Клініко-патогенетичні особливості і оптимізація терапії у хворих на хронічний гепатит С

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Клініко-патогенетичні особливості і оптимізація терапії у хворих на хронічний гепатит С

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Загальна характеристика роботи

Задачі дослідження:

1 Дослідити клініко-біохімічні параметри перебігу ХГС у дорослих хворих.

2 Визначити субпопуляційний склад лімфоцитів у хворих на ХГС на тлі лікування ронколейкіном.

3 Визначити спектр імунорегуляторних молекул - цитокінів у різних груп хворих на ХГС.

4 Визначити клінічну ефективність лікування хворих на ХГС ронколейкіном і оцінити його вплив на показники імунного статусу в групах хворих.

Об'єкт дослідження - хворі на хронічний вірусний гепатит С.

Предмет дослідження - клінічні особливості перебігу ХГС, маркери вірусного гепатиту, лікування хворих на ХГС ронколейкіном та визначення критеріїв його використання, імунний статус хворих на ХГС до, впродовж та після закінчення терапії.

Методи дослідження - клінічні, імунологічні (визначення антигенних маркерів HCV інфекції, кластерів диференціровки (CD) лімфоцитів периферичної крові, сироваткової концентрації цитокінів), біохімічні (визначення амінотрансфераз, альбуміну, імуноглобулінів, білірубіну), молекулярно-біологічні (виявлення й напівкількісне визначення вмісту в крові РНК HCV і реплікативних інтермедіатів), статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів.

Показано, що хронічний гепатит супроводжується вираженим імунодефіцитом як гуморальних, так і клітинних ланок імунітету.

Встановлено характерні особливості імунних реакцій, що перебігають при хронічній HCV інфекції за допомогою вивчення цитокінового профілю у співставленні із клініко-лабораторними даними.

Виявлено дисбаланс функціонування системи цитокінів, який має тенденцію до поглиблення при прогресуванні хвороби.

Встановлено, що головною складовою імунопатогенезу ХГС є некомпетентність вірусспецифічних клонів Т-хелперів 2 типу, які відповідають за індукцію гуморальної імунної відповіді. Це пов'язане із апоптозом як Т-, так і В-ефекторів, що розвивається при ХГС.

Доведено, що в умовах слабкої і неефективної антитільної відповіді відбувається гіперіндукція клітинної ланки імунітету, що викликає незбалансовано високий рівень гибелі інфікованих гепатоцитів. Це, в свою чергу, з часом може привести до масивного розвитку сполучної тканини в печінці, тобто до фіброзу і цирозу.

Вперше у вітчизняній практиці у комплексному лікуванні ХГС використаний рекомбінантний препарат ІЛ-2 - ронколейкін.

Доведено, що одним із можливих шляхів оптимізації терапії ХГС є поєднання двох етіотропних препаратів із різними механізмами дії - інтерферону альфа-2b (лаферобіон) та ронколейкіну. Проведене дворічне клінічне спостереження з оцінкою ефективності метода лікування за клініко-лабораторними та вірусологічними показниками.

Практичне значення отриманих результатів. Для закладів практичної охорони здоров'я проведені дослідження доповнюють уявлення про зміни, які відбуваються в імунній системі HCV-інфікованих осіб і які є підґрунтям персистенції вірусу і хронізації запального процесу (зміни з боку субпопуляційного складу лімфоцитів та дисбаланс системи цитокінів).

Доведено доцільність визначення показників цитокінового спектру для оцінки характеру перебігу HCV-інфекції, а також клінічної ефективності лікування хворих.

Доведено доцільність використання препарату рекомбінантного ІЛ-2 (ронколейкіну) для лікування хворих на хронічний ГС. Сформульовані рекомендації використання ронколейкіну у комплексній терапії хворих на ХГС.

Матеріали дослідження впроваджені в практичну роботу лікарів-інфекціоністів ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України».

Отримані результати використані при підготовці інформаційних листів: «Методика застосування «Ронколейкіну» при хронічному гепатиті С / Дьяченко П.А., Вовк А.Д., Федоченко С.В., Ясеновий С.П. №220-2007. К., 2007», «Методика застосування комбінованої терапії «Ронколейкіном» та «Лаферобіоном» при хронічному гепатиті С / Дьяченко П.А., Вовк А.Д., Федоченко С.В., Ясеновий С.П. №221-2007. К., 2007»

