Вплив екзогенних нейропептидів на ендокринну функцію підшлункової залози та асоційовані метаболічні процеси в нормі і при цукровому діабеті (експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА

«ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ ЕНДOКРИННОЇ ПАТОЛОГІЇ

ім. В.Я.ДАНИЛЕВСЬКОГО» АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

УДК 615.357:577.175.82].015:616.379-008.64-092.9

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Вплив екзогенних нейропептидів на ендокринну функцію підшлункової залози та асоційовані метаболічні процеси в нормі і при цукровому діабеті (експериментальне дослідження)

14.01.14 - ендокринологія

Тржецинський Сергій Дмитрович

Харків - 2011

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Запорізькому державному медичному університеті МОЗ України

Науковий консультант: доктор медичних наук, професор Колесник Юрій Михайлович, Запорізький державний медичний університет, ректор, завідувач кафедри патологічної фізіології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, старший науковій співробітник Калинська Людмила Миколаївна, Державна установа «Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України», головний науковий співробітник відділу фундаментальних проблем ендокринології;

доктор біологічних наук, старший науковій співробітник Горбенко Наталія Іванівна, Державна установа «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України», завідувачка відділу експериментальної фармакології і токсикології;

доктор медичних наук Михайличенко Тетяна Євгенівна, Донецький національний медичний університет ім. М. Горького, доцент кафедри клінічної імунології, алергології та ендокринології.

Захист відбудеться « 19 » травня 2011 р. о 13.00 годині на засіданні спеціалізованої ради Д 64.564.01. при Державній установі «Інституті проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України» за адресою: 61002, м. Харків, вул. Артема, 10.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Державної установи «Інститут проблем ендокринної патології ім. В.Я. Данилевського АМН України» (61002, м. Харків, вул. Артема, 10).

Автореферат розісланий « 12 » квітня 2011р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Ж.А. Лещенко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Однією з найбільш актуальних проблем клінічної медицини є хвороби обміну речовин і, зокрема, цукровий діабет (ЦД), який посідає лідируючі позиції не лише в структурі ендокринних хвороб, але і серед захворювань неінфекційної природи. Частота ЦД в промислово розвинених країнах складає в середньому 3-6 % загальної чисельності населення. Згідно з оцінками ВОЗ і Міжнародної Діабетичної Асоціації кількість хворих на ЦД збільшилася зі 100 млн. у 1994 році до 246 млн. у 2007 році, а за прогнозами в 2025 році хвороба може досягти 380 млн, серед яких 95 % складатимуть хворі на ЦД 2 типу (Wild S. et al., 2004).

В Україні за офіційною статистикою нараховують біля одного мільйона хворих на ЦД, проте їх реальна кількість може бути в кілька разів більшою (Тронько М.Д., 2000; Ефімов А.С., Маньковський Б.М., Костюк Е.П та співавт. 2000). Велика соціальна значущість цього захворювання полягає в тому, що воно призводить до ранньої інвалідизації і летальності у зв'язку з судинними ускладненнями діабету, серед яких - діабетичні мікроангіопатії, макроангіопатії та невропатії, гангрена, інфаркт міокарду, інсульт (Campbell R.K., Martin T.M., 2009).

Попри те, що довгий час ЦД 1 типу розглядали як результат незворотної втрати панкреатичних бета-клітин, а початковою причиною розвитку ЦД 2 типу вважали інсулінорезистентність, на сьогодні основною патогенетичною ланкою, що пов'язує обидва типи ЦД, називають дефіцит маси бета-клітин і відповідне зниження секреції інсуліну (Meier J.J., 2008).

Припускають, що однією з основних причин значного зниження маси панкреатичних бета-клітин як при 1 типі, так і при 2 типі ЦД є посилення в них апоптичних процесів (Butler A.E., Janson О., 2003; Campbell R.K., 2009).

Відповідно до сучасних уявлень про патогенез ЦД 2 типу він є результатом прогресуючого погіршення функціональної активності панкреатичних бета-клітин на тлі хронічної інсулінорезистентності. Центральна роль дисфункції бета-клітин у патогенезі ЦД 2 типу була підтверджена такими широкомасштабними клінічними дослідженнями, як UKPDS, ADOPT і Belfast Diet Study, які встановили зниження секреторної активності інсулін-продукуючих клітин до 28 % від норми за шість років захворювання незалежно від виду антидіабетичної терапії (Del Prato S. et al., 2007; Bonora, E., 2008).

Оскільки існуюча фармакотерапія ЦД 2 типу не перешкоджає зниженню функції бета-клітин, що неминуче призводить до погіршення глікемічного контролю і прогресування діабетичних мікро- і макросудинних ускладнень, особливої актуальності набуває пошук нових фармакологічних засобів, які здатні забезпечити збереження ендокринної функції підшлункової залози.

За останні роки накопичені численні факти, що вказують на участь гіпоталамічних структур і синтезованих в цих структурах нейропептидів у регуляції та моделюванні ендокринної функції, секреціі гормонів, так і їх периферійні ефекти (Слєпушкин С.Д., 1988), зокрема, ендокринної функції підшлункової залози (Ackermann A.M., Gannon M., 2007; Колесник Ю.М., 2003). Це обумовлює перспективність клінічного застосування регуляторних пептидів для лікування ендокринної патології і, зокрема, для корекції вуглеводного гомеостазу при діабеті (Панков Ю.А., 2005).

Проте істотним недоліком попередньо проведених досліджень щодо впливу нейрогормонів на функцію ендокринних клітин підшлункової залози було те, що вони, як правило, проводилися в експериментах in vitro на культурі в-клітин (Richardson S. B. et al., 1990; Yibchok-anum S., Hsu W. H. 1998; Le Dran G. et al., 1999), ізольованих панкреатичних острівцях (Gao Z. Y. et al., 1990) чи перфузованих підшлункових залозах (Wallin L. A. et al. 1989; Widmaier E. P. et al., 1991; Morgan D. G., 1998), та за умов їх одноразового введення добровольцям (Paolisso G. et al., 1990) на тлі нормоглікемії (Gao Z. Y. et al., 1991; Bray G. A., 1995). Це не сприяло створенню повної картини щодо впливу нейропептидів на ендокринну функцію підшлункової залози і процеси метаболізму в організмі, оскільки не враховувалися особливості гормон-рецепторних і регуляторних взаємодій за умов деструкції панкреатичних острівців і метаболічних порушень при діабеті. Крім того, ефекти екзогенних нейрогормонів можуть залежати від шляхів їх введення, тривалості надходження в організм і від рівня глікемії, що є вкрай важливим при вивченні їх ефектів при розвитку цукрового діабету (Gao Z. Y. et al., 1990; Sohlstrom A. et al., 1999; Sohlstrom A. et al., 2000).

