Апоптоз мононуклеарів периферичної крові при атопічній бронхіальній астмі

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

АПОПТОЗ МОНОНУКЛЕАРІВ ПЕРИФЕРИЧНОЇ КРОВІ ПРИ АТОПІЧНІЙ БРОНХІАЛЬНІЙ АСТМІ

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Центральній науково-дослідній лабораторії Вищого державного навчального закладу України „Українська медична стоматологічна академія” Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Кайдашев Ігор Петрович, Вищий державний навчальний заклад України „Українська медична стоматологічна академія”, завідувач Центральної науково-дослідної лабораторії, завідувач кафедри внутрішніх хвороб з доглядом за хворими

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Гавриленко Тетяна Іллівна, Національний науковий центр „Інститут кардіології ім. М.Д. Стражеска” АМН України, керівник відділу імунології

доктор медичних наук, професор, академік НАН України Гольцев Анатолій Миколайович, Інститут проблем кріобіології та кріомедицини НАН України, керівник відділу кріопатофізіології і імунології, заступник директора з наукової роботи;

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий 17.04. 2009 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Молчанець О.В.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Апоптоз або програмована клітинна загибель є одним з надзвичайно важливих біологічних процесів, який спрямований на підтримання гомеостазу клітин. За участю апоптозу проходять як нормальні фізіологічні, так і патологічні процеси. Сьогодні встановлено, що дисбаланс в системі регуляції апоптозу лежить в основі розвитку ряду захворювань, асоційованих переважно з його пригніченням (пухлинні, аутоімунні, нейропроліферативні захворювання) або з стимулюванням (СНІД, нейродегенеративні захворювання і т.д.) [Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2000, Kalden J.R., Hermann M., 2003], тому дослідження апоптозу імунних клітин має перспективне значення в імунології.

Вивчення апоптозу мононуклеарних клітин при атопічних алергічних захворюваннях, а саме при атопічній бронхіальній астмі (АБА), є актуальним напрямком сучасних досліджень. Це обумовлено тим, що при АБА підвищена міграція цих клітин до тканин, їх активація, подовжене виживання можуть бути викликані порушенням процесів апоптозу і спричиняти розвиток алергічного запалення [Ohta K., Yamashita N., 1999, Kay A.B., 2002, Kuwano K. et al., 2005, Wardlaw A.J. et al., 2005]. На сьогоднішній день не існує єдиного чіткого погляду на стан апоптозу запальних імунних клітин при АБА, оскільки відзначають як стимулювання [Grzegorczyk J. et al., 2002], так і пригнічення програмованої клітинної загибелі [Vignola A.M. et al., 1999, Lamb J. P. et al., 2005]. Є окремі дані про обернену кореляцію між апоптозом запальних імунних клітин та перебігом АБА [Xu J. et al., 2007]. В цілому, на цей час досліджені лише окремі ланки багатоланцюгових механізмів апоптозу, що безсумнівно вказує на доцільність розширення уявлень про роль різних ланцюгів імунорегуляції апоптозу імунних клітин при АБА.

Важливими гуморальними регуляторами апоптозу є сироваткові фактори (наприклад, цитокіни), які можуть контролювати дані процеси на генетично детермінованому рівні [Kaneko S. et al., 1997], а порушення їх апоптотичної активності може призводити до розвитку та прогресування ряду патологічних станів [Bengtsson A.A. et al., 2004, Minambres E. et al., 2005]. Разом з тим, майже не висвітлені дані, що доводять вплив сироваткових факторів на апоптоз імунних клітин при АБА.

Початковий механізм активації апоптозу тісно пов'язаний з рецепторами, які відіграють вирішальну роль у сприйнятті та передачі летального сигналу. Однією з ключових молекул запуску апоптозу є рецептор Fas (CD95/APO-1) [Peter M.E., Krammer P.H., 2003]. Рецептори Fas у достатній кількості експресують еозинофіли, а активація Fas-FasL сигнального шляху апоптозу в даних клітинах є важливим механізмом пригнічення запалення в органах-мішенях при АБА [Druilhe A. et al., 1996, Бойчук С.В., Мустафин И.Г., 2001]. Але, апоптоз реалізується не тільки через активацію спеціалізованих рецепторів клітинної смерті. Лише останнім часом доведено, що молекули головного комплексу гістосумісності або MHC (Major Histocompatibility Complex) І та ІІ класів медіюють апоптотичні сигнали у Т- і В-лімфоцитах, моноцитах [Rubio G. et al., 2004, Jindra P.T., Reed E.F., 2007], проте відомості стосовно їх участі у регуляції апоптозу мононуклеарів при АБА є обмеженими. Експресія даних молекул виявлена на Т- і В-лімфоцитах, моноцитах периферичної крові та органів-мішеней при АБА [Lara-Marquez M. L. et al., 2001]. Механізми, які лежать в основі МНС І- та ІІ-опосередкованого апоптозу є відмінними від Fas-опосередкованих, але дані форми програмованої смерті однаково завершуються типовими морфологічними змінами [Castaigne J.G. et al., 2002, Daniel D. et al., 2003]. Регуляція процесів апоптозу забезпечується великою кількістю генів, серед яких найбільш відомими є білок Вcl-2 (B-cell leukaemia/lymphoma 2) та білок р53. Ці білки активують значну кількість мішеней, при цьому, Вcl-2 проявляє антиапоптотичну активність, а р53 - проапоптотичну. Експресія даних білків виявлена в еозинофілах, лімфоцитах слизової оболонки бронхів при АБА [Brutsche M.H. et al., 2001, El-Gamal Y. et al., 2004, Васильева М.В., 2006], що свідчить про необхідність вивчення їх участі в регуляції апоптозу.

В зв'язку з вищесказаним, актуальною є проблема розуміння сигналів та механізмів, відповідальних за регулювання процесів апоптозу, що здійснюється даними рецепторами та апоптоз-регулюючими білками в імунних клітинах при АБА. Так, рецептори Fas, молекули МНС І та ІІ класів або білки Bcl-2 та р53 добре відомі і вивчені, визначена їх експресія на/в імунних клітинах у нормі, тоді як їх роль у процесах апоптозу при АБА ще тільки належить вивчити. Дана робота присвячена вивченню стану спонтанного та Fas-, МНС І- або МНС ІІ-індукованого апоптозу з врахуванням впливу сироваткових факторів та рівня експресії білків Bcl-2 та р53 в мононуклеарних клітинах периферичної крові (МНПК) при АБА. Розуміння суті даних процесів дозволить поглибити існуючі і отримати нові знання, а також намітити подальші напрямки корекції патологічних змін при атопічних алергічних захворюваннях.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є фрагментом науково-дослідної роботи Вищого державного навчального закладу України “Українська медична стоматологічна академія” “Регуляція процесів апоптозу лімфоїдних клітин при розвитку алергічних захворювань”, № ДР 0102U001583.