Особистий внесок дисертанта. Автором самостійно здійснено інформаційно-патентний пошук та проведено аналіз наукової літератури, сформульовано мету та задачі роботи, вибрані адекватні матеріали та методи дослідження, здійснено комплексне обстеження хворих і здорових осіб. Дисертант брав участь у проведенні клініко-лабораторних та імунологічних досліджень, самостійно здійснив статистичну обробку отриманих результатів. Аналіз вмісту ФНП- й ІФН у сироватці крові було проведено за участю автора у відділі експериментальних клітинних ліній (керівник - доктор біологічних наук Ю.Й. Кудрявець) ДУ «Інститут експериментальної патології, онкології та радіобіології ім. Р.С. Кавецького НАН України». Автор особисто написав всі розділи дисертаційної роботи, обґрунтував основні положення, сформулював висновки та практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були повідомлені та обговорені на ІІ Республіканській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених (м. Суми, 2003 р.); ІІІ Республіканській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених (м. Суми, 2004 р.); Науково-практичній конференції «Вірусні хвороби, токсоплазмоз, хламідіоз» (м. Тернопіль, 2004 р.); науково-практичній конференції і пленумі Асоціації інфекціоністів «Хіміотерапія та імунокорекція інфекційних хвороб» (м. Тернопіль, 2005 р.); 10-й Російській конференції «Гепатология сегодня» (м. Москва, 2005 р.); V з'їзді товариства гастроентерологів Росії й ХХХII сесії Центрального науково-дослідного інституту гастроентерології (м. Москва, 2005 р.); VI Всеросійський науково-практичній конференції «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (м. Москва, 2005 р.); VII з'їзді інфекціоністів України «Інфекційні хвороби - загальномедична проблема» (м. Миргород, 2006); Російській науково-практичній конференції, присвяченої 110-річниці кафедри інфекційних хвороб Військово-медичної академії ім. С.М. Кірова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины» (м. С.-Петербург, 2006 р.); Науково-практичній конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів «Хвороби печінки в практиці інфекціоніста» (м. Донецьк, 2007 р.); Міжнародному Євро-азіатськаму конгресі по інфекційним хоробам та 7-му Симпозіумі гепатологів Беларусі (Вітебськ, 2008 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 18 наукових робіт, з яких 6 статей у фахових виданнях, затверджених ВАК України, 2 інформаційних листа й 10 - у збірниках з'їздів та науково-практичних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 155 сторінках друкованого тексту. Робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, 4-х розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій і списку літературних джерел. Дисертація ілюстрована 4 рисунками, 13 таблицями. Список використаних літературних джерел включає 273 роботи, з них 79 кирилицею і 194 латиницею.

Основний зміст роботи

гепатит печінка інфекційний вірусний

Матеріали і методи досліджень. Під нашим спостереженням знаходилося 126 хворих на ХГС, серед яких було 73 (58%) чоловіків і 53 (42%) жінок віком від 18 до 70 років, середній вік 36,2±7,2 років. Діагноз ХГС і ступінь його активності встановлювали згідно сучасної міжнародної класифікації хвороб печінки (Лос Анджелес, 1994). Враховували дані анамнезу та клінічні показники (слабкість, підвищена стомлюваність, зниження працездатності, шкірне свербіння, зниження або відсутність апетиту, епізодична нудота, відчуття тяжкості в правому підребер'ї, гепатомегалія). В таблиці 1 поданий розподіл хворих за віком, статтю, тривалістю захворювання, генотипом вірусу, наявністю супутньої патології, ознаками цирозу та підтвердженням діагнозу ХГС методом пункційної біопсії печінки.

Таблиця 1

У всіх хворих проводили загальний аналіз крові і сечі, досліджували рівні в сироватці крові загального білірубіну та його фракцій, активність амінотрансфераз (АлАТ/АсАТ), концентрацію загального білка та його фракцій, протромбіновий індекс, лужну фосфатазу.

Ступінь активності патологічного процесу встановлювали по наявності астеновегетативних та диспептичних проявів, фактору підвищення АлАТ, рівню білоксинтетичних процесів, даних ультразвукового дослідження. Слабо виражена активність процесу (фактор підвищення рівня АлАТ не перевищував 3) встановлена у 68 хворих (53,9%). 49 хворих (38,9%), у яких активність ферменту підвищувалася у 3-5 разів, були віднесені до групи з помірно вираженою активністю процесу.

Верифікація діагнозу та встановлення фази захворювання здійснювали визначенням специфічних серологічних маркерів HCV інфекції (анти-HCV антитіла загальні, анти-HCV-IgM, анти-HCV-IgG, анти-NS3, анти-NS4, анти-NS5) методом імуноферментного аналізу з використанням тест-систем «Діапроф-Мед» (Україна) й «Диагностические системы» (Росія). Фазу реплікативного циклу та ступінь вірусного навантаження (у частки хворих) визначали за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) якісним та напівкількісним методом з використанням тест-систем «Ампли Сенс HCV - 240 s/BKO - 440» (Росія). Генотип HCV також встановлювали за допомогою напівкількісної ПЛР з використанням тест-системи «Вектор-Бест» (Росія).

Концентрацію цитокінів у сироватці крові визначали за допомогою тест-систем «Проконтур» (С.-Пб., Росія) в лабораторії Сумського обласного диспансеру радіаційного захисту населення.

Всі обстежені хворі згідно з характером терапії були розподілені на 3 групи:

1 група хворих, яким проводили мототерапію ронколейкіном на фоні базисної терапії, складала 10 осіб (5 чоловіків та 5 жінок) віком від 17 до 35 років (середній вік становив 28,2±7,02 р), тривалість захворювання становила в середньому 4,1±3,53 років (від 1 до 10 років). Найчастіше було діагностовано генотип 1b (8 випадків) та генотип 3 а (2 випадки).

2 група хворих, яким була проведена комбінована терапія з використанням ронколейкіну та інтерферону альфа-2в на фоні базисної терапії, складала 10 осіб (9 чоловіків і 1 жінка) віком від 17 до 45 років (середній вік становив 28,1±6,96 р), середня тривалість захворювання 2,66±1,77 років (від 1 до 6 років). При генотипуванні виявлений генотип 1b (7 випадків) та генотип 3 а (3 випадки).

3 група хворих (106), що одержувала лише базисну терапію, яка включала лікувально-охоронний режим, дієтичне харчування (стіл №5 за Певзнером), полівітамінні комплекси, антиоксиданти (берлітіон), гепатопротектори (дарсил, ліволін).