Також недостатньо досліджена роль нейропептидів у регуляції тканинного метаболізму і обміну речовин в нормі і при цукровому діабеті. Саме з цих причин вивчення центрального і периферійного введення холецистокініну, бомбезину, нейропептиду Y, вазопресину й окситоцину на синтетичну і секреторону функції б- і в-клітин підшлункової залози і пов'язаний з цим ряд метаболічних змін має важливе значення не лише в теоретичному плані, але й дозволить обґрунтувати ефективність клінічного застосування нейропептидів з метою збереження або відновлення ендокринної функції підшлункової залози при цукровому діабеті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження, результати яких відображені в даній роботі, виконувалися в рамках науково-дослідної роботи кафедр патофізіології, госпітальної терапії-1, фармакології і ЦНІЛ Запорізького державного медичного університету «Роль пептидергічної системи гіпоталамусу в регуляції ендокринної функції підшлункової залози і стану міокарду в нормі і при цукровому діабеті і обґрунтування способів корекції її порушень за допомогою синтетичних нейрогормонів (експериментально-клінічне дослідження)» (№ держреєстрації 0198U004224).

Мета і завдання дослідження. Метою даного дослідження було вивчення впливу нейропептидів на гормональний статус та морфо-функціонульний стан альфа- і бета-клітин підшлункової залози та експериментальне обґрунтування ефективності застосування синтетичних нейропептидів для збереження і/або відновлення ендокринної функції підшлункової залози.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:

1. Вивчити вплив курсового центрального і периферійного введень синтетичних нейропептидів: вазопресину, холецистокініну-тетрапептиду, бомбезину, нейропептиду Y і окситоцину на морфо-функціональний стан б- і в-клітин панкреатичних острівців за умов нормоглікемії та цукрового діабету.

2. Дослідити гормональний статус щурів з нормоглікемією та цукровим діабетом після центрального і периферійного введень синтетичних нейропептидів.

3. Вивчити вплив курсового центрального і периферійного введення синтетичних нейропептидів на показники вуглеводного обміну в нормі і виразність глюкотоксичності у діабетичних щурів.

4. Дослідити вплив різних способів застосування синтетичних нейропептидів на показники ліпідного обміну в нормі і виразність ліпотоксичності у діабетичних щурів.

5. Оцінити інтенсивність перекисного окислення ліпідів в нормі і розвиток оксидативного стресу при діабеті на фоні центрального і периферійного введення синтетичних нейропептидів.

6. Обґрунтувати вибір найбільш перспективного пептиду для подальшого вивчення як потенційного препарату для збереження і/або відновлення ендокринної функції підшлункової залози.

7. Розробити оптимальні способи застосування цього нейропептиду для корекції ендокринної функції підшлункової залози при цукровому діабеті.

Об'єкт дослідження - ендокринна функція підшлункової залози в нормі та при цукровому діабеті і корекція цієї функції.

Предмет дослідження - морфо-функціональний стан б- і в-клітин панкреатичних острівців, гормональний статус, вуглеводний і ліпідний обміни у нормоглікемічних і діабетичних тварин на тлі введення синтетичних нейропептидів.

Методи дослідження: для дослідження показників вуглеводного і ліпідного обмінів, активності вільнорадикального окислення ліпідів і антиоксидантного захисту використовувалися спектрофотометрічні біохімічні методи, гормональний гомеостаз досліджувався радіоімунологічним і флюорометричним методами; визначення вмісту інсуліну і катехоламінів в еритроцитах проводилося цитофотометричним методом; для вивчення стану ендокринних клітин панкреатичних острівців був застосований метод непрямої імунофлюоресценції у поєднанні з методами кількісного аналізу зображень в автоматичному і напівавтоматичному режимі; у роботі застосовувалися статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Результати проведених досліджень значно розширюють уявлення про роль нейропептидів у регуляції ендокринної функції підшлункової залози в нормі і при цукровому діабеті, що має велике значення для сучасної ендокринології і діабетології. У дисертаційній роботі вперше експериментально обґрунтована концепція перспективності включення регуляторних нейропептидів до складу мультифакторної антидіабетичної терапії, згідно з якою ці регуляторні пептиди позитивно впливають не тільки на ендокринну функцію підшлункової залози, але й на асоційовані метаболічні процеси.

Вперше в результаті проведених досліджень було доведено, що синтетичні нейропептиди (вазопресин, холецистокінін-тетрапептид, бомбезин, нейропептид Х і окситоцин) по-різному впливають на морфофункціональний стан б- і в-клітин підшлункової залози і гормонально-метаболічний статус у здорових і діабетичних тварин. При цьому ефекти нейропептидів залежать як від стану тварин (норма або діабет), так і від шляху введення нейрогормонів (центральний або периферійний).

Вперше в результаті порівняльного аналізу фармакологічних властивостей досліджуваних нейропептидів, встановлено, що найбільш виражена антидіабетична активність властива окситоцину. Так, вперше встановлено, що при курсовому введенні окситоцину здоровим тваринам спостерігається збільшення кількості в-клітин у панкреатичних острівцях підшлункової залози і посилення їх функціональної активності, це підтверджується підвищенням площі острівців і вмістом у них інсуліну, а також супроводжується збільшенням концентрації цього гормону в крові. Одночасно окситоцин має стимулюючий ефект щодо функціональної активності б-клітин панкреатичних острівців, що призводить до підвищення вмісту контрінсулінового гормону - глюкагону та забезпечує збереження базальної нормоглікемії.