Мета дослідження - визначити стан спонтанного та індукованого апоптозу мононуклеарних клітин периферичної крові при атопічній бронхіальній астмі для з'ясування імунопатогенезу даного захворювання.

Завдання дослідження:

Вивчити стан спонтанного апоптозу мононуклеарних клітин периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму та здорових людей.

Дослідити вплив сироваткових факторів на апоптоз мононуклеарних клітин периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму та здорових людей.

Визначити стан Fas-індукованого апоптозу та вплив сироваткових факторів на мононуклеарні клітини периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму та здорових людей.

Встановити стан МНС І-індукованого апоптозу та вплив сироваткових факторів на мононуклеарні клітини периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму та здорових людей.

З'ясувати стан МНС ІІ-індукованого апоптозу та вплив сироваткових факторів на мононуклеарні клітини периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму та здорових людей.

Об'єкт дослідження - роль апоптозу мононуклеарних клітин периферичної крові в імунологічних механізмах атопічної бронхіальної астми.

Предмет дослідження - характеристика стану апоптозу, спонтанного та індукованого різними факторами, в мононуклеарних клітинах периферичної крові при атопічній бронхіальній астмі.

Методи дослідження. Вирішення поставлених завдань було досягнуто шляхом дослідження апоптозу мононуклеарних клітин периферичної крові з використанням впливу на основні зовнішньоклітинні системи передачі сигналу за допомогою ряду різних індукторів: сироваткові фактори хворих на АБА та здорових людей; анти-CD95, анти-HLA-A,B,C та анти-НLA-DR моноклональні антитіла (мкАТ), які зв'язують відповідно рецептори Fas, молекули МНС І та ІІ класів. Застосовано комплексну оцінку процесів апоптозу мононуклеарних клітин периферичної крові із врахуванням маркерів програмованої клітинної загибелі та використанням сучасних методів дослідження: морфологічних, імуноцитохімічних, молекулярно-біологічних, статистичних.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані нові дані про те, що стійкість до спонтанного апоптозу забезпечується гіперекспресією антиапоптотичного білка Bcl-2, який блокує високу експресію проапоптотичного білка р53 та пригнічує програмовану загибель в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей.

Вперше виявлена антиапоптотична активність сироватки хворих на АБА, що вказує на присутність у ній фактора(-ів), які викликають зниження рівня апоптозу, підвищення експресії білка Bcl-2 та пригнічення експресії білка р53 в МНПК здорових людей та хворих на АБА.

Встановлено, що резистентність до Fas-індукованого апоптозу не є абсолютною, а залежить від впливу сироваткових факторів хворих на АБА та стану експресії проапоптотичного білка р53 в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей.

Вперше визначено диференційовану чутливість до МНС І-індукованого апоптозу, яка залежить від впливу сироваткових факторів та стану активності апоптоз-регулюючих білків Bcl-2 та р53, рівні експресії яких позитивно корелюють в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей.

Отримані нові дані про резистентність до МНС ІІ-індукованого апоптозу, яка найбільше виражена під впливом сироватки хворих на АБА, що викликано модулюванням рівня експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 в МНПК хворих на АБА та здорових людей.

Практичне значення одержаних результатів. Встановлену наявність антиапоптотичної активності сироватки хворих на АБА і її здатність підвищувати експресію антиапоптотичного білка Bcl-2 в МНПК здорових людей та хворих на АБА необхідно враховувати при відборі імунної плазми та сироватки для специфічної серотерапії, при залученні даного біологічного матеріалу для збереження у банку сироваток, при проведенні експериментальних досліджень по модулюванню процесів апоптозу МНПК сироваткою за умов культивування in vitro.

Ідентифіковане підвищення експресії проапоптотичного білка р53 у чутливих та резистентних до Fas-індукованого апоптозу МНПК хворих на АБА може мати перспективне практичне значення, оскільки дозволяє у подальшому провести цілеспрямований пошук та розробку підходів до контролю програмованої загибелі, а саме здійснити пошук препаратів, здатних ініціювати даний процес через р53-опосередковані механізми залежно від стану чутливості МНПК.

Розроблено “Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин периферичної крові” (деклараційний патент на винахід № 2003010400 від 16.01.2003 року), який включає виділення клітин, їх активацію мкАТ до молекул Fas, МНС І та ІІ класів, оцінку рівня апоптозу морфологічними методами, аналіз рівня експресії білків Bcl-2 та р53 імуноцитохімічним методом, та може бути рекомендований для вивчення процесів активаційної загибелі та аналізу їх механізмів регуляції, як у нормі, так і при патологічних процесах, які супроводжуються порушенням у системі апоптозу.

Матеріали дисертації впроваджені в навчальний процес на кафедрах нормальної фізіології; патологічної фізіології; мікробіології, вірусології та імунології; експериментальної та клінічної фармакології з клінічною імунологією та алергологією Вищого державного навчального закладу України “Українська медична стоматологічна академія”, а також на кафедрі біології людини та тварин Полтавського державного педагогічного університету ім. В.Г. Короленка.

