Епідеміологічне і молекулярно-генетичне дослідження раку стравоходу в Китаї

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа

«Науковий центр радіаційної медицини

Академії медичних наук України»

ЕПІДЕМІОЛОГІЧНЕ І МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ РАКУ СТРАВОХОДУ В КИТАЇ

03.00.15 - генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Цао Юй

Київ - 2009

АНОТАЦІЯ

Цао Юй. Епідеміологічне і молекулярно-генетичне дослідження раку стравоходу в Китаї. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.15 - генетика (біологічні науки). - ДУ «Науковий центр радіаційної медицини АМН України», 2009 р.

Частота раку стравоходу складає 0,24%. Співвідношення чоловіків і жінок у населенні Китаю складає 1,06:1, а серед хворих у середньому 1,7:1. У провінції Хебей співвідношення статей серед хворих складає 3,5:1. Ризик раку стравоходу підвищений не тільки для родичів хворого, але також для їх подружжя і свояків. За наслідками сегрегаційного аналізу була відхилена моногенна модель успадкування раки стравоходу. В результаті компонентного аналізу було розраховано показник успадковуваності раку стравоходу, який склав 73%. Це значення вказує на існування в системі генетичного контролю захворювання не повністю пенетрантного гена з сильним ефектом, як досліджений ген FHIT. Частота делеції в 5 екзоні гена FHIT складає q=0,37, в 8 екзоні q=0,09. Згідно з розрахунками, 14% населення провінції Хебей теоретично є гомозиготними носіями делеції в екзоні 5 і 47% гетерозиготами. Менше 1% є гомозиготами і 16% гетерозиготами по делеції в 8 екзоне. У 63% гетерозиготних носіїв мутації гена FHIT у ракових клітинах виявлена втрата гетерозиготності 5 екзона, у 57% - втрата гетерозиготності відбулася у 8 екзоні. Гіперметилювання гена FHIT виявлено у клітинах пухлини у 77% пацієнтів. Генетична або епігенетична зміна гена FHIT виявлена у ракових клітинах усіх пацієнтів, що дає підставу розглядати його як головний чинник схильності до раку стравоходу у дослідженій частині населення Китаю.

Ключові слова: рак стравоходу, успадковуваність, ген FHIT, втрата гетерозиготності, метилювання.

АННОТАЦИЯ

Цао Юй. Эпидемиологическое и молекулярно-генетическое исследование рака пищевода в Китае. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика (биологические науки). - ГУ «Научный центр радиационной медицины АМН Украины», 2009 г.

В населении Китая на 100 женщин приходится 106 мужчин. Среди всех больных раком пищевода в Китае соотношение мужчин и женщин составляет 1,7:1. В провинции Хебэй соотношение полов среди больных ещё больше сдвинуто в сторону мужского пола и составляет 3,5:1. Популяционная частота рака пищевода в провинции Хебэй составляет 0,24 %. В родословных пробандов отмечается семейное накопление случаев рака пищевода, превышающее популяционное значение в 14-50 раз. Родословные пробандов женского пола демонстрируют более высокое семейное накопление, чем родословные пробандов-мужчин. У женщин больные родители составляют 12,3%, больные сибсы 7,5%. У мужчин больны 11,0% родителей и 3,3% сибсов. Смертность от рака пищевода для родителей пробандов составляет 355 на 100 тыс. населения, сибсов 262 на 100 тыс. Смертность супругов пробандов выше, чем смертность свойственнников, и в обеих группах превышает средние популяционные значения. Это указывает на наличие в этиологии рака пищевода общего средового и семейного фактора. Стандартизованная смертность родителей пациентов составляет 2,671, а для родителей супругов 0,472. У родственников пациентов вероятность развития рака пищевода в 5,66 раза выше, чем у свойственников.