Вперше продемонстровано, що як периферійне, так і центральне введення окситоцину тваринам з абсолютною інсуліновою недостатністю гальмує деструкцію панкреатичних в-клітин і стимулює їх регенерацію, а також сприяє підвищенню функціональної активності інсулін-продукуючих клітин, підвищенню рівня цього гормону в крові та зниженню базальної глікемії і глюкотоксичності. Водночас вплив окситоцину на б-клітини підшлункової залози діабетичних тварин залежить від способу застосування нейропептиду. Так, периферійне введення окситоцину діабетичним тваринам гальмує функціональну активність б-клітин, тоді як при центральному надходженні нейропептиду спостерігається збільшення їх кількості в острівцях і підвищення функціональної активності.

Вперше виявлено, що окситоцин може спричиняти не тільки прямий стимулюючий ефект на масу і функціональну активність панкреатичних бета-клітин, але також здатний знижувати виразність таких метаболічних чинників, як ліпотоксичність і оксидативний стрес, що визначають інтенсивність деструктивних процесів у панкреатичних острівцях.

Показано, що регулюючий вплив окситоцину на метаболічні процеси, пов'язані з ендокринною функцією підшлункової залози, може також реалізовуватися через зміну рівня тиреоїдних гормонів і глюкокортикоїдів.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлена біологічна активність синтетичних нейропептидів, спрямована на відновлення і збереження ендокринної функції підшлункової залози, є підставою для їх використання як потенційних препаратів для профілактики і лікування цукрового діабету. Отримані дані про перспективність застосування регуляторних пептидів у комплексній терапії цукрового діабету наводяться при читанні лекційних курсів кафедр фармакології Харківського, Сумського, Одеського, Запорізького й Івано-Франківського державних медичних університетів, Вінницького національного медичного університету ім. М.І. Пирогова, а також Національного фармацевтичного університету.

У роботі вперше експериментально обґрунтована доцільність включення окситоцину до комплексної терапію цукрового діабету, застосування якого разом з інсуліном сприяє більш вираженій нормалізуючій дії на функцію ендокринних острівців підшлункової залози й асоційовані метаболічні процеси у діабетичних тварин, аніж монотерапія. Перевагою використання інсуліну в поєднанні з окситоцином є більш стійке зниження гіперглікемії при меншій дозі інсуліну і зменшеному ризику розвитку гіпоглікемічних станів. Результати проведених досліджень знайшли віддзеркалення в методичних рекомендаціях «Нові підходи до фармакотерапії цукрового діабету І типу» (м. Київ, 2005р.) і декларативному патенті на відкриття «Спосіб лікування цукрового діабету І типу» (№71310 А Пріоритет 19.12.2003. Опубл. 15.11.2004 р. Бюл. №11.).

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено пошук та аналіз наукової літератури, були визначені напрям, мета і завдання наукової роботи, самостійно розроблена методологія дослідження, виконані фармакологічні, біохімічні та морфологічні дослідження, проведена статистична обробка отриманих даних і аналіз усього матеріалу, сформульовані основні положення і висновки, написані всі розділи дисертації. Автор безпосередньо брав участь у експериментальному моделюванні цукрового діабету, а також у дослідженнях із впливу центрального і периферійного введень нейропептидів на гормонально-метаболічний статус у здорових і діабетичних тварин. Дисертантом самостійно виконані аналіз і статистична обробка отриманих результатів. Морфометричні й імуноцитохімічні дослідження ендокринної функції підшлункової залози здобувачем проведені в лабораторії кафедри патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету під керівництвом д.мед.н., професора О.В. Абрамова.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень були представлені на Всеросійській конференції «Гіпоксія: механізми, адаптація, корекція» (Москва, 1997 р.), VІІ-ій Міжнародній науково-практичній конференції зі створення і апробації нових лікарських засобів «Ліки - людині» (Москва, 1998 р.), пленумі товариства фізіологів України (Чернівці, 1998 р.), 5-му національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 1999 р.), 3-му національному конгресі патофізіологів України (Одеса, 2000 р.), республіканській науковій конференції „Наукові напрями у створенні лікарських засобів у фармацевтичному секторі України” (Харків, 2000 р.), науково-практичній конференції „Учені України - вітчизняній фармації” (Харків, 2000 р.), 2-му національному з'їзді фармакологів України (Дніпропетровськ, 2001 р.), міжнародній науково-практичній конференції «Історія і перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти» (Запоріжжя, 2004 р.), I-ій міжнародній науково-практичної конференції «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів» (Тернопіль, 2004 р.), IV-ій Української науково-практичній конференції з клінічної фармакології (Вінниця, 2004 р.), VI-ому Національному з'їзді фармацевтів України (Харків, 2005 р.), VII-му з'їзді ендокринологів України (Київ, 2007 р.), ІІІ-му з'їзді фармакологів Росії “Фармакологія - практичній охороні здоров'я” (Санкт-Петербург, 2007 р.), першому національному конгресі "ЛЮДИНА І ЛІКИ - Україна» (Київ, 2008 р.), науково-практичні конференції з міжнародною участю “Експериментальна і клінічна ендокринологія: від теорії до практики (Шості, сьомі, восьмі, дев'яті Данилевські читання)” (Харків, 2007, 2008, 2009, 2010 роки).

Апробація матеріалів дисертації проведена на спільному засіданні кафедр патофізіології, нормальної фізіології, патологічної фізіології, нормальної анатомії, патологічної анатомії, гістології, цитології і ембріології, біофізики і медичної апаратури, біохімії, фармакології з основами медичної рецептури, клінічної фармакології і фармакотерапії, мікробіології і імунології, центральної науково-дослідної лабораторії Запорізького державного медичного університету (протокол №4 від 16.12.09 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 50 наукових робот, з яких - 26 статей, зокрема 21 у фахових журналах і збірках, з них 18 - у вітчизняних журналах, 3 - в іноземних (Росія), 9 робіт опубліковані без співавторів, отримано 1 патент, видано 1 методичний посібник; 24 роботи у наукових збірках, матеріалах і тезах конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 316 сторінках машинописного тексту, складається зі вступу, огляду літератури, 9 розділів власних досліджень, висновків, списку використаних джерел, який містить 635 джерела, зокрема 540 іноземних авторів та займає 65 сторінок. Матеріал дисертації ілюстрований 75 таблицями, 74 рисунками і мікрофотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дослідження виконані на 420 щурах лінії Вістар масою 250-270 г. в осінньо-зимовий період (жовтень-березень). Тварин утримували в стандартних умовах віварію при відповідному освітленні і годуванні ad libitum. Дослідження проводилися відповідно до національних "Загальних етичних принципів експериментів на тваринах" (Україна, 2001), які відповідають положенням „Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей” (Страсбург, 1985). Процедури, які викликають біль (гострі досліди, вилучення органів, евтаназія та інші) проводили під наркозом (вводили внутрішньоочеревно натрію етаміналу в дозі 40 мг/кг маси тіла).

