Вплив продуктів деградації фібрину на клітини лінії РС-12

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ІМ. О. В. ПАЛЛАДІНА

УДК 577.27

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив продуктів деградації фібрину на клітини лінії РС-12

03.00.04 - біохімія

Калашник Олена Миколаївна

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Скок Марина Володимирівна, головний науковий співробітник відділу молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Макогоненко Євген Митрофанович, головний науковий співробітник відділу хімії та біохімії ферментів Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Погорєла Неллі Христофорівна, старший науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України.

Захист відбудеться 20 березня 2009 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України за адресою: 01601, м. Київ, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (м. Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат розісланий 20 лютого 2009 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Кірсенко О.В.

фермент фібрин деградація проліферація

ЗАГАЛЬНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ РОБОТИ

Актуальність теми. Пошкодження тканин вищих тварин супроводжується зсіданням крові та утворенням фібринового згустку в кров'яному руслі. Крім того, фібриноген та неактивні попередники коагуляційного каскаду потрапляють в позасудинне оточення. Кількість їх значно зростає при розвитку запалення, коли відбувається ретракція ендотеліальних клітин, що сприяє виходу в позасудинний простір компонентів системи зсідання крові. Під дією прокоагулянтних факторів, що вийшли з кровообігу або асоційовані з клітинами, фібриноген перетворюється в позасудинний фібрин. Його накопичення загострює перебіг таких хвороб нервової системи, як бактеріальні менінгіти, ВІЧ-енцефаліти, множинний склероз, інсульт, хвороба Альцгеймера (Adams et al., 2002).

В хірургічній практиці клеї на основі фібрину набули широкого розповсюдження завдяки їх гемостатичному ефекту, спрощенню хірургічної процедури та позитивному впливу на відновлення тканин. Для зєднання пошкоджених нервів фібринові клеї пропонують з 70-х років ХХ століття як більш швидкий і менш травматичний метод, що також дозволяє уникнути утворення шовних гранульом та реакцій на чужорідний матеріал швів (Suri et al., 2002). Фібриновий матрикс знаходить застосування для стабілізації нервів під час операції, депонування нейротрофних речовин та як складова сполучних трубок, що застосовуються як канали для направлення проростання нервів при відновленні. Фібринові клеї запропоновані як середовище при трансплантації хромафінних клітин для полегшення стану при хронічних болях та при деяких нейродегенеративних захворюваннях (Yin et al., 2001; Kalbermatten et al., 2008).

Більшість досліджень демонструє позитивний вплив фібринового матриксу на відновлення пошкоджених нервів, проте в частині робіт представлено суперечливі результати, що стримує його використання на практиці (Dagum, 1998; Junior et al., 2004; Bhang et al., 2007). З накопиченням фібрину також пов'язують посилення дегенерації аксонів при множинному склерозі (Akassoglou et al., 2004). В той же час будь-яке травмування змушує нервові клітини контактувати з фібрином внаслідок пошкодження локальної судинної сітки. Таким чином, взаємодія нервових клітин і фібринового матриксу є важливою темою досліджень, проте молекулярні механізми впливу фібрину і продуктів його деградації на нервові клітини вивчені мало. Обставиною, яка ускладнює ці дослідження, є те, що нервові клітини важко підтримуються in vitro. Тому для подібних досліджень використовують модельні клітинні лінії. Однією з визнаних моделей є лінія РС-12, яка походить з хромафінних клітин наднирників щура і може диференціюватися в культурі в клітини, подібні до симпатичних нейронів (Greene and Tischler, 1976). Завданням нашої роботи було дослідити взаємодію і взаємний вплив цих клітин і фібрину.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі молекулярної імунології Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України протягом 1998 - 2002 і 2007 рр. Дисертація безпосередньо зв'язана з плановими дослідженнями відділу за бюджетними темами: „Дослідження імунохімічної структури біологічно активних білків та пептидів”, розділ І „Вивчення будови та особливостей експресії клітинних рецепторів за допомогою імунохімічних методів, ДР № 0199U000273 (1999 - 2003 рр.), розділ ІІ „Вивчення будови та функцій нікотинових та протеазо-активованих рецепторів на лімфоцитах”, ДР № 0104U003280 (1999 - 2003, 2004 - 2008), та „Протеомікс біологічно активних білків людини, розробка методів одержання білків, важливих для діагностики і лікування”, розділ VIIІ - „Вивчення експресії нікотинових ацетилхолінових рецепторів на лімфоцитах і їхньої ролі в нормі та за патологічних умов”, ДР № 0102V006218 (2002 - 2006). Роботу підтримано грантом INTAS-Ukraine (грант 0056): „Роль структури функціонально важливих доменів в б-субодиницях різних нейрональних ацетилхолінових рецепторів, що визначають їх фармакологію та фізіологічне значення” (1997 - 2000), програмою спільних досліджень з лабораторією Oxford Bioresearch (Велика Британія).

Мета і завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було вивчення взаємного впливу фібринового згустку і клітин лінії РС-12.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

- дослідити вплив клітин РС-12 на фібриновий згусток;

- визначити ферменти, завдяки продукції яких клітини РС-12 гідролізують фібриновий згусток, і фрагменти фібрину, які утворюються при цьому;

- дослідити вплив продуктів деградації фібрину на швидкість проліферації, виживання, адгезію і напрямок диференціювання клітин РС-12;

- визначити рецептори до DD(D) і Е фрагментів фібрину на поверхні клітин РС-12.

Об'єкт дослідження: клітинна лінія феохромоцитоми щура РС-12.

Предмет дослідження: вплив фібрину і продуктів його деградації на базові життєві функції клітин РС-12; рецептори, що опосередковують цей вплив.

