Вплив аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин на регенерацію суглобового хряща

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА “ІНСТИТУТ ТРАВМАТОЛОГІЇ ТА ОРТОПЕДІЇ АКДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ”

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

14.01.21 - травматологія та ортопедія

ВПЛИВ АУТОЛОГІЧНИХ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТОВБУРОВИХ КЛІТИН НА РЕГЕНЕРАЦІЮ СУГЛОБОВОГО ХРЯЩА

ВИКОНАВ ЗАСАДНЮК ІВАН АНДРІЙОВИЧ

Київ - 2009



АНОТАЦІЯ

стовбуровий кістковий суглобовий хрящ

Засаднюк І.А. Вплив аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин на регенерацію суглобового хряща (експериментальне дослідження). Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальностю 14.01.21 - травматологія та ортопедія. ДУ “Інститут травматології та ортопедії АМН України”, Київ, 2009.

Робота присвячена вивченню впливу аутологічних мезенхімальних клітин кісткового мозку з різним ступенем хондрогенного диференціювання на перебіг репаративного хондрогенезу суглобового хряща при його травматичному пошкодженні.

За даними світлової мікрокопії доведено позитивний вплив внутрішньосуглобового введення культури аутологічних мезенхімальних клітин кісткового мозку на репаративний хондрогенез. Аналіз отриманих даних за альтернативною OS шкалою виявив достовірно кращий результат при застосуванні недиференційованої культури аутологічних мезенхімальних клітин (8,6±0,24) у моделі механічного травматичного пошкодження суглобового хряща в порівнянні з культурою аутологічних МСК із попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням (7,6±0,24), (р < 0,05).

Методом мічення аутологічних мезенхімальних клітин кісткового мозку за допомогою флюоресцентних зондів РКН-26 доведено, що дані клітини безпосередньо беруть участь у процесах хондрорепарації при їх внутрішньосуглобовому введені в порожнину суглоба.

Визначено оптимальну щільність посіву та терміни попереднього культивування аутологічних мезенхімальних клітин кісткового мозку для їх нарощування та хондрогенного диференціювання.

На основі проведених біохімічних досліджень доведено, що внутрішньосуглобове введення аутологічних мезенхімальних клітин кісткового мозку на початкових етапах розвитку патологічного процесу стабілізує метаболічні процеси в хрящовій тканині, а в подальшому нормалізує їх, досягаючи фізіологічних норм, які характерні для інтактних тварин.

Практична цінність результатів дослідження полягає в доведенні високої ефективності та експериментальному обґрунтуванні застосування аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку у лікуванні ортопедо-травматологічних хворих із травматичними ушкодженнях суглобового хряща з метою відновлення функції ураженого суглоба та профілактики розвитку посттравматичного остеоартрозу.



1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Проблема відновлення ушкодженого суглобового хряща в сучасній ортопедії залишається актуальною. Частка механічної травматизації суглобового хряща в структурі усіх внутрішньосуглобових ушкоджень доволі значна. За даними різних авторів, під час артроскопічних втручань, травми суглобового хряща зустрічаються у 63-92%, серед яких повношарові ушкодження складають 19,2% (Zanasi S., 2006). Часто ушкодження суглобового хряща поєднуються з травмами інших тканин. Так, наприклад, при ушкодженні зв'язок колінного суглоба суглобовий хрящ страждає в 14-25%, а при ушкодженні менісків - у 30-61% (Curl W., 1997).

Відсутність кровопостачання, лімфатичного дренажа та інервації суглобового хряща, а також складна організація його позаклітинного матриксу, не дозволяють хондроцитам мігрувати до ділянки ушкодження, що зумовлює слабку репаративну реакцію в зоні дефекту (Белогородцев С.Н., 2005).

Консервативні методи лікування ушкоджень суглобового хряща, що існують на сьогоднішній день, спрямовані на зменшення больового синдрому, ліквідацію запалення, оптимізацію обміну в хрящовій тканині, відновлення фізико-хімічного складу синовіальної рідини, однак дія їх короткочасна і на якість регенерації хряща вони суттєво не впливають.

При механічних ушкодженнях суглобового хряща застосовують інвазивні способи лікування, які розподіляються на оперативні втручання на осередку ураження без заміщення дефекту хряща та часткову хондропластику. До перших відносяться абразивна артропластика та остеоперфорація. Однак тканина, яка утворюється при використанні даних методів, має характер волокнистого хряща. Перспективною методикою є мозаїчна кістково-хрящова аутопластика, яка дозволяє відновити гіаліновий хрящ, однак вона може застосовуватися лише при невеликих обмежених травматичних дефектах та відсутності в тканинах суглоба загальних дегенеративно-дистрофічних змін (Зазірний І. М., 2003). Інші артропластичні втручання розрізняються між собою за видом застосованих алогенних тканин (демінералізовані кістково-хрящові тканини, реберна надхрящниця, меніск тощо). Але результати їх використання далекі від бажаного, оскільки у віддаленні строки, як правило, дефекти суглобової поверхні зберігаються або заповнюються волокнистою тканиною (Поляков В. Ю., 2000).

Останнім часом у світі для відновлення суглобового хряща і усунення його дефекту все більшої популярності набувають методи клітинної та тканинної імплантації. Джерелом одержання хондроцитів можуть служити як хондроцити із власне хрящової тканини, так і отримані шляхом культивування клітин попередників різного ступеня зрілості (ембріональні стовбурові клітини, фетальні тканини, стовбурові клітини плаценти, періостальні прогеніторні клітини та ін.). Cеред біотехнологічних методів найбільшого розповсюдження набула методика аутологічної трансплантації хондроцитів. Однак, дана методика може використовуватися лише за умови відсутності в суглобі дегенеративних змін. Також, рядом досліджень доведено, що при оцінці віддалених результатів ця методика не має переваг перед іншими артропластичними втручаннями, зокрема мозаїчною хондропластикою (Brittberg M., 1994, Wasiak J, 2006).