На щурах було проведено дослідження перебігу експериментального цукрового діабету різної тривалості. У цій серії досліджень тварини були розділені на три групи: контрольна група і щури з експериментальним діабетом три- і п'ятитижневої тривалості.

Проведено п'ять серій досліджень з вивчення впливу курсового (двотижневого) центрального і периферійного введення холецистокініну-тетрапептиду (ССК-4), [Arg⁸]-вазопресину (Ваз), окситоцину (Окс), бомбезину (ББ), нейропептиду Y (нпY) на ендокринну функцію підшлункової залози й асоційовані метаболічні процеси здорових і діабетичних тварин. Тварини кожної експериментальної серії були розділені на чотири групи: нормоглікемічні щури з центральним (група 1) і периферійним (група 2) введенням пептиду, діабетичні щури з центральним (група 3) і периферійним (група 4) введенням нейропептиду.

Для контролю ефектів, що виникають при курсовому введенні нейропептидів, проведена серія досліджень з вивчення впливу центрального введення нормоглікемічним і діабетичним тваринам стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду (чотири групи тварин).

В окремій серії досліджень було проведено порівняльне вивчення роздільного і сумісного введення інсуліну і окситоцину на перебіг експериментального діабету (сім груп тварин).

Також була проведена серія досліджень з вивчення впливу центрального і периферійного введення окситоцину на процеси проліферації у нормальних та діабетичних тварин (сім груп тварин) за ступенем включення бромдезоксиуридину (БрДУ) в ДНК-синтезуючі клітини.

Для відтворення цукрового діабету застосовували стрептозотоцинову модель захворювання, яка є однією з найбільш поширених експериментальних моделей діабету в щурів (Полторак В.В., 1996). Стрептозотоцин (SIGMA Chemical, США) вводили щурам внутрішньоочеревно в дозі 50 мг/кг. Час, що пройшов з дня введення препарату, в подальшому викладі матеріалу, позначатиметься як тривалість перебігу діабету.

Синтетичні аналоги нейропептидів виробництва фірми Peninsula Laboratories Ins., США вводили протягом 14 діб. Вибір доз для введення нейрогормонів здійснювався на підставі даних літератури. (про що ?)

Для центрального - інтрацеребровентрикулярного (іцв) введення нейрогормонів щурам заздалегідь імплантували канюлю в правий латеральний шлуночок мозку. На 8 добу після операції тварин відбирали для експерименту. Інфузії діабетичним тваринам починали на 21 добу після введення стрептозотоцину (29 доба після операції). Щоденна доза для кожного з нейропептидів, що вводилися, складала: для Ваз - 0,12 мкг/кг (0,12 пмоль/кг), Окс - 1,5 мкг/кг (1,5 нмоль/кг), ХЦК-4 - 50 нг/кг (0,1 нмоль/кг), ББ - 1,2 мкг/кг (7,5 пмоль/кг), нпY - 50 нг/кг (12,5 пмоль/кг).

Периферійне - інтраперитоніальне (іп) введення нейрогормонів здійснювали в аналогічному режимі в дозах: для Ваз - 1,2 мкг/кг (1,2 нмоль/кг), Окс - 15 мкг/кг (16,5 нмоль/кг), ХЦК-4 - 25 мкг/кг (50нмоль/кг), ББ - 10 мкг/кг (6 нмоль/кг), нпY - 12,5мкг/кг, (2,5 нмоль/кг) в 0,5 мл 0,9 % NACI.

Інсулін S.N.C. („Берлін-хемі”, Німеччина) вводили підшкірно в дозі 2 ОД/кг двічі на добу, а також в дозі 3 ОД/кг, яка в попередніх експериментах знижувала рівень базальної глікемії нижче 8,5 ммоль/л і таким чином викликала компенсацію діабетичного стану у тварин.

Дослідження ендокринної функції підшлункової залози і асоційовані метаболічні процеси у діабетичних тварин проводили відповідно до методичних рекомендацій «Доклінічні дослідження лікарських засобів» (Стефанов О.В., 2001)

Стан глюкозного гомеостазу визначали за показниками базальної глікемії, рівнем глікозильованого альбуміну, інсулінемії, під час внутрішньочеревного тесту толерантності до глюкози, вмісту глікогену в гомогенатах печінки і скелетній мускулатурі. Рівень глюкози визначали уніфікованим фотометричним глюкозооксидазним методом за допомогою набору ДІАКОМ Глюкоза ГО (ДІАКОМ-СИНТЕКО, Росія). Глікемічну реакцію при проведенні тесту толерантності до вуглеводів оцінювали за площею під глікемічною кривою, яку розраховували за допомогою комп'ютерної програми “Mathlab”. Дослідження глікозильованого альбуміну проводили методом (Вікторова Л.Н., Городецкий В.К., 1990). Вміст глікогену в тканинах визначали за методом (Прохоровна М.І., 1982). Чутливість периферійних тканин на дію інсуліну визначали за допомогою „короткого інсулінового тесту” (Akinmokun A. et al., 1992).

Для дослідження стану ліпідного обміну проводили вивчення вмісту в плазмі крові загальних ліпідів, тригліцеридів, загального холестерину, в-ліпопротеїдів і неестерифікованих жирних кислот (НЕЖК) уніфікованими методами (Мєньшиков В.В., 1987).

Оксидативний стрес характеризували за станом мембран еритроцитів, у яких проводили вивчення вмісту первинних (дієнові кон'югати), вторинних (триєнові й оксодієнові кон'югати і сполуки, що реагують з тіобарбітуровою кислотою), а також кінцевих продуктів ліпоксидації (сполуки типу шифових основ) (Коробєйніков Є.М., 1989; Волчегорський І.А. та співавт., 1991). Для оцінки інтенсивності антиоксидантного захисту еритроцитів було досліджено активність каталази (Королюк М.А. та співавт., 1988), глутатіонредуктази (Прохорова М.І., 1982), а також вміст одного з основних компонентів неферментативної ланки АОЗ - б-токоферолу (Elmadf J., et al., 1989).