Особистий внесок здобувача. У співробітництві з науковим керівником д.мед.н., проф. Кайдашевим І.П. розроблено концепцію дисертаційної роботи. Автором самостійно визначено мету та завдання дослідження, проведено патентно-інформаційний пошук, аналіз вітчизняної та закордонної наукової літератури. Всі дослідження виконані автором самостійно. Автором дисертації самостійно проведений статистичний аналіз результатів дослідження та аналіз всього отриманого фактичного матеріалу, розроблено основні положення та сформульовані висновки роботи у відповідності до мети і завдань дослідження.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації доповідалися на I З'їзді алергологів України (Київ, 2002); IV Міжнародній конференції імунологів і алергологів “Central and Eastern European Conference” (Лодзь, Польща, 2002); V З'їзді імунологів та алергологів СНГ і XVII Всесвітньому конгресі з астми (Санкт-Петербург, Росія, 2003); 58 науково-практичній конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини” (Київ, 2003); засіданнях школи молодих вчених “Сучасні аспекти клінічної імунології та алергології” (Полтава, 2003); І Всеукраїнській науковій конференції “Методологічні аспекти регуляції антигенструктурного гомеостазу нервової, ендокринної та імунної систем” (Запоріжжя, 2006); V Всесвітньому конгресі з імунопатології та алергії і V Європейському конгресі з астми (Москва, Росія, 2007); ІІ Національному конгресі з клінічної імунології та алергології “Сучасні здобутки клінічної імунології та алергології” (Київ-Миргород, 2007); Х Українській науково-практичній конференції з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації (Київ, 2008); на засіданні Апробаційної ради № 1 Вищого державного навчального закладу України „Українська медична стоматологічна академія” (Полтава, 2008), на засіданні міжкафедрального наукового семінару біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 17 наукових робіт, серед них 2 статті у фахових закордонних журналах та 5 статей у журналах, рекомендованих ВАК України, 1 деклараційний патент на винахід, 9 тез доповідей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 159 сторінках друкованого тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу «Матеріали і методи дослідження», 5 розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків, списку використаних джерел, що містить 238 джерела, з яких 227 іноземних авторів. Робота ілюстрована 6 таблицями, 43 рисунками, з яких 12 мікрофото.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні дослідження проведені на мононуклеарних клітинах периферичної крові 25 хворих на АБА віком від 16 до 46 років (основна група дослідження) та 25 практично здорових людей віком від 16 до 45 років (контрольна група). Комісією з етичних питань та біоетики Вищого державного навчального закладу України “Українська медична стоматологічна академія” (протокол № 45 від 16.01.2007) встановлено, що забір крові у пацієнтів, проведення експериментальних наукових досліджень відповідають вимогам норм біоетики.

Дослідження процесів апоптозу проводили на мононуклеарних клітинах, які виділяли із периферичної крові шляхом центрифугування у градієнті густини фікол-верографіну (1,077 г/мл) [Бейум А., 1980]. Сироватки виділяли із периферичної крові та термоінактивували [Новиков Д.К., Новикова В.И., 1979]. Життєздатність МНПК в тесті на виключення барвника трипанового синього складала 98%, при підрахунку кількість МНПК у суспензії становила 3-7х10⁶ клітин/мл [Меньшиков В.В., 1987].

Для вивчення стану та динаміки спонтанного апоптозу в МНПК хворих на АБА та здорових людей були проведені дослідження шляхом аналізу мононуклеарних клітин після їх виділення із периферичної крові та після інкубування (1х10⁶клітин/мл) протягом 24 годин у поживному середовищі з додаванням 10% термоінактивованої сироватки ембріонів телят (СЕТ) (BioMark, Україна). Для всіх експериментів in vitro інкубування МНПК проводили у повному поживному середовищі 199 (ін-тут поліомієліту і вірусних енцефалітів, Росія) з додаванням 10 % (за об'ємом) термоінактивованих сироваток і 100 мкг/мл гентаміцину сульфату (ГНЦЛС, Україна) при 37°С протягом 24 годин.

На наступному етапі для дослідження впливу сироваткових факторів на апоптоз МНПК хворих на АБА та здорових людей, інкубували клітини (1х10⁶ клітин/мл) у поживному середовищі з паралельним додаванням 10% (за об'ємом) термоінактивованих СЕТ, сироватки хворих на АБА або сироватки здорових людей.

Для дослідження стану Fas-, МНС І- та МНС ІІ-опосередкованого апоптозу та впливу сироваткових факторів на МНПК хворих на АБА та здорових людей застосували мкАТ до поверхневих антигенів: анти-CD95 мкАТ (ізотип IgM, клон ІПО-4) до рецепторів Fas, анти-HLA-A,B,C мкАТ (ізотип IgG2a, клон BRA-23/9) до молекул МНС І класу, анти-HLA-DR мкАТ (ізотип IgG3, клон ІПО-10) до молекул МНС ІІ класу (ІЕПОР, Україна) [Шлапацкая Л.Н., 1989, Сидоренко С.П., 1998, Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В., 2002]. Для вирішення поставлених завдань провели серії дослідів, в яких МНПК (1х10⁶ клітин/мл) хворих на АБА та здорових людей інкубували у паралелях відповідно з анти-CD95 мкАТ, анти-HLA-A,B,C мкАТ або анти-HLA-DR мкАТ у дозі 10 мкг/10⁶ клітин/мл та з паралельним додаванням 10% (за об'ємом) термоінактивованих СЕТ, сироватки хворих на АБА або сироватки здорових людей у поживному середовищі. Першим контролем були серії дослідів без додавання мкАТ, а другим - з додаванням СЕТ.

Для дослідження апоптозу МНПК нами був застосований комплексний методичний підхід, що дозволяє оцінити маркери програмованої клітинної смерті, які поетапно характеризують ланцюг подій апоптотичного каскаду від ініціації, регулювання та до кінцевих стадій [Мотуляк А.П., 2002, Kroemer G. et al., 2005].

Для оцінки в МНПК морфологічних змін, характерних для апоптозу, використали забарвлення клітин ДНК-тропним барвником-флуорохромом Hoechst-33342 (Sigma, СШA) з наступним підрахунком на флуоресцентному мікроскопі ЛЮМАМ-Р-8 (ЛОМО, Росія) [Chiu L. et al., 1996]. Додатково, у паралелі, використали забарвлення клітин за методом Май-Грюнвальд-Романовським-Гімза з підрахунком на світловому мікроскопі Біолам Р-11 [Меньшиков В.В., 1987]. Враховували МНПК (%), які мали морфологічні ознаки апоптозу: конденсація хроматину, фрагментація ядра, наявність апоптотичних тілець. Необхідно підкреслити, що саме морфологічна оцінка є стандартом ідентифікації і кількісної оцінки апоптозу [Kroemer G. et al., 2005].

Для виявлення та візуалізації білків регуляторів апоптозу Вcl-2 та р53 застосовували стрептавідин-пероксидазний імуноцитохімічний метод. Використовували мкАТ проти білка Вcl-2 (DAKO, США) і білка р53 (DAKO, США) з попередньою пермеабілізацією клітин та постановкою відповідних контролів [Гуревич Л.Е., Исаков В.А., 1999, Yamashita S., 2007]. Для кількісного вираження ступеня експресії білків Bcl-2 та р53, обраховували середній цитохімічний коефіцієнт (СЦК), який базується на виявленні різного ступеня інтенсивності специфічного забарвлення [Astaldi G., Verga L., 1957]. Для оцінки превалювання апоптоз-регулюючих білків в МНПК додатково аналізували кількісне співвідношення білків Вcl-2/p53.