Більш перспективним матеріалом для імплантації хряща, на думку багатьох вчених, є стовбурові мезенхімальні клітини пацієнта, які можуть отримуватися із спонгіозної кісткової тканини. На даний час у світі вивчається не лише застосування цих клітин для відновлення травмованого хряща, але й для лікування остеоартрозу. Однак, потенційні можливості стовбурових мезенхімальних клітин у регенерації суглобового хряща, їх безпечність та ефективність потребують подальших досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана згідно з планом науково-дослідної роботи ДУ "Інститут травматології та ортопедії АМН України" на тему "Розробити систему діагностики, лікування та профілактики посттравматичного остеоартрозу колінного суглоба у спортсменів" (№ держреєстрації 0108U000064).

Мета дослідження - вивичити вплив аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин (МСК) кісткового мозку на регенерацію суглобового хряща при його травматичному пошкодженні.

Завдання дослідження:

1. Визначити особливості виділення, культивування та направленого хондрогенного диференціювання МСК кісткового мозку.

2. Вивчити в експерименті на моделі механічного ушкодження суглобового хряща колінного суглоба перебіг репаративного хондрогенезу.

3. Дослідити в експерименті на моделі механічного ушкодження суглобового хряща колінного суглоба перебіг репаративного хондрогенезу в умовах введення культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку.

4. Дослідити в експерименті на моделі механічного ушкодження суглобового хряща колінного суглоба перебіг репаративного хондрогенезу в умовах введення культури аутологічних МСК кісткового мозку з попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням.

5. Провести порівняльну оцінку результатів перебігу репаративного хондрогенезу при введенні культур аутологічних МСК кісткового мозку з різним ступенем хондрогенного диференціювання.

6. Вивчити метаболічні процеси колагену і протеогліканів при травматичному ушкодженні суглобового хряща та оцінити вплив аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку на дані процеси.

7. Підвердити в експерименті, що саме імплантовані аутологічні МСК кісткового мозку беруть участь у репаративному хондрогенезі при механічному ушкодженні суглобового хряща.

Об'єкт дослідження - змодельований травматичний дефект суглобового хряща колінних суглобів кролів.

Предмет дослідження - перебіг репаративного процесу в травматичному дефекті суглобового хряща при застосуванні культури аутологічних МСК кісткового мозку із різним ступенем хондрогенного диференціювання.

Методи дослідження - у роботі використовувалися методи світлової та флюоресцентної мікроскопії, а також біохімічні та статистичні методи дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. У результаті проведеного нами експериментального дослідження:

– встановлена пряма залежність колонієутворюючої активності аутологічних МСК кісткового мозку від щільності їх посіву та строку попереднього культивування на хондрогенний потенціал аутологічних МСК кісткового мозку;

- доведено в експерименті, що внутрішньосуглобове введення недиференційованої культури аутологічних МСК кісткового мозку позитивно впливає на перебіг репаративного хондрогенезу при механічному травматичному ушкодженні суглобового хряща, а саме призводить до формування в ділянці дефекту гіаліноподібної тканини, яка повністю заповнює травматичний дефект при обмежених або відсутніх дистрофічних і некротичних змінах у суглобовому хрящі;

- відмічено, що попередньо спрямоване хондрогенне диференціювання культури аутологічних МСК кісткового мозку у порівнянні із недиференційованою культурою не сприяє оптимізації перебігу репаративного хондрогенезу, адже в ділянці дефекту суглобового хряща формується гіаліноподібна тканина з явищами її гіперплазії на фоні явищ дистрофії, некрозу та осередкової проліферації хондроцитів по краях дефекту;

- встановлено, що внутрішньосуглобове введення аутологічних МСК при травматичному пошкодженні суглобового хряща на початкових етапах розвитку патологічного процесу стабілізує метаболічні процеси в хрящовій тканині, а в подальшому нормалізує їх, досягаючи фізіологічних норм, які характерні для інтактних тварин;

- доведено, що саме імплантовані аутологічні МСК кісткового мозку безпосередньо беруть участь у репаративному хондрогенезі при механічному травматичному ушкодженні суглобового хряща.

Практичне значення одержаних результатів. Проведені експериментальні дослідження та отримані дані свідчать про позитивний вплив аутологічних МСК кісткового мозку на репаративний хондрогенез при травматичному пошкодженні суглобового хряща. Це дає підстави пропонувати застосування аутологічних МСК кісткового мозку у лікуванні хворих із травматичними ушкодженнях суглобового хряща з метою відновлення функції ураженого суглоба та профілактики розвитку посттравматичного остеоартрозу.

Особистий внесок здобувача. Автором визначені вибір наукового напрямку, мети та завдань дослідження. Дисертант провів інформаційно-патентний пошук, аналіз спеціальної літератури з досліджуваної проблеми, вибрав об'єкт дослідження та детермінував групу експериментальних тварин, самостійно виконав експериментальну частину досліджень, брав участь у підготовці та описанні препаратів для гістоморфологічних досліджень. Самостійно провів статистичний аналіз даних експериментального дослідження, опублікував 9 наукових робіт у співавторстві. У даних роботах участь здобувача полягала у бібліографічному пошуку, експериментальних дослідженнях та статистичних обчисленнях.

Апробація результатів дослідження. Матеріали дисертаційної роботи заслухані на: XIV з'їзді ортопедів- травматологів України (Одеса, 2006); ІІІ Всеросійському симпозіумі з міжнародною участю “Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии” (Москва, 2007); ІІ Всеукраїнській школі з міжнародною участю “Фізіологія та морфологія тканин опорно-рухової системи в нормі і при ішемічних ушкодженнях” (Київ-Черкаси, 2007); науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні питання діагностики і лікування пошкоджень і захворювань колінного суглоба у спортсменів ” (Алушта, 2007); Науково-практичній конференції з міжнародною участю “Новітні технології в спеціалізованій медичній допомозі” (Київ, 2007); IV з'їзді трансплантологів України (Київ, 2007), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної артрології ” (Київ, 2008) та науково-практичних конференціях ДУ “Інститут травматології та ортопедії АМН України” (Київ, 2008).