Моногенная модель наследования рака пищевода, тестированная с помощью сегрегационного анализа, не получила подтверждения. По сегрегационным частотам составлены таблицы повторного риска, которые могут использоваться на первом этапе генетического консультирования. Анализ заболевания как полигенного признака позволил сделать оценку показателя наследуемости, который составил 73%. Величина показателя наследуемости попадает в область значений, адекватных полигенной модели с эффектом главного гена. В качестве такого гена изучали ген супрессор опухоли FHIT. Для изучения делеций этого гена в области 5 и 8 экзона использованы маркёры D3s1540 и D3s1234. Установлено, что клетки здоровой ткани пищевода 17 (77,3%) пациентов несут гетерозиготную делецию в 5 экзоне. При этом у 10 из них в гомологичной опухолевой ткани произошла утрата гетерозиготности. Нормальные и опухолевые клетки четырёх (18,2%) пациентов были гомозиготными по делеции. У одного пациента опухолевые клетки были гетерозиготными, а нормальные гомозиготны по делеции 5 экзона. Клетки здоровой ткани у 21 (95,5%) пациента были гетерозиготны по делеции в 8 экзоне. У одного пациента в здоровой ткани, как и в опухолевой, имелась гомозиготная делеция этого экзона. Всего в опухолевых клетках 18 (81,8%) пациентов имелась та или иная гомозиготная делеция гена FHIT, а у трёх больных в анализируемых участках гена FHIT искомые мутации не выявлены. По-видимому, у этих больных мутацией могут быть затронуты другие участки гена, либо природа генетических изменений, вызвавших рак, была иной. На основании проведённых исследований можно предполагать, что делеция гена, обнаруженная в данной зоне, играет важную роль в возникновении рака пищевода у лиц китайской этнической группы. Согласно полученным оценкам, около 23% населения являются гомозиготами по делеции в 5 экзоне, 50% являются гетерозиготными носителями этой мутации, 27% являются гомозиготами по нормальному аллелю. Около 5 % населения являются гомозиготами по делеции в 8 экзоне, 33 % - гетерозиготные носители мутации и 62 % - нормальные гомозиготы. Высокие частоты мутации гена супрессора опухоли у изученного населения можно рассматривать как причину высокой частоты рака пищевода в данном регионе. Только у одного из 22 (4,6%) пациентов в клетках здоровой ткани пищевода обнаружено метилирование гена FHIT. В клетках опухоли метилирование выявлено у 17 (77,3%) пациентов. Всё изложенное указывает на то, что определение делеций и уровня метилирования гена FHIT может быть использовано для ранней диагностики рака пищевода.

Ключевые слова: рак пищевода, наследуемость, ген FHIT, делеції, потеря гетерозиготности, метилирование.

SUMMARY

Сао Yu. A study of epidemiology and molecular genetics of esophageal cancer in China. - A manuscript.

Thesis for the Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.15 - genetics (biological sciences). - State institution “Research Centre for Radiation Medicine, Academy of Medical Sciences of Ukraine”Kyiv, 2009.

In China, population's average sex ratio is every 106 males per 100 females. But in patients, who ill with esophageal cancer, the ratio is 170 males per 100 females. Province Hebei (China) is one of the areas that have high-incidence of esophageal cancer. Especially the most high-incidence in the Cixian County. In random sample from Hebei and from Cixian County, that ratio is appearing excursion to male sex, and higher than the sex ratio of China. Sex ratio of patients shifted sharply to male. In relatives, the highest mortality rate of esophageal cancer appears in the first degree relatives - 313 per 100 thousand. It is an average value of the first degree relatives - parents (355 per 100 thousand), and siblings (262 per 100 thousand).The mortality rate of second degree relatives is lower than first degree relatives'. The share of the similar family environment accounts for 30%, and it can be considered as an environmental component for phenotypic variance. The share of the genetic component, namely genetic variance, accounts for 70%, and in a narrow sense, that is heritability. The mortality of spouses who have the same family environment with patient is higher than other relatives in law. Maybe there are strong factors in the etiology of esophageal cancer. Relatives in law of patient shared with the general social environment, but spouses also have a family environment. Family environment is 50.3%, 49.7% common home. SMR (standard mortality ratio) in parents of patients is 2.671, but in the parents of spouses is only 0.472. This means that the probability to getting esophageal cancer in the relatives of patients is 5.66 times higher than relatives in law - people, who haven't consanguinity with them. Spouses of patients have not same genes with patients, but there live together, namely, there are the same living conditions. The relative risk in them was 1.99. This value of them is higher than others that don't live together, namely, have not the same environment.

Key words: esophageal cancer, hereditability, FHIT gene, deletion, loss of heterozigosity, methylation.