Методи дослідження: Мікроскопічні дослідження клітин проводили безпосередньо в культурі. Продукти деградації фібрину та тип гідролізу виявляли за допомогою електрофорезу та імуноблотінгу. Ферменти, що секретуються клітинами, визначали ензим-електрофорезом, хромогенним аналізом та сорбційним імуноферментним аналізом (ІФА). Оцінку проліферації та виживання клітин проводили за включенням тіазолілу блакитного. Диференціювання клітин вивчали методами цитохімії та імуноцитохімії. Зв'язування з клітинами DD, D, Е фрагментів фібрину, як і експресію нікотинового ацетилхолінового рецептору (нАХР), визначали клітинним імуноферментним аналізом (К-ІФА). Інтегрини клітин РС-12, які опосередковують зв'язування цих фрагментів, визначали методом проточної цитофлуориметрії.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше хромогенним аналізом кількісно визначена базова продукція тканинного активатора плазміногену (ТАП) клітинами РС-12. Показано, що клітини РС-12 конститутивно продукують ТАП, що сприяє деградації фібрину. Вперше показано, що низько- (М.в.10 - 30 кДа) і високомолекулярні (М.в. > 30 кДа) продукти деградації фібрину різняться за своєю дією на клітини РС-12. Низькомолекулярні продукти стимулюють проліферацію клітин, послаблюють їх адгезію до підложки, збільшують експресію нАХР і сприяють росту нейритів. Високомолекулярні продукти гідролізу, зокрема DD, D і Е фрагменти фібрин(оген)у, суттєво збільшують адгезію клітин РС-12 до пластику. Вперше показано, що вплив DD, D і Е фрагментів на клітини РС-12 опосередкований б_vв₃ інтегрином, який після зв'язування ліганду інтерналізується і його експресія ап-регулюється. Вперше показано, що вплив сорбованих і розчинних DD, D і Е фрагментів на клітини може бути різним.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані результати демонструють, що на життєдіяльність клітин симпатоадренального походження позитивний вплив мають продукти деградації фібрину, проте не сам фібрин. Швидкість утворення продуктів деградації фібрину та їх вплив на досліджувані клітини залежить від об'єму та густини згустку, що може пояснювати суперечливі результати використання фібринових клеїв в нейрохірургії. Результати представленої роботи можуть бути використані в дослідженнях з тканинної інженерії. Отримані дані також підтверджують важливість для відновлення нервових клітин відповідної активності системи фібринолізу.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота - завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1998-2007 рр. Дисертантом особисто зроблено пошук та аналіз даних літератури, проведено частину експериментів і зроблено науковий аналіз експериментальних даних, сформульовано основні положення та висновки. Результати досліджень, викладені у підрозділах 3.2 та 3.3, в більшості одержані автором особисто; підрозділи 3.1 та 3.4 виконано сумісно з іншими співробітниками відділу молекулярної імунології та відділу структури і функції білка в межах співробітництва з Oxford Bioresearch. Фібриноген, його фрагменти, очищений плазміновий гідролізат було люб'язно надано д.б.н. Платоновою Т.М., пров.н.с. відділу структури і функції білка. Антитіла проти субодиниць нАХР отримано у відділі молекулярної імунології м.н.с. Лихмус О.Ю. Моноклональні антитіла ІІІ-3Б надані групою д.б.н. Е.В. Луговського відділу молекулярної імунології.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були оприлюднені на наукових семінарах відділу молекулярної імунології (2005, 2007 рр.), конференції-конкурсі молодих учених Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (2005 р.), на 4-ій науковій конференції “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000” (Санкт-Петербург, 2000), 5^th John Humphrey Advanced Summer Programmer and Lecture Series in Immunology (Пущино, Росія, 2000 р.), ESN Conference on “Advances in molecular mechanisms of neurological disorders” (Перуджи, Італія, 2001) та 20^th Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Сідней, Австралія, 2005).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 друкованих праць, з яких 3 статті в періодичних фахових наукових виданнях України і 5 тез доповідей у збірках вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить 143 сторінки друкованого тексту, в тому числі 116 сторінок основної текстової частини. Результати досліджень представлені у 47 рисунках. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (3 підрозділи), експериментальної частини, що включає розділи „Матеріали і методи досліджень” (12 підрозділів) і „Результати досліджень і їх обговорення ” (4 підрозділи), а також висновків, заключення, списку використаної літератури (223 посилання).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. В огляді літератури наведена інформація про структуру фібриногену, фібрину та їх фрагментів, про взаємодію цих білків з різними типами клітин та про рецептори, що опосередковують таку взаємодію. Детально охарактеризовані клітини лінії РС-12 та їх рецептори адгезії.

Матеріали та методи дослідження. Клітини лінії РС-12 було одержано з Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, Київ. Їх культивували в поживному середовищі RPMI-1640 («Sigma», США) з додаванням 20 мМ HEPES, 20 мМ L-глутаміну, 40 мкг/мл гентаміцину, 5Ч10^-5 М в-меркаптоетанолу, та 10% ембріональної сироватки крові теляти (“Gibco BRL”, Німеччина). Для експерименту клітини сіяли у 96-лункові планшети або чашки Петрі («Falcon», США) у густині 2Ч10⁴ кл./мл, а для вивчення адгезивних властивостей - у густині 2,5Ч10⁵ кл./мл. Згусток готували з розчинів фібриногену, одержаного з донорської цитратної плазми, розведеного поживним середовищем з 20% ембріональної сироватки теляти до концентрації 6-20 мг/мл, та тромбіну (“Merck”, Німеччина, 1 мг/мл з активністю 100 одиниць/мл) у співвідношенні 4 одиниці тромбіну:1 мл фібриногену. Цю суміш витримували 30 секунд в пробірці і вносили в лунки або чашки Петрі з розрахунку 10 - 400 мм³ на мл поживного середовища (1 - 40 мм³/лунку). Варіювання густини і об'єму згустку було проведено у відповідності з різними концентраціями і об'ємами нанесення фібринових клеїв in vivo. Клітини вносили поверх згустку або, у деяких експериментах, додавали до суміші фібриноген-тромбін під час полімеризації. Під час культивування згусток спостерігався візуально, і рівень його деградації фіксувався вимірюванням його діаметру і фотографуванням. Як контроль деградації згустку його інкубували в поживному середовищі, але без клітин.

Після повної деградації згустку відбирали проби для електрофорезу та імуноблотингу, а одержаний гідролізат фракціонували ультрафільтрацією з межою розділення 30 кДа. Відібрані проби очищували на КМ - сефадексі C-50 (“Pharmacia Fine Chemicals”, Швеція), з яким зв'язуються всі білки, що містять D-домен фібриногену, і частина Е фрагменту завдяки утворенню DD:Е-комплексів. SDS-електрофорез високомолекулярних продуктів деградації проводили в 7% поліакриламідному гелі за методом Лемлі (Laemmli, 1970), а низькомолекулярних продуктів - в 12,5% поліакриламідному гелі за методом Свенка (Swank and Munkers, 1971). За допомогою напівсухого блоту білки переносили на нітроцеллюлозну мембрану Hybond-C (“Amersham”, Велика Британія). Мембрану обробляли послідовно або кролячими антитілами (АТ) проти фібрин(оген)у та його фрагментів, отриманими нами раніше, і пероксидазним кон'югатом АТ кози проти імуноглобулінів кроля, або моноклональними АТ (мАТ) ІІІ-3В і комплексом пероксидаза-анти-пероксидаза (“Sigma”, США). Білкові зони візуалізували за допомогою хромогенного субстрату пероксидази 4-хлор-1-нафтола (“Sigma”, США).