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження виконані на базі віварію Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (м. Харків), відділу патоморфології з експериментально-біологічним відділенням та відділу спортивної та балетної травми ДУ “Інститут травматології та ортопедії” (м. Київ).

Робота виконана на 30 дорослих кролях-самцях масою 3000 ± 250 г. У всіх тварин під кетаміновим наркозом в умовах операційної парапателярно розтинали суглобову капсулу колінного суглоба та скальпелем у фронтальній площині по надколінковій поверхні стегнової кістки наносили, з використанням шаблону, стандартне, повношарове пошкодження суглобового хряща розміром 6 на 3 мм із збереженням цілісності підхрящової кісткової пластинки. Після цього рану промивали водним розчином хлоргексидину та пошарово зашивали м'які тканини. Усі маніпуляції з тваринами проводили згідно з міжнародними правилами про гуманне відношення до тварин (ETS 123, 1986).

Усі тварини до початку та в процесі дослідження знаходились в умовах віварію на звичайному харчовому раціоні. Утримання та харчування тварин здійснювали відповідно з "Санітарними правилами створення, обладнання та утримання експериментально-біологічних клінік (віваріїв)" від 06.04.1973 р. та доповнень від 04.12.1978 р. до Наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.1966 р. "Про добові норми харчування тварин та продуценти". У період акліматизації (два тижні) і під час експерименту тварини знаходились у віварії при температурі 18 - 22 °С, вологості 50 - 60 %, природному світловому режимі "день - ніч". Підбір тварин та формування груп проводили за методом випадкових чисел.

На лабораторних тваринах проведено два дослідження. У першому дослідженні вивчали перебіг репаративного хондрогенезу у травматичному дефекті суглобового хряща після введення культури аутологічних МСК кісткового мозку з різним ступенем хондрогенного диференціювання. Тварин розділили на три серії по п'ять тварин у кожній серії.

Тваринам першої серії (5 тварин) на 3 день після травмування суглобового хряща в порожнину оперованого колінного суглоба вводили по 0,25 мл сольового фізіологічного розчину (плацебо).

Тваринам другої серії (5 тварин) на 3 день вводили по 10⁶ аутологічних МСК кісткового мозку.

Тваринам третьої серії (5 тварин) на 3 день вводили по 10⁶ аутологічних МСК кісткового мозку із попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням.

Джерелом мезенхімальних стовбурових клітин була кісткова спонгіозна тканина, яка механічним шляхом забиралася з клубової кістки у вигляді фрагментів діаметром 3 - 4 мм за допомогою кісткових кусачок. Культивування та хондрогенне диференціювання аутологічних МСК кісткового мозку здійснювали за загально прийнятою методикою.

Ядровмісні клітини виділяли в градієнті щільності фікола, ресуспендували в 20 мл культурального середовища. Ядерні клітини підраховували в камері Горяєва з використанням 3% оцтової кислоти та висівали в культуральний посуд площею 180 см². Використовували середовище наступного складу: альфа-МЕМ, доповненої 15% ембріональною сироваткою великої рогатої худоби, 2 мМ L-глутаміна, 50 од/мл пеніциліну та 50 мг/мл стрептоміцину. Після 24-годинної інкубації при температурі 37^_С с 5% СО₂ не прикріплені клітини видаляли, прикріплені двічі відмивали фосфатно-сольовим буфером та культивували на протязі 4-11 днів. Першу заміну середовища виконували через 48 год. культивування і далі - через кожні 3 доби. Після досягнення конфлюенту клітини знімали 0,25% розчином трипсину та 1 мМ розчином ЕДТА на протязі 5 хв при температурі 37^_С та знову висівали в культуральні флакони в концентрації 3-50 клітин/см² та здійснювали подальше культивування.

Для хондрогенного диференціювання використовували наступний метод: мезенхімальні стовбурові клітини у кількості до 200 000 поміщали в 15 мл пропіленову пробірку та осаджували за допомогою центрифугування при 450 g на протязі 10 хв. Осадженні клітини культивувалися 21 день в хондрогенному середовищі Дюльбекко МЕМ з високим вмістом (25 мМ) глюкози, 10 нг/мл трансформуючого ростового фактора beta (TGF-в), 10^-7 М дексаметазона, 50 мг/мл аскорбат-2-фосфату, 40 мг/мл проліну, 100 мг/мл пірувату у безсироватковому середовищі.

У другому дослідженні вивчали механізм впливу культури недиференційованих аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку на процеси регенерації суглобового хряща. Для цього проводили їх мічення червоним флюоресцентним зондом РКН-26 (Sigma, США) та вводили на 3-й день після нанесення дефекту в порожнину травмованого суглоба 15 тваринам.

Для цього мезенхімальні стовбурові клітини знімали 0,25% розчином трипсину та 1мМ розчином ЭДТА протягом 5 хвилин при температурі 37^_С, триразово відмивали у середовищі без сироватки та ресуспендували у середовищі у відношенні 1:2. Потім змішували з рівним обґємом розчина РКН-26 (Sigma) та витримували 5 хвилин при кімнатній температурі. Для зупинки реакції застосовували середовище з вмістом сироватки. Після інгібіції реакції клітини знову відмивали від фарбника триразовим центрифугуванням. Відмиті та ресуспендовані клітини застосовували для введення у місце пошкодження.

За всіма тваринами проводили клінічне спостереження. Із досліду кролів першої - третьої серій виводили шляхом застосування летальних доз ефіру для наркозу в строки 45 діб після травми. Тварин, яким імплантували мічені мезенхімальні стовбурові клітини, виводили із досліду через 7, 14 та 21 добу після введення клітин.

Для морфологічного дослідження брали колінний суглоб. Після фіксації в 10% розчині формаліну проводили декальцинацію препаратів у 8% розчині азотної кислоти, зневоднювали та знежирювали в ацетонах і спиртах наростаючої міцності. Шматочки заливали в целоїдин та отримували в горизонтальній площині гістологічні зрізи, які фарбували гематоксиліном та еозином, а також пікрофуксином за ван Гізоном.