рак стравохід ген

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Рак стравоходу - одне з найпоширеніших в Китаї онкологічних захворювань. Його частота в окремих реѓіонах на 1-2 порядки вища, ніж на територіях інших країн світу (Wu, Sun, 2004). Такий стан справ викликає закономірний інтерес у вчених і тривогу клініцистів. Враховувати випадки раку в Китаї почали в 70-х роках минулого століття. Тоді ж почали проводити генетичні дослідження. Було виявлено сімейне накопичення випадків захворювання (Zhang, Yan, Sun, 1999), розраховано показники успадковуваності, які сильно варіювали від популяції до популяції (Wu, Sun, 2004). Останніми роками дослідники звернулися до вивчення молекулярних основ раку стравоходу. Вже описано багато генів онкологічних захворювань (Wu, Sun, 2004), один з них - FHIT (fragile histidine triad). У різних пухлинах відсутня активність гена FHIT, виявляються його змінені варіанти (T. Druck, 1997; S. Hayashi, 1997; N. Hu 2000; W. D. Li, 1998; X.Luan, 2000; C. Menin, 2000; S. Ogasawara, 1995; L.Virgilio, 1996; D. B. Zimojic, 1997). Нормальний алель гена FHIT є супресором пухлини, а мутантний надає схильності до утворення пухлини (M. Ohta, 1996). У різних видах пухлин людини виявляються делеції гена FHIT і його надмірне метилювання (T. Kuroki, 2003; T. Niguchi, 2003; H. Tanaka, 1998; Yang Q.2002; S. Zochbauer- Muller, 2001). Видавалося важливим провести дослідження змін гена FHIT хворих на рак стравоходу з провінції Хебей, яка відрізняється найвищою в світі частотою цього захворювання.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана на кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету імені В.Н.Каразіна за проблематикою, яка розробляється в рамках теми “Структура і генетичні процеси, поширеність спадкової патології в популяціях різного ступеня урбанізації”, номер державної реєстрації 0103U005742.

Мета дослідження - вивчити спадкові основи раку стравоходу в китайській провінції Хебей.

Для досягнення цієї мети потрібно було вирішити наступні завдання:

- проаналізувати дані захворюваності і смертності

родичів і свояків пробандів;

- вивчити генеалогічний матеріал і оцінити сімейне накопичення;

- протестувати моногенні моделі успадкування раку стравоходу;

- розрахувати успадковуваність раку стравоходу;

- вивчити делеції в гені FHIT в пухлинних і нормальних клітинах хворих на рак стравоходу;

- досліджувати рівень метилювання гена FHIT в ракових і нормальних клітинах;

- визначити частоти алелей гена FHIT, описати структуру популяції за цим геном.

Об'єкт дослідження: спадковість людини.

Предмет дослідження: спадкові чинники розвитку раку стравоходу.

Методи дослідження: епідеміологічний, популяційно-генетичний, клініко-генеалогічний, молекулярно-генетичний, статистичний.

Новизна роботи полягає в тому, що в ній вперше проведено комплексне дослідження раку стравоходу в населення, яке характеризується найвищою розповсюдженістю цього захворювання у світі. Вперше одночасно досліджувалися генетичні (делеції) і епігенетичні (метилювання) зміни того ж самого гену - FHIT. Показано, що будь-яка інактивація гена-супресора - як генетична, так і епігенетична - призводить до розвитку захворювання, і це стало експериментальним підтвердженням двоударної теорії виникнення раку. Вперше за результатами аналізу здорової тканини пацієнтів були розраховані частоти алелей гена FHIT і висунуто припущення, що висока розповсюдженість раку стравоходу у дослідженому регіоні Китаю пов'язана із високою частотою делецій цього гену.

Теоретичне значення дослідження полягає в тому, що при вивченні спадкової основи раку стравоходу в ньому реалізовані різні підходи - епідеміологічний, сімейно-генеалогічний, молекулярно-генетичний і популяційний. Дисертація важлива також і тим, що в ній досліджувалося населення з унікально високою частотою даного захворювання. Вона робить повнішим уявлення про різноманітність людських популяцій. У роботі показано, що при підвищенні частоти захворювання переважно страждає більш схильна стать - чоловіча. Уточнено показники, що враховуються при оцінці ризику під час генетичного консультування. Показано, що чинником ризику виникнення раку стравоходу є не тільки спільність генів, але й спільність сімейного середовища, тому до групи ризику на це захворювання належать не тільки родичі пробандів, але також їх чоловіки або жінки і свояки. Встановлено етіологічне значення генетичних і епігенетичних змін гена FHIT в захворюванні на рак стравоходу. За даними молекулярно-генетичного аналізу розраховано частоти нормальних і мутантних алелей вивченого гена, представлено теоретичний опис структури популяції за цим геном. Розраховані частоти алелей і генотипів можуть служити відправною точкою у подальших дослідженнях генетичної основи раку стравоходу.