Активатори плазміногену в еуглобуліновій фракції супернатантів клітин визначали трьома методами: ензим-електрофорезом, ІФА і хромогенним аналізом. Еуглобулінову фракцію культурального середовища і супернатантів клітин РС-12 готували за методом Хмелевської (Chmielewska et al., 1983). Для ІФА проби адсорбували на полістиролові планшети (“Nunc MaxiSorp”, Данія), потім, після блокування вільних сайтів зв'язування 2% розчином бичачого сироваткового альбуміну (БСА, “Sigma”, США) в забуференому фосфатом фізіологічному розчині, рН 7,2-7,4 (ЗФР), 60 хв. при 37ъ С обробляли козячими АТ W51, специфічними до ТАП (“Oxford Bioresearch Laboratory”, Велика Британія). Після трикратного відмивання первинні АТ виявляли пероксидазним кон'югатом АТ кроля проти імуноглобулінів кози (“Sigma”, США) з подальшим виявленням пероксидази зв'язаного кон'югату розчином субстрату: 0,4 мг/мл о-фенілендіаміну (“Sigma”, США) і 0,05% Н₂О₂ в 0,05 М КН₂РО_4, рН 5,0. Реакцію зупиняли додаванням 4н розчину H₂SO₄ та фотометрували за довжини хвилі 490 нм на фотометрі “Microelisa Autoreader“ (“Dynatech”, Швейцарія).

Ензим-електрофорез проводили за методом Хойсена і Даудла (Heussen and Dowdle, 1980). Хромогенний аналіз з синтетичним субстратом плазміну S-2251 (“Chromogenic”, Швеція) проводили методом Хмелевської за модифікацією Савчука (Савчук та ін., 2002).

Для визначення інтенсивності проліферації клітини сіяли в 96-лункові планшети за присутності згустку (з додаванням інгібіторів протеолізу і без), або продуктів його деградації, або тромбіну. Як контроль клітини сіяли в чисте поживне середовище. Після 5-7 днів інкубації кількість живих клітин визначали за включенням тіазолілу блакитного (3-4,5диметилтриазоліл-2,5-дифенілтетразолію броміду, “Sigma”, США), який вносили до поживного середовища до кінцевої концентрації 0,4 мг/мл. Після 4 годин інкубації при 37°С утворені кристали формазану розчиняли у діметилсульфоксиді, до лунок додавали 0,1 М гліциновий буфер, рН 10,5, і фотометрували планшети за довжини хвилі 540 нм (Carmichael et al., 1987). Кількість клітин визначали на основі попередньо побудованої калібрувальної кривої.

Силу адгезії клітин РС-12 до культурального (адгезивного) пластика після 5 днів інкубації зі згустком або продуктами його деградації визначали двома методами. В першому варіанті клітини вирощували в чашках Петрі діаметром 100 мм, знімали з пластика 0,2% розчином ЕДТА, відмивали ЗФР і сіяли в 96-лункові планшети в густині 2,5 Ч10⁵ кл./мл. Через 2,5 години інкубації при 37°С ступінь розпластування клітин оцінювали візуально і фотографували. Планшети струшували на шейкері 30 хвилин, клітини, що відкріпилися, змивали ЗФР, а кількість клітин, що залишилися прикріпленими, визначали за включенням тіазолілу блакитного. Загальна кількість клітин (без струшування) визначалась окремо, і результат досліду було представлено як процент клітин, що залишилися прикріпленими. В другому варіанті клітини одразу вирощували в 96-лункових планшетах, струшували на шейкері, а далі експеримент проводили як описано в першому варіанті.

Диференціювання клітин РС-12 в нейрональному або ендокринному напрямку визначали цитохімічно за вмістом катехоламінів (КА), ферментів їх синтезу і розпаду: тирозингідроксилази (ТГ) та моноаміноксидази (МАО), відповідно, - і за рівнем експресії 3- і 5-субодиниць нАХР. Для цього клітини вирощували 5 днів (в присутності фібрину, продуктів його деградації, або без них) на предметних скельцях, які заздалегідь покривали 5% розчином желатину, в скляних кільцях, або в чашках Петрі, з наступною посадкою на предметні скельця за допомогою цитоцентрифуги. Вміст катехоламінів визначали за допомогою флуоресцентної мікроскопії після обробки клітин 4% параформальдегідом (ПФА) та 2% гліоксиловою кислотою. Активність МАО виявляли за методом Гленнера (Glenner et al., 1957). Рівень ТГ і 3- і 5-субодиниць нАХР визначали імуноцитохімічно, після фіксації клітин 4% ПФА: ТГ - за допомогою специфічних мАТ (“Sigma”, США), після пермеабілізації мембрани 0,1% Triton X-100, а 3- і 5-субодиниці нАХР - специфічними до них біотинільованими АТ. Після троєкратного відмивання і блокування ендогенної пероксидазної активності 1% Н₂О₂ скельця 1 годину обробляли кролячими АТ до імуноглобулінів миші, кон'югованими з пероксидазою, або авідин-пероксидазним кон'югатом (“Sigma”, США) в 1% БСА в ЗФР, забарвлення проявляли розчином 3,3-діамінобензидину (2 мг/мл) та 0,1% Н₂О₂ в 0,05 М тріс-HCl буфері, рН 7,6 і аналізували за допомогою світлового мікроскопу (“Olympus”, Japan).

Зміну експресії 3- і 5-субодиниць нАХР під впливом продуктів деградації фібрину вивчали також на живих клітинах методом К-ІФА. Для цього клітини вирощували в чашках Петрі, як описано вище, знімали з пластика, переносили в мікропробірки Епендорф (5х10⁵ клітин/пробу) і 30 хвилин інкубували на льоду з біотинільованими АТ (10 мкг/мл), специфічними до 3- і 5-субодиниць нАХР, в 1% БСА/ЗФР. Після блокування ендогенної пероксидазної активності клітини 30 хвилин обробляли авідин-пероксидазним кон'югатом (1:50000) в ЗФР/БСА. Забарвлення проявляли розчином субстрату, що містив о-фенілендіамін, як вказано вище. Реакцію зупиняли додаванням 4н розчину H₂SO₄. Клітини осаджували центрифугуванням, а надклітинну рідину переносили в лунки 96-лункового планшету і фотометрували за довжини хвилі 490 нм.

