Алельний поліморфізм генів INHа, FSHR ТА FMR1 у пацієнтів з порушенням функції яєчників

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОї БіОЛОГії і ГЕНЕТИКИ

Автореферат

Алельний поліморфізм генів INHб, FSHR ТА FMR1 у пацієнтів з порушенням функції яєчників

03.00.22 - молекулярна генетика

Лівшиць Ганна Борисівна

КИїВ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор

Бариляк Ігор Романович,

ДУ „Науковий центр радіаційної медицини АМН України” (м.Київ), завідувач відділу медичної генетики.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор

Філоненко Валерій Вікторович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України,

завідувач відділу сигнальних систем клітини;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Акопян Гаяне Рубенівна,

ДУ Інститут спадкової патології АМН України (м.Львів),

завідувач відділу клінічної генетики.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасні методи структурної і функціональної геноміки сприяють відкриттю мутантних генів і розробці методів діагностики спадкових захворювань, які основані на аналізі нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), відкриваючи широкий шлях програмам генетичного тестування - первинної ланки молекулярної медицини.

За даними Міністерства охорони здоров`я України близько 10 25 % подружніх пар в нашій країні страждають на безпліддя. За попередніми оцінками, передбачається, що приблизно в 50 % випадків безпліддя зумовлено генетичними чинниками. Для вивчення їхньої природи важливим є дослідження генетичної складової порушень окремих ланок функціонування таких складних біологічних процесів як оогенез та овуляція. З точки зору медичної практики вирішення цих питань відкриє перспективу розробки молекулярно-генетичних методів аналізу мутантних генів, залучених у патогенез дисфункції яєчників.

Порушення гаметогенезу у жінок в основному спричинено недостатністю функції яєчників. Встановлено, що на цю патологію страждає близько 13 % жінок репродуктивного віку. Порушення функції яєчників, в першу чергу, спричинює безпліддя. На фізіологічному рівні порушення функції яєчників найбільш вірогідно повинно виникати або внаслідок зменшення кількості ооцитів, які формуються під час ембріонального розвитку, або при збільшенні рівня загибелі ооцитів, яка має місце протягом репродуктивного періоду життя. В останні роки в різних лабораторіях світу було встановлено, що порушення функції яєчників може мати генетичну природу [Aittomaki et al. 1995; Shelling et al., 2000; Davison et al., 2000; Marozzi et al., 2002;].

Таким чином, аналіз мутантних генів, залучених у патогенез дисфункції яєчників, дозволить запровадити програми генетичного тестування, які нагально необхідні як з точки зору прогнозу та профілактики генетично обумовленого жіночого безпліддя, так і для розробки індивідуальної терапії, при використанні допоміжних репродуктивних технологій.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає основному планові науково-дослідних робіт відділу геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України і виконувалась в рамках бюджетної теми: „Молекулярно-генетичні дослідження чинників, що призводять до репродуктивних втрат та інвалідності” (шифр теми 2.2.4.13, № держ. реєстрації 0105U005341, 2006-2010 рр.). Робота також виконувалась в рамках отриманого на конкурсних засадах вітчизняного проекту: „Молекулярні основи функціонування геному та його регуляція” (шифр теми 2.2.4.20, № держ. реєстрації 0104U000436, 2002-2006 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є дослідження ролі поліморфних варіантів генів INHб, FSHR та FMR1 у патогенезі передчасного виснаження яєчників та у формуванні індивідуальної відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном у циклах екстракорпорального запліднення (ЕКЗ).

Для досягнення мети були поставлені основні завдання дослідження:

1. Створити банк зразків лейкоцитарної ДНК пацієнтів: а) з порушенням функції яєчників; б) з різною відповіддю на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном; в) фертильних жінок, які народили дитину, зачату природнім шляхом, до 35-ти та після 35-ти років.

2. Проаналізувати мононуклеотидну заміну 769GA (варіант Ala257Thr) в 2-ому екзоні гена INHб (інгібіну б), мононуклеотидні заміни 919A>G (варіант Thr307Ala) та 2039A>G (варіант Asn680Ser) в 10-ому екзоні гена FSHR (рецептора фолікулстимулюючого гормону) та поліморфізм кількості копій CGG-повторів в гені FMR1 (розумової відсталості 1) серед жінок з порушенням функції яєчників, у пацієнтів з різною відповіддю на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном та у контрольних групах жінок, які народили дитину, зачату природнім шляхом, до 35-ти та після 35-ти років.

3. На основі власних та літературних даних проаналізувати роль досліджуваних поліморфних варіантів у регуляції фізіологічного резерву яєчників.

4. Вивчити показники індивідуальної відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном у пацієнтів з різними генотипами.

5. Дослідити діагностичну інформативність алельних варіантів генів FSHR, INHб та FMR1 як маркерів для генетичного тестування з метою прогнозу ризику розвитку передчасного виснаження яєчників та слабкої відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном.

Об'єктом дослідження є спадкова схильність до порушень природної та індукованої овуляції, а предметом - поліморфні варіанти генів FSHR, INHб та FMR1 у пацієнтів з дисфункцією яєчників та різною відповіддю на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном. У роботі використовувались загальноприйняті методи: виділення та очищення ДНК, полімеразна ланцюгова реакція, рестрикційний аналіз, секвенування, різні види гель-електрофорезу та статистична обробка даних.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено банк ДНК, який нараховує 374 зразки лейкоцитарної ДНК пацієнтів з дисфункцією яєчників, та з різною відповіддю на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном, а також жінок із різних регіонів України, які народили дитину, зачату природнім шляхом, до 35-ти та після 35-ти років. Вперше серед цих пацієнтів отримані дані про розповсюдження мононуклеотидної заміни 769GA (варіант Ala257Thr) в 2-му екзоні гена INHб, мононуклеотидних замін 919A>G (варіант Thr307Ala) та 2039A>G (варіант Asn680Ser) в 10-му екзоні гена FSHR та поліморфізму кількості копій CGG-повторів у гені FMR1 в популяції України. Вперше були вивчені показники індивідуальної відповіді на екзогенний гонадотропін у пацієнтів з різними генотипами. Вперше показано асоціацію гетерозиготної заміни 769GA (варіант Ala257Thr) в 2-му екзоні гена INHб, гомозиготного генотипу Ala307-Ser680/Ala307-Ser680 10-го екзону гена FSHR та алелів високого ризику (4047 CGG-повторів) гена FMR1 з патогенезом дисфункції яєчників та зі слабкою відповіддю на екзогенний гонадотропін.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлено діагностичну інформативність мононуклеотидної заміни 769GA (варіант Ala257Thr) в 2-му екзоні гена INHб, мононуклеотидних замін 919A>G (варіант Thr307Ala) та 2039A>G (варіант Asn680Ser) в 10-му екзоні гена FSHR та поліморфізму кількості копій CGG-повторів в гені FMR1 як маркерів для генетичного тестування:

а) з метою прогнозу ризику розвитку передчасного виснаження яєчників у молодих жінок та планування народження дитини;

б) для прогнозу індивідуальної відповіді на стимуляцію суперовуляції яєчників екзогенним гонадотропіном у циклах екстракорпорального запліднення у програмах допоміжних репродуктивних технологій.