Практичне значення. Результати дослідження можуть знайти застосування в медико-генетичному консультуванні. Відомості про сімейне накопичення можуть бути використані для формування групи підвищеного ризику виникнення раку стравоходу. Складені на основі отриманих даних таблиці повторного ризику можуть використовуватися для орієнтовної кількісної оцінки вірогідності захворювання на рак стравоходу на першому етапі генетичного консультування. Уточнені показники ризику можуть використовуватися при складанні генетичного прогнозу сім'ї, що потребує консультації. Показано, що представники чоловічої статі, що мають хворих родичок, повинні бути об'єктом підвищеної уваги генетиків і онкологів. Доведено, що до групи ризику на рак стравоходу належать не тільки родичі пробандів, але також подружжя і свояки. Найбільш високий ризик захворювання на рак стравоходу у чоловіків, що мають хворих на рак родичок першого ступеня. Саме вони є першочерговими кандидатами на молекулярно-генетичне обстеження. Для уточнення ризику раку стравоходу пропонується аналізувати делеції гена FHIT в області 5 і 8 екзонів, а також метилювання цього гена.

Особистий внесок дисертанта. Дисертант самостійно провів пошук і аналіз наукової літератури за темою дослідження, зібрав демографічний і генеалогічний матеріал, склав електронну базу даних, написав комп'ютерну програму для розрахунків, пов'язаних з генетичним аналізом, обчислив демографічні показники, виконав сегрегаційний і компонентний аналіз, склав таблиці повторного ризику. Дисертант власноручно виділив ДНК з пухлинних і нормальних тканин хворих на рак стравоходу, підібрав праймери і умови проведення полімеразної ланцюгової реакції і метилспецифічної полімеразної ланцюгової реакції, виконав усі аналізи, перевірив статистичні гіпотези, звів результати в таблиці, надав у вигляді графіків.

Апробація результатів дисертації. Основні положення своїх досліджень дисертант доповів на Науковій конференції, присвяченій 100-літтю з дня народження Г.І.Семененко (Харків, 2006), II-й міжнародній науковій конференції студентів і аспірантів «Молодь і поступ біології» (Львів, 2006), I-й міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2006), Науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання медичної генетики» (Київ, 2007), II-й міжнародній конференції молодих учених «Біологія: від молекули до біосфери» (Харків, 2007), на IV з'їзді медичних генетиків України з міжнародною участю (Львів, 2008).

Публікації. Основні положення дисертації викладено в 11 друкованих працях, серед них 5 статей у виданнях, затверджених ВАК України, 1 стаття у збірнику наукових праць, 5 тез у матеріалах з'їздів, симпозіумів та наукових конференцій.

Структура і об'єм дисертації. Дисертація викладена на 130 сторінках друкованого тексту, включає 27 таблиць і 10 рисунків. Дисертація складається зі вступу, огляду наукової літератури, методичного розділу, розділу власних досліджень, висновків, практичних рекомендацій. Список використаної літератури містить 247 джерел.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Збір матеріалу проведено в Інституті онкології 4-ої клініки Медичного університету провінції Хебей (Китай). Вивчено родоводи 603 (467 чоловіків і 136 жінок) хворих на рак стравоходу, що проживають у провінції Хебей, і 211 мешканців повіту Цийсян (154 чоловіки і 57 жінок). Всі пробанди етнічні китайці. Генеалогічна інформація охоплює чотири покоління. Дані про захворюваність на рак стравоходу і смертності отримані з China Cancer DateBase (2000). Обчислено показники стандартизованої смертності (Дінів Дянг, 1983; Huang Y. Q., 2002), відносного ризику і атрибутивного ризику (Дінів Дянг, 1983). Сегрегаційний аналіз виконано методом А. Вайнберга (N. E. Morton, 1969). Показник успадковуваності обчислено за формулами компонентного розкладання загальної фенотипової дисперсії (D. S. Falconer, 1965; J. W. James, 1971).

Пухлинні і гомологічні здорові тканини 22 (17 чоловіків і 5 жінок) хворих на рак стравоходу було отримано хірургічним шляхом. Зразки тканини відразу після резекції охолоджувалися і зберігалися до аналізу при температурі -80.С. ДНК виділяли за допомогою протеїнкинази К методом фенол-хлороформної екстракції (Joe Sambrook, David Russell, 2001). Виділену ДНК зберігали при -20єС. Для визначення концентрації ДНК використовували програму «Gel-pro 4.0». Два нуклеотидних повтори маркерів, локалізованих на D3S1234 і D3S1540, було ампліфіцировано за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Положення мікросателітів, послідовність праймерів і розмір продуктів ПЛР наведені в табл.8. Рівень метилювання гена FHIT досліджували за допомогою метилспеціфічної полімеразної ланцюгової реакції (J. G. Herman, 1996). Створення праймерів для гена FHIT (табл.9) здійснювалося відповідно до Noguchi (T. Noguchi, 2003). Номер в GeneBank: U76262 і U76263.