Для оцінки заключної стадії апоптозу проводили якісний аналіз міжнуклеосомної фрагментації ДНК, яку виділяли з МНПК, згідно інструкції комплекту реагентів (НВФ “ДНК-Технологія”; Росія) і аналізували методом електрофорезу в 2% гелі агарози з візуалізацією результатів в ультрафіолетовому світлі у присутності етидіум броміду [Zakeri Z.F., 1993].

Статистичну обробку отриманих даних проводили за допомогою програми “STATISTICA 6.0”, „MedStat” (серійний номер № MS 00019) [Боровиков В., 2003] з використанням наступних методів: визначали нормальність розподілу (критерій “хі-квадрат”), парний t-тест Ст'юдента для підрахунку змін у групі даних, двохвибірковий t-тест Ст'юдента для порівняння показників у двох незалежних групах даних, залежність між досліджуваними показниками оцінювали кореляційним аналізом Пірсона. Визначали наступні параметри: середнє арифметичне (М), помилку середнього арифметичного (m) та середнє квадратичне відхилення (або стандартне відхилення) (д). Різницю вважали вірогідною при досягненні рівня значущості (р) не більше 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення.

Дослідження стану спонтанного апоптозу показало, що початковий рівень в 1,2 рази нижче в мононуклеарних клітинах після виділення із периферичної крові хворих на АБА у порівнянні із здоровими людьми (р<0,05). Рівень апоптозу після інкубації через 24 години в 1,4 рази вище в МНПК хворих на АБА, ніж у здорових людей (р<0,05). Отже, отримані дані свідчать про підвищену стійкість до спонтанного апоптозу МНПК хворих на АБА. Літературні дані також вказують на порушення апоптозу в лімфоцитах при АБА [Vignola A.M. et al., 1999, Бойчук С.В. и др., 2002].

Встановлено, що початкові рівні експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 та проапоптотичного білка р53 в мононуклеарних клітинах після виділення із периферичної крові вищі у хворих на АБА, ніж у здорових людей (р<0,05). Проте, не виявлено різниці у рівнях експресії білків Bcl-2 та р53 після інкубації через 24 години між МНПК хворих на АБА та здорових людей (р>0,05). Аналіз кількісного співвідношення експресії білків Bcl-2/р53 дозволив виявити у 2 рази вищий рівень експресії Bcl-2, ніж р53 в МНПК хворих на АБА та здорових людей як до, так і після 24 годинного інкубування (р<0,05Одержані дані свідчать, що високий початковий рівень експресії білка Bcl-2 визначає рівень антиапоптотичного захисту та регулює активність білка р53 в МНПК хворих на АБА. Виявлена початкова гіперекспресія білка р53 в МНПК хворих на АБА може вказувати на підвищену готовність клітин до апоптозу, який з певних причин не отримує розвитку. На таку можливість вказують дані про пригнічення активності білка р53 на транскрипційному рівні в МНПК при АБА [Brutsche M.H., 2001]. Отже, при АБА “працює” молекулярний реостат Bcl-2/р53, який у значній мірі визначає апоптотичну активність МНПК.

Не дивлячись на те, що розщеплення ДНК на міжнуклеосомні фрагменти вважається однією з найбільш характерних біохімічних рис апоптозу, нам не вдалося його виявити в мононуклеарних клітинах після виділення із периферичної крові або після інкубації через 24 години в МНПК хворих на АБА та здорових людей.

Таким чином, отримані результати свідчать про дисбаланс стану спонтанного апоптозу в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей. Даний дисбаланс полягає у вираженому пригніченні початкового рівня апоптозу, підвищенні початкового рівня експресії білків Bcl-2 та р53, із кількісним співвідношенням експресії даних білків 2:1, відсутність фрагментації ДНК в МНПК хворих на АБА.

Відомо, що сироваткові фактори (наприклад, цитокіни) можуть виступати регуляторами апоптозу імунних клітин [Kay A.B., 2002]. При будь-яких стресових впливах, зокрема і під впливом факторів, які надходять із вогнища запалення можуть виникати порушення у їх дії на апоптоз [Bengtsson A.A. et al., 2004, Minambres E. et al., 2005]. Тому, з метою з'ясування характеру впливу сироваткових факторів хворих на АБА на апоптоз було досліджено їх дію на МНПК хворих на АБА та здорових людей.

Встановлено, що внесення сироватки хворих на АБА викликає зниження рівня апоптозу в 1,3 рази в МНПК здорових людей та хворих на АБА у порівнянні із СЕТ (контроль) або із сироваткою здорових людей (р<0,05). Внесення сироватки здорових людей призвело до відновлення рівня апоптозу в МНПК хворих на АБА та здорових людей у порівнянні із СЕТ (р>0,05). Отже, отримані результати свідчать, що сироватка хворих на АБА містить фактор(-и), які пригнічують апоптоз МНПК здорових людей та хворих на АБА.

Внесення сироватки хворих на АБА викликало підвищення в 1,2 рази рівня експресії білка Bcl-2 в МНПК здорових людей (р<0,05), та навпаки відновлення даного показнику в МНПК хворих на АБА. Внесення сироватки хворих на АБА призвело до зниження в 1,3 рази рівня експресії білка р53 в МНПК хворих на АБА (р<0,05). При внесенні сироватки здорових людей рівні експресії білків Bcl-2 та р53 мали тенденцію до відновлення в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р>0,05). Встановлено залежність рівня експресії білка р53 при дії СЕТ від рівня експресії білка р53 при дії сироватки хворих на АБА в МНПК здорових людей (r= - 0,62; р<0,05). Одержані дані дозволяють припускати, що активність білків Bcl-2 та р53 регулюється сироватковими факторами, а точніше цитокіновою мережею в МНПК при АБА.

Таким чином, сироваткові фактори хворих на АБА проявляють антиапоптотичну активність здійснюючи вплив на пригнічення рівня апоптозу та експресії проапоптотичного білка р53, підвищення експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 в МНПК здорових людей та хворих на АБА.

Враховуючи, що Fas-опосередкований апоптоз в лімфоцитах є регуляторним механізмом, який перешкоджає накопиченню ефекторних клітин і нерегульованій продукції цитокінів [Хаитов Р.М., и др., 2006] наступним етапом дослідження стало вивчення стану Fas-індукованого апоптозу та впливу сироваткових факторів на МНПК хворих на АБА та здорових людей.