Генетичне тестування досліджуваних поліморфних варіантів також є важливим для пошуку індивідуалізованої стратегії стимуляції овуляції у пацієнток з безпліддям, які проходять лікування методом екстракорпорального запліднення в клініках репродуктивних технологій, а у разі неефективності такої стимуляції підґрунтям для рекомендацій переходу на програму з використанням донорських яйцеклітин. Генетичне тестування може бути ефективним також і для відбору донорів яйцеклітин.

Особистий внесок здобувача. Весь обсяг експериментальної частини дисертації, пошук та обробку літературних даних виконано автором особисто. Планування досліджень, обговорення, аналіз, інтерпретацію отриманих даних і публікацій до друку здійснено разом із науковим керівником. Здобувачем особисто проведено виділення та очищення зразків лейкоцитарної ДНК пацієнтів, підібрано умови та оптимізовано проведення полімеразної ланцюгової реакції, рестрикційного аналізу та електрофоретичного розділення для аналізу послідовності генів INH, FSHR та FMR1. Секвенування нуклеотидної послідовності продуктів ПЛР 2-го екзону гена INH та 10-го екзону гена FSHR проводили спільно з аспірантом Угриним Д.Д. Cтатистичну обробку даних проводили спільно з к.б.н. Кравченко С.А. та к.мед.н. Берестовим О.О. Аналіз клінічних даних пацієнтів проводився спільно з лікарями клінік „ІСІДА” та „НАДІЯ”, Інституту генетики репродукції та ДУ Інститут педіатрії акушерства та гінекології АМН України.

Дисертантка вдячна д.мед.н. Судомі І.О., к.мед.н. Зукіну В.Д., к.мед.н. Бичковій Г.М. та к.мед.н. Іл'їну І.О. за поради при аналізі клінічних даних і надання зразків крові пацієнтів. Здобувач висловлює подяку науковому керівнику д.мед.н., професору Бариляку І.Р., а також всім співробітникам відділу геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за підтримку і сприяння у виконанні досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на вітчизняних та міжнародних з'їздах та конференціях: V конференції асоціації репродуктивної медицини України (Київ, 2004), Європейській конференції з генетики людини (Прага, Чехія, 2005), Міжнародній конференції „Генетика в России и в мире посвещенной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН” (Москва, Росія, 2006), Другому семінарі з репродуктивної медицини "From laboratory to clinics, from science to practice" (Тарту, Естонія, 2007), 6-й Парнасівській конференції „Molecular Mechanism of Cellular Signalling” (Краків, Польща, 2007), ІV З'їзді медичних генетиків України з міжнародною участю (Львів, 2008), 9-й Міжнародній конференції з системної біології (Гетеборг, Швеція, 2008), Другій міжнародній нараді з регіонального співробітництва у галузі здоров'я, науки та технології „Bridges in Life Sciences (RECOOP HST) Consortium” (Загреб, Хорватія, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 19 друкованих праць, зокрема 5 статей у спеціалізованих наукових виданнях, із них 3 у фахових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України, та тези доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях, та з'їздах.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, яка має два розділи, узагальнення та обговорення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел. Дисертаційну роботу викладено на 155 сторінках машинописного тексту. Текст дисертації проілюстровано 20 таблицями та 20 рисунками. Перелік використаних джерел охоплює 174 найменувань.

ОСНОВНий зміст

Матеріали і методи дослідження

Матеріалом дослідження були зразки крові, отримані з інформованої згоди, пацієнтів з дисфункцією яєчників; пацієнтів з різною відповіддю, яким проводили стимуляцію суперовуляції гонадотропіном в циклах ЕКЗ, та жінок з різних регіонів України, які народили дитину, зачату природним шляхом, до 35-ти років, (контрольна група І) та після 35-ти років (контрольна група ІІ). Зразки крові та клінічні дані були надані клініками „ІСІДА”, „НАДІЯ”, Інститутом генетики репродукції та ДУ Інститут педіатрії акушерства та гінекології АМН України.

Виділення та очищення препаратів ДНК проводили за допомогою стандартного методу (Маниатис и др., 1985).

Ампліфікацію in vitro геномних послідовностей ДНК генів INHб (2-й екзон), FSHR (10-й екзон) та FMR1 (ділянка CGG-повторів) проводили за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Saiki et al., 1988).

Для ідентифікації поліморфних варіантів генів INHб та FSHR застосовували метод рестрикційного аналізу продуктів ПЛР відповідних послідовностей. Реакції рестрикції проводили в об`ємі 520 мкл реакційної суміші та 110 од. акт. відповідної ендонуклеази рестрикції за умов, рекомендованих фірмами-виробниками.

Електрофоретичне розділення продуктів рестрикції проводили в 1,8 % агарозному та в 10 % поліакриламідному гелях в трис-боратному буферному розчині. Електрофоретичне розділення ПЛР продуктів, праймери для яких мітили флуоресцентним барвником Cy5, проводили на автоматичному лазерному флуориметрі “A.L.F.-express” (“GE HealthCare Bio-Sciences AB”, CША). Після сканування дані обробляли за допомогою програми FM2.1 (Fragment Manager Software V2.1, Pharmacia, Швеція).

Очищення продукту ампліфікації для секвенування проводили за допомогою Qiaex II kit (Qiagen, Hilden, Німеччина). Для секвенування використовували набір „ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequincing Ready Reaction Kits” та здійснювали на приладі ABI Prism 3110 Genetic Analyser (Applied Biosystem).

Статистичну обробку даних проводили за загальноприйнятими методами варіаційної статистики (Лі, 1980) з використанням пакету програм ARLEQUIN, “GENEPOP” (Raymond et al., 1995),"SYSTAT" (Felsenstein et al., 1993).