Ефективність проведеної терапії оцінювали на підставі досягнення біохімічної (нормалізація активності АлАТ) та вірусологічної (зменшення на 2 порядки чи зникнення з сироватки хворого HCV РНК) ремісії відповідно до рекомендації Європейської групи по вивченню печінки (Eurohep, 1996).

Групу співставлення складали 25 здорових донорів (середній вік становив 35,7±3,4 років).

Виміряння цитотоксичної активності ФНП- шляхом його титрування проводили в стабільній клітинній лінії мишиних фібробластів L929 [П.А. Дьяченко та ін., 2005]. Суспензію клітин (3х10⁴ клітин) в об'ємі 0,1 мл вносили до плоскодонних лунок 96-лункової планшети. Через 24 години в перший ряд лунок планшети вносили дослідний розчин і проводили титрування подвійними розведеннями. Останній ряд залишали вільним, як контролі клітин (з актиноміцином Д та без нього). Після титрування в усі лунки планшети додавали по 50 мкл розчину актиноміцину Д (Sigma, США) у кінцевій концентрації 2 мкг/мл. Облік цитотоксичної дії ФНП- проводили через 24 год. Показник, зворотній останньому розведенню препаратів, яке викликало загибель 50% клітин, враховували як титр ФНП-. Чутливість цієї системи титрування ФНП- становила 2,5 пкг/мл. В якості стандарту використовували високоочищений препарат ФНП- у початкових концентраціях 10 і 2,5 нг/мл.

Візуалізацію цитотоксичної активності ФНП- в досліджених зразках визначали за допомогою вітального МТТ-тесту (3 - (4,5 - dimethyl-2-thiazolyl) - 2,5 - diphenyl-2H-tetrazolium bromide), який ґрунтується на зміні забарвлення з густо блакитного на жовтий під дією мітохондріальних ферментів живої клітини. Скорочено, після титрування ФНП- до кожної лунки додавали по 10 мкл розчину МТТ (5 мг/мл), інкубували 4 години при 37⁰С в інкубаторі з 5% СО₂. Після цього розчин з лунок видаляли вакуумним насосом і додавали 100 мкл ДМСО. Після 10 хв. інкубації у планшетах визначали за допомогою багатоканального спектрофотометру Малтіскан (Швеція) оптичну густину зразків при 570 нм, а контролів - при 640 нм.

Титрування ІФН в клінічних зразках на клітинах MDBK. Клітини MDBK нарощували на флаконах Т75 до щільного моношару. В лунки 96-лункового планшету вносили по 100 мкл ростового середовища (DMEM із 5% телячої ембріональної сироватки). В перші лунки вносили клінічні зразки в кінцевому розведенні 1/10 за схемою та розтитровували подвійними розведеннями зразки до 10 лунки включно, 11 лунка - контроль клітин, 12 - контроль вірусу. Для підтвердження наявності в даних зразках саме досліджуваного цитокіну - альфа / бета ІФН, паралельно титрували проби, що були в умовах дуже низьких рН (2). По 3-3,5х10⁴ клітин в об'ємі 100 мкл після відокремлення від субстрату за допомогою версену та суміші трипсин-версену вносили в лунки планшету із розтитрованими зразками. Культури витримували 24 год. в CO₂ інкубаторі при 37^оС.

Для титрування ІФН в клінічних зразках використовували вірус везикулярного стоматиту (VSV-Vero, пул 910/02) у дозі 5000 БУО/лунку (розведення стоку 10^-3). Інкубація протягом 24-48 год. за вищевказаними умовами. Результати класифікували наступним чином: (-) - цитопатична дія вірусу відсутня, клітини формують щільний моно шар; (+) - спостерігається тотальна цитопатична дія, моно шар клітин зруйнований; (±) - 50% клітинного моно шару зруйновано вірусом. Титр ІФН виражали в міжнародних одиницях активності (МО/мл), де 1 МО дорівнює кількості ІФН, що захищає 50% моно шару клітин MDBK від ЦПД VSV. В якості стандарту використовували галузевий стандарт альфа-ІФН, отриманий з Державного НДІ стандартизації та контролю медичних біологічних препаратів ім. Л.О. Тарасевича (Москва, Росія), а також препарати лаферону (рекомбінантний альфа-2b ІФН) та роферону (рекомбінантний альфаА ІФН).

Одержані результати обробляли методами описувальної статистики (розрахунок середньої величини, середньоквадратичного відхилення, критерій достовірності Стьюдента, значення достовірності) за допомогою програм Microsoft Excel. З метою виявлення кореляційних залежностей між окремими показниками були виведені коефіцієнт кореляції (R) і вірогідність кореляції (кореляційний аналіз Спірмена і Пірсона).

Результати дослідження та їх обговорення

Дебют НСV-інфекції, як правило, перебігав безсимптомно, без яскравої клінічної картини. Загальна тривалість хронічної фази процесу коливалася від 6 місяців до 12 років. Хронічний гепатит С відрізнявся широкою різноманітністю проявів - від маніфестних до субклінічних та інапарантних. У більшої частини хворих хронічний гепатит С мав латентний перебіг. Перші клінічні прояви ХГ були різними в залежності від тривалості латентної фази, ступеня ураження печінки, джерела інфекції, імунного статусу пацієнта. Маніфестація хронічного гепатиту С спостерігалася у вигляді астенічного (117 - 92,8%) та диспептичного (107 - 84,9%) синдромів. Специфічних скарг не відзначалось. Хворі скаржились на загальну слабкість, швидку стомлюваність, відчуття розбитості, зниження працездатності, інтересу до справ, апатію, порушення сну, а також погіршення апетиту, зниження маси тіла, відчуття важкості у правому підребер'ї. Найбільш частими були скарги на слабість (підвищену стомлюваність) і, як наслідок, зниження працездатності у хворих. Збільшення і ущільнення печінки поєднувалося зі збільшенням селезінки у 37,3% хворих.