Якість репаративних процесів в ділянці дефекту оцінювали, враховуючи поверхневу будову регенерату, морфологію новоутвореної тканини, структури її матриксу, характер та життєздатність хондроцитів, стан кальцифікованої зони хряща та підхрящевої кісткової пластинки, наявність зон вторинної осифікації та кровоносних судин.

Для оцінки використовували альтернативну OS шкалу (Roberts S., 2006) та ICRS шкалу (Mainil-Varlet Р., 2003).

Використовуючи альтернативну OS шкалу, якість регенерату вважали дуже поганою при отриманні сумарного балу - 0 та оптимальною при сумарно отриманому балі - 10. Чотирибальна ІCRS шкала використовується для оцінки кожного показника індивідуально.

Вираженість дегенеративно-дистрофічного процесу в колінному суглобі оцінювали за якістю та поширеністю прояву патологічних змін структури з боку суглобового хряща. За основу взята модифікована схема оцінки, яка запропонована методичними рекомендаціями з експериментальних досліджень та клінічного вивчення протиартрозних (хондромоделюючих) лікарських засобів, затверджених Фармкомітетом МОЗ України, та Yoshioka M. et al., а саме: зміна форми та зменшення кількості хондроцитів суглобового хряща (дистрофія, некроз); вогнищева проліферація хондроцитів; дезорганізація, ерозія, розволокнення та поява тріщин у суглобовому хрящі; оголення підхрящової кісткової пластинки та зміни з боку субхондріальної кістки; розповсюдженість патологічних змін з боку суглобового хряща.

Запропонована чотирибальна система оцінки ступеня ураження, в основу якої покладено розповсюдженість відносно місця травми (мм) та тяжкість проявлення (+, ++, +++, ++++) визначених критеріїв патологічних змін з боку суглобового хряща медіальніше та латеральніше від нанесеного пошкодження: І ступінь - розповсюдженість обмежена краями пошкодження (до 0,5 мм) та тяжкість проявлення +, II ступінь - від 0,6 до 1 мм та тяжкість проявлення ++, III ступінь - розповсюдженість від 1 до 2 мм та тяжкість проявлення +++ і IV ступінь - розповсюдженість патологічних змін понад 2 мм та тяжкість їх прояву ++++.

Для відслідковування мічених PKH-26 клітин готували зрізи на кріостаті та застосовували флюоресцентну мікроскопію.

Для вивчення впливу аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку при травматичних пошкодженнях суглобового хряща, в сироватці крові експериментальних тварин визначали наступні біохімічні показники: активність колагенази, фракції гідроксипроліну та глікозаміногліканів. При вивченні цих показників використовували наступні методи: активність колагенази визначали за методом Lindy S., Halme J. Вміст глікозаміногліканів (г/л) в сироватці крові визначали за методом Кляцкіна С.А. та Ліфшіц Р.І. Фракції гідроксипроліна, мкмоль/л, виділяли по Frey S., а гідроксипролін в них визначали за Stegemann H.

Для аналізу отриманих даних та виявлення вірогідних змін показників, що були отримані при застосуванні вищевказаних методів, застосовували статистичний аналіз за допомогою комп'ютерних програм “Microsoft Excel” та “Statistica 5” з використанням параметричних критеріїв. Результати представленні у вигляді середніх та їх помилок (M±m). Відмінності вважали вірогідними при t > 2 та р < 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На сьогоднішній день відомі методи забору аспірату кісткового мозку та культивування в умовах, при яких МСК зберігають здатність до диференціювання в остеобласти, адіпоцити, хондроцити, міоцити та ранні прогенітори нервових клітин. Однак нерідко при культивуванні в стандартних умовах ці клітини втрачають свою проліферативну здатність. Раніше було замічено, що клітини проліферують швидше та максимально зберігають мультипотентність, якщо вони проходять через посів із низькою щільністю.

Із цих спостережень та даних попередніх досліджень випливає, що в експериментальних та практичних цілях необхідно враховувати велику кількість варіацій та параметрів. У наших експериментах ми досліджували деякі із цих факторів культивування та хондрогенного диференціювання аутологічних МСК кісткового мозку та визначили ряд умов отримання клітинних препаратів аутологічних МСК кісткового мозку.

Для визначення впливу щільності посіву на ріст аутологічних МСК кісткового мозку в культурі, вони були посіяні із щільністю 10, 50, 100 та 1000 клітин/см² на культуральний посуд площею 60 см². При цьому було виявлено, що первинна щільність посіву 50 клітин/см², є оптимальною для нарощування необхідної маси клітин в експерименті, та дозволяє зберегти максимальний колонієутворюючий потенціал (здатність формувати колонії із однієї клітини).

Також було доведено, що культура із 7-денною попередньою інкубацією МСК у стандартному середовищі з наступним культивуванням у хондрогенному середовищі має найбільший хондрогенний потенціал, який проявлявся формуванням агрегатів хрящових клітин із найбільшою масою. Хондрогенне диференціювання було підтверджено наявністю протеогліканів у матриксі конгломератів клітин шляхом фарбування толуідіновим блакитним (Fluka). Також виявили маркер хондрогенного диференціювання - колаген ІІ типу, для чого використовували непряму імунофлюоресценцію із застосуванням первинних антитіл (Chemicon MAB 6b3) у розведенні 1:200 та вторинних антитіл, кон'югованих з флюоресцентною міткою FITC (Dako, rabbit anti-mouse FITC-conjugated.

Експериментально-морфологічне дослідження впливу введення в порожнину колінного суглоба культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку на репаративний хондрогенез проведено на другій серії тварин. Вивчення впливу культури аутологічних МСК кісткового мозку з попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням проведено на третій серії тварин. Отримані дані порівнювали з даними контрольних спостережень за тваринами, яким внутрішньосуглобово вводили за такою самою схемою та кількістю сольовий фізіологічний розчин (перша серія тварин).

Морфологічні зміни у суглобі вивчали через 45 діб після нанесення механічної травми колінного суглоба.