Результати досліджень та обговорення

Дослідження мононуклеотидної заміни 769GA (варіант Ala257Thr) в 2-му екзоні гена INHб. Для аналізу заміни 769G>A в гені INHб застосовано метод, який оснований на рестрикційному аналізі продукту ПЛР послідовності ДНК 2-го екзону з використанням ендонуклеази рестрикції BstV1I. У випадку даної мутації зникає один із сайтів впізнавання BstV1I (Лівшиць та ін., 2005). У гомозигот за нормальним алелем гена INHб спостерігали фрагменти довжиною 85 п.н., та 134 п.н, а у гетерозиготних носіїв мутації 769G>A гена INHб фрагменти довжиною 85 п.н., 134 п.н та 159 п.н. (рис.1). Контроль аналізованої послідовності здійснювали за допомогою секвенування продукту ПЛР 2-го екзону гена INH (рис.2).

За результатами досліджень проведених серед жінок з дисфункцією яєчників та в контрольних групах встановлено, що частота гетерозиготних носіїв поліморфізму 769GA в гені INHб була вище серед жінок з дисфункцією яєчників (8,8 %) порівняно з контрольною групою І (3,8 %) та статистично вірогідно (р0,05) переважала порівняно з контрольною групою ІІ (0 %).

У досліджувану нами групу пацієнтів із дисфункцією яєчників входили жінки, яких за клінічними ознаками можна зарахувати до категорії пацієнтів з ПВЯ (передчасним виснаженням яєчників) або до пацієнтів з синдромом резистентних яєчників „прихована форма” ПВЯ (O'Herlity et al., 1980).

За даними Шелінга із співавторами (Shelling et al., 2000) на ПВЯ страждає лише 0,1 % жінок молодше 30-ти років.

Результати порівняння частоти транзиції 769GA серед пацієнтів та індивідів не лише з контрольної групи І, а і контрольної групи ІІ, дозволяють найадекватніше оцінити і підтвердити, що з віком у жінок гетерозиготних носіїв даної заміни в гені INHб реалізується ризик розвитку ПВЯ.

Подібні тенденції були зазначені в роботах Шелінга та ін. і Мароззі та ін. (Shelling et al., 2000; Marozzi et al., 2002).

Додатковим свідченням на користь того, що заміна 769GA може змінювати функціональну активність б-субодиниці інгібіну, залученого до сигналінгу негативної регуляції синтезу фолікулстимулюючого гормону (ФСГ) (Robertson et al., 2004), є отримані нами дані про те, що у гетерозиготних носіїв мутації 769G>A в гені ІNHб середнє значення базального рівня сироваткового ФСГ на 2-3-й день менструального циклу становило 17,79 ± 2,17 між.од.акт. /л і було достовірно вище (р<0,05), ніж середній рівень сироваткового ФСГ у жінок гомозигот за нормальним алелем гена ІNHб 8,86 ± 0,33 між.од.акт. /л.

Алельний поліморфізм 10-го екзону гена FSHR. Поліморфізми 919 A>G (варіант Thr307Ala) та 2039A>G (варіант Asn680Ser) 10-го екзону гена FSHR призводять до утворення сайтів для ендонуклеаз Eco81I та BsеNI. Тому дані заміни досліджували методом ампліфікації in vitro послідовності ДНК 10-го екзону, з подальшим гідролізом продуктів ПЛР відповідними ферментами та електрофоретичним розділенням у 2 % агарозному гелі. У гетерозиготних носіїв поліморфного варіанту 919 A>G спостерігали фрагменти довжиною 364 п.н. та 328 п.н., а у гомозиготних носіїв даної заміни - фрагмент довжиною 328 п.н., у гомозигот без заміни 364 п.н. (рис.3).

У індивідів без заміни 2039A>G спостерігали фрагмент довжиною 520 п.н., у гетерозиготних носіїв даної заміни фрагменти довжиною 520 п.н., 413 п.н. та 107п.н., а у гомозитотних носіїв - рестрикційні фрагменти довжиною 413 п.н. та 107 п.н. (рис.4).

Контроль аналізованої послідовності проводили шляхом повного секвенування нуклеотидної послідовності продукту ПЛР 10-го екзону гена FSHR (рис. 5, 6).

На основі аналізу комбінованих генотипів (табл. 1) за обома замінами з використанням методу likelihood-ratio test (Excoffier et al., 1995) встановлено статистично вірогідну нерівновагу за зчепленням між даними поліморфними варіантами (р<0,0001). Згідно даного аналізу виведені комбінації гаплотипів: Thr307-Asn680, Ala307-Ser680, Ala307-Asn680 та Thr307-Ser680.

Таблиця 1

Розподіл комбінованих генотипів за поліморфними локусами FSHR307 та FSHR680 у трьох досліджуваних групах

Генотипи гена FSHR	Контрольна група І n=130, (%)	Група жінок з дисфункціями яєчників n=102, (%)	Контрольна група ІІ n=63, (%)
AASS	10 (7,7)а	27 (26)a	11 (17,5)
TTNN	38 (29,2)	17 (17)	28 (44,4)
ATSN	59 (45,4)	52 (51)	22 (34,9)
AASN	4 (3,1)	1 (1)	0
ATSS	9 (6,9)	1 (1)	0
ATNN	4 (3,1)	2 (2)	1 (1,6)
TTNS	5 (3,8)	2 (2)	1 (1,6)
AANN	1 (0,8)	0	0

Примітка. Оцінка статистичної вірогідності за критерієм Фішера: ^а р<0,001; T - 307Thr, A - 307Ala, N - 680Asn, S - 680Ser.

Встановлено, що в контрольній групі І, що репрезентує популяцію України, гаплотипи Thr307-Asn680 та Ala307-Ser680 є найрозповсюдженими (55,4 % та 35,4 %, відповідно), тоді як рекомбінантні гаплотипи Ala307-Asn680 та Thr307-Ser680 зустрічалися значно рідше (3,8 % та 5,4 %).

За результатами досліджень, проведених серед жінок з дисфункцією яєчників та в контролях, встановлено, що частота мутантного гаплотипу Ala307-Ser680 статистично вірогідно вище (р<0,05), ніж у контрольних групах І та ІІ (табл. 2).

Мутантний генотип Ala307-Ser680/Ala307-Ser680 статистично вірогідно також переважав в групі пацієнтів з дисфункцією яєчників порівняно з контрольною групою І (р<0,001). Подібні закономірності були встановлені Сюдо та ін. для груп пацієнтів з первинною та вторинною аменореєю та синдромом полікістозних яєчників (Sudo et al., 2002).

