Уперше в Україні проведено комплексне вивчення особливостей змін клінічних, морфологічних, біохімічних та імунологічних показників крові у собак під впливом білка курячого яйця, які є аналогічні змінам в організмі собак за спонтанної алергії, спричиненої білковими кормами.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлена однотипність змін клінічних, морфологічних, біохімічних та імунологічних показників крові у собак за спонтанної та експериментальної алергії при білковому навантаженні на організм. Результати досліджень можуть бути використані у розробці науково обґрунтованої системи діагностики, профілактики та лікування собак, хворих на алергію, при згодовуванні білкових кормів.

Розроблено науково-практичні рекомендації для фахівців ветеринарної медицини: “Рекомендації з діагностики та лікування кормової алергії собак”, які затверджено науково-методичною радою Державного департаменту ветеринарної медицини України (протокол № 3 від 20 грудня 2006 року).

Особистий внесок здобувача. Здобувач самостійно провела аналіз першоджерел наукової літератури, освоїла методи та виконала весь запланований обсяг клініко-експериментальних досліджень, статистичну обробку, а також узагальнила одержані результати, сформулювала висновки та пропозиції виробництву.

Ряд експериментів провела спільно з іншими дослідниками, які є співавторами окремих публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень доповідались та обговорювались на наукових конференціях професорсько-викладацького складу, наукових співробітників та аспірантів Навчально-наукового інституту ветеринарної медицини та якості і безпеки продукції тваринництва Національного аграрного університету (нині - Національний університет біоресурсів і природокористування України (м. Київ, 2005, 2006, 2008); Міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка Р.С. Чеботарьова (м. Київ, 2006); Міжнародній науково-практичній конференції “Наукові та практичні аспекти ветеринарної медицини в Україні” (м. Біла Церква, 2006).

Публікації. Основний зміст дисертації викладено у дев'яти наукових працях: шести статтях (три - однооосібні) у фахових наукових виданнях, що входять до переліку ВАК України, двох тезах за матеріалами доповідей на наукових конференціях і одних рекомендаціях.

Обсяг та структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 164 сторінках комп'ютерного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, вибору напрямів досліджень, матеріалів та методів виконання роботи, результатів досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, пропозицій виробництву, додатку і списку використаних джерел, що включає 331 найменування, з яких 75 - іноземних. Робота ілюстрована 40 таблицями та 20 рисунками.

2. Основний зміст роботи

Вибір напрямів дослідження, матеріали та методи виконання роботи. Дисертаційна робота виконана впродовж 2004-2007 рр. на базі наукової лабораторії кафедри паразитології та тропічної ветеринарії і віварію факультету ветеринарної медицини Національного університету біоресурсів і природокористування України. Окремі дослідження виконані у діагностичному відділі Київської міської державної лабораторії ветеринарної медицини, а також у біохімічному відділі загальної токсикології і медико-біологічних досліджень Науково-дослідного інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя, на базі клініки ветеринарної медицини Печерського району м. Києва (вул. Кіквідзе, 34-б) та Міської клініки дрібних тварин м. Києва (вул. Волинська, 12). Імунологічні дослідження проводили в лабораторії відділу імунології Інституту кардіології ім. М.Д. Стражеска АМН України (Національний науковий центр) та лабораторії відділу нейроімунології Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. Ромоданова АМН України.

У першій серії досліджень вивчалися породні, вікові та статеві особливості прояву алергії на білкові корми в собак віком від 5 міс. до 12 років різних порід (спанієлі, стаффордширські бультер'єри, далматини, німецькі вівчарки, шар-пеї, пуделі, французьські бульдоги, бассети), у тому числі безпородні тварини. Всього у дослід було залучено 97 собак, обох статей, у яких була виявлена алергія на білкові корми.

У другій серії досліджень залучалися дорослі собаки віком від 2 до 5-ти років породи спанієль, масою тіла 7-8 кг, що знаходились на лікуванні у клініці ветеринарної медицини Печерського району м. Києва та Міської клініки дрібних тварин м. Києва.

У третій серії досліджень проводили експериментальне відтворення алергії при різних способах уведення (підшкірне, внутрішньовенне) білкового алергену (білка курячого яйця та сироватки крові коня) цуценятам.

На базі клінік ветеринарної медицини м. Києва обстежено 120 собак з проявами алергії. Була проведена вибірка 10-ти дорослих собак одного віку, породи, розмірів, хворих на алергію, спричинену згодовуванням білкових кормів, та 10-ти клінічно здорових тварин-аналогів, які ввійшли до контрольної групи. У 15-ти цуценят досліджували зміни клінічних, морфологічних, біохімічних і імунологічних показників при експериментальному введенні алергенів білкового походження та фізіологічного розчину. Всього досліджено 175 проб крові від дорослих собак і цуценят.