Для оцінки гормонального статусу в плазмі крові тварин визначали імунореактивний інсулін за допомогою наборів для імунорадіометричного визначення фірми “ДП ХОп Ібох НАН Білорусі”, а також вільний трийодтиронін (fТ3) і тироксин (fТ4) за допомогою наборів фірми “Immunotech” (Чеська республіка) згідно з доданими до наборів протоколів визначення. Кількість радіоактивних імпульсів у калібрувальних і досліджуваних пробах вимірювали на лічильнику Гамма-12 (СРСР). Вміст кортикостероїдів у крові оцінювали за рівнем некон'югованих 11-оксикортикостероїдів (11-ОКС) в плазмі флюориметричним методом (Балашов Ю.Г., 1990).

Після вилучення та стандартної гістологічної проводки підшлункову залозу заливали в парафін. Для виявлення інсуліну в в-клітинах підшлункової залози використовувався метод непрямої імунофлюоресценції. Процес обробки серійних зрізів підшлункової залози здійснювався згідно з протоколом, що додається до комерційного набору фірми Peninsula Laboratories Inc. (США). Для ідентифікації б-клітин як первинних антитіл використовувалися мишачі моноклональні антитіла до глюкагону, а вторинних - кролячі антитіла проти IgG миші, кон'юговані з FITC (SIGMA Chemical, США). Імунофлюоресценцію, пов'язану із вмістом інсуліну в в-клітинах і глюкагону в б-клітинах вивчали в ультрафіолетовому спектрі збудження 390-420 нм на комп'ютерній системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Eiectronik, Німеччина). Зображення, що отримували в спектрі люмінесценції на мікроскопі Axioscop (Zeiss, Німеччина), за допомогою спеціальної високочутливої відеокамери COHU 4722 (COHU Inc., США), вводилося в комп'ютер VIDAS- 386 і аналізувалося пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS- 2.5 (Kontron Eiectronik, Німеччина). У автоматичному режимі проводилося вимірювання площі панкреатичних острівців, площі та концентрації інсулінімунореактивного матеріалу (ІІРМ) в в- клітинах, або глюкагонімунореактивного матеріалу (ГІРМ) в б-клітинах, які пов'язані із вмістом інсуліну та глюкагону. Також визначався вміст гормонів в острівцях, котрий обчислювався як визначення похідного площі імунореактивного матеріалу на концентрацію відповідного гормону.

Інтенсивність проліферації вивчали за включенням бромдезоксиуридину (БрДУ) в ДНК-синтезуючі клітини. Внутрішньочеревне введення БрДУ в дозі 40 мг/кг раз на добу впродовж 5 діб починали за два дні до початку введення Окс.Через 12 годин після останнього введення Окс тварин декапітували і вилучали підшлункову залозу, у якій, після стандартної гістологічної обробки, виявляли мічені БрДУ клітини методом непрямої імунофлюоресценції. (Як первинні антитіла використовували моноклональні антитіла до БрДУ, а як вторинні - козячі IgG проти миші, кон'юговані з FITC.) У підшлунковій залозі реєстрували кількість флюоресцуючих ядер у центральній і периферійній частинах панкреатичних острівців. Обстежували не менше 200 острівців в серії і розраховували середню кількість флюоресцуючих ядер на 1 острівець.

Цитохимічне вивчення вмісту інсуліну в еритроцитах проводили за методом (Сандуляк Л.І., 1987), а вміст катехоламінів за методом ( Мордар Г.І., 1996). Після фарбування оптичну щільність еритроцитів визначали в автоматичному режимі в світлі, що проходить, на мікроскопі Axioskop (Zeiss, Німеччина). Зображення, отримане за допомогою спеціальної високочутливої відеокамери COHU 4722 (COHU Inc., США), вводилося в комп'ютер VIDAS-386 і аналізувалося пакетом прикладних і статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина). У кожному мазку аналізували не менше 200 клітин. Розраховували відсоток еритроцитів, які містили інсулін або катехоламіни (оптична щільність яких більша 0,1).

Статистичний аналіз отриманих результатів здійснений методами варіаційної статистики за допомогою стандартних пакетів програм Exel ліцензійної програми «STATISTICA® for Windows 6.0» (Statsoft Inc., США) на персональному комп'ютері Pentium III. Визначення виду розподілу ознаки у вибірці проводили з використанням критерію Шапіро-Уїлка, а рівність дисперсій розподілу ознак у групах - за допомогою критерію Левена. Порівняння двох груп з нормальним розподілом здійснювали із застосуванням параметричного класичного t-критерію Ст'юдента для незалежних вибірок і модифікованого t-критерію Ст'юдента з роздільними оцінками дисперсій. При порівнянні двох груп з розподілом вибірки, відмінним від нормального, використовували непараметричний U-критерій Манна-Уїтні. Для множинних порівнянь даних з нормальним розподілом проводили параметричний однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA) і застосовували метод Стьюдента-Ньюмена-Кейлса, а в інших випадках - ранговий аналіз варіацій за Крускалом-Уоллісом і апостеріорне порівняння середніх за допомогою критерію Дана. Розбіжності вважали статистично значущими при (P < 0,05) (Мінцер О.П., 2003).

Результати дослідження та їх обговорення. Відомо, що загальна маса панкреатичних в-клітин, яка відповідає за продукцію інсуліну та регулює глюкозний гомеостаз в організмі, визначається їх кількістю та розмірами. Оскільки ЦД характеризується абсолютною (ЦД 1 типу) або відносною (ЦД 2 типи) недостатністю синтезу і секреції інсуліну в-клітинами, основною метою сучасної антидіабетичної терапії є забезпечення організму інсуліном і відновлення/збереження функції панкреатичних в-клітин (Ackermann A.М., Gannon M., 2007). На сьогодні загальноприйнятим вважається той факт, що зниження маси в-клітин при ЦД обумовлене їх посиленою апоптотичною загибеллю і, меншою мірою, атрофією, тоді як неогенез клітин (принаймні при ЦД 2 типу) практично не порушений, але дуже сповільнений (Cnop N. et al., 2005).