Здатність клітин РС-12 прикріплюватися до фібрину і продуктів його деградації вивчали в експериментах з неадгезивним (бактеріологічним) пластиком, вкритим фібриновою плівкою, фібриногеном (10 мкг/мл), желатином (0,6 мг/мл), D, DD і Е фрагментами фібрину (10 мкг/мл). Фібрин готували з фібриногену концентрацією 2 мг/мл і тромбіну з активністю 6 одиниць/мл. Розчини висушували в лунках 96-лункових планшетів з неадгезивною поверхнею (“Greiner”, Німеччина) протягом 12 годин при 37°С, після чого планшети тричі відмивали ЗФР. Клітини в концентрації 2,5Ч10⁵ кл./мл вносили в лунки в поживному середовищі на 2 години, потім двічі відмивали розчином ЗФР за допомогою м'якого піпетування. Кількість клітин, які залишилися прикріпленими, підраховували за включенням тіазолілу блакитного.

В деяких експериментах клітини попередньо інкубували з розчинним DD фрагментом (1, 10, 100 мкг/мл) протягом 30 хвилин при 37°С, після чого вносили в лунки з сорбованим фрагментом і далі аналізували, як описано вище. Для визначення ролі RGD-сайту в зв'язуванні фрагментів фібрину разом з клітинами в лунки вносили пептид Arg-Gly-Asp-Ser (“Sigma”, США).

Пряме вивчення зв'язування розчинних фрагментів фібрину з клітинами РС-12 проводили методом К-ІФА. Клітини, поміщені в пробірки Епендорф, інкубували з різними концентраціями фібриногену або фрагментів фібрину при 4°С або 37°С. Далі всі інкубації і відмивання проводили при 4°С, щоб запобігти інтерналізації адгезивних рецепторів клітин, з якими зв'язалися фрагменти фібрину. Після відмивання клітини обробляли 40 хвилин кролячими АТ проти фібриногену або проти його D і E фрагментів (“Oxford Bioresearch Laboratory”, Велика Британія). Після блокування ендогенної пероксидазної активності АТ, які зв'язалися з поверхнею клітин, виявляли кон'югатом антитіл кози проти IgG кроля з пероксидазою хрону (“Sigma”, США). Далі експеримент проводили, як описано вище.

Для вивчення кінетики зв'язування D фрагмент мітили ізотіоцианатом флуоресцеїну (ФІТЦ) за стандартною методою (Клаус, 1990). Залежність інтенсивності флуоресценції від концентрації D-ФІТЦ визначали на спектрофлюориметрі MPF-4 „Hitachi” при довжині хвилі збудження 494 нм з максимумом емісії на 520 нм. В проби клітин (0.86 x10⁶ кл./пробу) вносили D-ФІТЦ до концентрації 0 - 200 мкг/мл і інкубували 30 хвилин на льоду. В деяких експериментах клітини попередньо інкубували 60 хвилин з неміченими D або Е фрагментами (0 - 100 мкг/мл), відмивали ЗФР, додавали на 30 хвилин D-ФІТЦ (60 мкг/мл) і знову відмивали. Інтенсивність флуоресценції зв'язаного з клітинами D-ФІТЦ вимірювали на спектрофлюориметрі, кінетичний аналіз зв'язування проводили на основі ізотерми Ленгмюра:

,

де X - концентрація вільного D-ФІТЦ, Y - зв'язаний D-ФІТЦ, розрахований як % від концентрації насичення, К - константа афінності зв'язування D-ФІТЦ клітинами. Концентрацію зв'язаного D-ФІТЦ для кожної точки титрування розраховували за стандартною кривою, побудованою на основі різних концентрацій розчинного D-ФІТЦ. Концентрацію вільного D-ФІТЦ визначали як різницю між кількістю внесеного D-ФІТЦ та кількістю D-ФІТЦ, що зв'язався з клітинами, розраховану на основі стандартної кривої флуоресценції розчинного D-ФІТЦ. Константу афінності розраховували як нахил прямої, побудованої в координатах Y/1-Y та X, а коефіцієнт Хіла - як нахил прямої, побудованої в координатах Хіла lg Y/1-Y та lg Х. Кількість сайтів зв'язування D-фрагменту на клітину (n) розраховували за рівнянням:

,

де N - число Авогадро, В - максимальна концентрація насичення при зв'язуванні D-ФІТЦ, С - кількість клітин на мл (Корниш-Боуден, 1979).

Наявність інтегрину б_vв₃ на клітинах РС-12 було проаналізовано методом проточної цитофлуориметрії за допомогою біотинільованих козячих АТ до б_v субодиниці інтегрину щура (“Santa Cruz Biotechnology”, США). 1х10⁶ клітин/пробу інкубували з АТ (1-20 мкг/мл) протягом 30 хвилин в 1% БСА/ЗФР, з попередньою інкубацією клітин з 1 мкг/мл фібриногену або без неї. Всі інкубації і відмивання проводили при 4^оС в присутності 0,09% NaN₃, щоб запобігти інтерналізації інтегринів. Зв'язані АТ виявляли комплексом стрептавідин-фікоеритрин (1:400, “Pharmigen™”, BD), вимірюючи флуоресценцію при довжині хвилі 575 нм за допомогою проточного цитофлуориметра EPICS XL (“Beckman Coulter”, Франція).

Обробку даних, побудову графіків та статистичний аналіз за стандартним критерієм t-тесту Ст'юдента виконували за допомогою пакету програм OriginPro 7.5. Значення при р0,05 розглядались як достовірні.

Результати досліджень та їх обговорення. Під час культивування клітин РС-12 в присутності фібринового згустку відбувалась деградація останнього. Рівень деградації залежав як від кількості клітин, так і від об'єму згустку і вихідної концентрації фібриногену. Гідроліз згустку спостерігався також при інкубації з супернатантами клітин РС-12, одержаних за відсутності згустків, але не з чистим культуральним середовищем. Таким чином, клітини РС-12 конститутивно секретували певну протеїназу. Лізис згустку пригнічувався лише апротиніном, апротинін-вмісною сумішшю і діізопропілфлюорофосфатом, з чого було висунуто припущення, що згусток руйнує серинова протеїназа плазмін. Це припущення було підтверджено результатами SDS-електрофорезу в 7% поліакріламідному гелі. Виявилося, що під дією клітин РС-12 утворюються такі ж фрагменти фібрину, як при гідролізі його плазміном, а саме DD (180 кДa), D (90 кДa) і Е (50 кДa) фрагменти. У відновлюючих умовах DD фрагмент розпадався на продукти з М.в. 78, 40 і 14 кДа, що відповідає масі його гг, в і б-ланцюгів. В низькомолекулярній фракції виявлялися продукти з М.в. 25-26, 19, 7-8 і 6 кДа.