Дослідження проводили на собаках із характерними клінічними проявами алергії, а саме: ураження шкіри - свербіж, випадіння шерсті на різних ділянках тіла з утворенням алопецій, дерматити, екземи; отит із одночасним ураженням шкірного покриву, а також розлади травного каналу у вигляді запору або проносу. Зазначені клінічні ознаки спостерігались у собак як окремо, так і в комплексі.

Встановлення етіології алергічних захворювань у собак грунтувалось на проведенні ретельного збору даних анамнезу: виключали спадкове походження алергії у піддослідних тварин, проведення їм медикаментозного лікування, з'ясовували причини алергічних проявів, повторності у тварини раніше алергії (якщо так, то чи не прослідковувалася сезонність виникнення хвороби), якість кормів, чи дегельмінтизовані тварини, враховували періодичність проявів і пору року.

Для виключення алергії на укуси бліх проводили візуальне обстеження собак на наявність комах та ушкоджень на їх тілі. Для виключення ендопаразитів тваринам застосовували антигельмінтний препарат “Дронтал плюс (для собак)” з розрахунку 0,66 г (1 табл.) на 10 кг маси тіла, у випадку, коли власники тварин не проводили профілактичну дегельмінтизацію (щоквартально).

З метою диференціальної діагностики проведено мікроскопічне дослідження зскрібків шкіри для виключення збудника демодекозу, наявності дерматофітів та стрептококової інфекції, а також досліджували венозну кров на наявність мікродирофілярій для виключення збудника дирофіляріозу.

Одним з найголовніших етапів диференціальної діагностики було призначення гіпоалергенної дієти: як джерело протеїну використовували м'ясо кроля, а вуглеводів - рис варений. При поліпшенні загального стану тварин до раціону (з тижневим інтервалом) вводили корми, що згодовували раніше, як це рекомендовано в літературі (Медведєв К.С., 1999; Сорока Н.М., Журавель О.М., 2007). Відмічали ті з них, при згодовуванні яких виникали патологічні зміни шкіри. Дієту застосовували впродовж 5-6 тижнів.

Для морфологічних, біохімічних та імунологічних досліджень відбирали кров у собак з підшкірної вени передпліччя до прийому корму. Як антикоагулянт застосовували розчин гепарину з активністю 1000 ОД/мл.

Для проведення експерименту було сформовано дві дослідні групи з безпородних цуценят 4-місячного віку, по п'ять тварин у кожній групі. До контрольної групи входило п'ять безпородних цуценят аналогічного віку. Тварин утримували в умовах віварію Національного університету біоресурсів і природокористування України. Експериментальне дослідження алергії у собак проводили з дотриманням вимог щодо утримання лабораторних тварин (Закон України: “Про захист тварин від жорстокого поводження”, 2006; Яблонський В.А., 2007), встановлених Конвенцією Ради Європи. Даний вид лабораторних тварин, як модель для проведення експерименту, був обраний нами для більш повного відображення морфофункціональних змін в організмі собак, які виникають при перебігу алергії. Цуценят витримували на карантині впродовж двох тижнів, проводили дегельмінтизацію препаратом “Дронтал юніор” згідно з настановою, проти ектопаразитів застосовували інсектоакарицидні краплі “Барс” згідно з настановою. Краплі проти бліх наносили цуценятам на холку, вздовж спини. Цуценят кожної групи утримували ізольовано у вольєрах віварію, дотримуючись встановлених норм у роботі та утримання лабораторних тварин (Западнюк І.П., 1985). Годували їх вівсяною кашею, чорним хлібом та сухим кормом для цуценят згідно з настановою. Раціон був одноманітним упродовж всього періоду дослідження. Піддослідні тварини перебували під постійним клінічним наглядом і не хворіли на інфекційні, інвазійні та незаразні хвороби.

Цуценятам першої дослідної групи підшкірно вводили нативний білок курячого яйця, який попередньо збивали у рідку масу, з розрахунку 0,2 мл/кг маси тіла. Цуценятам другої дослідної групи - сироватку крові коня з розрахунку 0,2 мл/кг маси тіла. Для отримання сироватки, кров у кількості 50 мл відбирали з яремної вени у клінічно здорового коня, що знаходився на утриманні клініки Національного університету біоресурсів і природокористування України. Венозну кров, отриману без антикоагулянту, відбирали в скляну пробірку, відстоювали в термостаті при t +37-38 °С упродовж 60 хв. Після утворення згустку піпеткою відділяли його від стінок пробірки та збирали сироватку в іншу центрифужну пробірку. Центрифугували впродовж 15-20 хв. при 3000 об/хв. Сироватку крові коня зберігали у холодильнику при t +2…+4 °С. Термін зберігання сироватки крові без консерванту становив 24 год. (Кондрахін І.П., 1985). Цуценятам контрольної групи підшкірно вводили 0,9 %-й розчин натрію хлориду у дозі 0,2 мл/кг маси тіла. Тваринам першої дослідної групи повторно через 14 діб вводили внутрішньовенно білок курячого яйця у дозі 0,2 мл/кг маси тіла, тваринам другої дослідної групи - сироватку крові коня у дозі 0,2 мл/кг маси тіла. При цьому контролем були клінічно здорові тварини, яким внутрішньовенно вводили 0,9 %-й розчин натрію хлориду в дозі 0,2 мл/кг маси тіла.