Хронічна НСV-інфекція приводить до значних змін в імунному статусі пацієнтів. У хворих на ХГС спостерігається відносний лімфоцитоз, проте абсолютна кількість лімфоцитів суттєво не змінюється. Аналіз клітинної ланки імунітету показав достовірну різницю кількості лімфоцитів із CD3 фенотипом. Кількість CD3-клітин, які у кров'яному руслі складають популяцію зрілих Т-лімфоцитів, у хворих на ХГС була знижена і становила 45,7±0,85% проти 61,5±1,6% у групі співставлення (р<0,001). Відомо, що лімфоцити з CD4 маркерами, які володіють характеристиками Т-хелперів/індукторів, через цитокіновий каскад у процесі міжклітинних взаємодій включають імунну відповідь на антиген, що потрапив до організму. Пригнічення експресії маркерних рецепторів Т-хелперів свідчить про їх функціональну недієздатність. Аналіз імунофенотипу лімфоцитів крові хворих на ХГС показав достовірне зниження експресії рецепторів CD4 у порівнянні із контрольними даними (27,3±1,1% і 36,5±1,3% відповідно, р<0,001). Зниження кількості CD4-лімфоцитів спостерігалось у 93 (73,8%) пацієнтів. На відміну від CD4 відносний вміст цитотоксичних CD8 лімфоцитів дещо зростав (26,6±1,05%), проте статистично вірогідно ці показники не відрізнялись від аналогічних параметрів у здорових донорів (23,1±0,8%, р>0,05). Підвищення експресії антигенів CD8 було знайдено у 52 (41,2%) осіб. Внаслідок Т-клітинного дисбалансу у пацієнтів із ХГС спостерігається зниження індексу імунорегуляції, тобто співвідношення субпопуляцій із маркерами CD4/CD8 (1,58±0,05 і 1,02±0,03 у здорових і хворих відповідно, р<0,001). Імунорегуляторний індекс менше за одиницю виявлений у 39,6% випадків. Відносний вміст інших кілерних клітин, природних кілерів, із фенотипом CD16 у хворих на ХГС дещо знижується (7,9±0,65% проти 12,3±0,9% у контролі, р<0,05). Суперекспресія CD16 фенотипу була виявлена у 71 (56,3%) пацієнта.

Паралельно дисрегуляції Т-клітинної ланки у хворих на ХГС спостерігається також помірна активація гуморального імунітету: відносна кількість В-лімфоцитів із фенотипом CD19 достовірно підвищується (16,5±0,98% проти 11,4±0,8% у групі співставлення, р<0,05). Було відзначено достовірне підвищення продукції імуноглобулінів IgG та IgM. У хворих на ХГС виявлена пряма тісна кореляційна залежність між вмістом В-лімфоцитів і рівнем продукції імуноглобулінів (R=0<75, p<0,05).

Непрямий імунофлуоресцентний аналіз маркерів активації показав, що кількість клітин, які реагують із анти-CD25 МКАТ, у сумарній популяції лімфоцитів у хворих на ХГС достовірно порівняно з контролем знижується (табл. 3). Відсоток CD25 клітин в середньому у групі хворих становив 8,7±0,5% проти 13,4±1,1% у здорових осіб (р<0,05). Рівень експресії CD25 маркера (рецептор ІЛ-2) був нижче референтної межи у 73 (57,9%) хворих. Ще одним маркером ранньої активації є рецептор преплазматичних клітин CD38. У обстеженої групи пацієнтів спостерігалося суттєве, в 1,3 рази, підвищення відносної (21,3±0,7%, р<0,05) кількості клітин із CD38 активаційним маркером у порівнянні з даними контрольної групи (16,2±0,6%). Встановлено позитивний помірний зв'язок між вмістом Т-хелперів і активованих CD3-лімфоцитів (R=0,58, p<0,05) і тісний прямий зв'язок між експресією антигенів CD38 і CD19 (R=0,77, p<0,05).

Експресія активаційних маркерів циркулюючими мононуклеарами периферійної крові хворих на ХГС

Окрім маркерів ранньої активації нами була вивчена також експресія маркерів так званої пізньої активації - CD95 і HLA-DR. Аналіз експресії Fas (CD95) рецептора на поверхні сумарної фракції лімфоцитів хворих на ХГС показав значне підвищення відсотка клітин із фенотипом CD95 (16±1,2% проти 12,4±1,5% в контролі, р<0,05). Причому відсоток пацієнтів, у яких готовність до апоптозу була високою, становив 48,1% (61 особа).

Аналіз лімфоцитів, які мали на поверхні антигени HLA-DR, у хворих на ХГС показав зменшену їх експресію при вивчені відносних параметрів. Так відносне число лімфоцитів, які експресують маркери HLA-DR, становило 18,3±0,6% проти 22,7±0,8% в контролі. Однак ця різниця була поза межами статистичної вірогідності (р>0,05), хоча у 40 пацієнтів (31,7%) цей показник виходив за межі референтного інтервалу.