Нейропептиди володіють широким спектром біологічної активності, яка охоплює найважливіші функції організму - від участі в організації загальної поведінки до тонких регуляторних взаємодій на клітинному рівні (Rozengurt, E., 2002). Вибір нейропептидів для проведення даного дослідження пов'язаний з отриманими раніше даними про те, що розвиток ЦД викликає в гіпоталамусі поступове підвищення синтезу і секреції цілого ряду регуляторних пептидів (Абрамом А.В., 1998). Ця активація пептидергічної системи гіпоталамусу, ймовірно, має компенсаторне значення при діабеті і спрямована як на стимуляцію функції в-клітин панкреатичних острівців, так і на нормалізацію гомеостазу в організмі загалом. Для дослідження були обрані наступні нейропептиди: [Arg8]-вазопресин, холецистокінін-тетрапептид, бомбезин, нейропептид Y та окситоцин. Оскільки ефекти нейропептидів залежать від шляхів їх введення, тривалості надходження в організм і його гормонально-метаболічного стану, було проведено вивчення впливу курсового (14 діб) центрального і периферійного введення вищезгаданих нейропептидів на стан в- і б- клітин панкреатичних острівців, їх гормональний статус, а також параметри вуглеводного, ліпідного обмінів і оксидативного стресу у здорових і діабетичних тварин.

Центральне і периферійне введення нейропептидів проводилося для визначення відмінностей в ефективності впливу на показники, що вивчалися, при дії на відповідні рецептори в центральній нервовій системі, або на периферії. У клінічній практиці попадання пептидів у гіпоталамічні центри, минаючи гематоенцефалічний бар'єр, досягається інтраназальним краплинним введенням розчинів, з метою їх всмоктування в порожнині носа (Бахарев, В.Д., 1989). Концентрації нейропептидів, які використовувалися нами для центрального введення були на порядок нижчими за дозу, необхідну для активації рецепторів на периферії, тому ефекти, які спостерігалися при центральному введені могли бути викликані винятково їх впливом на структури центральної нервової системи.

Однією з особливостей даного дослідження було застосування нового методичного підходу в оцінці параметрів в- і б-клітин панкреатичних острівців, що вивчалися. Цей підхід полягав у використанні сучасної системи цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Electronic, Німеччина) з оригінальним програмним забезпеченням. Це дозволило після постановки імуноцитохімічної реакції, що має кількісний характер, досліджувати в автоматичному режимі зміни параметрів панкреатичних острівців і власне в-клітин (площа острівців, площа інсулін-імунореактивного матеріалу, вміст і концентрацію інсуліну в них), а також б- клітин (площа, вміст і концентрація глюкагон-імунореактивного матеріалу) у різних експериментальних групах, що дало нам можливість зробити висновки про стан синтетичної і секреторної активності клітин. Оскільки для регуляторних нейропептидів відмічені як активуючі, так і модулюючі ефекти, експерименти проводилися на здорових тваринах і на щурах зі стрептозотоцин-індукованим ЦД.

Так, у експериментах на нормоглікемічних тваринах порівняльне вивчення впливу обраних доз і способів введення досліджуваних регуляторних пептидів на стан панкреатичних острівців показало, що найбільш виражене збільшення кількості функціонуючих в-клітин в острівцях спостерігалося при центральному введенні нпY, а також при обох шляхах введення Окс (табл. 1). Подібна зміна маси в-клітин певною мірою може бути пов'язана зі здатністю цих пептидів стимулювати процеси проліферації в різних органах і тканинах (Decressac M., 2009).

Таблиця 1. Впливи досліджуваних регуляторних пептидів на площу панкреатичних острівців, кількість в-клітин, концентрацію і вміст ІІРМ в острівцях у нормоглікемічних щурів, (± S), n=10.

Примітки: ^а - рівень значущості відносно контрольної групи (р< 0,05);

^г - рівень значущості відносно групи тварин з інтраперитоніальним введенням нейропептиду (р< 0,05).

Даний факт був встановлений і в наших дослідженнях, які підтвердили активацію процесів проліферації в-клітин під впливом курсового введення Окс. Один з можливих шляхів реалізації подібного впливу нейропептидів пов'язаний зі здатністю як нпY, так і Окс стимулювати секрецію пролактину (Ozawa H., 1993; Barker-Gibb M.L., 1995), який, у свою чергу, може підсилювати проліферацію в-клітин і гальмувати їх апоптоз (Bordin S., 2004).

Разом з тим, дослідження останніх років, присвячені встановленню сигналінгових шляхів, які активуються під впливом нейропептидів, призвели до виявлення раніше не прогнозованих фактів того, що робота їх специфічних рецепторів, які містять G-білок, пов'язана не тільки з утворенням ряду відомих вторинних месенджерів, але і з індукцією каскаду тирозинової фосфориляції мітогенного характеру (Rozengurt E., 2002). На сьогодні активно ведуться роботи по встановленню конкретних молекулярних учасників даних сигналінгових процесів.

З іншого боку, необхідно відзначити, що введення нпY в більшій мірі призводило до збільшення площі острівців, аніж до зростання в них кількості в-клітин і, відповідно, зниження концентрації інсуліну в острівці не може свідчити про інтенсифікацію секреції гормону в кров. У той же час периферійне застосування Окс, окрім збільшення площі острівців, також викликало значне зростання кількості в-клітин, тому зниження в них концентрації інсуліну, скоріш за все, свідчить про активацію специфічної функції в-клітин під впливом даного нейропептиду. Центральне введення Окс, підсилюючи мітотичні процеси у в-клітинах, ймовірно, меншою мірою активувало процеси секреції, що призвело до деякого накопичення інсуліну в острівцях.

Помітне збільшення вмісту ІІРМ в острівцях викликали також ХЦК-4 і ББ, особливо при їх центральному введенні (див. табл. 1). Необхідно відзначити, що механізм впливу даних нейропептидів різний, оскільки якщо для ХЦК відзначено самостійний вплив на синтез і секрецію гормону панкреатичними в-клітинами (Berthoud H.R., 1996), то ББ впливає на даний процес опосередковано, через пов'язану з роботою бомбезинових рецепторів 2 типу активацію секреції інкретинів, зокрема, ГПП-1 (Persson K., 2002), який, окрім інсулінотропної дії, підсилює транскрипцію гена проінсуліну.