У тварин першої серії у дефекті суглобового хряща виявили фіброзну тканину з ділянками дистрофії та некрозу. У навколишньому суглобовому хрящі спостерігали прояви дегенеративно-дистрофічного процесу.

У тварин другої серії виявили формування в ділянці дефекту гіаліноподібної тканини, яка повністю заповнювала травматичний дефект, при обмежених або відсутніх дистрофічних і некротичних змінах у навколишньому суглобовому хрящі.

У тварин третьої серії в ділянці дефекту суглобового хряща спостерігали формування гіаліноподібної тканини з явищами її гіперплазії на фоні явищ дистрофії, некрозу та осередкової проліферації хондроцитів по краях дефекту;

Якість репаративних процесів у місці дефекту оцінювали враховуючи поверхневу будову регенерату, морфологію новоутвореної тканини, структури її матриксу, характер та життєздатність хондроцитів, стан кальцифікованої зони хряща та підхрящової кісткової пластинки, наявність зон вторинної осифікації та кровоносних судин.

Використовуючи альтернативну OS шкалу, якість регенерату вважали дуже поганою при отриманні сумарного балу - 0 та оптимальною при сумарно отриманому балі - 10.

За альтернативною OS шкалою якість регенерату в контрольній серії склала 1,2±0,12, при використанні культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку - 8.6±0,24, а в серії із застосуванням культури аутологічних МСК кісткового мозку із попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням - 7,6±0,24 (M±m). Отримані дані свідчать про позитивний вплив застосування культури аутологічних МСК кісткового мозку на процеси хондрорепарації, причому якість регенерату була кращою в другій серії тварин, яким вводили культуру недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку (t > 3, p < 0,01).

Використовуючи альтернативну ICRS шкалу, оцінювали кожний показник індивідуально за чотирибальною системою. Результати оцінки наведені в таблиці 1.

Таблиця 1. Оцінка якості регенерату за шкалою ICRS

Серії тварин	Критерії оцінки
	Поверхня регенерату	Матрикс регенерату	Життєздатність клітин
	М	m	p	M	m	p	M	m	p
І	1	0	p1<0,001	1	0	p1<0,001	1,4	0,24	p1<0,001
ІІ	3	0	p2<0,001	3,2	0,2	p2<0,001	3,6	0,4	p2<0,001
ІІІ	3,4	0,6	p3<0,01	3	0	p3<0,001	3,2	0,49	p3<0,05
	Розміщення клітин	Субхондральна кістка	Зони мінералізації
І	1	0	p1<0,001	2,6	0,87	p1<0,05	1,6	0,6	p1<0,01
ІІ	2	0	p2<0,001	4	0	p2<0,05	4	0	p2<0,01
ІІІ	1,8	0,2	p3<0,01	3,4	0,6	p3<0,01	3,4	0,6	p3<0,01

І - контрольна серія дослідження;

ІІ - серія дослідження із застосуванням культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку;

ІІІ - серія дослідження із застосуванням культури аутологічних МСК кісткового мозку із попереднім спрямованим хондрогенним диференціюванням.

Отримані дані також свідчать про позитивний вплив застосування культури аутологічних МСК кісткового мозку на процеси хондрорепарації, причому якість за кожним показником була кращою у серії тварин, яким вводили культуру недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку.

У контрольних тварин, яким після нанесення стандартного ушкодження в колінний суглоб вводили 0,25 мл фізіологічного розчину через 45 діб після травми сумарний показник оцінки розвитку дегенеративно-дистрофічного процесу в суглобовому хрящі стегнової кістки дорівнював 8,2±0,58 балів.

У тварин, яким після аналогічної стандартної травми надколінкової поверхні стегнової кістки в колінний суглоб вводили 0,25 мл суспензії недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку (друга серія) та аутологічних МСК кісткового мозку з попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням (третя серія) прояви дегенеративно-дистрофічного процесу були значно меншими та були обмежені переважно зоною дефекту. Ці зміни відповідно дорівнювали 2,9±0,15 та 5,15±0,30 (р < 0,05).

Наведені дані свідчать, що застосування культури аутологічних МСК кісткового мозку після свіжої травми суглобового хряща без ушкодження підхрящової кісткової пластини не тільки сприяє перебігу репаративного хондрогенезу в дефекті, але й, у значній мірі, гальмує розвиток дистрофічних та некротичних змін з боку суглобового хряща стегнової кістки, на якій отримували травматичне ушкодження.

Механізм цього позитивного впливу культури аутологічних МСК кісткового мозку на суглобовий хрящ можна пов'язати не тільки із загальнобіологічною дією на тканини суглоба, але й з біомеханічним ефектом. Оскільки, більш повноцінне відновлення цілісності та структури суглобового хряща покращує його функцію в результаті відновлення конгруентності суглобових поверхонь.

Експериментально-морфологічне визначення участі недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку в репаративному хондрогенезі проведено на 15-ти лабораторних тваринах за допомогою мічення in vitro аутологічних МСК кісткового мозку червоним флюоресцентним зондом РКН-26. У тварин, яким були трансплантовані мічені аутологічні МСК, у всіх випадках на зрізах за допомогою флюорисцентної мікроскопії виявляли їх присутність. На 7-й день клітини були розташовані дифузно, без помітних скупчень. На 14 день мічені клітини, що флюоресцювали в червоній зоні спектру, створювали компактні конгломерати переважно біля зони дефекту. На 21 день мічені клітини вдалося виявити лише в зоні регенерату.

Отримані дані свідчать про безпосередню участь аутологічних МСК у процесах хондрорепарації при їх екзогенному введені в порожнину суглоба.