При досліджені спектра медіаторів імунної відповіді у хворих із маркерами HCV-інфекції були знайдені суттєві та різноспрямовані зміни вмісту багатьох цитокінів (табл. 4). Хронічна інфекція викликає підвищення сироваткової концентрації основних прозапальних цитокінів IЛ-1_в, ФНП-б та ІЛ-6 (105,119,9; 88,98,2 i 88,417,8 пкг/мл відповідно), які в 2,0, 7,1 i 2,5 рази перевищують контрольні показники (51,710,4, р<0,05; 12,54,1, р<0,01; 34,86,3, р<0,05, пкг/мл, відповідно). Встановлено помірну кореляційну залежність між рівнями IЛ-1_в і ФНП-б (R=0,57, p<0,05). У хворих із клінічно маніфестними формами (62 пацієнта, 73,8%) виявлені більш високі показники IЛ-1_в та ФНП-б у порівнянні із субклінічними (22 пацієнта, 26,8%) (125,3±7,6 і 97,4±5,6; 73,2±6,8 і 49,1±5,6 пкг/мл, р<0,05, р<0,05).

На рівень цитокінів у сироватці крові суттєво впливають різноманітні фактори, перш за все стать, вік, вживання внутрішньовенних препаратів. Так, у жінок (36, 42,8%) зареєстровані більш високі показники IЛ-1_в та ІЛ-6 у порівнянні із чоловіками (116,3±8,8 і 103,4±9,5 проти 71,2±6,9 і 66,9±5,3 пкг/мл відповідно, р<0,05, р<0,05). У осіб до 25 років концентрація прозапальних цитокінів IЛ-1_в і ФНП-б була вірогідно вище, ніж у осіб зрілого та похилого віку (153,2±11,7 і 121,5±9,8 проти 77,2±6,4 і 61,8±5,3 пкг/мл, р<0,05, р<0,05).

Далі вивчався вміст прозапальних цитокінів у сироватці крові хворих із високою та низькою ферментативною активністю. Встановлено, що у хворих із високою активністю АлАТ/АсАТ (10 осіб, 11,9%) концентрація IЛ-1_в і ФНП-б перевищувала аналогічні показники решти хворих (161,3±10,5 і 127,6±8,1 проти 78,7±6,5 і 66,9±5,4 пкг/мл відповідно, р<0,05, р<0,05). У хворих на ХГС виявлялася помірна пряма кореляційна залежність між рівнями IЛ-1_в і АлАТ (R=0,45, p<0,05).

У хворих (38 чоловік) із значною білірубінемією (більше двох норм) секреція ІЛ-6 була більш високою, ніж у решти пацієнтів (127,4±8,1 проти 63,8±5,2 пкг/мл, р<0,05).

Була зроблена також спроба співставити рівень цитокінів залежно від генотипу вірусу, яким була інфікована людина. У хворих із 1b генотипом вірусу, який зустрічався найчастіше (75 пацієнтів), рівень експресії ІЛ-6 і ФНП-б був вище, ніж у хворих із 3а генотипом вірусу (104,8±10,3 і 108,2±7,5 проти 61,8±4,3 і 72,9±6,6 пкг/мл відповідно, р<0,05, р<0,05). Кореляційний зв'язок у цьому випадку мав помірне позитивне значення (R=0,38 i R=0,41, р<0,05, р<0,05). Це свідчить про більшу активність запального процесу в печінці в разі інфекції 1b генотипом вірусу. Виявлений також помірний кореляційний зв'язок між рівнями ІЛ-6 і ФНП-б (R=0,49, p<0,05), що може відображати стимулюючий вплив ФНП-б на продукцію ІЛ-6.

Ситуація з регуляторними цитокінами ІЛ-2 і ІФН-г була прямо протилежна: високі показники частіше спостерігалися у хворих із 3а генотипом вірусу (141,4±12,5 і 175,2±19,3; 47,7±3,2 і 109,1±8,9 пкг/мл відповідно, р<0,05, р<0,05). Рівень позитивної кореляції був також помірним (R=0,37 i R=0,46, р<0,05, р<0,05).

Звертає на себе увагу висока концентрація визначального медіатора другого клону Т-хелперних клітин ІЛ-4. Середня концентрація його у сироватці крові хворих на ХГС становила 558,945,7 пкг/мл, що у 10,7 рази перевищує рівень контролю. Цей факт свідчить про різкий дисбаланс у функціюванні основних клонів Т-хелперних клітин, що приводить до активації гуморальної імунної відповіді, втім неадекватної, персистенції вірусу та хронізації інфекції. Відзначалася помірна кореляційна залежність між показниками ІЛ-4 та прозапальних цитокінів ІЛ-6 та ФНП-б (R=0,58 i R=0,54, p<0,05, p<0,05).

Як зазначено, вплив ронколейкіну на перебіг ХГС вивчався на двох групах хворих по 10 осіб кожна. До складу першої групи хворих (монотерапія ронколейкіном) входило 5 чоловіків та 5 жінок віком від 17 до 35 років (середній вік становив 28,2±7,02 р.) з тривалістю захворювання в середньому 4,1±3,53 років (від 1 до 10 років). У 8 хворих цієї групи був виявлений генотип 1b вірусу і ще у двох - генотип 3а.