Перевірку гіпотези про зв'язок раку стравоходу з генетичними і епігенетичними змінами гена FHIT проведено за допомогою критерію ч2 і точного методу Фішера (R. A. Fisher, 1958). Розрахунки виконано в програмі Еxcel.

Результати. Частота раку стравоходу складає 0,24 %. В середньому серед населення Китаю на 100 жінок припадає 106 чоловіків. Серед хворих на рак стравоходу співвідношення чоловіків і жінок у середньому по країні складає 1,7:1. Зсув у бік чоловічої статі серед хворих у вивчених випадкових вибірках виражено сильніше. У вибірці хворих з провінції Хебей співвідношення чоловіків і жінок дорівнює 3,5:1 (р<0,001), у повіті Цийсян 2,5:1 (табл.1). Наведені дані свідчать, що чоловіча стать є чинником підвищеного ризику на рак стравоходу. Підвищення частоти захворювання здебільшого зачіпає чоловічу стать, що призводить до ще більшого зсуву у співвідношенні статей убік більш схильної статі, тобто чоловічої.

Під час аналізу родоводів виявлено сімейне накопичення випадків раку стравоходу, яке перевищує середнє популяційне значення у 7-60 разів

Аналіз родоводів пробандів виявив, як ізольовані (рис. 1), так і повторні (рис. 2) випадки раку стравоходу. Розподіл випадків раку в сім'ях і популяції демонструють характерний для цих захворювань ефект Картера, який виявляється в тому, що пробанди статі, що рідше вражається, мають вищу спадкову обтяженість, ніж пробанди статі, що часто вражається. Чоловіки, як представники більш схильної до захворювання статі, спадково обтяжені у менший мірі, ніж жінки. У пробандів-жінок хворі батьки складають 12,3%, хворі сібси 7,5%. У пробандів-чоловіків хворі 11,0% батьків (р>0,05) і 3,3% сібсів (р<0,05). Ця закономірність виявляється і в частоті уражених сібсів: як у чоловіків, так і у жінок частіше хворіють брати (4,7 і 13,4%), ніж сестри (1,6 і 1,8%, табл.2, р<0,001).

Під час аналізу даних демографічної і медичної статистики було встановлено, що смертність від раку стравоходу залежить від ступеня спорідненості і відносин свояцтва з ураженим пробандом. Найбільш висока смертність у родичів першого ступеня: вона складає 313 чоловік на 100 тис. населення (табл. 3). Цей показник є усередненим. Для батьків він складає 355 на 100 тисяч населення, а для сибсів - 262 на 100 тисяч. Відмінності у смертності між цими категоріями родичів пояснюються різницею у віці. Показник смертності для родичів другого і третього ступеня в 2-2,5 рази нижчий, ніж для родичів першого ступеня.

За даними сімейного дослідження було обчислено показники ризику на рак стравоходу для різних категорій родичів (табл. 4), які можуть використовуватися під час генетичного консультування.

Смертність від раку стравоходу підвищена в порівнянні із популяційним значенням не тільки у родичів, але й у чоловіків (дружин) і свояків пробандів (табл.5), що також може свідчити про наявність чинника спільного середовища за умови, що вони не мають загальних генів із пробандом.

Вища в порівнянні з популяцією смертність чоловіків або дружин і свояків уражених пробандів може мати два пояснення. З одного боку, це свідчить на користь існування загальних середовищних у тому числі і сімейних чинників, що викликають рак стравоходу. З іншого боку, не виключається, що причиною накопичення випадків раку стравоходу є позитивна шлюбна асортативність (більш висока ймовірність укласти шлюб з носієм такої ж ознаки), яка призводить до накопичення захворювання в окремих сім'ях. Позитивна шлюбна асортативність по спорідненості, яка ще притаманна сільському населенню Китаю, за своїми наслідками аналогічна інбридингу. Вона призводить до накопичення в окремих сім'ях генетичних чинників, що спонукають до розвитку раку і сприяють гомозиготизації мутантних алелей, що спричиняють розвиток захворювання.