Аналіз біохімічних показників, отриманих при динамічному дослідженні сироватки крові експериментальних тварин із травмою хрящової тканини колінного суглоба, виявив, що активність колагенази в 1-й серії тварин на 7-му добу після початку досліду досягає 1,80±0,10 мкмоль/л•год, при нормі 1,52±0,16 мкмоль/л•год, в процентному відношенні до норми це склало 118%. В ці ж терміни спостереження концентрація вільної фракції гідроксипроліну (ВФ ГП), біохімічного маркера розпаду колагенази, залишається в межах нормальних величин із тенденцією до зростання (101% по відношенню до норми). Вміст білковозв'язаної фракції гідроксипроліну (БЗФ ГП), біохімічного маркера синтезу колагена, дещо зростає, сягаючи 104% відносно норми, що свідчить про посилення синтезу колагена. Показники глікозаміногліканів (ГАГ) також зростають відносно норми, складаючи 111%, що підтверджує перевагу розпаду протеогліканів в ці терміни спостереження. На 14-у добу спостереження активність колагенази продовжує зростати і досягає 2,10±0,30 мкмоль/л•год або 138% по відношенню до норми. В ці ж терміни спостереження, вміст ВФ ГП залишається на рівні 7-ї доби, тобто в межах нормальних величин. Концентрація БЗФ ГП дещо знижена і складає 97% від норми. Концентрація ГАГ продовжує зростати, сягаючи 119 % відносно норми. На 21-у добу після початку досліду у цієї ж групи тварин, активність колагенази досягає 2,40±0,20 мкмоль/л•год, що склало 158% по відношенню до норми. Поряд із зростанням активності фермента збільшується концентрація ВФ ГП до 12,40±0,20 мкмоль/л, що склало 107% від норми. Вміст БЗФ ГП знижується до 86 % відносно нормальних показників. Концентрація ГАГ, навпаки, зростає до 0,071±0,001 г/л, що склало 125% від норми. Дані отримані при дослідженні сироватки крові на 28 добу дослідження, виявили подальше збільшення активності колагенази до 164% відносно норми.

Також збільшується вміст ВФ ГП до 110%. При цьому знижується вміст БЗФ ГП до 72 %. Концентрація ГАГ дещо знижується (121%) відносно показників попереднього терміну дослідження, але залишається високою відносно норми. На 35-у добу спостереження у цієї групи тварин показники активності колагенази дещо знижуються відносно показників 21-ї доби, але по відношенню до фізіологічних норм залишаються високими, досягаючи 158%. Вміст ВФ ГП дещо зростає і становить 117%. Концентрація БЗФ ГП також зростає до 80 % відносно норми. Вміст ГАГ продовжує зростати і складає 126% по відношенню до фізіологічної норми. Аналіз даних, отриманих на 35-у добу спостереження, виявив, що метаболічні порушення продовжують посилюватися у цієї серії тварин і відповідно підсилюється патологічний процесс. На 42-у добу спостереження показники активності колагенази, вміст фракцій ГП і ГАГ залишаються на рівні 35-ї доби (табл. 2).

Таблиця 2. Біохімічні показники експериментальних тварин 1 серії

Досліджувані показники	Терміни дослідження, доба
	7	14	21	28	35	42
Колаген аза, мкмоль/л•год	1,8±0,1	2,1±0,3	2,4±0,2	2,5±0,1	2,4±0,2	2,6±0,3
ВФ ГП, мкмоль/л	11,7±0,3	11,9±0,0,4	12,4±0,2	12,8±0,3	13,6±0,4	13,8±0,4
БЗФ ГП, мкмоль/л	10,6±0,6	9,8±0,2	8,7±0,3	7,3±0,2	8,1±0,4	7,2±0,5
ГАГ , г/л	0,063±0,003	0,068±0,003	0,71±0,001	0,069±0,004	0,072±0,002	0,071±0,003

Таким чином, можна стверджувати, що метаболічні порушення в органічній основі кістково-хрящової тканини у 1-ї серії тварин, сягаючи піка на 35-у добу від початку досліду і залишаються на цьому рівні і в наступні терміни дослідження.

Дані, отримані при дослідженні сироватки крові експериментальних тварин 2-ї серії, виявили, що на 7-у добу спостереження активність колагенази дещо перевищує фізіологічну норму, досягаючи 112%. Вміст фракцій ГП як вільної, так і білковозв?язанної залишаються в межах норми, які характерні для інтактних тварин. Концентрація ГАГ також залишається в межах норми. На 14-у добу спостереження всі показники (активність колагенази, фракції ГП і ГАГ) залишаються на рівні нормальних величин. Через 21-у добу після початку досліду нами не було виявлено будь-яких відхилень від фізіологічних норм, як в активності колагенази, в показниках вмісту фракцій ГП, так і в концентрації ГАГ. Дані, отримані при дослідженні сироватки крові у цієї серії тварин на 28-у добу спостереження, також підтвердили, що яких-небудь відхилень від фізіологічної норми, яка характерна для інтактних тварин, не спостерігається. Так, активність колагенази склала 1,63±0,10 мкмоль/л•год при нормі 1,52±0,16 мкмоль/л•год, вміст ВФ ГП склав 11,50±0,30 мкмоль/л (норма 11,63±0,28), білковозв?язанної фракції - 10,30±0,20 мкмоль/л (норма 10,14±0,55). Вміст ГАГ склав 0,058±0,003 г/л при нормі 0,057±0,003 г/л. На 35-у добу спостереження всі показники залишаються на рівні 28-ї доби дослідження, тобто в межах нормальних величин, за виключенням активності колагенази, яка дещо вище норми - 107%. При дослідженні сироватки крові експериментальних тварин на 42-у добу після початку досліду всі показники були аналогічні показникам на 35-у добу і відповідали фізіологічній нормі, яка характерна для інтактних тварин (табл. 3).

Таблиця 3. Біохімічні показники експериментальних тварин 2 серії

Досліджувані показники	Терміни дослідження (доба)
	7	14	21	28	35	42
Колагеназа, мкмоль/л•год	1,7±0,2	1,6±0,2	1,56±0,1	1,63±0,1	1,50±0,3	1,54±0,1
ВФ ГП, мкмоль/л	11,7±0,02	11,4±0,3	11,68±0,1	11,5±0,3	11,8±0,04	11,63±0,1
БЗФ ГП, мкмоль/л	10,8±0,5	9,7±0,1	10,3±0,3	10,3±0,2	10,2±0,3	10,5±0,2
ГАГ, г/л	0,059±0,001	0,064±0,002	0,578±0,003	0,057±0,003	0,056±0,001	0,054±0,004

Метаболічні порушення, які виникають в органічних компонентах при травматичному ушкодженні суглобового хряща, стабілізуються під дією недиференційованих стовбурових клітин цієї серії експериментальних тварин. На початкових етапах розвитку патології, показники, що вивчаються, дещо відхилені від норми, а в подальшому в усі строки дослідження показники основного білку кістково-хрящової тканини - колагена, а також глікозаміноглікани стабілізуються, досягаючи фізіологічної норми, яка характерна для інтактних тварин.