Перед початком лікування у 8 хворих спостерігалось підвищення активності АлАТ (2,62±1,75 ммоль/г*л). У 2 хворих АлАТ була в межах норми. АсАТ була підвищена у 6 хворих (1,26±0,76 ммоль/г*л). Рівень віремії коливався від 10⁴ до 10⁵ копій/мл (у двох пацієнтів вірусне навантаження сягало 10⁷ копій/мл). У більшості хворих спостерігалося зниження кількості Т-хелперів з фенотипом CD4+, яка в середньому становила 28,17±3,74%, внаслідок чого зменшувався також ІРІ.

Усі хворі одержали курсову дозу ронколейкіну (12,5 млн МО) протягом двох місяців на фоні базисної терапії.

Ефективність терапії оцінювалася після завершення курсу лікування. На початку лікування у всіх хворих спостерігалась субфебрільна температура, у 6 пацієнтів відмічалося нестійке погіршення самопочуття (запаморочення, головний біль, помірне підвищення температури тіла, нудота, підвищення АТ), підвищення активності трансаміназ. Усі ці симптоми через 6-10 днів лікування зникали.

На протязі лікування відмічено зменшення диспепсичного та астено-вегетативного синдромів з 7 дня, нормалізація розмірів печінки з 15 дня, зникнення позапечінкових проявів, покращення самопочуття.

В біохімічному аналізі крові спостерігалося зниження активності АлАТ (1,44±1,11 ммоль/г*л, у 4 хворих - нормалізувалась) і нормалізувалась у 9 хворих АсАТ (0,54±0,41 ммоль/г*л), зменшення рівня білірубіну, підвищення рівня альбуміну крові, зниження рівня глобулінів.

При дослідженні рівня цитокінів виявлено зниження рівня ФНПб (загального і вільного), IЛ-1_в, підвищення рівнів IЛ-2, IЛ-6, ІФНб, ІФНг (табл. 5). Спостерігалися також зміни в субпопуляційному складі Т-лімфоцитів: незначне зниження CD3, підвищення рівня СD4, різке зниження CD8 та, відповідно, підвищення ІРІ, досить суттєве підвищення кількості NK-клітин. Усі ці зміни свідчать про підсилення клітинної та неспецифічної ланок імунітету.

Аналіз вірусного навантаження після закінчення терапії показав зниження віреміїї в середньому на 3 порядки. У двох хворих після закінчення терапії вірус в крові не визначався. Втім, у однієї пацієнтки через 6 місяців знову зв'явилася віремія, в той час як у другої вже протягом 6 місяців вірус у крові не визначається. У двох пацієнтів рівень вірусного навантаження не змінився. З метою підвищення ефективності лікування у подальшому ми використали комбіновану терапію ронколейкіном та інтерфероном альфа-2b.

Друга група хворих складала 10 пацієнтів (9 чоловіків і 1 жінка), хворих на ХГС, віком від 17 до 45 років (середній вік становив 28,1±6,96 років), середній термін захворювання 2,66±1,77 років (від 1 до 6 років). У всіх спостерігалось підвищення активності АлАТ (2,36±1,69 ммоль/ч*л). Рівень віремії визначався кількісним методом і в середньому складав 2,4*10⁵ копій/мл (коливався від 3200 копій/мл до 1,7*10⁷ копій/мл). При генотипуванні виявлений генотип 1b (7 випадків) та генотип 3 а (3 випадки). У більшості хворих спостерігалось зниження кількості Т-хелперів, яка в середньому складала 28,17±3,74%. Зменшувався також ІРІ. При дослідженні цитокінового профілю у крові хворих цієї групи з маркерами хронічної HCV-інфекції знайдені підвищені концентрації IФН обох типів (IФНб - 670,2±69,8 МО/мл, IФНg-- - 139,7±45,8 пкг/мл) і прозапальних цитокінів: ФНПб, IЛ-2, IЛ-6, (IЛ-2 - 71,9±15,3 пг/мл, IЛ-6 - 29,3±17,0 пг/мл).

Усі хворі отримували ронколейкін у кількості 12,5 млн МО на курс (5 інфузій по 1 млн МО та 15 інфузій по 500 тис МО) шляхом в/в крапельного повільного введення через 2 дні та препарати інтерферону-б2в (лаферобіон) (по 3 млн МО в/м тричі на тиждень на протязі 3 місяців). На початку лікування у всіх хворих відмічався грипоподібний синдром (підвищення температури до 38-39 С, нездужання, головокружіння).

Результати лікування: у всіх хворих відзначалася нормалізація активності трансаміназ, імунограми (підвищення рівня Т-хелперів та ІРІ). Рання вірусологічна відповідь (зникнення РНК ВГС з крові) відмічена у 70% пацієнтів. У 3 хворих зафіксовано зниження вірусного навантаження, але менш ніж на 2 log.

При дослідженні цитокінового профілю у крові хворих після лікування спостерігалося підвищення концентрації ІФН обох типів (IФНб - 792,1±86,2 МО/мл, IФНg-- - 198,2±54,1 пкг/мл) і зниження вмісту прозапальних цитокінів: ФНПб, IЛ-2, IЛ-6, (ФНПб - 47,2±11,9 пг/мл, IЛ-6 - 17,2±7,3 пг/мл). Водночас у групі хворих, що отримували лише базисну терапію, не було зафіксовано змін рівнів цитокінів, вірусного навантаження, вмісту імуноцитів.

Після отримання ранньої вірусологічної відповіді хворі продовжували лікування комбінацією інтерферона і рибавірина.