Встановлено (рис. 1), що зв'язування анти-CD95 мкАТ у присутності СЕТ та сироватки здорових людей призвело до стимулювання апоптозу в МНПК хворих на АБА (р<0,05). Зв'язування анти-CD95 мкАТ у присутності сироватки хворих на АБА викликало резистентність до апоптозу в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р<0,05).

Виявлено, що сироватка хворих на АБА на відміну від СЕТ більш виражено пригнічує апоптоз, індукований анти-CD95 мкАТ в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р<0,05). Отримані дані щодо стійкості до Fas-індукованого апоптозу узгоджуються з даними інших авторів [Jayaraman S. et al., 1999, Spinozzi F. et al., 1997, 1998, Mezei G. et al., 2006].

Відзначено відновлення рівня експресії білка Bcl-2 після зв'язування анти-CD95 мкАТ у присутності СЕТ, сироватки хворих на АБА або здорових людей в МНПК хворих на АБА (р>0,05). Однак, відмічено різні тенденції у рівні експресії білка Bcl-2 після зв'язування анти-CD95 мкАТ в МНПК здорових людей в залежності від виду сироваткових факторів: 1) відсутність змін у присутності СЕТ (р>0,05); 2) підвищення у 1,4 рази у присутності аутологічної сироватки (р<0,05), та 3) зниження у 1,3 рази у присутності сироватки хворих на АБА (р<0,05). Зареєстровано (рис. 2) підвищення рівня експресії білка р53 в 1,4 рази після зв'язування анти-CD95 мкАТ у присутності СЕТ або сироватки хворих на АБА в МНПК хворих на АБА (р<0,05). Виявлено однакове кількісне співвідношення експресії білків Bcl-2/р53 після зв'язування анти-CD95 мкАТ у присутності СЕТ або аутологічної сироватки в МНПК хворих на АБА. Отримані дані про вплив активації рецепторів Fas на рівень експресії білка Bcl-2 корелюють з даними інших дослідників, які показали, що даний білок є слабким антагоністом Fas-індукованого апоптозу, оскільки його активність блокується Daxx, протеїнкіназами С (ПКС) або MAPK [Фильченков А.А., и др., 2002, Farley N. et al., 2006, Manicassamy S. et al., 2007].

Таким чином, отримані результати свідчать, що зв'язування рецепторів Fas з анти-CD95 мкАТ у присутності сироваткових факторів в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей може викликати два типи відповіді на індукцію апоптозу - стимуляцію або резистентність. Встановлено, що стимуляція Fas-індукованого апоптозу відбувається у присутності СЕТ або сироватки здорових людей за участю проапоптотичного білка р53. Резистентність до Fas-індукованого апоптозу проявляється у присутності сироватки хворих на АБА та відзначається збалансованістю взаємодії анти- та проапоптотичних білків, а саме Bcl-2 та р53.

Враховуючи, що молекули МНС І та ІІ класів відіграють важливу роль у регуляції імунної відповіді [Ярилин А.А., 2003], процесах активації [Kowal K. et al., 2003, Lensmar C. et al., 2006] та апоптозу [Daniel D. et al, 2004, Narayanan K. et al., 2006, Lee D.A., Molinaro G.A., 2003, Bertho N. et al., 2002] імунних клітин нами досліджено участь молекул МНС І та ІІ в індукції апоптозу та вплив сироваткових факторів на МНПК хворих на АБА та здорових людей.

Встановлено (рис. 3), що зв'язування анти-HLA-A,B,C мкАТ у присутності СЕТ або сироватки здорових людей призвело до підвищення, а у ряді випадків відновлення рівня апоптозу в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р<0,05). Навпаки, зв'язування анти-HLA-A,B,C мкАТ у присутності сироватки хворих на АБА викликало пригнічення рівня апоптозу в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р<0,05). Подібний апоптоз-індукуючий ефект анти-HLA-A,B,C мкАТ відмічений іншими авторами в неактивованих лімфоцитах здорових людей [Woodle E.S., et al, 1997], а ще більше посилення цього впливу відбувається при додатковій дії ІЛ-2, ІФН-г або розчинною формою молекул MHC I класу [Genestier L. et al., 1997, Contini P. et al., 2003]. Разом з тим, нами встановлена резистентність до МНС І-індукованого апоптозу під впливом аутологічної сироватки в МНПК хворих на АБА може бути обумовлена недостатністю дії ряду факторів (напр., факторів росту) [Assa-Kunik E., 2003].

Зареєстровано (рис. 4) підвищення рівня експресії білків Bcl-2 та р53 (р<0,05) після зв'язування анти-HLA-A,B,C мкАТ у присутності сироватки хворих на АБА в МНПК хворих на АБА та здорових людей. Але, виявлено зниження рівня експресії білка Bcl-2 після зв'язування анти-HLA-A,B,C мкАТ у присутності СЕТ в МНПК хворих на АБА.

Відновлення рівнів експресії білків Bcl-2 та р53 відзначено після зв'язування анти-HLA-A,B,C мкАТ у присутності сироватки здорових людей в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р>0,05). Кореляційним аналізом встановлено залежність рівня експресії білка Вcl-2 від рівня експресії білка р53 після зв'язування анти-HLA-A,B,C мкАТ у присутності аутологічної сироватки в МНПК хворих на АБА (r=0,576; р<0,05). Отримані дані дозволяють зробити висновок, що активація білка Bcl-2 є важливим регуляторним механізмом блокування МНС І-індукованого апоптозу в МНПК хворих на АБА та здорових людей. Аналогічні результати стосовно пригнічення МНС І-опосередкованого апоптозу на фоні високої експресії Bcl-2 зареєстровані іншими авторами, що обумовлено активацією ПКС [Ruvolo P.P. et al., 1998, Jin Y.P. et al., 2004]. Високий рівень експресії білка р53 може визначати готовність до стимуляції МНС І-індукованого апоптозу, зокрема через стрес-активовані протеїнкінази JNK [Lamberth K. et al., 2001].

Таким чином, зв'язування молекул МНС І класу з анти-HLA-A,B,C мкАТ під впливом сироваткових факторів викликає диференціацію у розвитку апоптозу в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей. Стимуляція МНС І-індукованого апоптозу реєструється під впливом факторів СЕТ за рахунок пригнічення експресії білка Bcl-2 та підвищення експресії білка р53 в МНПК хворих на АБА. Резистентність до МНС І-індукованого апоптозу визначається впливом аутологічної сироватки та підвищенням експресії білка Bcl-2, який у 1,5 рази перевищує експресію білка р53 та позитивно з ним корелює в МНПК хворих на АБА.