З даних літератури відомо, що сайти розщеплення фібрину плазміном лише на декілька амінокислот відрізняються від сайтів розщеплення його еластазою (Gaffney, 2001), і результати електрофорезу не давали змоги диференціювати ці два типи гідролізу. Імуноблотинг з мАТ ІІІ-3Б, специфічним до D, DD фрагментів фібрину, утворених при плазміновому гідролізі, показав, що ці мАТ виявляли лише продукти, які утворювалися при розщепленні фібрину під дією плазміну і клітин РС-12, але не еластази.

Активний плазмін утворюється з плазміногену під дією певного активатора (Mosesson, 1997; Ellis et al., 1991). З чистим культуральним середовищем лізис згустку не спостерігався, тобто клітини РС-12 мали продукувати активатор плазміногену, і, можливо, сам плазміноген. Ензим-електрофорез з додаванням плазміногену в гель показав в супернатанті клітин РС-12 ензиматичну активність на рівні контрольного зразка ТАП. В чистому культуральному середовищі ензиматична активність не виявлялася.

Продукцію ТАП клітинами РС-12 також було підтверджено ІФА, а хромогенний аналіз з синтетичним субстратом плазміну показав, що кожна клітина РС-12 продукує 6Ч10^-7 нг ТАП.

Фібрин і продукти його деградації мають високу біологічну активність відносно багатьох типів клітин (Clark, 2001; Naito et al., 2000; Szaba et al., 2002), тому наші подальші експерименти було спрямовано на визначення впливу, який чинять продукти гідролізу фібрину на життєві показники клітин лінії РС-12.

При культивуванні клітин за присутності фібринового згустку спостерігалися зміни інтенсивності їх проліферації. Характер змін залежав від об'єму згустку: згустки об'ємом до 100 мм³ на мл середовища культивування стимулювали проліферацію, а згустки більшого об'єму пригнічували її.

Схожий ефект спостерігався при додаванні до клітин кондиційованого середовища, яке одержували при сумісній інкубації 5Ч10³ клітин зі згустком (150 мм³): малі дози кондиційованого середовища мали стимулюючий, а великі - інгібуючий ефект. Стимулюючий ефект згустку не міг бути пояснений за рахунок дії тромбіну, присутнього в складі згустку, оскільки в концентрації, використаній в експерименті (0,8 мкг/мл, що відповідає активності 0,08 одиниць/мл), тромбін не впливав на проліферацію клітин РС-12. Стимулюючий ефект згустку не відтворювався дією фібринопептидів А і В. Апротинін, що інгібував деградацію згустку, знімав його вплив на проліферацію клітин. Ці результати свідчили про те, що саме продукти деградації фібринового згустку впливають на інтенсивність проліферації клітин РС-12.

Сумісне культивування з фібриновим згустком збільшувало життєздатність клітин РС-12 при їх засіванні у субоптимальній густині (меншій, ніж 1Ч10⁴ кл./мл). Об'єм згустку, що найбільш ефективно стимулював виживання (100 мм³), був значно більшим за такий, що ефективно стимулював поділ клітин, посіяних в нормальній густині (20 мм³). Це означало, що виживання культури було обумовлено не тільки прискоренням проліферації клітин, а й зниженням їх загибелі при несприятливих умовах культивування.

У попередніх експериментах нами було виявлено, що для виживання клітин РС-12 критичною є адгезія до підложки: позбавлення їх можливості прикріпитися протягом всього двох годин суттєво зменшувало життєздатність культури і втричі збільшувало час її подвоєння. За даними літератури, фрагменти білків матриксу, які є розчинними лігандами інтегринів, захищають від апоптозу клітини нейробластоми при несприятливих умовах культивування (Gibson et al., 2005). Це дозволило нам припустити, що інкубація з фібриновим згустком може впливати на адгезивні властивості клітин РС-12. Виявилося, що клітини, які культивувалися зі згустком, значно швидше прикріплювалися і розпластувалися на пластику, ніж контрольні. Зростала також міцність адгезії клітин до підложки: після 30 хвилин струшування на шейкері прикріпленими залишалось значно більше клітин, що протягом 5 днів інкубувалися з фібриновим згустком або кондиційованим середовищем, ніж контрольних. При цьому оптимальний об'єм згустку (100 мм³) був значно більшим, ніж той, що найбільш ефективно стимулював поділ клітин (20 мм³). Таким чином, наші дані свідчили на користь того, що протективна дія продуктів деградації фібрину обумовлена їх взаємодією з адгезивними рецепторами клітин РС-12.

Одна з особливостей клітин лінії РС-12 полягає в тому, що вони зберегли множинний потенціал первинного попередника, який дозволяє їм під дією певних факторів диференціюватися в хромафінні клітини або в симпатичні нейрони. Диференціювання в нейрональному напрямку відбувається, наприклад, під дією фактору росту нервів (ФРН). Воно характеризується уповільненням проліферації, ослабленням адгезії, подовженням нейритів і зростанням рівня холінергічних маркерів, зокрема нАХР, а рівень катехоламінів (КА), як і ферментів їх утворення і розпаду, залишається майже незмінним. Диференціювання в ендокринному напрямку, яке відбувається, наприклад, під дією дексаметазону, призводить до збільшення вмісту КА за відсутності росту нейритів і змін в експресії нАХР (Fujita et al., 1989). Для визначення впливу продуктів деградації фібрину на напрямок диференціювання клітин РС-12 ми оцінювали морфологію клітин, вміст КА і ферментів їх метаболізму та експресію нАХР. Як виявилося, під дією продуктів гідролізу фібрину росту нейритів не спостерігалось, вміст КА, ТГ та МАО також не змінювався, але експресія б3- і б5-субодиниць нАХР зростала порівняно з контролем, що було показано як імуноцитохімічним тестом, так і К-ІФА.

Таким чином, продукти деградації фібрину впливали на експресію нАХР подібно до ФРН, але, на відміну від ФРН, прискорювали проліферацію клітин РС-12 і збільшували їх адгезивні властивості. Також протилежні ефекти спостерігалися в залежності від об'єму згустку. Це дало підставу припустити, що ми спостерігаємо певну суму дій окремих компонентів гідролізату, які вивільнювалися зі згустку з різною швидкістю (Walker and Nesheim, 1999). Тому далі ми розділили продукти гідролізу згустку ультрафільтрацією за їх молекулярною вагою. Високомолекулярна фракція включала фрагменти з М.в. більше 30 кДа, а низькомолекулярна - від 30 до 10 кДа, оскільки діаліз при її приготуванні приводив до втрати фрагментів з молекулярною вагою меншою, ніж 10 кДа. Виявилось, що саме низькомолекулярні фрагменти фібрину (НМФ) прискорювали проліферацію клітин РС-12.