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення актуальної наукової задачі, що полягає у встановленні імунопатогенетичних закономірностей HCV-інфекції, які приводять до її хронізації й довічної персистенції вірусу гепатиту С, а також в патогенетичному обгрунтуванні включення в комплексну терапію хворих на ХГС рекомбінантного аналогу ІЛ-2 (ронколейкіну) та аналізі його клінічної ефективності.

1. У 33,0% хворих не вдалося встановити зв'язок захворювання з певним фактором ризику інфікування. Дебют НСV-інфекції перебігав безсимптомно, без яскравої клінічної картини. В клінічній картині домінували гепатомегалія (100,0%), астенічний (92,8%) та диспепсичний (85,7%) синдроми. З позапечінкових проявів (23,8% хворих) найчастіше спостерігалася анемія (23,3%), червоний плоский лишай (20,0%), та автоімунний тиреоідит (33,3%). Специфічні зміни в загальному аналізі крові не визначались.

2. Для HCV-інфекції в цілому характерне зменшення вмісту в крові зрілих Т-лімфоцитів, які несуть маркер CD3+, і субпопуляції Т-хелперів із фенотипом СD4+ (73,8% хворих), в той час як кількість Т-клітин кілерів в цілому не змінюється (кількість ЦТЛ із фенотипом CD8+ дещо збільшується (41,2% хворих), а NK-клітин із маркером CD16+ - падає майже вдвічі (56,3% хворих). Це приводить до суттєвого зменшення імуно-регуляторного індексу (39,6% хворих). Вміст В-лімфоцитів при хронічній HCV-інфекції зростає на 30-40%. Значимо також зростає продукція імуноглобулінів.

3. Встановлена одночасна суперекспресія імунорегуляторного цитокіну ІФН-г (139,7±45,8 пкг/мл) і ключового цитокіну Th2-клону Т-лімфоцитів ІЛ-4 (558,945,7 пкг/мл), що приводить до виснаження імунної системи: спостерігається слабка антитільна віруснейтралізуюча відповідь в той час, як ефект підвищеної продукції ІФН-г не реалізується належним чином і в потрібному обсязі. Домінування ІЛ-4 визначає весь спектр імунопатологічних процесів, наслідком яких є персистенція вірусу і хронізація інфекції. Одночасне включення функцій Th1 i Th2 гальмує розвиток будь-якої форми імунної відповіді й приводить до розвитку імунодефіциту. Показано, що кількість одного з найважливіших прозапальних цитокінів ФНП-б, не співпадає з очікуваною величиною біологічної активності. Це свідчить про наявність в крові систем, які обмежують реалізацію біологічних ефектів ФНП-б.

4. При призначенні ронколейкіну у більшості випадків (89,7%) хворі відзначали покращання самопочуття на тлі лікування. Як моно-, так і комбінована (із ІФН-б2в - лаферобіоном) терапія ронколейкіном сприяє активації Т-клітинної ланки імунітету: збільшенню вмісту Т-лімфоцитів та їх CD4+ субпопуляції (40,4% хворих), зменшенню кількості В-лімфоцитів та рівней імуноглобулінів. Використання ронколейкіну приводить до зменшення дисбалансу цитокінової регуляції імунної відповіді: зменшується рівень ФНП-б (79,4% хворих) й підвищується концентрація ІЛ-2 (75,4% хворих). При одночасному порівняльному аналізі використання ронколейкіну для моно- і комбінованої терапії ХГС серйозних побічних ефектів, які б примусили призупинити терапію, зареєстровано не було.

5. Повна відповідь (біохімічна й вірусологічна) досягнута у 60% пацієнтів. Рекомендована терапія з використанням ронколейкіну у наступних випадках:

· пацієнтів із генотипом 1b вірусу, який погано піддається стандартній ІФН терапії

· коли немає ефекту після комбінованої терапії із інтерфероном та рибавірином

· якщо є непереносимість до одного з компонентів комбінованої терапії рибавірином і інтерфероном або спостерігається розвиток ускладнень при їх використанні

Практичні рекомендації

1. Показання для використання ронколейкіну включають наявність 1b генотипу вірусу ГС, відсутність ефекту після комбінованої терапії інтерфероном та рибавірином, непереносимість до ІФН або рибавірину чи розвиток ускладнень при їх використанні.

2. При лікуванні хворих на ХГС зі слабкою та помірною активністю патологічного процесу доцільне використання монотерапії ронколейкіном.

3. Ронколейкін пропонується у складі комбінованої терапії за схемою: 12,5 млн МО на курс (5 інфузій по 1 млн МО та 15 інфузій по 500 тис МО) вводиться в/в крапельно повільно через 2 дні разом із препаратами інтерферону-б2в (лаферобіон) (по 3 млн МО в/м тричі на тиждень на протязі 3 місяців).

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Дьяченко П.А. Діагностика і терапія вірусного гепатиту С / П.А. Дьяченко // Вісник СумДУ. - 2004.- №11 (70).-С. 126-137.

2. Дьяченко П.А. Дифференцировка Т-лимфоцитов при хронических вирусных гепатитах / П.А. Дьяченко, Н.Д. Чемич // Вісник СумДУ. - 2004. - №7 (66).-С. 173-184. (Здобувач здійснив аналіз літературних джерел, дослідження матеріалу, узагальнення результатів і сформулював висновки).