Моногенна модель генетичного контролю раку стравоходу, що тестується за допомогою сегрегаційного аналізу, не підтвердилася (табл. 6), тому проведено аналіз захворювання як полігенної ознаки. Для компонентного аналізу використано дані генеалогії пробандів і дані медичної статистики про смертність від раку стравоходу в провінції Хебей.

Для того, щоб кількісно виразити частку генетичних і середовищних чинників в розвитку раку стравоходу були використані епідеміологічні дані. З метою запобігання ефекту часового тренда, порівнювали батьків пробанда і їх сибсів як представників однієї генерації. Перші мають коефіцієнт спорідненості з пробандом 0,5, другі 0,25. Зіставивши показники смертності 355 і 124, приходимо до висновку, що, якби він залежав тільки від спадкових чинників, то різниця була б двократна: 248 і 124. Дядьки і тітки на відміну від батьків не розділяють з пробандом сімейне середовище. Тому різницю в 107 одиниць було віднесено на рахунок спільності сімейного середовища батьків і пробандів. На її частку припадає 30% фенотипічної схожості, і вона може розглядатися як середовищний компонент фенотипічної дисперсії. У такому разі на долю генетичного компоненту доводиться 70% дисперсій, що і є успадковуваністю у вузькому сенсі. Про наявність сильного середовищного чинника в етіології раку стравоходу свідчить те, що смертність подружжя, з якими пробанд розділяє сімейне середовище, вище, ніж інших свояків. Розрахунки доводять, що негенетичний компонент фенотипічної дисперсії наполовину (15%) обумовлений загальносімейним чинником і наполовину (15%) чинником загального середовища.

Значення успадковуваності (73%, табл. 7), розраховане на генеалогічних показниках, добре співпадає з величиною, отриманою на даних медичної статистики про смертність в провінції Хебей (70%). Слід визнати, що показник успадковуваності є заниженим в результаті недообліку хворих родичів внаслідок того, що деякі з них ще не дожили до віку прояву хвороби. Навіть за цієї умови він має досить високе значення. Це дає підставу зробити висновок про існування в системі генетичного контролю раку стравоходу головного гена з сильним ефектом.

Таким геном може бути супресор пухлини ген FHIT. Було зроблено припущення, що досліджені пацієнти були гетерозиготними носіями мутації FHIT(+/-). Їх здорові клітини гетерозиготні, а ракові клітини внаслідок делеції, яка привела до втрати гетерозиготності, стали гомозиготними FHIT(-/-) і дали початок пухлинам. Делеції вивчали в області 5 і 8 екзона, використовуючи маркери D3s1540 і D3s1234 відповідно (табл.10).

Про наявність делеції свідчать результати порівняння електрофореграм ДНК пухлинної і здорової тканин. На електрофореграмі ракової тканини (рис.3, зразок Т2) відсутня смуга, тоді як в здоровій тканині того ж хворого (зразок N2) смуга є. Про наявність делеції в області 8 екзона свідчить також знижена інтенсивність фарбування смуги (зразок Т4 в порівнянні з нормальною тканиною N4). На рис. 4 в зразках 1, 2 і 3 смуга на електрофореграмі ДНК з пухлинної тканини (Т) забарвлена слабкіше, ніж на електрофореграмі ДНК з гомологічної здорової тканини (N). У зразку 10 смуги забарвлені однаково інтенсивно, отже, делеція в області 5 екзона в ракових клітинах відсутня.

Встановлено, що клітини здорової тканини стравоходу 17 (77,3%) пацієнтів несуть гетерозиготну делецію в 5 екзоні. При цьому у 10 з них в гомологічній пухлинній тканині відбулася втрата гетерозиготності. Нормальні і пухлинні клітини чотирьох (18,2%) пацієнтів були гомозиготними по делеції. У одного пацієнта пухлинні клітини були гетерозиготними, а нормальні - гомозиготними по делеції 5 екзона. Клітини здорової тканини у 21 (95,5%) пацієнта були гетерозиготними по делеції в 8 екзоні. В одного пацієнта у здоровій тканині, як і в пухлинній, була гомозиготна делеція цього екзона. У пухлинних клітинах 18 (81,8%) пацієнтів була та або інша гомозиготна делеція гена FHIT, а у трьох хворих в аналізованих ділянках гена FHIT ці мутації не виявлені. Мабуть, у цих хворих мутація може бути в інших ділянках гена, або природа генетичних змін, що викликали рак, була іншою. Якщо враховувати мутацію гена і в здоровій тканині, то 19 (86,6%) хворих мають змінений супресорний ген. Прогностично більш значущим є делеція 8 екзона.