На наступному етапі роботи досліджено стан МНС ІІ- індукованого апоптозу та вплив сироваткових факторів на МНПК хворих на АБА та здорових людей. В отриманих результатах привернув увагу той факт, що зв'язування анти-HLA-DR мкАТ викликало лише відновлення рівня апоптозу в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей, що на перший погляд не залежало від виду внесеної сироватки (р>0,05). Проте проаналізувавши ці дані, ми з'ясували, що рівень апоптозу був вірогідно нижчим при внесенні сироватки хворих на АБА у порівнянні з іншими сироватками в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р<0,05). Була відмічена паралельна тенденція у вираженому пригніченні рівня апоптозу після зв'язування анти-HLA-DR мкАТ у присутності СЕТ або аутологічної сироватки в МНПК здорових людей (р<0,05). Такий виражений інгібіторний вплив сироватки хворих на АБА на стан МНС ІІ-індукованого апоптозу в МНПК хворих на АБА може бути пояснений високою концентрацією у сироватці розчинної форми молекул МНС ІІ класу, які можуть блокувати апоптоз [Максимова А.В., 2005].

Виявлено підвищення рівня експресії Bcl-2 після зв'язування анти-HLA-DR мкАТ у присутності аутологічних сироваток в МНПК хворих на АБА та здорових людей (р<0,05). Навпаки, пригнічення рівня експресії Bcl-2 (р<0,05) та р53 (р<0,05) спостерігали після зв'язування анти-HLA-DR мкАТ у присутності сироватки здорових людей в МНПК хворих на АБА, а також у присутності сироватки хворих на АБА в МНПК здорових людей. Визначена залежність рівня апоптозу від рівня експресії білка Вcl-2 після зв'язування анти-HLA-DR мкАТ у присутності аутологічної сироватки в МНПК хворих на АБА (r= - 0,418; р<0,05). Отримані дані свідчать, що внаслідок активації молекул МНС ІІ класу та дії аутологічних сироваток може відбуватись, зокрема опосередкована через ПКС, стимуляція білка Bcl-2, який по принципу зворотного зв'язку блокує апоптоз та білок р53 [Jindra P.T., Reed E.F., 2007].

Таким чином, зв'язування молекул МНС ІІ класу з анти-HLA-DR мкАТ під впливом сироваткових факторів викликає резистентність до апоптозу в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей. Резистентність до МНС ІІ-індукованого апоптозу найбільше виражена під впливом сироватки хворих на АБА за рахунок посилення експресії антиапоптотичного білка Bcl-2, рівень якого негативно корелює з рівнем апоптозу в МНПК хворих на АБА.

Узагальнюючи отримані дані можна відзначити, що активація рецепторів Fas, молекул МНС І та ІІ класів за умов дії факторів сироватки хворих на АБА викликає резистентність до апоптозу в МНПК при АБА. Резистентність до апоптозу обумовлена декількома факторами. Перш за все, це гіперекспресія антиапоптотичного білка Bcl-2, який попереджує активацію апоптозу. Окрім того, подекуди, відмічається гіперекспресія проапоптотичного білка р53, попередника активного апоптозу. По принципу негативної регуляторної петлі білок Bcl-2 репресує білок р53, що вносить вклад у відміну активного розвитку Fas-, МНС І- або МНС ІІ-індукованих сигналів апоптозу. Більш того, фактори сироватки хворих на АБА здійснюють додатковий могутній антиапоптотичний ефект, який реалізується через підвищення експресії білка Bcl-2. Припускають, що стійкість до апоптозу, індукованого зв'язуванням рецепторів Fas, молекул МНС І та МНС ІІ класів у присутності сироватки хворих на АБА викликана існуванням особливої “селекції”, спрямованої на дозрівання апоптоз-резистентних CD4⁺ Т-лімфоцитів у хворих на АБА [Кайдашев И.П. и др., 2006].

Разом з тим, не можемо не відзначити, що апоптоз МНПК при АБА не є абсолютно блокованим і може стимулюватись через активацію рецепторів Fas та молекул МНС І класу за участю проапоптотичного білка р53 у присутності сироваткових факторів. На таку можливість вказують роботи ряду авторів [Holtzman M.J. et al., 2000, Бойчук С.В., 2002], в яких встановлено, що при АБА незначна за кількістю Тх1 популяція лімфоцитів є високо чутливою до Fas-індукованого апоптозу, тоді як, навпаки, кількісно переважаюча Тх2 популяція лімфоцитів, які підтримуються поліклональними сигналами виживання, є стійкою до Fas-індукованого апоптозу.

Таким чином, отримані дані свідчать, що резистентність до апоптозу (спонтанного та індукованого) при АБА визначається як клітинними факторами, так і дією сироваткових факторів і може бути важливим елементом патогенезу захворювання, оскільки дає можливість клітинам тривало персистувати в органах-мішенях, спричиняючи або підтримуючи алергічне запалення. периферичний мононуклеар індукований апоптоз

Висновки

У роботі отримані дані про порушення спонтанного та індукованого, зв'язуванням рецепторів Fas (CD95/APO-1), молекул МНС І та ІІ класів процесів апоптозу у присутності факторів сироватки хворих на атопічну бронхіальну астму в мононуклеарних клітинах хворих на атопічну бронхіальну астму на відміну від мононуклеарних клітин здорових людей.

Мононуклеарні клітини периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму на відміну від мононуклеарних клітин периферичної крові здорових людей мають знижений початковий рівень спонтанного апоптозу (р<0,05), підвищені початкові рівні експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 (р<0,05) та проапоптотичного білка р53 (р<0,05), із кількісним співвідношенням експресії даних білків відповідно 2:1 (р<0,05), міжнуклеосомна фрагментація ДНК відсутня.

Сироватка хворих на атопічну бронхіальну астму на відміну від сироватки здорових людей або сироватки ембріонів телят містить фактор(-и), які пригнічують процеси апоптозу за рахунок підвищення експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 та зниження експресії проапоптотичного білка р53 в мононуклеарних клітинах периферичної крові здорових людей та хворих на атопічну бронхіальну астму (р<0,05).

Мононуклеарні клітини периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму та мононуклеарні клітини периферичної крові здорових людей після зв'язування рецепторів Fas анти-CD95 моноклональними антитілами проявляють стійкість до апоптозу під впливом сироватки хворих на атопічну бронхіальну астму за рахунок балансу білків з антиапоптотичною (Bcl-2) та проапоптотичною (р53) активністю (р<0,05), та навпаки, відповідають індукцією апоптозу під впливом сироватки ембріонів телят або сироватки здорових людей за рахунок підвищення експресії проапоптотичного білка р53 (р<0,05).