Як показано на рис. 5, бС-фрагмент, який має М.в. 20-25 кДа і, відповідно, входить до складу низькомолекулярної фракції, був значно менш ефективним, а у вищій концентрації навіть пригнічував проліферацію, тобто не він визначав ефект низькомолекулярних фрагментів.

Високомолекулярні фрагменти фібрину (ВМФ), в тому числі очищені D, DD та Е фрагменти, дозозалежно уповільнювали проліферацію клітин РС-12.

Таким чином, уповільнення поділу клітин РС-12 під впливом фібринових згустків великих об'ємів могло бути зумовленим накопиченням ВМФ (і бС-фрагменту), дія яких переважала стимулюючий ефект НМФ.

Як НМФ, так і DD фрагмент фібрину підвищували життєздатність клітин при засіванні їх в субоптимальній густині, хоч і не так ефективно, як сумарний гідролізат. Отже, як і було запропоновано, виживання при несприятливих умовах залежало як від взаємодії ВМФ з адгезивними рецепторами клітин, так і від мітогенної і, можливо, анти-апоптотичної дії НМФ. Такий результат узгоджується з даними літератури про те, що прикріплення клітин внаслідок підвищення експресії молекул адгезії забезпечує чутливість клітин до захисної дії нейротрофінів (Hong et al., 2003). Характерно, що під дією НМФ та частина клітин, яка вижила, утворювала відростки більш розвинені, ніж клітини в контролі, посіяні в оптимальній густині. НМФ, на відміну від сумарного гідролізату, не тільки стимулювали ріст нейритів, а й послаблювали адгезію клітин до пластику. Вони також більш ефективно, ніж сумарні продукти деградації, підвищували експресію б3- і б5-субодиниць нАХР. Інакше кажучи, під дією НМФ клітини РС-12 набували властивостей нервових клітин, одночасно зберігаючи і навіть підвищуючи здатність до проліферації. ВМФ, напроти, посилювали адгезію клітин до підложки і не впливали на експресію нАХР і ріст нейритів. На відміну від НМФ, ефект ВМФ на адгезію клітин посилювався при збільшенні дози.

Таким чином, ВМФ, в тому числі і очищені DD, D і Е фрагменти, дуже суттєво впливали на адгезивні властивості клітин, посилюючи їх, з чого ми припустили, що високомолекулярні фрагменти є лігандами адгезивних рецепторів клітин РС-12. Наші подальші експерименти було спрямовано на вивчення та ідентифікацію таких рецепторів.

За даними мікроскопічних досліджень, клітини РС-12 не прикріплювались до фібринового згустку, уникаючи контакту з ним. Вони також слабко прикріплювались до пластику, покритого фібрином, проте добре адгезували до фібриногену і фрагментів фібрину.

Це означало, що адгезивні рецептори клітин РС-12 взаємодіють з ділянками молекули фібриногену, які стають менш доступними після полімеризації, але зберігаються в високомолекулярних продуктах деградації фібрину.

Методом К-ІФА було показано, що при 4°С зв'язування D і Е-фрагментів фібрину з клітинами PC-12 має характер насичення. Проте при 37°С кількість зв'язаних фрагментів зростала лише перші 15 хвилин, а потім відбувалося різке її зниження з наступним повільним відновленням протягом 45 хвилин.

Ці результати вказували на наявність специфічних рецепторів на поверхні клітин РС-12, які за фізіологічних умов при зв'язуванні ліганда інтерналізувалися, а потім поверталися на поверхню клітини.

Використання в клітинному ІФА вторинних реагентів (антитіл) не давало можливості проведення кінетичного аналізу зв'язування. Тому наступним кроком було отримано флуоресцентне похідне очищеного D фрагменту. Пряме виявлення зв'язування міченого фрагменту дозволило визначити, що кожна клітина РС-12 несе на своїй поверхні близько 1х10⁶ сайтів зв'язування, з якими D фрагменти фібрину взаємодіють з константою афінності 8.12 Ч10⁶ М^-1. Розрахований коефіцієнт Хіла дорівнював 0,697 (<1), що вказувало на зв'язування рецептор-ліганд у співвідношенні 1:1.

Отримані результати однозначно свідчили про наявність на поверхні клітин РС-12 рецепторів до фрагментів фібрину і фібриногену. Однак природа і специфічність цих рецепторів залишались невизначеними. Найбільші питання виникали стосовно перехресної специфічності D і Е фрагментів фібрину, які не є подібними і навіть гомологічними.

Вплив Е, D і DD фрагментів на клітини РС-12 і кінетика зв'язування їх з клітинами були схожі між собою. 30-хвилинна передінкубація клітин з розчинним DD фрагментом збільшувала їх адгезію до цього фрагменту, сорбованого на пластику. Передінкубація з Е фрагментом також призводила до посилення зв'язування D фрагменту з клітинами (за даними К-ІФА і прямого визначення D фрагменту, міченого ФІТЦ). Ці дані свідчили, що зв'язування лігандів призводить до ап-регуляції відповідних рецепторів, і давали підставу вважати D і Е фрагменти фібрину лігандами одного типу рецепторів. Однак ефективність зв'язування клітин з Е фрагментом була нижчою.

Базуючись на даних літератури, ми припустили, що взаємодія фрагментів фібрину і фібриногену з клітинами РС-12 опосередкована рецептором типу інтегринів. Більшість інтегринів є RGD-залежними, тобто вони розпізнають на своїх лігандах RGD-сайт (послідовність Arg-Gly-Asp), або зв'язування з лігандом може бути заблоковано в присутності RGD-вмісного пептиду (Yokoyama et al., 1999). В наших експериментах прикріплення клітин РС-12 до фібриногену та його D і Е фрагментів зменшувалось в присутності RGD-вмісного пептиду. Висока густина рецепторів на поверхні, рівень афінності, а також ап-регуляція після зв'язування ліганда відповідали відомим характеристикам інтегринів (Critchley, 2000).

RGD-залежними рецепторами адгезії, з якими може взаємодіяти фібриноген, є інтегрини ?_V?_?, б₅в₁ і ?_??b?₃ (Podolnikova et al., 2003)_. Інтегрин ?_??b?₃ є характерним для клітин мегакаріоцитарного ряду і попередників кровотворних клітин (Corbel et al., 2005). Інтегрин б₅в₁ зв'язує переважно колаген і фібронектин, зв'язування його з фібриногеном досить спірне (Yang et al., 1999; Ly et al., 2003, 2005). Тому найбільш ймовірним кандидатом в рецептори до фібриногену і фрагментів фібрину на клітинах РС-12 здавався інтегрин ?_V?_?. Експресія саме цього інтегрину, незв'язаного з лігандом, ініціює загибель клітин, що прикріплюються (Stupak et al., 2001). Присутність ?_V?_??інтегрину на клітинах РС-12 було прямо показано нами методом проточної цитофлуориметрії за допомогою антитіл до б_v ланцюга. Антитіла дозозалежно зв'язувалися з клітинами, і їх зв'язування зменшувалося в присутності фібриногену.