Родичі, хворі на рак стравоходу, були тільки у трьох пацієнтів, тому поки немає можливості робити висновок про зв'язок між змінами в гені FHIT і успадкуванням схильності до раку. Висока частота делеції екзонів 5 і 8, можливо, пов'язана зі специфічною зоною, яка проходить через ламкий сайт FRA3B. Тому можна припустити, що делеція гена, яку виявлено в даній зоні, грає важливу роль у виникненні раку стравоходу у осіб китайської етнічної групи.

Генотипи здорових тканин стравоходу, узятих у пацієнтів, було розглянуто (з відомими припущеннями) як генотипи зигот, що репрезентують популяцію. Виходячи з цього і використавши формулу Харді-нберга, зробили орієнтовну оцінку частот алелей

Згідно з отриманими оцінками, близько 23% населення є гомозиготами по делеції в 5 екзоні, 50% є гетерозиготними носіями цієї мутації, у 27%, можливо, генотип нормальний. Близько 5% населення є гомозиготами по делеції у 8 екзоні, 33% - гетерозиготні носії мутації і 62% мають нормальний генотип. Високі частоти мутації гена супресора пухлини у населення дослідженого регіону можна розглядати як причину високої частоти раку стравоходу в даному регіоні.

Інактивація гена може відбуватися не тільки внаслідок мутаційних змін, але й внаслідок епігенетичних процесів. Пошук гіперметильованих ділянок виявив наступне. На електрофореграмі ракової тканини пацієнта 2 при використанні метильованої затравки в зразку Р2М специфічна смужка відсутня, а при використанні неметильованої затравки (P2U) можна бачити присутність смужки (рис.5). Це є показником того, що ракова тканина даного пацієнта не містить метильованої ДНК. Зразок гомологічної здорової тканини цього ж пацієнта (N2M і N2U) дав таку ж картину. У зразку 4 є метилювання ДНК у раковій тканині і відсутнє метилювання в гомологічній здоровій тканині.

Тільки у одного з 22 (4,6%) пацієнтів в клітинах здорової тканини стравоходу виявлено метилювання гена FHIT (табл. 10). У клітинах пухлини метилювання виявлено у 17 (77,3%) пацієнтів. Все викладене свідчить про те, що визначення рівня метилювання гена FHIT може бути використано для ранньої діагностики раку стравоходу.

ВИСНОВКИ

У дисертаційному дослідженні проведено епідеміологічне, популяційно-генетичне і молекулярно-генетичне вивчення раку стравоходу серед населення китайської провінції Хебей, яка характеризується найвищою у світі частотою цього захворювання.

1. Серед хворих на рак стравоходу з провінції Хебей зсув у бік чоловічої статі виражений сильніше (3,5:1), ніж в середньому у хворих (1,7:1), а також сильніше, ніж у населення Китаю вцілому (1,06:1). Сімейне накопичення раку стравоходу більш виражено в родоводах хворих жінок. Найбільш високе сімейне накопичення виявлено у пробандів повіту Цийсян. Ризик раку стравоходу підвищений не тільки для родичів хворого, але також для їх чоловіків або дружин і свояків.

2. Тестування моногенної моделі успадкуваня раку стравоходу показало її неспроможність. Успадковуваність раку стравоходу (73%) вказує на існування в системі генетичного контролю захворювання не повністю пенетрантного гена із сильним ефектом, такого, як вивчений ген FHIT.

3. Частота делеції в 5 екзоні гена FHIT складає q=0,37, в 8 екзоні q=0,09. Згідно розрахункам, 14% населення провінції Хебей є гомозиготними носіями делеції в екзоні 5 і 47% - гетерозиготними. Менше 1% є гомозиготами і 16% - гетерозиготами по делеції в 8 екзоні.

4. У 63% гетерозиготних носіїв мутації гена FHIT у ракових клітинах виявлена втрата гетерозиготності 5 екзона, у 57% втрата гетерозиготності відбулася у 8 екзоні. Гіперметилювання гена FHIT виявлено в клітинах пухлини у 77% пацієнтів.

5. Генетична або епігенетична зміна гена FHIT виявлена в ракових клітинах у всіх пацієнтів, що дає підставу розглядати його як головний чинник схильності до раку стравоходу у дослідженій частині населення Китаю.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Під час генетичного консультування з метою орієнтовної оцінки вірогідності захворювання на рак стравоходу у наступного нащадка доцільно використовувати таблиці повторного ризику.

2. Формуючи групи ризику щодо раку стравоходу доцільно звертати увагу на стать того, хто консультується. Чоловічу стать слід вважати фактором підвищеного ризику на рак стравоходу.