Асоціацію генотипів із фенотипом дисфункції яєчників оцінювали за допомогою розрахунку співвідношення шансів (odds ratio, OR). Згідно отриманих статистично вірогідних значень OR, можна зробити висновок, що носійство мутантного гаплотипу Ala307-Ser680 є фактором ризику розвитку дисфункції яєчників. При цьому як гетерозиготи, так і гомозиготи мають ризик розвитку даної патології як мінімум в 2,065 разів вищий (р0,05), ніж індивіди, до генотипу яких не входить мутантний гаплотип Ala307-Ser680. Гомозиготи за даним гаплотипом мають ризик розвитку яєчникової недостатності в 4,32 раза вищий (р0,0001), ніж індивіди з іншими генотипами.

Таблиця 2

Розподіл Thr307-Asn680, Ala307-Asn680 Thr307-Ser680 та Ala307-Ser680 гаплотипів гена FSHR у жінок з дисфункцією яєчників та в контрольних групах

Групи	Гаплотипи гена FSHR
	TN	AN	TS	AS
	n (%)	n (%)	n (%)	n (%)
Група жінок з дисфункцією яєчників	90 (44,1)	3 (1,5)	3 (1,5)	108(52,9) а,б
Контрольна група І	144 (55,4)	10 (3,8)	14 (5,4)	92 (35,4) а
Контрольна група ІІ	79 (62,7)	1 (0,8)	1 (0,8)	45 (35,7) б

Примітки. Оцінка статистичної вирогідності за критерієм Фішера: ^а,бр<0,001; T - 307Thr, A - 307Ala, N - 680Asn, S - 680Ser.

Аналіз поліморфізму СGG-повторів 5'-нетрансльованої ділянки першого екзону гена FMR1. Аналіз поліморфізму СGG-повторів гена FMR1 проводили з використанням методу ПЛР з Cy-5 міченими синтетичними олігонуклеотидами з подальшою візуалізацією на автоматичному лазерному флуориметрі „A.L.F.-express” (рис. 7). Розміри продуктів ПЛР, ідентифіковані у всіх досліджуваних групах, варіювали від 130 п.н. до 221 п.н. (від 1747 CGG-повторів).

Встановлено, що гетерозиготні носії нестабільних алелів „високого ризику” гена FMR1 (4047 CGG-повторів) значно частіше зустрічалися в групі жінок з дисфункцією яєчників (9,4 %), порівняно з контрольними групами І (3,1 %) та ІІ (6,4 %), при цьому різниця між часткою таких генотипів серед пацієнтів та індивідів контрольної групи І була статистично вірогідною (р<0,05).

Результати, отримані в наших дослідженнях стосовно розповсюдженості носіїв алелів зони ”високого ризику” в групі пацієнтів із дисфункцією яєчників, узгоджуються з даними отриманими Сулліван із співавторами, які встановили, що носії алелів, які входять до, так званої, „сірої зони” або „зони ризику”, мають підвищений ризик розвитку як ПВЯ, так і початку ранньої менопаузи (Sullivan et al., 2005).

За результатами аналізу асоціації генотипу, до складу якого входить алель „високого ризику” гена FMR1, з дисфункцією яєчників, яку оцінювали за допомогою розрахунку співвідношення шансів (odds ratio, OR) можна зробити висновок, що гетерозиготне носійство даних алелів (4047 СGG-повторів) гена FMR1 є фактором ризику розвитку дисфункції яєчників. Показник OR для всіх генотипів, до складу яких входить алель „високого ризику” гена FMR1, становив 3,155 (р0,05).

Алельний поліморфізм генів INHб, FSHR та FMR1, як можливий генетичний чинник індивідуальної чутливості до стимуляції екзогенним гонадотропіном. Оскільки нами встановлено роль поліморфних варіантів 769G>A в гені ІNHб, гаплотипу Ala307-Ser680 в гені FSHR та алелів „високого ризику” (4047 CGG-повторів) в гені FMR1 як факторів спадкової схильності до розвитку дисфункції яєчників, ми вирішили перевірити асоціації цих генетичних чинників з індивідуальною відповіддю на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном. Відомо, що така відповідь може бути пов'язана як з, так званим, резервом яєчників, так і з індивідуальною чутливістю до стимулюючих препаратів (Pellicer et al., 1998). Для перевірки цієї гіпотези нами було проведено дослідження розподілу мононуклеотидної заміни 769G>A в гені ІNHб, гаплотипу Ala307-Ser680 гена FSHR та алелів „високого ризику” (4047 CGG-повторів) гена FMR1 в групах „гарних” та „поганих” відповідачів. До групи жінок „гарних відповідачів” (n=40) входили жінки репродуктивного віку до 40-а років, у яких отримували 10 і більше яйцеклітин після стимуляції суперовуляції екзогенним гонадотропіном у циклах ЕКЗ при денній дозі гонадотропіну 125250 між. од. акт. Групу „поганих відповідачів” (n=39) складали жінки репродуктивного віку, до 40-а років, які мали слабку відповідь (до 4-х яйцеклітин) на стимуляцію суперовуляції екзогеним гонадотропіном у циклах ЕКЗ у відповідь на денну дозу 225300 між. од. акт.

Частота гетерозиготних носіїв заміни 769G>A в гені ІNHб (2-й екзон) у групі “поганих відповідачів” (15,4 %) статистично вірогідно (р<0,05) перевищувала даний показник в групі “гарних відповідачів” (0 %), а також в контрольній групі І (3,8 %) та в контрольній групі ІІ (0 %). Передбачається, що досліджуваний нами варіант 769G>A в гені ІNHб призводить до порушення зв'язування між інгібіном та його рецептором або іншими рецепторами-мішенями (Robertson et al., 2004). Оскільки під час контрольованої стимуляції пацієнти отримували препарати, що містять рекомбінантний ФСГ, ми припускаємо, що варіант 769G>A може призводити не тільки до порушення негативної регуляції продукції ФСГ, а і до послаблення паракринної дії інгібіну. На користь цього також свідчать дані про те, що середня кількість фолікулів та ооцитів отриманих після стимульованої овуляції у гетерозиготних носіїв мутації 769G>A (2,4 ± 0,3 та 1,1 ± 0,2, відповідно) була статистично вірогідно менше (t_st=2,34 та t_st=2,52, відповідно, p0,05), ніж у гомозигот за нормальним алелем (13,8 ± 1,5 та 9,6 ± 1,0, відповідно). Середня загальна доза гонадотропіну, необхідна для стимуляції у гетерозиготних носіїв мутації 769G>A (4208 ± 373 між. од. акт) була статистично вірогідно вище (t_st=5,938, p0,001), ніж у гомозигот за нормальним алелем (2269 ± 97 між. од. акт.).Також встановлено, що частота гомозиготного генотипу Ala307-Ser680/Ala307-Ser680 у групі жінок „поганих відповідачів” (33,3 %) виявилася статистично достовірно вищою (р<0,05), ніж у всіх контрольних групах (табл. 3).