3. Дьяченко П.А. Интерфероны в патогенезе и лечении вирусных гепатитов / П.А. Дьяченко, А.Г. Дьяченко // Вісник СумДУ. - 2005. - №7 (79).-С. 35-44. (Здобувач здійснив пошук літературних джерел, провів аналіз матеріалу та узагальнення результатів і сформулював висновки).

4. Вміст інтерферону і фактору некрозу пухлин альфа у сироватці крові хворих на хронічні вірусні гепатити / [П.А. Дьяченко, Ю.Й. Кудрявець, А.Г. Дьяченко, А.О. Сніцар] // Вісник СумДУ. - 2005. - №3 (75).-С. 111-117. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, описання і аналіз отриманих результатів).

5. Сироватковий рівень інтерферону і фактора некрозу пухлин у хворих, хронічно інфікованих вірусами гепатиту В та С / [П.А. Дьяченко, Ю.Й. Кудрявець, А.Г. Дьяченко, А.Д. Вовк] // Сучасні інфекції, - 2005. - №1.-С. 24-29. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, статистична обробка та описання і узагальнення отриманих результатів).

6. Аутоиммунные процессы при вирусных гепатитах / [П.А. Дьяченко, H.A. Галушко, А.Г. Дьяченко, Е.В. Коверга] // Імунол. та алергол. - 2003. - №1.-С. 22. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, описання і аналіз отриманих результатів).

7. Дьяченко П.А. Нарушение регуляции иммунного ответа при вирусных гепатитах / П.А. Дьяченко // Мат. II Республіканської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених. Сумы, 2003, с. 92-93

8. Дьяченко П.А. Клинические особенности хронических вирусных

9. гепатитов В и С / П.А. Дьяченко // Мат. III Республіканської науково-практичної конференції студентів та молодих вчених. Суми, 2004, С. 124-125.

10. Дьяченко П.А., Цитокинемия в патогенезе хронических вирусных гепатитов / П.А. Дьяченко, А.Г. Дьяченко // Мат. 10-й Росс.конф. «Гепатология сегодня», 28-30.03.05, М.: Росс.ж.гастроэнтерол. гепатол. - 2005.-Т.ХУ, №1.-С. 12. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, статистична обробка та описання і узагальнення отриманих результатів).

10 Дьяченко А.А. Содержание интерферона и фактора некроза опухоли в крови больных хроническими вирусными гепатитами / А.А. Дьяченко, П.А. Дьяченко // Мат. V съезда гастроэнтерол. России, М., 3-6.02.2005.-С. 237-238. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, статистична обробка та описання і узагальнення отриманих результатів).

11 Дьяченко А.А. Вирусспецифическая продукция цитокинов мононуклеарами периферической крови при хронической инфекции вирусами гепатита В и С / А.А. Дьяченко, П.А. Дьяченко // Мат. V съезда гастроэнтерол. России, М., 3-6.02.2005. - С. 238-240. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, статистична обробка та описання і узагальнення отриманих результатів).

12 Дьяченко П.А. Сходство иммунопатогенетических мотивов персистенции гепатотропных вирусов / П.А. Дьяченко, А.Г. Дьяченко // Мат. VI Всеросс.конф. «Вирусные гепатиты», 24-26.05.2005.-С. 88-89. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, статистична обробка та описання і узагальнення отриманих результатів).

13 Дьяченко П.А. Сучасний погляд на патогенез гепатиту С. Досвід лікування хворих Ронколейкіном / П.А. Дьяченко, А.Д. Вовк, А.Г. Дьяченко // Мат. VII з'їзду інфекціоністів України «Інфекційні хвороби - загальномедична проблема». - 26-29 вересня 2006 р. Миргород.-С. 42-43.

14 Дьяченко П.А. Содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-а,) и иммунокомпетентных клеток у больных хроническими вирусными гепатитами (ХВГ) / П.А. Дьяченко, А.Д. Вовк, А.Г. Дьяченко // Мат. Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. СМ. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», С.-Пб., 2006, С. 101-102. (Здобувач здійснював пошук літератури, проводив дослідження й приймав участь в аналізі та у загальненні результатів).

15 Дьяченко П.А. Досвід застосування препарату Ронколейкіну у хворих на хронічний гепатит С. / П.А. Дьяченко, А.Д. Вовк // Мат. науково-практичної конференції і пленуму Асоціації інфекціоністів «Хвороби печінки в практиці інфекціоніста», Донецьк, 2007, С. 40-42. (Здобувач здійснив пошук літературних джерел, провів аналіз матеріалу та узагальнення результатів і сформулював висновки).

16 Дьяченко П.А., Федорченко С.В., Дьяченко А.Г. Эффективность комбинированной терапии препаратами рекомбинантного интерлейкина-2 и рекомбинантного интерферона альфа-2в у больных с хронической НСV-вирусной инфекцией / Мат. Международного Евро-азиатского конгресса по инфекционным болезням, 7-го Симпозиума гепатологов Беларуси. 4-6 июня 2008 г. Витебск. С. 71-72. (Здобувач здійснив пошук літературних джерел, провіє аналіз матеріалу та узагальнення результатів і сформулював висновки).

17 Методика застосування «Ронколейкіну» при хронічному гепатиті С / [Дьяченко П.А., Вовк А.Д., Федоченко С.В., Ясеновий С.П.] // Інформаційний лист про нововведення в системі охорони здоров'я №220-2007. К., 2007. - 4 с. (Здобувачем зібрано матеріал, проведене його дослідження, статистична обробка та описання і узагальнення отриманих результатів)

Размещено на Allbest.ru