Фібриноген може зв'язуватися з інтегрином ?_V?_? через RGD-вмісні послідовності Аб 572-574 бС-домену і Аб 95-97. Послідовність Аб 572-574 відсутня в Х₁ і Х₂-фрагментах та в фібриногені бика, з якими взаємодіяли клітини РС-12. Також вона, як і послідовність Аб 95-97, відсутня в D, DD і Е фрагментах фібрину. В г-ланцюгах D і DD фрагментів показана наявність RGD-залежного комплексного сайту 190-202 і 346-358 (Yokoyama et al., 2000), однак в Е фрагменті подібні послідовності невідомі. Наші дані свідчать за те, що в Е фрагменті також існує RGD-залежний сайт взаємодії з б_vв₃ інтегрином, можливо, меншої афінності, оскільки адгезія клітин РС-12 до Е фрагменту була слабшою, ніж до D. Наявність такого сайту узгоджується з даними Кодами та співавторів (Kodama et al., 2002), які показали, що RGD-залежна міграція клітин гладеньких м'язів судин в фібриновий гель блокувалася D і Е фрагментами фібрин(оген)у і антитілами проти них.

На відміну від розчинних DD, D і Е фрагментів, фрагменти, адсорбовані на поверхні пластику, сприяли проліферації клітин РС-12.

Такий феномен, вірогідно, був зумовлений неможливістю інтерналізації інтегринів при зв'язуванні з іммобілізованими лігандами. Крім того, наявність ліганду виключно на підложці призводила до асиметричного розподілу інтегринів на поверхні клітин, що також впливає на їх сигнальні властивості (Critchley, 2000). Не виключено, що саме такий ефект переважає за фізіологічних умов, коли продукти деградації фібринового згустку зв'язуються на прилеглих тканинах.

Загалом, описані результати свідчать, що клітини нейронального походження активно сприяють руйнації фібринового згустку, а продукти деградації фібрину чинять комплексну і гетерогенну дію на життєдіяльність цих клітин. Також дані роботи пояснюють суперечливі результати в застосуванні фібринових клеїв в нейрохірургії, які, очевидно, зумовлені балансом між об'ємом і густиною фібрину, здатністю нервових клітин гідролізувати його та виживати при контакті з ним.

ВИСНОВКИ

1. Незважаючи на інтенсивне дослідження впливу фібринового матриксу на клітини різного походження, молекулярні основи його взаємодії з нервовими клітинами залишаються мало вивченими. Накопичення позасудинного фібрину пов'язують з загостренням перебігу ряду хвороб нервової системи, проте в нейрохірургічних розробках набувають застосування клеї та біоконструкти на основі фібрину. В дисертаційній роботі теоретично обґрунтовано та експериментально вирішено актуальне наукове завдання - з'ясування впливу фібрину та продуктів його деградації на клітини лінії РС-12, що є визнаною моделлю нервових клітин.

2. В результаті виконання дисертаційної роботи встановлено, що клітини лінії РС-12 сприяють деградації фібринового згустку в культурі шляхом конститутивної секреції тканинного активатора плазміногену. При цьому утворюються високо- і низькомолекулярні фрагменти фібрину, характерні для плазмінового гідролізу.

3. Продукти деградації фібринового згустку впливають на показники життєдіяльності клітин РС-12: сприяють виживанню за несприятливих умов, підвищують рівень б3- і б5-субодиниць нікотинового ацетилхолінового рецептору, збільшують адгезію до підложки.

4. Низькомолекулярні фрагменти фібрину (М.в. 10 - 30 кДа) стимулюють проліферацію та виживання клітин, подовження їх нейритів і підвищення рівня б3- і б5- субодиниць нікотинового ацетилхолінового рецептору .

5. Розчинні високомолекулярні фрагменти фібрину (М.в.>30 кДа), в тому числі очищені D, DD, E фрагменти, сприяють виживанню клітин РС-12, посилюють їх адгезивні властивості, проте гальмують їх проліферацію.

6. Іммобілізовані D, DD і Е фрагменти фібрину сприяють проліферації клітин РС-12.

7. D, DD і Е фрагменти фібрин(оген)у впливають на клітини РС-12 через б_vв₃ інтегрини. Взаємодія з D і DD фрагментами відбувається по RGD-залежному сайту (190-202 і 346-358) в г-ланцюгу, а з Е фрагментом - через невідомий RGD-залежний сайт.

8. Виявлений характер взаємодій фрагментів фібрину і клітин РС-12 дозволяє пояснити позитивний вплив продуктів деградації фібрину на відновлення нервових клітин.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Петрова Ю.І. Клітини РС-12 гідролізують фібриновий згусток шляхом продукції плазміногену та його тканинного активатора / Ю.І. Петрова, О.М. Савчук, О.М. Калашник, Т.М. Платонова, М.В. Скок, С. Седерхольм-Вільямс // Укр. біохім. журн. - 2004. - 76, № 2. - С.64-68.

2. Калашник О.М. Роль продуктів деградації фібринового згустка в регуляції життєвих функцій клітин лінії РС-12 / О.М. Калашник, Ю.І. Петрова, Т.М. Платонова, М.В. Скок, С. Седерхольм-Вільямс // Укр. біохім. журн. - 2005. - 77, № 5. - С. 37-44.

3. Чорна Н.Ю. Рецептори до фрагментів фібрину на нейроендокринних клітинах РС-12 / Н.Ю.Чорна, Ю.І. Петрова, О.М.Калашник, Т.М.Платонова, С. Седерхольм-Вільямс, М.В. Скок. // Біополімери і клітина. - 2008. - 24, № 4. - С. 294-299.

4. Петрова Ю.И. Влияние IL-6 и продуктов деградации фибринового сгустка на дифференцировку клеток РС-12 / Ю.И. Петрова, Е.Н. Калашник, М.В. Скок // ІV научная конференция «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2000», Санкт-Петербург, 23-25 мая 2000 р. : Медицинская иммунология. - т.2, № 2. - 2000. - С. 134-135.

5. Petrova J.I. The effect of IL-6 and fibrin clot degradation products on PC-12 cell differentiation, proliferation and adhesion / J.I. Petrova, E.N. Kalashnik and M.V.Skok // 5^th John Humphrey Advanced Summer Programmer and Lecture Series in Immunology “Immunology in Health and Disease”, September 15-21, 2000.: Abstract Book. - Pushchino, 2000. - P. 72.