Таблиця 3

Розподіл генотипів за поліморфними локусами FSHR307 та FSHR680 у групах „поганих відповідачів”, „гарних відповідачів” та в контрольних групах

Генотип	Група жінок „поганих відповідачів” n=39, (%)	Група жінок „гарних відповідачів” n=40, (%)	Контрольна група І n=130, (%)	Контрольна група ІІ n=63, (%)
AASS	13 (33,3)а, б, в	5 (12,5)а	10 (7,7)б	11 (17,5)в
TTNN	5 (12,8)	12 (30)	38 (29,2)	28 (44,4)
ATSN	18 (46,2)	23 (57,5)	59 (45,4)	22 (34,9)
AASN	0	0	4 (3,1)	0
ATSS	1 (2,6)	0	9 (6,9)	0
ATNN	0	0	4 (3,1)	1 (1,6)
TTNS	2 (5,1)	0	5 (3,8)	1 (1,6)
AANN	0	0	1 (0,8)	0

Примітка. Оцінка статистичної вірогідності за критерієм Фішера: ^а,в р<0,05, ^бр<0,001; T - 307Thr, A - 307Ala, N - 680Asn, S - 680Ser.

За результатами наших досліджень встановлено, що середня кількість фолікулів та ооцитів (7,0 ± 1,7 та 4,6 ± 1,1, відповідно), отриманих після стимуляції овуляції у гомозигот за мутантними гаплотипом Ala307-Ser680 гена FSHR, була статистично вірогідно менше (t_st=2,49 та t_st=2,64, p0,05), ніж у жінок з іншими генотипами (13,8 ± 1,5 та 9,6 ± 1,0, відповідно).

Також з'ясували, що для стимуляції суперовуляції пацієнтам з мутантним генотипом Ala307-Ser680/Ala307-Ser680 необхідні були вищі дози екзогенного гонадотропіну. Оскільки середня загальна доза, необхідна для пацієнтів (4007 ± 232 між. од. акт), була статистично вірогідно вище (t_st=8,25, p0,001), ніж у жінок з іншими генотипами (2269± 97 між. од. акт).

Показник відносного ризику OR для всіх генотипів, до складу яких входить гаплотип Ala307-Ser680, становив 2,914 (р0,05). Ця закономірність була підсилена після розрахунку ОR, для гомозигот за даним гаплотипом, значення якого складало 3,5 (р0,05). Тобто гетерозиготи за даним мутантим гаплотипом мають ризик слабкої відповіді яєчників на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном в 2,9, а гомозиготи в 3,5 раза вище, ніж індивіди з іншими генотипами.

За результатами наших досліджень встановлено, що мононуклеотидні заміни 769G>A в 2-му екзоні гена ІNHб, а також 919 A>G (варіант Thr307Ala) та 2039 G>A (варіант Asn680Ser) в 10-му екзоні гена FSHR є не тільки фактором спадкової схильності до передчасного виснаження яєчників, а і до слабкої відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном, тобто дисфункція яєчників та слабка відповідь на екзогенний гонадотропін є ланцюгами одного процесу, в якому знижений функціональний резерв яєчників, і який зумовлений спільними генетичними чинниками. На користь цього свідчать результати, отримані нами в дослідженні асоціації алелів зони „високого ризику” (4047 CGG-повторів) гена FMR1 з слабкою відповіддю на екзогенний гонадотропін. В групі „поганих відповідачів” спостерігали тенденцію до підвищення частоти алеля „високого ризику” гена FMR1 (10,3 %) при порівнянні з групою жінок “гарних відповідачів” (2,5 %), контрольною групою І (3,1 %) та контрольною групою ІІ (6,4 %). Середня ж кількість фолікулів та ооцитів, отриманих після стимуляції овуляції у гетерозиготних носійок даних алелів (4,5 ± 1,1 та 2,9 ± 0,8, відповідно) була статистично вірогідно менше (t_st=2,015 та t_st=2,097, p0,05), ніж у жінок з нормальними алелями гена FMR1 (13,8 ± 1,5 та 9,6 ± 1,0, відповідно). В той же час середня загальна доза екзогенного гонадотропіну, необхідна для стимуляції суперовуляції для гетерозиготних носійок алелів „високого ризику” (4387 ± 222 між. од. акт.) була статистично вірогідно вище (t_st=7,063, p0,001), ніж необхідна для стимуляції пацієнтів з генотипом, до якого входять лише нормальні алелі гена FMR1 (2269 ± 97 між. од. акт.). Раніше нами зазначалось про статистично вірогідне підвищення частки носіїв алелів „високого ризику” гена FMR1 в групі жінок з дисфункцією яєчників у порівнянні контрольною групою І. Передбачається, що підвищення рівня мРНК з алелів експансованих до премутації (40200 CGG-повторів) може призводити до зменшення ефективності трансляції (Chen et al., 2003). Проте, на сьогодні, ще не до кінця з'ясовані молекулярні механізми залучення гена FMR1 у процеси оогенезу та овуляції. Спираючись на отримані нами дані та дані інших авторів, які свідчать на користь того, що алельні варіанти із збільшеною кількістю CGG-повторів (алелі із зони „високого ризику” та премутації) є генетичним чинником ПВЯ, можна зробити припущення про те, що ці ж самі механізми також є причиною зменшення резерву яєчників, а отже слабкої відповіді на індуковану овуляцію. яєчник ген овуляція мононуклеотидний

Отримані нами дані про асоціацію мононуклеотидної заміни 769GA в 2-му екзоні гена INHб, мононуклеотидних замін 919 A>G (варіант Thr307Ala) та 2039 A>G (варіант Asn680Ser) в 10-му екзоні гена FSHR та поліморфізму кількості копій CGG-повторів в гені FMR1 свідчать про те, що дані поліморфні варіанти можуть бути використані як ДНК-маркери у програмах генетичного тестування з метою прогнозу ризику розвитку передчасного виснаження яєчників у молодих жінок та при плануванні народження дитини. Таке генетичне тестування є також необхідним для прогнозу індивідуальної відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном у циклах екстракорпорального запліднення. За результатами генетичного тестування та медико-генетичного консультування може бути скореговане планування сім'ї та народження дітей, що є особливо важливим в умовах сучасного суспільства, коли жінка робить кар'єру та відкладає заведення сім'ї на більш пізній період життя. Результати генетичного тестування з використанням аналізу алельного поліморфізму генів INHб, FSHR та FMR1, апробовані в клініках „ІСІДА” та „НАДІЯ”, стали підґрунтям пошуку індивідуалізованої стратегії стимуляції овуляції для пацієнток з безпліддям, а у разі неефективності такої стимуляції базою рекомендацій переходу на програму з використанням донорських яйцеклітин.