Більш виражений ефект при центральному шляху введення нейропептидів можна пояснити не тільки їх взаємодією зі специфічними рецепторами, але і включенням центральних механізмів регуляції синтезу інсуліну. Провідну роль у даному випадку може відігравати здатність деяких пептидів активувати нейрони дорсального комплексу блукаючого нерва, які завдяки прямим проекціям до панкреатичних острівців стимулюють синтез і секрецію інсуліну (Krowicki Z.K., 1996).

Відмічене збільшення площі панкреатичних острівців під впливом курсового введення нейропептидів супроводжувалося також морфо-функціональними змінами б-клітин. Так, при обох шляхах введення ХЦК-4, а також при центральному введенні ББ спостерігалося істотне збільшення їх кількості. Даний ефект, ймовірно, також пов'язаний з активацією процесів проліферації в підшлунковій залозі, яка встановлена при дії цих пептидів (Morisset J., 2008).

Разом з тим, введення нейропептидів по-різному впливало на синтетичну функцію б-клітин. Тільки ХЦК-4 при обох шляхах введення збільшував вміст ГІРМ (на 18 і 25 %, відповідно), тоді як застосування решти нейропептидів призводило до зниження даного параметра. Слід зазначити, що при центральному введенні Окс це падіння (на 22,4 %) поєднувалося зі збільшенням площі ГІРМ, що, ймовірно, пов'язано зі збільшенням синтезу глюкагону в б-клітинах і підвищенням секреції цього гормону в кров. При периферійному шляху введення пептидів зниження вмісту не супроводжувалося вірогідними змінами площі ГІРМ, що свідчить про зменшення синтезу глюкагону.

Використовуючи дані про середню кількість б- і в-клітин в острівцях і вмісті в них імунореактивного матеріалу, можна розрахувати відносний вміст інсуліну і глюкагону в панкреатичних острівцях (рис. 1).

Проведені розрахунки свідчать, що під впливом центрального введення ББ, нпY і Окс відносний вміст ІІРМ значно збільшувався. Менш виражений ефект спостерігався при периферійному введенні ХЦК-4, нпY і Окс.

При центральному введенні ХЦК-4 і при обох шляхах введення Ваз відносний вміст ГІРМ в острівці збільшувався, що не суперечить літературним даним про глюкозо-залежну стимуляцію б-клітин даними нейропептидами (Folny V., 2003).

Результати даних розрахунків знайшли підтвердження при дослідженні базальної інсулінемії, яке показало, що при центральному введенні ХЦК-4, ББ, нпY, а також при обох шляхах введення Окс у здорових тварин спостерігалося підвищення рівня інсуліну в крові, і лише при введенні Ваз базальна інсулінемія істотно не змінювалася, що можна пояснити його глюкозо-залежним ефектом на острівцеві клітини підшлункової залози.

Рис. 1. Вплив введення регуляторних пептидів на відносний вміст інсуліну і глюкагону в панкреатичних острівцях здорових тварин.

У той же час визначення базальної глікемії показало, що лише при периферійному введенні Окс спостерігалося істотне зниження цього показника, тоді як у решті груп рівень глікемії не відрізнявся від контролю, або був дещо підвищений. Подібну невідповідність між вмістом інсуліну і рівнем глюкози в крові можна пояснити стимулюючим впливом нейропептидів на секрецію глюкокортикоїдів, які, будучи наділені контрінсуліновою дією, здійснюють вплив на рівень глікемії шляхом активації ключових ферментів глюконеогенезу (Buhl E.S., 2007). Про нестабільну базальну глікемію в даних умовах свідчив показник глікозильованого альбуміну, підвищений у всіх групах, за винятком тварин з периферійним введенням Окс.

Під час експериментів була встановлена така послідовність нейропептидів за їх здатностями до підвищення рівня глюкокортикоїдів у крові при курсовому центральному введенні: Ваз, нпY, ХЦК-4, ББ. Відомо, що Ваз, продемонструвавши максимальний ефект, стимулює викид АКТГ аденогіпофізом (Guillon G., 1998), тоді як ББ не має подібної дії (Gregersen S., 1996). Менш виражене підвищення рівня глюкокортикоїдів спостерігалося при периферійному введенні пептидів; за активністю їх можна розтошувати в наступній послідовності: нпY, Ваз, ХЦК-4, ББ. Окс, на відміну від інших нейропептидів, здійснював різноспрямований вплив на концентрацію глюкокортикоїдів - при центральному його введенні рівень підвищувався, а при периферійному - знижувався. У зв'язку з цим необхідно відзначити, що індекс резистентності, розрахований як співвідношення концентрації глюкокортикоїдів до інсуліну, при периферійному введенні Окс був нижче контрольного.

Проведений аналіз кореляційної залежності між концентраціями інсуліну, глюкокортикоїдів, індексу резистентності і базальної глікемії показав, що найбільш істотний кореляційний зв'язок спостерігався між двома останніми показниками (r = 0,69, р < 0,05), тобто рівень глікемії більше залежав від співвідношення між концентраціями глюкокортикоїдів та інсуліну, аніж від величини концентрацій цих гормонів.

Відомо, що тиреоїдні гормони також здатні впливати на вуглеводний обмін організму шляхом регуляції глюконеогенезу на рівні циклу Корі і глюкозо-аланінового циклу. Рециклювання глюкози в цих метаболічних шляхах зменшується при гіпотиреоїдному стані і зростає при гіпертиреоїдному (Кендиш І.Н., 1985). З іншого боку, регуляція процесів термогенезу, безпосередньо залежна від рівня тиреоїдних гормонів, відіграє велику роль у патогенезі ЦД 2 типу і ожирінні (Guan H.P., 2002). Раніше було встановлено, що більша частина циркулюючого в крові Т₃ (близько 80 %) синтезується не в самій щитоподібній залозі, а утворюється за рахунок дейодування Т₄ в периферійних тканинах під впливом ферментів дейодиназ. Швидкість цього процесу може змінюватися під впливом різних чинників як ендогенної, так і екзогенної природи (Моргунова Т.Б., 2005). Проведені дослідження показали істотне пригнічення функції щитоподібної залози у нормальних щурів під впливом центрального введення ББ, що узгоджується з даними, отриманими іншими дослідниками, котрі встановили зниження секреції тиреотропного гормону при активації бомбезинових рецепторів 1 типу (Baranowska B. et al. 2005).