Дані, отримані при дослідженні сироватки крові 3-ї серії експериментальних тварин, свідчать про те, що активність колагенази на 7-у добу спостереження залишається на рівні нормальних величин з тенденцією до зростання (107% відносно норми). Показники фракцій ГП і ГАГ також знаходяться в межах норми.

На 14-у добу спостереження всі показники залишаються в межах нормальних величин, за виключенням активності колагенази, яка досягає 117% або 1,78±0,10 мкмоль/л•год (норма 1,52±0,16 мкмоль/л•год). На 21-у добу після початку досліду, досліджувані показники, також як і в попередні строки спостереження, залишаються без особливих відхилень від нормальних величин, за виключенням активності колагенази, яка продовжує зростати і досягає 131% відносно норми. Треба відмітити, що концентрація ГАГ зростає до 112% відносно норми. На 28-у добу спостереження показники залишаються на рівні попереднього строку дослідження з невеликими коливаннями. Активність колагенази знижується від 131% до 125% відносно норми. Такі ж показники активності колагенази, вмісту фракцій ГП були отримані при дослідженні сироватки крові експериментальних тварин на 35-у добу після початку досліду. Треба відмітити, що концентрація ГАГ зростає від 105% до 116% відносно фізіологічної норми. Аналогічні зміни були виявлені і при дослідженні на 42-у добу спостереження: активність колагенази зростає до 138%, вміст БЗФ ГП дещо знижується - до 88%, концентрація ГАГ досягає 121% відносно норми (табл. 4).

Таблиця 4. Біохімічні показники експериментальних тварин 3 серії

Досліджувані показники	Терміни дослідження (доба)
	7	14	21	28	35	42
Колагеназа, мкмоль/л•год	1,63±0,13	1,78±0,1	2,0±0,3	1,9±0,2	2,0±0,1	2,1±0,2
ВФ ГП, мкмоль/л	11,9±0,1	12,4±0,3	12,8±0,1	12,9±0,2	12,8±0,1	12,9±0,2
БЗФ ГП, мкмоль/л	10,2±0,5	9,8±0,4	10,0±0,5	9,7±0.5	9,4±0,3	8,9±0,2
ГАГ, г/л	0,058±0,001	0,061±0,002	0,064±0,003	0,060±0,002	0,066±0,003	0,069±0,002

Аналіз отриманих даних при динамічному дослідженні сироватки крові експериментальних тварин 3-ї серії свідчить про те, що метаболічні порушення, які розвиваються при травматичному ушкодженні суглобового хряща, стабілізуються під впливом аутологічних МСК кісткового мозку із поперднім спрямованим хондрогенним диференціюваннням. Це підтверджується при порівнянні біохімічних показників 1-ї та 3-ї серій експерименту.

Дані, які отримали при динамічному дослідженні сироватки крові експериментальних тварин з моделлю травматичного ушкодження суглобового хряща, показують порушення метаболізму основних органічних компонентів хрящової тканини. Ці порушення проявляються у зростанні активності одного із ключових ферментів у метаболізмі колагену - колагенази, з одночасним збільшенням вмісту ВФ ГП (біохімічного маркера катаболізма колагена) та зниженням БЗФ ГП (біохімічного маркера синтезу колагена).

Поряд з патобіохімічними змінами в колагені порушується і метаболізм протеоглікана - одного з важливих компонентів хрящової тканини, який визначає фізіологічні і біохімічні властивості тканини.

Застосування аутологічних МСК для відновлення пошкоджених ділянок хрящової тканини у експериментальних тварин виявило інгібуючий ефект катаболічної фази метаболізму органічних компонентів хрящової тканини. Особливо цей ефект проявився у тварин 2-ї серії, де застосовували недиференційовані аутологічні МСК. Вже на 7-у добу спостереження виявлено стабілізацію метаболічних показників, а на 14-у добу вони досягають фізіологічних нормальних величин і на цьому рівні залишаються в усі наступні строки дослідження.

У тварин 3-ї серії зміни в метаболічних показниках більш виражені, ніж у тварин 2-ї серії, але менш виражені в порівнянні з показниками 1-ї серії. Це свідчить про те, що диференційовані аутологічні МСК виявляють дію на метаболічні процеси колагену і протеогліканів. Але ці дії менше виражені порівняно з 2-ю серією тварин, яким були підсаджені недиференційовані стовбурові клітини.



ВИСНОВКИ

1. Для нарощування маси клітин у культурі щільність посіву 50 клітин/см² є оптимальною. Найкращий хондрогенний потенціал проявляється в культурі із 7-денною преінкубацією в стандартному середовищі.

2. Після механічного ушкодження при збереженій підхрящовій кістковій пластинці у дефекті суглобового хряща формується фіброзна тканина з ділянками дистрофії та некрозу. У навколишньому суглобовому хрящі також виникають прояви дегенеративно-дистрофічного процесу, які можна кваліфікувати як типову картину початку розвитку післятравматичного остеоартрозу.

3. Внутрішньосуглобове введення культури недиференційованих аутологічних МСК кісткового мозку після отримання механічного дефекту суглобового хряща без ушкодження підхрящової кісткової пластинки призводить до формування в ділянці дефекту гіаліноподібної тканини, яка повністю заповнює травматичний дефект, при обмежених або відсутніх дистрофічних і некротичних змінах у навколишньому суглобовому хрящі.