ВИСНОВКИ

Вирішення поставлених в даній роботі завдань дозволило довести залучення поліморфних варіантів послідовностей ДНК генів INHб, FSHR та FMR1 в патогенез передчасного виснаження яєчників та у формування індивідуальної відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном у циклах екстракорпорального запліднення, а також запропонувати дослідження алелів цих генів як ДНК-маркери фізіологічного резерву яєчників.

1. Вперше створено банк, що налічує 374 зразки лейкоцитарної ДНК індивідів: а) з порушенням функції яєчників; б) пацієнтів з різною відповіддю на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном; в) фертильних жінок, які народили дитину, зачату природнім шляхом, до 35-ти та після 35-ти років з різних регіонів України.

2. За результатами порівняльного аналізу розподілу частот генотипів за генами INHб, FSHR та FMR1 встановлено, що мононуклеотидна заміна 769GA в гені INHб, мутантний гаплотип Ala307-Ser680 гена FSHR та алелі „високого ризику” гена FMR1 (4047 CGG-повторів) є фактором спадкової схильності до порушень оогенезу.

3. Вперше встановлено, що мононуклеотидна заміна 769GA в гені INHб, мутантний гаплотип Ala307-Ser680 гена FSHR та алелі „високого ризику” гена FMR1 (4047 CGG-повторів) можуть бути генетичними чинниками слабкої відповіді на індукцію овуляції екзогенним гонадотропіном.

4. На основі розрахунку статистично вірогідних показників відносного ризику OR (Odds Ratio) доведено, що поліморфні варіанти генів FSHR, INHб та FMR1 можуть бути використані як маркери для генетичного тестування з метою прогнозу ризику розвитку передчасного виснаження яєчників та слабкої відповіді на стимуляцію суперовуляції екзогенним гонадотропіном.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Використання методів ДНК-аналізу для діагностики спадкових форм виснаження яєчників / Г. Б. Лівшиць, С. А. Кравченко, Н. В. Грищенко, І. А. Судома // Цитология и генетика. - 2005. - Т. 39, №2. - С. 60-64. Особистий внесок здобувача - розробка модифікованих методів аналізу мононуклеотидної заміни 769G>A в гені INH та кількості CGG-повторів у гені FMR1.

2. Молекулярно-генетичні дослідження порушень природної та стимульованої овуляції / Г. Б. Лівшиць, С. А. Кравченко, П. Ф. Татарський, І. О. Судома, Л. А. Лівшиць // Цитология и генетика. - 2008. - Т. 24, № 2. - C. 63-69. Особистий внесок здобувача - дослідження поліморфних варіантів генів INH, FSHR та FMR1 у пацієнтів з дисфункцією яєчників та різною відповіддю на стимуляцію овуляції.

3. Distribution of FSHR307 and FSHR680 allelic variants of FSH receptor gene exon 10 in females from Ukraine / G. B. Livshits, S. S. Podlesnaja, S. A. Kravchenko, L. A. Livshits // Біополімери та клітина. - 2008. - Т. 24, №4. - P. 218-322. Особистий внесок здобувача - дослідження розподілу та нерівноваги за зчепленням поліморфних варіантів 10-го екзону гена FSHR в популяції України.

4. Роль мутацій гена інгібіну, генів родини глютатіон-S-трансферази та гена FMR1 у розвитку деяких форм репродуктивних порушень у жінок / Г. М. Бичкова, Г. Б. Лівшиць, Л. А. Лівшиць, Г. В. Скибан, І. Р. Бариляк, Н. І. Сопко, К. Г. Хажиленко, О. М. Мозгова // Збірник наукових праць „Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології”. - 2007. - T. 1. - С. 410-414. Особистий внесок здобувача - аналіз асоціації поліморфних варіантів генів INH та FMR1 з показниками індивідуальної відповіді.

5. Лившиц А. Б. Генетические аспекты преждевременного истощения яичников / А. Б. Лившиц, Л. А. Лившиц, С. А. Кравченко // Медицинские аспекты здоровья женщины. - 2006. - №1. - С. 52-55. Особистий внесок здобувача-вивчення асоціації генотипів за поліморфними варіантами генів INH та FMR1 у донорів яйцеклітин з різною відповіддю на стимуляції овуляції.

6. Молекулярно-генетические аспекты нарушения функции яичников / А. Б. Лившиц, А. Ф. Мельник, И. А. Судома, Е. М. Мозговая, В. М. Зинченко, Л. А. Лившиц // Збірка наукових праць академії співробітників КМАПО ім. П. Л. Шупика. - 2006. - Вип. 14, кн. 4. - С. 143-151. Особистий внесок здобувача - аналіз поліморфних варіантів генів INH та FMR1 серед пацієнтів з ПВЯ та донорів яйцеклітин.

7. Розробка методів ДНК-аналізу для діагностики спадкових форм передчасного виснаження яєчників / Г. Б. Лівшиць, С. А. Кравченко, Н. В. Грищенко, І. А. Судома, Л. А. Лівшиць // V конференція асоціації репродуктивної медицини України, 8-10 вересня 2004 р.: тези доп. - Київ, 2004. - С. 11. Особистий внесок здобувача - розробка методів ДНК- поліморфних варіантів генів INH та FMR1.

8. 769GA Mutation in INHб1 and CGG - repeats in FMR1 genes pilot testing in Ukraine / A. Livshits, N. Hrischenko, S. Kravchenko // European human genetics conference, 7-10 May 2005: abstracts. - Prague, 2005. - P. 222. Особистий внесок здобувача -результати пілотного скрінінгу поліморфних варіантів генів INH та FMR1 серед пацієнтів з ПВЯ з України.

9. Дослідження мутації 769GA в гені INH1 та поліморфізму кількості CGG -повторів в гені FMR1 з метою розробки програм генетичного тестування / Г. Б. Лівшиць, Ю. В. Маслій, І. А. Судома // Український біохімічний журнал: тези доповідей конференції молодих учених „Актуальні проблеми біохімії та біотехнології2005”. - 2005. - Т. 77, №5. - С. 146. Особистий внесок здобувача - аналіз асоціації поліморфних варіантів генів INH та FMR1 з показниками індивідуальної відповіді.