При центральному введенні нпY і обох шляхах введення Ваз спостерігалося зменьшення коефіцієнта конверсії fТ₃/fТ₄, що, ймовірно, пов'язано з пригніченням процесів дейодувания Т₄ в периферійних тканинах. Разом з тим, окситоцин незалежно від шляху введення, призводив до активації процесів дейодування тироксину в периферійних тканинах, що узгоджується з літературним даним (Ciosek J., Stempniak B., 1997).

Всі досліджувані нейропептиди так чи інакше викликали зменшення вмісту глікогену в тканинах, що, ймовірно, значною мірою пов'язано зі здатністю підвищувати рівень глюкокортикоїдів у крові, аніж із змінами в концентрації циркулюючого глюкагону або тиреоїдних гормонів. Так, проведений кореляційний аналіз показав сильний зв'язок між індексом резистентності і вмістом глікогену в м'язах (r = 0,878, р < 0,05), і тісну кореляцію між концентрацією глюкокортикоїдів у крові і вмістом глікогену в печінці (r = 0,544, p < 0,05). Найбільш значуще зниження вмісту глікогену в м'язах і печінці викликало введення Ваз, який, як відомо, окрім здатності підвищувати рівень кортикостероїдів, спроможний безпосередньо пригнічувати глікогенсинтетазу (Ciudad C., 1984). Поряд з тим периферійне введення Окс не викликало істотних змін у вмісті глікогену.

Вивчення впливу нейропептидів на параметри ліпідного обміну нормоглікемічних тварин показало, що ХЦК-4, ББ і нпY підвищували вміст усіх визначуваних фракцій ліпідів, тоді як введення Ваз і Окс сприяло зниженню рівня ліпідемії, що, можливо, пов'язано з їх здатністю пригнічували процеси ліполізу (Hiroyama M., et al., 2009).

Оцінка оксидативного статусу здорових тварин продемонструвала, що введення тваринам нейропептидів у вибраних нами дозах не викликає істотних змін.

Таким чином, курсове введення нейропептидів призводило до деяких змін гормонально-метаболічних процесів у нормоглікемічних тварин. При цьому центральне введення пептидів характеризувалося більш вираженими зрушеннями оцінюваних параметрів, що, ймовірно, пов'язано з активацією центральної ланки регуляції гомеостазу.

Результати, отримані в експериментах на нормоглікемічних тваринах, дозволили припустити, що серед досліджуваних нейропептидів найбільш перспективним щодо впливу на морфо-функціональний стан панкреатичних острівців і супутні метаболічні процеси, задіяні в патогенезі ЦД, а відтак, який потребує детальнішого вивчення на моделі даної патології, є окситоцин.

При дослідженні тварин з експериментальним діабетом було встановлено, що обрані нейропептиди при курсовому введенні по-різному впливали на показники вуглеводного обміну (рис. 2).

Рис. 2. Вплив введення регуляторних пептидів на рівень базальної інсулінемії, глікемії та глікозильованого альбуміну у діабетичних тварин (в відсотках відхилень від показників групи тварин з трьохтижневим діабетом):

** - вірогідність відмінності з групою діабетичних тварин із трьохтижневим діабетом (р<0,05);

*** - вірогідність відмінності з групою діабетичних тварин, що отримували плацебо (р<0,05).

Так, введення ХЦК-4 діабетичним тваринам спричиняло більш виражену гіперглікемію і зростання вмісту глікованих білків, не впливаючи при цьому на рівень інсуліну в крові порівняно з діабетичними тваринами, що отримували плацебо. Введення решти нейропептидів гальмувало прогресуючий розвиток експериментального діабету.

При цьому істотне зниження базальної глікемії спостерігалося при центральному введенні нпY і ББ, при периферійному введенні Ваз і при обох шляхах введення Окс (див. рис. 2).

Слід відзначити, що тільки при введенні нпY і Окс було встановлено значне підвищення рівня інсуліну в крові. У той же час вагоме зменшення рівня глікованих білків порівняно з трьохтижневим діабетом реєструвалося лише в групах щурів, які отримували окситоцин, що свідчить про стабільність зниження концентрації глюкози в крові цих тварин.

Вивчення морфометричних і морфофункціональних параметрів в-клітин панкреатичних острівців діабетичних тварин показало, що розвиток експериментального діабету супроводжувався значним прогресуючим зменшенням площі острівців (рис. 3).

Рис. 3. Вплив введення регуляторних пептидів на площу панкреатичних острівців і кількість в-клітин у діабетичних тварин. (в відсотках відхилень від показників групи тварин з трьохтижневим діабетом);

** - вірогідність відмінності з групою діабетичних тварин із трьохтижневим діабетом (р<0,05);

*** - вірогідність відмінності з групою діабетичних тварин, що отримували плацебо (р<0,05).

Так, на третьому тижні патологічного процесу зменшення площі острівців складало 15 %, а на п'ятому тижні площа скоротилася ще на 40 %. Ці зміни були пов'язані зі значним зменшенням кількості в-клітин в острівцях (r = 0,76; p < 0,05), зокрема, якщо в групі контрольних тварин середня кількість цих клітин в острівці складала 50, то через три тижні після індукції діабету залишалося 16, а при введенні плацебо до кінця п'ятого тижня зменшувалося до 10.

Таку прогресивну загибель в-клітин після введення стрептозотоцину можна пояснити не тільки в-цитотоксичністю антибіотика, але і подальшим запуском у панкреатичних острівцях аутоімунних процесів, що беруть участь у деструкції цих клітин, що і було доведено в роботах (Камишний О.М., 2006), а крім того, ініціацією обумовленого глюко- і ліпотоксичністю апоптозу (Robertson P.R. et al., 2004).

Введення регуляторних пептидів спричиняло різний вплив на цей процес: ХЦК-4 підсилював процеси деструкції острівців (кількість в-клітин значно знизилася відносно показника в групі тварин, що отримували плацебо), ББ і Ваз - гальмували процеси деструкції (кількість в-клітин залишалася на рівні трьохтижневого діабету), тоді як при введенні нпY і Окс кількість в-клітин значно збільшувалася, що може бути наслідком стимуляції процесів проліферації і гальмування апоптотичної загибелі в-клітин в острівцях підшлункової залози діабетичних тварин.