В мононуклеарних клітинах периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму подібно до мононуклеарних клітин периферичної крові здорових людей зв'язування молекул МНС І класу анти-HLA-A,В,С моноклональними антитілами під впливом сироватки ембріонів телят стимулює індукцію апоптозу, зниження експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 (р<0,05), тоді як під впливом сироватки хворих на атопічну бронхіальну астму викликає стійкість до апоптозу, підвищення у 1,5 рази рівня експресії антиапоптотичного білка Bcl-2 (р<0,05) та у 1,75 рази рівня експресії проапоптотичного білка р53 (р<0,05), з кількісним переважанням у 1,5 рази першого апоптоз-регуляторного білка (р<0,05).

Мононуклеарні клітини периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму на відміну від мононуклеарних клітин периферичної крові здорових людей після зв'язування молекул МНС ІІ класу анти-HLA-DR моноклональними антитілами під впливом сироватки хворих на атопічну бронхіальну астму є резистентними до апоптозу за рахунок підвищення експресії антиапоптотичного білка Вcl-2 (р<0,05).

Список опублікованих робіт за темою дисертації

1. Мамонтова Т.В. Роль молекул МНС І класу в регуляції процесів апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові хворих на атопічну бронхіальну астму / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев //Імунологія та алергологія. - 2004. - № 3. - С. 10-14. (Проведення експериментальних досліджень, аналіз літератури, статистичний аналіз результатів, написання статті).

2. Мамонтова Т.В. Fas-індукований апоптоз мононуклеарних клітин периферійної крові хворих на атопічну бронхіальну астму / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев //Астма та алергія. - 2004. - № 3-4. - С. 44-47. (Проведення експериментальних досліджень, аналіз літератури, статистичний аналіз результатів, написання статті).

3. Мамонтова Т.В. Состояние CD95-, МНС І- и МНС ІІ-опосредованного апоптоза у больных атопической бронхиальной астмой / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев //Иммунология. - 2004. - Т. 25. - № 4. - С. 198-201. (Проведення експериментальних досліджень, аналіз літератури, статистичний аналіз результатів, написання статті).

4. Мамонтова Т.В. Спонтанний апоптоз та експресія білків Bcl-2 і Р53 мононуклеарних клітин периферійної крові у хворих на атопічну бронхіальну астму / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев //Імунологія та алергологія. - 2005. - № 3. - С. 43-46. (Проведення експериментальних досліджень, аналіз літератури, статистичний аналіз результатів, написання статті).

5. Мамонтова Т.В. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев //Аллергология. - 2005. - № 4. - С. 15-23. (Аналіз літератури, експериментальне обґрунтування стану апоптозу мононуклеарних клітин при атопічній бронхіальній астмі, написання статті).

6. Мамонтова Т.В. Інгібіторний вплив сироватки хворих на атопічну бронхіальну астму на стан апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев //Імунологія та алергологія. - 2005. - № 4. - С. 42-45. (Проведення експериментальних досліджень, аналіз літератури, статистичний аналіз результатів, написання статті).

7. Мамонтова Т.В. Стійкість до апоптозу, індукованого зв'язуванням молекул МНС ІІ класу в мононуклеарних клітинах периферичної крові хворих на атопічну бронхіальну астму: роль апоптоз-регуляторних білків / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев //Імунологія та алергологія. - 2007. - № 3. - С. 27-31. (Проведення експериментальних досліджень, аналіз літератури, статистичний аналіз результатів, написання статті).

8. Деклараційний патент на винахід UA 60629А, МПК А61В5/00, А61К39/00. Спосіб індукції апоптозу мононуклеарних клітин периферійної крові /Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев, Н.Л. Куценко, Т.В. Кривонос (UA). - № 2003010400; Заявл. 16.01.2003; Опубл. 15.10.2003; Бюл. № 10. - 2 с.

9. Мамонтова Т.В. Вивчення впливу зв'язування молекул МНС І та ІІ класів і CD95 з моноклональними антитілами на апоптоз мононуклеарних клітин периферійної крові хворих з атопією / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев, О.М. Садовнік //Матеріали наукових праць I з'їзду алергологів України. - 2002. - С. 69-70.

10. Kaidashev I.P. The influence of molecules MHC I and II classes and CD95 linkage by monoclonal antibodies on apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in atopic patients / I.P. Kaidashev, T.V. Mamontova, E.I. Kaidasheva, O.M. Sadovnik //4^th Central and Eastern European Conference. - 12-15 June 2002, Lodz, Poland. - Alergia Asthma Immunologia. - 2002. - Vol. 7(2). - P. 135.

11. Мамонтова Т.В. Апоптоз мононуклеарных клеток периферической крови больных атопической аллергией опосредован через CD95, МНС І и МНС ІІ молекулы / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев, Л.В. Беркало [и др.] //V съезд иммунологов и аллергологов СНГ и XVII Всемирный конгресс по астме. - 8-11 июля 2003, Санкт-Петербург, Россия. - Аллергология и иммунология. - 2003. - Т. 4. - № 2. - С. 79.

12. Мамонтова Т.В. Апоптоз мононуклеарних клітин периферійної крові атопічних пацієнтів //58 науково-практична конференція студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю “Актуальні проблеми сучасної медицини”. -28-31 жовтня 2003 року. - Київ, 2003. - С. 58.

13. Мамонтова Т.В. CD95-опосредованный апоптоз мононуклеарных клеток периферической крови у больных бронхиальной астмой / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев, Т.В. Кривонос, Е.Н. Садовник //Матеріали школи молодих вчених “Сучасні аспекти клінічної імунології та алергології”. - 16-18 грудня 2003 року. - Полтава. - Проблеми екології та медицини. - 2003. - Т. 7. - № 5-6. - С. 36.

14. Мамонтова Т.В. МНС І-опосередкований апоптоз мононуклеарних клітин периферійної крові хворих на атопічну бронхіальну астму / Т.В. Мамонтова, І.П. Кайдашев //1 Всеукраїнська наукова конференція “Методологічні аспекти регуляції антигенструктурного гомеостаза нервовою, ендокринною і імунною системами”. - 14-16 вересня 2004 року. - Запоріжжя. - Вісник Запорізького національного університету. - Біологічні науки. - 2006. - № 1. - С. 177.