10. Markers of genetic susceptibility to gonadothropin induced ovarian response / G. Livshits, Y. Masliy, A. Melnik, L. Livshits // European human genetics conference, May 6-9 2006: abstracts. - Amsterdam. - Vol. 13. - P. 251. Особистий внесок здобувача - дослідження показників індивідуальної чутливості у пацієнтів з різними генотипами генів INH та FMR1.

11. Изучение роли мутаций генов FMR1, INHб, NAT2, GSTT1 и GSTM1 в нарушениях функции яичников / А. Б. Лившиц, П. Ф. Татарский, И. А. Судома // „Генетика в России и в мире: международная конференция, посвещенная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН”, 28 июня-2 июля 2006 г.: тезисы докл. - Москва, 2006. - С. 109. Особистий внесок здобувача - порівняльний аналіз розподілу поліморфних генотипів генів INH та FMR1 у пацієнтів з ПВЯ та донорів яйцеклітин.

12. Роль мутацій генів FMR1, INHб1, NAT2, GSTT1 та GSTM1 у порушенні фізіологічного резерву яєчників // Г. Б. Лівшиць, А. Ф. Мельник, І. О. Судома, О. М. Мозкова, В. М. Зінченко // ІХ Українського біохімічний з'їзд, 24-27 жовтня 2006 р.: тези доп. - Харків. - Т. 2. - С. 80. Особистий внесок здобувача - аналіз асоціації поліморфних варіантів генів INH та FMR1 з показниками індивідуальної відповіді.

13. Генетичні аспекти передчасного виснаження яєчників / Г.Б. Лівшиць // „Молодь та поступ біології”: ІІІ Міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів, 27-27 квітня 2007 р.: тези доп. - Львів, 2007. - С. 162. Особистий внесок здобувача - аналіз мононуклеотидної заміни 769G>A в гені INH кількості CGG-повторів в гені FMR1 та мононуклеотидної заміни Asn680Ser гена FSHR у пацієнтів з ПВЯ та донорів яйцеклітин.

14. The association of mutation in FSH receptor, INHa1 and FMR1 genes with ovarian dysfunction / G. Livshits, Y. Masliy, I. Sudoma, S. Kravchenko // "From laboratory to clinics, from science to practice ": second workshop on reproductive biomedicine, 1719 May 2007: abstracts. - Tartu, 2007. - P. 51. Особистий внесок здобувача - аналіз мононуклеотидної заміни 769G>A в гені INH кількості CGG-повторів в гені FMR1 та мононуклеотидних замін Asn680Ser та Thr307Ala у пацієнтів з ПВЯ та слабкою відповіддю на стимуляцію овуляції.

15. Mutation in genes FSHR, INHa1 and FMR1 encoding proteins involved in premature ovarian failure (POF) / G. Livshits, A. Bichkova, L. Livshits // 6^th Parnas Conference Molecular Mechanism of Cellular Signalling, 30 May - 2 June 2007: abstracts. - Krakow, 2007. - P. 21. Особистий внесок здобувача - аналіз асоціації поліморфних варіантів генів INH, FSHR та FMR1 з показниками індивідуальної чутливості.

16. The assiciation of mutation in FSHR, INHa and FMR1 genes with ovarian dysfunction / G. Livshits, A. Bichkova, L. Livshits // European human genetics conference 16-19 June 2007: abstracts. - Nica. - P. 218. Особистий внесок здобувача - аналіз асоціації поліморфних варіантів генів FSHR, INH, та FMR1 з фенотипом дисфункції яєчників.

17. The study of SNP's in FSH receptor and INHб1 genes in women with diminished ovarian reserve from Ukraine / G. B. Livshits, S. S. Podlesnaja, S. A. Kravchenko // The 9-th International Conference of Systems Biology, 22-28 August 2008: abstracts. - Gothenburg, 2008. - P. 165. Особистий внесок здобувача - аналіз поліморфних варіантів генів FSHR та INH у пацієнтів із зниженим резервом яєчників.

18. The study of mutations in FSH receptor and INHб1 genes in women with ovarian dysfunctions from Ukraine / G. B. Livshits, S. S. Podlesnaja, S. A. Kravchenko // Bridges in Life Sciences Second Annual Scientific Review: interation conference, October 2008: abstracts. - Zagreb, 2008. - Vol. 1, №1. - P. 14. Особистий внесок здобувача - аналіз поліморфних генотипів генів FSHR та INH у пацієнтів з різною індивідуальною чутливістю.

19. Молекулярно-генетичне дослідження порушень природної та стимульованої овуляції / Г. Б. Лівшиць, С. С. Подлєсна, С. А. Кравченко // ІV З'їзд Медичних генетиків України з міжнародною участю, 9 -11 жовтня 2008 р.: тези доп. - Львів, 2008. - C. 19. Особистий внесок здобувача - дослідження поліморфних варіантів генів INH, FSHR та FMR1 у пацієнтів з дисфункцією яєчників та різною відповіддю на стимуляцію овуляції.

АнотаціЯ

Лівшиць Г.Б. Алельний поліморфізм генів INHб, FSHR та FMR1 у пацієнтів з порушенням функції яєчників Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 молекулярна генетика. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена вивченню асоціації поліморфних варіантів генів INHб, FSHR та FMR1 з порушенням функції яєчників та індивідуальною відповіддю на індукцію овуляції.

Встановлено, що частоти розповсюдження гетерозиготних носіїв мононуклеотидної заміни 769GA в гені INHб, алелів „високого ризику” гена FMR1 (4047 CGG-повторів) та носіїв мутантного гаплотипу Ala307-Ser680 гена FSHR статистично вірогідно переважали (р<0,05) в групах пацієнтів з дисфункцією яєчників, та слабкою відповіддю на індукцію овуляції у порівнянні з контрольними групами. Середня кількість фолікулів та ооцитів, отриманих після індукції овуляції, у жінок з даними генотипами були статистично вірогідно менше (p0,05), а середня загальна доза екзогенного гонадотропіну статистично вірогідно більше (p0,001), ніж у жінок з нормальними генотипами. На основі розрахунку показників відносного ризику OR доведено, що дані поліморфні варіанти генів FSHR, INHб та FMR1 можуть використовуватись як маркери для генетичного тестування ризику розвитку наведених патологій.

Ключові слова: алельний поліморфізм, спадкова схильність, генетичні маркери, дисфункція яєчників, індукція овуляції.