4. Внутрішньосуглобове введення культури аутологічних МСК кісткового мозку з попередньо спрямованим хондрогенним диференціюванням призводить до формування в ділянці дефекту суглобового хряща гіаліноподібної тканинини з явищами її гіперплазії. Обмежені краями дефекту прояви дистрофії та некрозу спостерігали на фоні осередкової проліферації хондроцитів.

5. Аналіз отриманих даних за альтернативною OS шкалою виявив достовірно кращий результат при застосуванні недиференційованої культури аутологічних МСК (8,6±0,24) у моделі механічного травматичного пошкодження суглобового хряща в порівнянні з культурою аутологічних МСК із спрямованим хондрогенним диференціюванням (7,6±0,24), (р<0,05).

6. У експериментальних тварин при травматичному пошкодженні суглобового хряща порушуються метаболічні процеси, що приводить до структурно-функціональних змін в хрящовій тканині та розвитку патологічного процесу. Ці зміни виявляються на 7-у добу і посилюються в наступні строки спостереження. Внутрішньосуглобове введення аутологічних МСК на початкових етапах розвитку патологічного процесу стабілізує метаболічні процеси в хрящовій тканині, а в подальшому нормалізує їх, досягаючи фізіологічних норм, які характерні для інтактних тварин.

7. Методом мічення аутологічних МСК кісткового мозку за допомогою флюоресцентних зондів РКН-26 доведено, що аутологічні МСК кісткового мозку безпосередньо беруть участь у процесах хондрорепарації при їх внутрішньосуглобовому введенні.

Враховуючи дані експериментального дослідження, високий профілактичний та лікувальний ефект застосування аутологічних мезенхімальних клітин кісткового мозку при травматичних ушкодженнях суглобового хряща, доцільно в майбутньому використовувати їх у лікувальних закладах пацієнтам з пошкодженнями суглобового хряща з метою його відновлення та профілактики розвитку посттравматичного остеоартрозу.



СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Коструб О.О. Лікування пошкоджень суглобового хряща: реальність та перспективи (огляд літератури) / О.О. Коструб, І. А. Засаднюк // Вісник ортопедії, травматології та протезування. - 2006. - № 2. - С. 80- 85.

2. Коструб О.О. Використання стовбурових клітин строми кісткового мозку у лікуванні пацієнтів з пошкодженнями суглобового хряща колінного суглоба / О.О. Коструб, В. І. Грищенко, О. Ю. Петренко, І. А. Засаднюк, А. І. Правдюк, Н. Г. Скоробагатова, Ю. О. Петренко // Вісник ортопедії, травматології та протезування. - 2007. - № 1. - С. 34 - 38.

3. Правдюк А. И. Хондрогенная дифференцировка и трансплантация стромальных клеток костного мозга, инкапсулированных в альгинатные микроносители / А. И. Правдюк, А. Ю. Петренко, И. А. Засаднюк, А. А. Коструб, Н. Г. Скоробагатова, Ю. А. Петренко, Н. А. Волкова, В. И. Грищенко // Трансплантология. - 2007. - Т. 2, № 1. - С.228 - 230.

4. Засаднюк А. И. Использование культуры диплоидных клеток в лечении дефектов суставного хряща / И. А. Засаднюк, Н. А. Волкова, В. В. Тимон, А. А. Коструб, Е. И. Гончарук // Материалы ІІІ всероссийского симпозиума с международным участием [“Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии”], (Москва , 25 - 26 апр. 2007 г.) / М-во здрав. и соц. развития Рос. Федерации, ФГУ Центр. инст. травм. и ортоп. им. И. И. Приорова. - М., 2007. - С. 69 - 70.

5. Коструб О.О. Культивування та хондрогенне диференціювання стовбурових клітин строми кісткового мозку / О.О. Коструб, В. І. Грищенко, О. Ю. Петренко, І. А. Засаднюк, А. І. Правдюк, Н. Г. Скоробогатова, Ю. О. Петренко // Матеріали ІІ всеукраїнської школи з міжнародною участю [“Фізіологія та морфологія тканин опорно-рухової системи в нормі і при ішемічних ушкодженнях”], (Київ-Черкаси, 14 - 15 червня 2007 р.) / АМН України, МОЗ України, Інст. травм. та ортоп. АМН України. - К., 2007. - С. 31- 33.

6. Коструб О.О. Використання культури диплоїдних клітин у лікуванні пошкоджень суглобового хряща / О.О. Коструб, І. А. Засаднюк, Н. А. Волкова, О. І. Гончарук, В. В. Тімон // Матеріали ІІ всеукраїнської школи з міжнародною участю [“Фізіологія та морфологія тканин опорно-рухової системи в нормі і при ішемічних ушкодженнях”], (Київ-Черкаси, 14 - 15 червн. 2007 р.) / АМН України, МОЗ України, Інст. травм. та ортоп. АМН України. - К., 2007. - С. 29 - 31.

7. Коструб О.О. Вплив культури аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин кісткового мозку на регенерацію суглобового хряща при його механічному пошкодженні / О.О. Коструб, І. А. Засаднюк // Матеріали науково-практичної конференції з міжнародною участю [“Новітні технології в спеціалізованій медицині”], (Київ, 29 - 30 лист. 2007 р.) / МОЗ України, Нац. мед. акад. післядипл. осв. ім. П. Л. Шупика. - К., 2007. - С. 64 - 66.

8. Гайко Г.В. Використання аутологічних мезенхімальних стовбурових клітин при травматичних пошкодженнях суглобового хряща (експериментальне дослідження) / Г.В. Гайко, О.О. Коструб, В. І. Грищенко, А. Т. Бруско, І. А. Засаднюк // Вісник ортопедії, травматології та протезування. - 2008. - № 1. - С. 5 - 9.

9. Волкова Н. О. Лікування експериментальної суглобової патології у тварин за допомогою диференційованих мезенхімальних стовбурових клітин / Н. О. Волкова, І. А. Засаднюк, О. І. Гончарук, О.О. Коструб, В. І.. Грищенко д// Ветеринарна медицина. - 2008. - № 89. - С. 80 - 85.

Размещено на Allbest.ru

...