15. Мамонтова Т.В. Влияние связывания молекул МНС І и МНС ІІ классов с моноклональными антителами на апоптоз, экспрессию антиапоптотического белка Bcl-2 и проапоптотического белка р53 в мононуклеарных клетках периферической крови больных атопической бронхиальной астмой / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев //V Всемирный конгресс по иммунопатологии и аллергии, V Европейский конгресс по астме. - 21-24 апреля 2007 года. - Москва, Россия. - Аллергология и иммунология. - 2007. - Т. 8. - № 1. - С. 35.

16. Мамонтова Т.В. Ингибирование апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови здоровых людей сывороткой больных атопической бронхиальной астмой / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев //ІІ Національний конгрес з імунології, алергології та імунореабілітації на тему «Сучасні досягнення клінічної імунології та алергології». - 19-23 жовтня 2007 року. - Київ-Миргород. - Імунологія та алергологія. - 2007. - № 3. - С. 102.

17. Мамонтова Т.В. Исследование апоптоза, индуцированного связыванием молекул МНС ІІ класса в мононуклеарных клетках периферической крови больных атопической аллергией / Т.В. Мамонтова, И.П. Кайдашев //Х Українська науково-практична конференція з актуальних питань клінічної і лабораторної імунології, алергології та імунореабілітації. - 22-23 квітня 2008 року. - Київ. - Імунологія та алергологія. - 2008. - № 1. - С. 41-42.

Анотація

Мамонтова Т.В. Апоптоз мононуклеарів периферичної крові при атопічній бронхіальній астмі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.09 - імунологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Дисертацію присвячено дослідженню апоптозу, спонтанного та індукованого різними факторами в мононуклеарних клітинах периферичної крові (МНПК) при атопічній бронхіальній астмі (АБА) для з'ясування імунопатогенезу даного захворювання.

При дослідженні стану спонтанного апоптозу було встановлено дисбаланс, який полягає у вираженому пригніченні спонтанного апоптозу, що обумовлено підвищенням експресії білка Bcl-2, який виступає блокатором гіперекспресії білка р53 в МНПК хворих на АБА на відміну від здорових людей. Зв'язування анти-CD95 моноклональних антитіл (мкАТ) з рецепторами Fas у присутності сироватки хворих на АБА викликає стійкість до апоптозу та підвищення експресії білка р53 в МНПК хворих на АБА та здорових людей. Зв'язування анти-HLA-A,В,С мкАТ з молекулами МНС І класу у присутності сироватки хворих на АБА викликає стійкість до апоптозу, підвищення рівня експресії білка Bcl-2 в МНПК хворих на АБА та здорових людей. Зв'язування анти-HLA-DR мкАТ з молекулами МНС ІІ класу в присутності сироватки хворих на АБА викликає резистентність до апоптозу, підвищення експресії білка Bcl-2 в МНПК хворих на АБА та здорових людей.

Аннотация

Мамонтова Т.В. Апоптоз мононуклеаров периферической крови при атопической бронхиальной астме. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 - иммунология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Диссертация посвящена исследованию апоптоза, спонтанного и индуцированного различными факторами в мононуклеарних клетках периферической крови (МНПК) при атопической бронхиальной астме (АБА) для выяснения иммунопатогенеза данного заболевания.

При исследовании состояния спонтанного апоптоза был установлен дисбаланс в МНПК больных АБА в отличие от здоровых людей. Данный дисбаланс выражается в подавлении спонтанного апоптоза, что обусловлено повышением уровня экспрессии антиапоптотического белка Bcl-2 и его блокирующим действием на гиперэкспрессию проапоптотического белка р53 в МНПК больных АБА. При этом, уровень апоптоза негативно коррелирует с уровнем экспрессии белка р53 в МНПК больных АБА. Связывание анти-CD95 моноклональных антител (мкАТ) с рецепторами Fas в присутствии сыворотки эмбрионов телят (СЭТ) или сыворотки здоровых людей приводит к стимуляции апоптоза, а в присутствии сыворотки больных АБА - устойчивости к апоптозу в МНПК больных АБА и здоровых людей. Связывание анти-CD95 мкАТ в присутствии различных сывороток вызывает только восстановление уровня экспрессии белка Bcl-2 в МНПК больных АБА. Выявлено повышение экспрессии проапоптотического белка р53 у резистентных и чувствительных к Fas-индуцированному апоптозу МНПК больных АБА. Связывание анти-HLA-A,В,С мкАТ с молекулами МНС І класса в присутствии СЭТ стимулирует апоптоз, снижение экспрессии белка Bcl-2 в МНПК больных АБА в отличие от здоровых людей. Напротив, связывание анти-HLA-A,В,С мкАТ в присутствии сыворотки больных АБА вызывает устойчивость к апоптозу, повышение экспрессии белка Bcl-2 и р53, между которыми обнаружена положительная взаимосвязь в МНПК больных АБА. Связывание анти-HLA-DR мкАТ с молекулами МНС ІІ класса в присутствии сыворотки больных АБА вызывает устойчивость к апоптозу, увеличение экспрессии белка Bcl-2, который количественно в 2 раза преобладает над уровнем экспрессии белка р53 в МНПК больных АБА и здоровых людей. Более того, уровень экспрессии белка Bcl-2 обратно коррелирует с уровнем МНС ІІ-опосредованного апоптоза в присутствии аутологической сыворотки в МНПК больных АБА.

Summary

Mamontova T.V. Apoptosis of peripheral blood mononuclear cells at atopic bronchial asthma. - A manuscript.

The thesis for the candidate of biological science degree in specialty 03.00.09 - Immunology. - Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2009.

The thesis is dedicated to investigating the state of apoptosis spontaneous and induced by different factors of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) at atopic bronchial asthma for the purpose of elucidation of the immunopathogenesis this disease.

We show that PBMCs from patients with atopic bronchial asthma (ABA) are more resistant to spontaneous apoptosis and exhibit enhanced expression of Bcl-2 protein compared with healthy donors (HD). Cross-linking Fas receptors by anti-CD95 monoclonal antibodies (mAb) on PBMCs from patients with ABA and HD induced resistance to Fas-mediated apoptosis in the presence of serum from patients with ABA. Moreover, expression of р53 protein tended to increase following activation, but expression of Bcl-2 protein declined. Cross-linking MHC class I molecules by anti-HLA-ABC mAb on PBMCs from patients with ABA and HD in the presence of serum from patients with ABA led to decreased apoptosis and enhanced expression of Bcl-2 protein. Cross-linking MHC class II molecules by anti-HLA-DR mAb on PBMCs from patients with ABA and HD in the presence of autologic sera decreased apoptosis and enhanced Bcl-2 expression.