Лившиц А.Б. Аллельный полиморфизм генов INHб, FSHR и FMR1 у пациентов с нарушением функции яичников Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению асоциации полиморфних вариантов генов INHб, FSHR и FMR1 с нарушением функции яичников и индивидуальной чувствительностью на индукцию овуляции екзогенным гонадотропином в циклах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

В ходе выполнения данной работы был создан банк лейкоцитарной ДНК пациентов с нарушением функции яичников, пациентов с разным ответом на индукцию суперовуляции экзогенным гонадотропином в циклах ЭКО, фертильных женщин, которые родили ребенка, зачатого естественным путем, до 35-ти (контрольная группа І) и после 35-ти лет (контрольная группа ІІ) из разных регионов Украины.

В группу женщин с дисфункцией яичников (n=102) входили женщины репродуктивного возраста (до 40-а лет), у них наблюдали задержку менструального цикла дольше 6-ти месяцев, а также повышенный уровень фолликулстимулирующего гормона (ФСГ) в сыворотке (больше 9,6 меж. ед. акт. /л). Все пациентки данной группы имели нормальный кариотип 46 ХХ.

Группу „плохих ответчиков” (n=39) составляли женщины репродуктивного возраста, до 40-а лет, которые имели слабый ответ (до 4-х яйцеклеток) на индукцию суперовуляции экзогенным гонадотропином в циклах ЭКО в ответ на дневную дозу 225 300 меж. ед. акт. В группу не были включены пациенты, которым проводили хирургическое вмешательство при лечении маточных труб и яичников, пораженных эндометриозом и кистами.

В группу „хороших ответчиков” (n=40) входили женщины репродуктивного возраста до 40-а лет, которые имели 10 и более яйцеклеток после индукции суперовуляции экзогенним гонадотропином в циклах ЭКО при дневной дозе гонадотропина 125250 меж. ед. акт.

По результатам анализа мононуклеотидной замены 769GA (вариант Ala257Thr) в 2-м экзоне гена INHб установлено, что гетерозиготные носители данного полиморфного варианта статистически достоверно чаще (p0,05) встречались в группе женщин с дисфункцией яичников, а также среди пациентов со слабым ответом (группа „плохих ответчиков”) на индукцию овуляции в циклах ЭКО, по сравнению с контрольнными группами І, ІІ и с группой „хороших ответчиков”.

В ходе исследования мононуклеотидных замен 919A>G (вариант Thr307Ala) и 2039A>G (вариант Asn680Ser) в 10-м экзоне гена FSHR установленно, что в группе женщин с дисфункцией яичников, а также среди пациентов со слабым ответом („плохих ответчиков”) на индукцию овуляции в циклах ЭКО частота мутантного гаплотипа Ala307-Ser680 гена FSHR статистически достоверно превосходила (р<0,05) таковую в контрольной группе І, в контрольной группе ІІ и в группе „хороших ответчиков”.

Доля гетерозиготных носителей аллелей «высокого риска» гена FMR1 (4047 CGG-повторов) в группе женщин с дисфункцией яичников, также статистически достоверно (р<0,05) преобладала, по сравнению с контрольной группой І.

В результате анализа показателей стимуляции овуляции у пациентов с разными генотипами установлено, что среднее количество фолликулов и ооцитов, полученных после индукции овуляции экзогенным гонадотропином в циклах ЭКО у гетерозиготных носителей мононуклеотидной замены 769G>A в гене ІNHб, у гомозигот по мутантному гаплотипу Ala307-Ser680 гена FSHR и у гетерозиготных носителей CGG-аллелей «высокого риска» гена FMR1 было статистически достоверно меньше (p0,05), чем у женщин с нормальным генотипом.

Общая средняя доза экзогенного гонадотропина, необходимая для индукции суперовуляции в циклах ЭКО у пациентов гетерозиготных носителей мононуклеотидной замены 769G>A в гене ІNHб, у гомозигот по мутантному гаплотипу Ala307-Ser680 гена FSHR и у гетерозиготных носителей CGG-аллелей «высокого риска» гена FMR1 была статистически достоверно выше (p0,001), чем у пациентов с генотипами, в состав которых не входили данные полиморфные варианты.

На основе статистически достоверных показателей относительного риска OR (Odds Ratio) можно сделать вывод о целесообразности использования полиморфных вариантов генов FSHR, INHб и FMR1 как ДНК-маркеров для генетического тестирования с целью прогноза риска развития преждевременного истощения яичников и слабого ответа на стимуляцию суперовуляции экзогенным гонадотропином в циклах ЭКО.

Полученные в данной работе результаты позволили сделать вывод о том, что проанализированные полиморфные варианты: мононуклеотидная замена 769GA (вариант Ala257Thr) во 2-м экзоне гена INHб, мононуклеотидные замены 919 A>G (вариант Thr307Ala) и 2039 A>G (вариант Asn680Ser) в 10-м экзоне гена FSHR и CGG-аллели «высокого риска» гена FMR1 являются факторами наследственной предрасположенности преждевременного истощения яичников и формирования индивидуального ответа на индукцию суперовуляции экзогенным гонадотропином в циклах ЭКО.

Полученны доказательства, в пользу того, что аллельные варианты генов INHб, FSHR и FMR1 могут быть использованы как ДНК-маркеры физиологического резерва яичников в программах генетического тестирования.

Ключевые слова: аллельный полиморфизм, наследственная предрасположенность, генетические маркеры, дисфункция яичников, индукция овуляции.

Livshyts G. B. Allelic polymorphism of INHб, FSHR and FMR1 genes in patients with ovarian dysfunction. Мanuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.22 - molecular genetics. Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2009.

The dissertation is devote to studing the association between phenotype and INHб, FSHR and FMR1 genotype in women with ovarian dysfunction and poor response to FSH ovarian stimulation. It was shown that the frequencies of 769G>A in INHб variant heterozygous carriers, mutant haplotype Ala307-Ser680 heterozygous carriers and “high risk” allels of FMR1 gene (4047 CGG-repeats) heterozygous carriers were significantly higher (p<0,05) both in ovarian dysfunction and in “poor responders” groups comparing with control groups. The average number of follicles and oocytes in women with such genotypes was significantly decreased (p0,05) and average gonadotropin doses needed for superovulation induction were significantly higher (p0,001), compared to women with normal genotype. The significant OR (Odds ratio) test values are the evidence that, the analyzed allelic variants in INHб, FSHR and FMR1 genes can be used as like DNA markers for genetic testing of ovarian dysfunction and poor response to exogenous gonadotrophin.

...