3. Чинником, що збільшує генетичний ризик раку стравоходу, вважати наявність в сім'ї жінки, що має це захворювання.

4. До групи підвищеного ризику щодо захворювання на рак стравоходу необхідно відносити дружин (чоловіків) і свояків пацієнтів.

5. Кандидатами для першочергового молекулярно-генетичного обстеження на схильність до раку стравоходу належить вважати чоловіків, які мають близьких родичок з таким захворюванням.

6. Для уточнення ризику захворювання на рак стравоходу рекомендується досліджувати ген FHIT відносно делецій в області 5 і 8 екзонів і/або метилювання.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Цао Юй. Генетико-эпидемиологическое исследование рака пищевода в Китае / Цао Юй, Л.А. Атраментова // Вісник Харківського національного університету. Серія: Біологія. - 2006. - Вип. 3, (№ 729). - С. 141-146.

(Особистий внесок здобувача - збір генетико-демографічного матеріалу, проведення розрахунків, складання таблиць, складання списку літератури, написання вступу статті.)

2. Цао Юй. Сегрегационный и компонентный анализ рака пищевода в провинции Хебэй / Цао Юй, Л.А. Атраментова // Вісник Харківського національного університету. Серія: Біологія.-2006, - Т.748, №(4)-С. 87-91.

(Особистий внесок здобувача - збір генетико-демографічного матеріалу, проведення розрахунків, складання таблиць, складання списку літератури, написання вступу статті.)

3. Цао Юй. Делеции гена FHIT при раке пищевода / Цао Юй, Л.А. Атраментова // Вісник Харківського національного університету. Серія: Біологія.-2007, - вып 6, Т 788 - С. 85-89.

(Особистий внесок здобувача - виділення ДНК, проведення полімеразної ланцюгової реакції, елекрофорезу, статистичного аналізу, складання таблиць і списку літератури, написання методичного розділу статті.)

4. Цао Юй. Метилирование гена FHIT у больных раком пищевода / Цао Юй, Л.А. Атраментова // Актуальні проблеми акушерства і гінекологіЇ, клінічної імунології та медичної генетики / Збірник наукових праць, - 2008 - Т. 15, С. 193-202.

(Особистий внесок здобувача - виділення ДНК, проведення метилспецифічної полімеразної ланцюгової реакції, елекрофорезу, статистичного аналізу, складання таблиць і списку літератури, опис методів дослідження.)

5. Цао Юй. Ген FHIT у канцерогенезі / Цао Юй, Л.А. Атраментова // Світ медицини та біології -2008 - № 3, С. 133- 136.

(Особистий внесок здобувача - складання рефератів статей з раку стравоходу.)

6. Цао Юй. Потеря гетерозиготности гена FHIT как фактор риска рака пищевода / Цао Юй, Л.А. Атраментова // Фактори експериментальної еволюції організмів. Збірник наукових праць. - Т.4. - Київ, 2008. - ЛОГОС. - С.438-442.

(Особистий внесок здобувача - виділення ДНК, проведення полімеразної ланцюгової реакції, елекрофорезу, статистичного аналізу, складання таблиць і списку літератури, написання методичного розділу статті.)

7. Цао Юй. Генетико-епідеміологічне дослідження раку стравоходу в Китаї / Цао Юй. // II міжнародна наукова конференція студентів та аспірантів «Молодь і поступ біології» / Збірник тез . Львів - 2006. С. 163-164.

8. Цао Юй. Половые различия в заболеваемости раком пищевода в Китае / Цао Юй. // Материалы трудов I-й международная конференция молодых ученых «биология: от молекулы до биосферы». - 2006 - Харьков. С.118

9. Цао Юй. Генетический анализ рака пищевода в Китае / Цао Юй. // Материалы трудов Научно-практической конференции с международным участием «Актуальні питання медичної генетики»- 2007- Киев. С.136-137.

10. Цао Юй. Делеции гена FHIT при раке пищевода / Цао Юй. // Материалы трудов II-й международной конференции молодых учёних «Биология: от молекулы до биосферы» - 2007- Харьков. С.149-150

11. Цао Юй. Генетический анализ рака пищевода в населении Китая (провинция Хебэй) /Цао Юй, Л.А. Атраментова // IV зїзд медичних генетиків України (з міжнародною участю), Львів, 2008, с.87.

(Особистий внесок здобувача - узагальнення результатів дослідження, написання тез. )

Размещено на Allbest.ru