6. Petrova J.I. The effect of fibrin clot and the products of its degradation on proliferation, adhesion and differentiation of PC-12 cells / J.I. Petrova, E.N. Kalashnik, N.E. Chorna, T.N. Platonova, M.V. Skok, S. Cederholm-Williams // Advances in molecular mechanisms of neurological disorders: ESN Conf., Perugia, (Italy), May 22-25, 2001. : J. Neurochem. - 2001. - 77, Suppl. 1. - P.51.

7. Petrova Y. The Effect of Fibrin Degradation Products on Neuroendocrine Cells / Petrova Y., Kalashnik O., Chorna N., Platonova T., Cederholm-Williams S. and Skok M // XX^th International Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Sydney, (Australia), August 6-12, 2005. : J. Thromb. Hemost. - V. 3, Suppl. 1. - 2005. - P. 1976.

8. Калашник О.М. Вплив продуктів деградації фібрину на життєві показники клітин РС-12 / О.М. Калашник // Актуальні проблеми біохімії та біотехнології-2005 : конф.-конк. молодих учених, 3-4 червня 2005. : Укр. біохім. журн. - 2005. - 77, № 5. - С.140.

АНОТАЦІЯ

Калашник О.М. Вплив продуктів деградації фібрину на клітини лінії РС-12.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - Біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ - 2008.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу фібринового згустку і продуктів його деградації на клітини лінії РС-12, яка є визнаною моделлю нервових клітин. Встановлено, що внаслідок конститутивної секреції тканинного активатора плазміногену клітини РС-12 руйнують згусток, що приводить до накопичення характерних для плазмінового гідролізу високо- і низькомолекулярних продуктів деградації фібрину, які, в свою чергу, впливають на життєві показники цих клітин. Сумарний гідролізат фібринового згустку сприяє виживанню клітин, їх адгезії до пластику, збільшенню рівня б3- і б5-субодиниць нікотинових ацетилхолінових рецепторів. Низькомолекулярні фрагменти фібрину (М.в. 10-30 кДа) стимулюють проліферацію, виживання, подовження нейритів і збільшення кількості нікотинових рецепторів. Розчинні високомолекулярні фрагменти фібрину (М.в. >30 кДа), в тому числі очищені D, DD, E фрагменти, сприяють виживанню і збільшують адгезивні властивості клітин РС-12, проте гальмують їх проліферацію. Іммобілізовані фрагменти, навпаки, сприяють проліферації. D, DD і Е фрагменти фібрин(оген)у впливають на клітини РС-12 через б_vв₃ інтегрини. Взаємодія з D і DD фрагментами відбувається по RGD-залежному сайту (190-202 і 346-358) в г-ланцюгу, а з Е фрагментом - через невідомий RGD-залежний сайт. Виявлений характер взаємодій фрагментів фібрину і клітин РС-12 дозволяє пояснити позитивний вплив фібрину на відновлення нервових клітин та причину суперечливих результатів при застосуванні фібринових клеїв в нейрохірургії.

Ключові слова: клітини лінії РС-12, тканинний активатор плазміногену, низькомолекулярні фрагменти фібрину, D, DD, Е фрагменти фібрин(оген)у, б_Vв₃ інтегрин.

АННОТАЦИЯ

Калашник Е.Н. Влияние продуктов деградации фибрина на клетки линии РС-12. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - Биохимия. - Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев - 2008.

Повреждение тканей и развитие воспаления сопровождаются образованием внесосудистого фибрина, накопление которого обостряет течение многих заболеваний. В то же время клеи на основе фибрина используются в нейрохирургии для соединения поврежденных нервов, хотя молекулярные механизмы влияния фибрина и его фрагментов на нервные клетки остаются малоизученными. Одной из признанных моделей нервных клеток считается линия РС-12, происходящая из феохромоцитомы крысы и способная дифференцироваться в культуре в клетки, подобные симпатическим нейронам. Задачей представленной работы было изучение взаимодействия клеток РС-12 с фибриновым сгустком и продуктами его деградации.

Инкубация фибрина с клетками РС-12 или их супернатантами приводила к лизису сгустка, в результате чего образовывались высоко- и низкомолекулярные продукты, характерные для плазминового гидролиза фибрина, что было показано SDS-електрофорезом в полиакриламидном геле. Лизис стимулировали также супернатанты клеток, культивированных в отсутствии сгустка, что свидетельствовало о конститутивной продукции клетками РС-12 протеиназ, способствующих разрушению фибрина. Плазминовый тип гидролиза сгустка был подтверждён результатами иммуноблотинга с моноклональными антителами, специфичными к D и DD фрагментам, образующимся при расщеплении фибрина плазмином. Методом энзим-электрофореза, хромогенного и иммуноферментного анализа было показано, что клетки линии РС-12 продуцируют тканевой активатор плазминогена (6Ч10^-7 нг/клетку).

В нескольких тестах было обнаружено, что продукты деградации фибрина, но не сам фибрин влияют на жизненные функции клеток РС-12. По данным включения тиазолила голубого, продукты, образующиеся при лизисе сгустков небольшого объема (до 100 мм³ на мл питательной среды, с оптимумом при 20 мм³), стимулировали пролиферацию клеток РС-12, большего - подавляли. Продукты деградации фибрина способствовали адгезии клеток РС-12 к подложке (адгезивному пластику) и их выживанию при посадке в субоптимальной плотности. При этом также увеличивалось количество б3- и б5-субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора, что считается показателем нейронального дифференцирования клеток РС-12. Такое разнонаправленное и комплексное влияние было обусловлено действием разных по молекулярной массе продуктов гидролиза фибрина, высвобождающихся из сгустка с разной скоростью. Низкомолекулярные фрагменты фибрина с молекулярной массой 10 - 30 кДа, но не очищенный бС-фрагмент, стимулировали пролиферацию клеток, ослабляли их адгезию к подложке и увеличивали экспрессию никотинового рецептора. Низкомолекулярная фракция менее эффективно, чем суммарный гидролизат, поддерживала выживание культуры при посадке в субоптимальной плотности, но, в отличии от суммарного гидролизата, способствовала росту нейритов выживших клеток. Напротив, высокомолекулярные продукты гидролиза, в частности D, DD и Е фрагменты фибрина, не влияли на степень дифференцировки клеток РС-12, но существенно усиливали адгезию этих клеток к пластику и способствовали выживанию культуры. Высокомолекулярные фрагменты, находящиеся в растворе, замедляли деление клеток РС-12, а адсорбированные на поверхности пластика, наоборот, способствовали их пролиферации.