Дослідження особливостей змін клінічних та імунологічних показників крові цуценят проводили через 1, 12 та 24 год. після разового підшкірного введення алергенів. Клінічні, морфологічні, біохімічні та імунологічні дослідження крові у піддослідних собак також проводили через 1, 12 та 24 год. після повторного внутрішньовенного введення алергенів (білка курячого яйця та сироватки крові коня). Кров у цуценят відбирали з підшкірної вени передпліччя у кількості 20 мл. Після повторного внутрішньовенного введення алергенів піддослідним тваринам спостерігали за перебігом у них анафілактичного шоку.

Клінічні дослідження тварин (визначення температури тіла, частоти пульсу та дихання) проводили за загальноприйнятими методами (Кондрахін І.П., 1985).

Дослідження зскрібків шкіри проводили під мікроскопом (ок. 10 x об. 9) із додаванням до матеріалу 1-2 крапель 10 %-го розчину натрію гідроокису та 50 %-го розчину гліцерину. Дослідження крові на наявність мікродирофілярій проводили методом розчавленої краплі (Воробйов А.А., 2003).

Для вивчення лейкограми мазки крові фарбували за Романовським-Гімза (Кудрявцев А.А., 1974). Швидкість осідання еритроцитів (ШОЕ) визначали за методом Т.П. Панченкова (1984).

Біохімічні показники сироватки крові досліджували за допомогою напівавтоматичного біохімічного аналізатора BA-88 фірми “Mindray” (Китай) з використанням реагентів фірми “Lachema” (Чехія), а також загальноприйнятими методами, описаними І.П. Кондрахіним та ін. (1985), з використанням реактивів виробництва ОАО “Донецького заводу хімреактивів” (Україна): вміст загального білка - за біуретовою реакцією; концентрацію глюкози - за кольоровою реакцією з ортотолуїдином; вміст загального та прямого білірубіну - за методом Ієндрашика, Клеггорна та Грофа; активність б-амілази (К.Ф. 3.2.1.1) - амілокластичним методом зі стійким крохмальним субстратом (метод Каравея); активність аспартатамінотрансферази (АсАТ, К.Ф. 2.6.1.1) і аланінамінотрансферази (АлАТ, К.Ф. 2.6.1.2) - за методом Райтмана-Френкеля.

Дослідження імунологічних показників проводили за такими методиками: рівень імуноглобулінів різних класів (A, M, G) - методом радіальної імунодифузії в гелі (РІД) за Манчіні з використанням діагностикумів фірми ФГУП НПО “Мікроген” (Москва, Росія) (Чернушенко Е.Ф., Когосова Л.С., 1978); рівень загального імуноглобуліну Е та алергенспецифічні-Ig E-антитіла - методом імуноферментного аналізу (ІФА) з використанням набору реагентів № А-8660 Ig E-ІФА-Бест-стріп для кількісного визначення імуноглобуліну Е (загальний Ig E) в сироватці крові фірми ЗАТ “Вектор Бест” (Новосибірськ, Росія) та діагностичних алергенів фірми НПО “Алерген” (Ставрополь, Росія) (Карпіщенко А.І., 1999); вміст циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) - спектрофотометричним методом з поліетиленгліколем - 6000 (у опт. од.) (Передерій В.Г., 1990); фагоцитарну активність (ФА) та фагоцитарний індекс (ІФ) неспецифічної резистентності організму - за методом Чумаченка В.Ю. (1975), тест-культура Staphylococcus aureus, штам 209 P (Чумаченко В.Ю. та ін., 1990); кількість Т- та В-лімфоцитів - непрямим імунофлуоресцентним методом на проточному цитофлуориметрі “Becton Diskinson” (США) (Jakson А., 1990, Пінєгін Б.В., Ярилін А.А., 2001;). За допомогою даного методу визначали такі субпопуляції лімфоцитів - CD3-лімфоцити відносили до Т-лімфоцитів, CD4-лімфоцити - Т-хелперів, CD8-лімфоцити - Т-цитотоксичних лімфоцитів/супресорів, CD16-лімфоцити - О-лімфоцитів (NK-клітини), CD19-лімфоцити - В-лімфоцитів. Імунорегуляторний індекс (ІРІ) визначали шляхом поділу кількості Т-хелперів на кількість Т-супресорів (Сохін А.А., 1984).