Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Мутації гена TGFBI у хворих із спадковими дистрофіями строми рогівки

03.00.22 - молекулярна генетика

Пампуха Володимир Миколайович

Київ - 2009

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Лівшиць Людмила Аврамівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу геноміки людини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Літошенко Олександр Якович, ДУ “Інститут геронтології АМН України”, завідувач лабораторії молекулярної та клітинної біології;

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Дмитренко Володимир Володимирович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу біосинтезу нуклеїнових кислот.

Захист дисертації відбудеться “23” червня 2009 р. о _10⁰⁰_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03680, м. Київ-680, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “ ” травня 2009 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Підпала

мутація ген дистрофія рогівка

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Важливим етапом в розвитку біологічних наук про людину стала реалізація програми “Геном людини”, основною метою якої було визначення нуклеотидної послідовності ДНК всього геному людини. Ці дослідження відкрили перед сучасною генетикою нові безпосередні шляхи до розуміння структури та функціонування складних геномів, сприяють розкриттю механізмів індивідуального розвитку та еволюції, поглиблюють розуміння біохімічної та фізіологічної природи живого. Але в першу чергу результати реалізації програми “Геном людини” інтенсифікують вивчення генів, мутації яких призводять до розвитку тяжких спадкових захворювань, і мають важливе теоретичне та практичне значення для медичної генетики в плані діагностики, профілактики та лікування спадкових захворювань.

Спадкові дистрофії рогівки - велика гетерогенна група прогресуючих захворювань, що призводять до помутніння рогівки і суттєвого зниження зору. Загальною характерною ознакою цих дистрофій є наявність аномальних депозитів різної форми і розмірів, які можуть вражати будь-який шар рогівки.

В 1997 році Муніер та співавтори за результатами попередніх генетичних та фізичних картувань генів-кандидатів чотирьох різних типів дистрофії строми рогівки в хромосомній ділянці 5q31 виявили ген, який індукується трансформуючим фактором росту бета (transforming growth factor- beta induced gene, TGFBI gene) (Munier et al., 1997). При дослідженні було встановлено, що у пацієнтів з вузликовою дистрофією (тип I), гратчастою дистрофією (тип I), дистрофіями Авеліно та Рейса-Бюклера захворювання асоційоване з мутаціями в даному гені. В подальших дослідженнях науковцями з Європи, Америки, Азії було показано, що при деяких інших клінічних формах дистрофії строми рогівки також спостерігаються мутації гена TGFBI.

Таким чином, актуальним є визначення спектра мутацій гена TGFBI у хворих з України на різні клінічні форми дистрофії строми рогівки та дослідження асоціації певних мутацій гена TGFBI з їхніми фенотипічними проявами з метою ефективної диференційної діагностики різних клінічних типів даної патології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота відповідає основному планові науково-дослідних робіт відділу геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України і виконувалась в рамках бюджетної теми „Молекулярно-генетичні дослідження чинників, що призводять до репродуктивних втрат та інвалідності” (шифр теми 2.2.4.13, № держ. реєстрації 0105U005341, 2006-2010 рр.). Роботу також виконано в рамках вітчизняного проекту „Молекулярні основи функціонування геному та його регуляція” (шифр теми 2.2.4.20, № держ. реєстрації 0104U000436, 2002-2006 рр.).

Мета і завдання дослідження. Метою роботи є дослідження спектра та походження мутацій гена TGFBI у хворих на різні клінічні форми дистрофії строми рогівки та вивчення асоціації певних мутацій гена TGFBI з фенотипічними проявами даного захворювання. Для досягнення мети були поставлені наступні завдання дослідження:

1. Створити банк ДНК з лейкоцитів периферійної крові хворих на дистрофії строми рогівки.

2. Визначити спектр мутацій в гені TGFBI у хворих на різні клінічні форми дистрофії строми рогівки.

3. Провести аналіз зчеплення мутацій гена TGFBI з гаплотипами за поліморфними мікросаталітними локусами D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 з хромосомної ділянки 5q31 у хворих з дистрофіями строми рогівки та членів їх родин.

4. Провести аналіз асоціації між певними мутаціями в гені TGFBI та клінічними формами дистрофії строми рогівки.

5. Розробити молекулярно-генетичні методики аналізу мажорних мутацій для диференційної діагностики певних клінічних варіантів дистрофії строми рогівки.

Об'єкт дослідження - спадкові дистрофії строми рогівки.

Предмет дослідження - спектр та походження мутацій гена TGFBI у хворих з дистрофіями строми рогівки.

Методи дослідження - молекулярно-біологічні методи, що включають виділення та очищення геномної ДНК, полімеразну ланцюгову реакцію, рестрикційний аналіз ДНК, електрофорез ДНК в агарозному і поліакриламідному гелях, визначення нуклеотидної послідовності ДНК.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше створено банк ДНК хворих з України з різними клінічними формами дистрофії строми рогівки. Вперше отримано дані про спектр мутацій гена TGFBI. Визначено, що дані мутації мають рекурентне походження. Показано асоціацію мутацій з певними клінічними фенотипами дистрофії рогівки. Ідентифіковано нову мутацію Leu558Pro гена TGFBI у хворих з атипічною дистрофією строми рогівки.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено та апробовано методи ДНК-аналізу мутацій гена TGFBI з метою диференційного визначення виду і типу дистрофії строми рогівки. Використання цих методів дозволяє діагностувати захворювання на доклінічній стадії, розробити нову стратегію медико-генетичного консультування, проводити допологову діагностику в родинах високого ризику та підбирати ефективні методи терапії цих недуг.

Особистий внесок здобувача. Результати, викладені у дисертації, одержано автором особисто або за безпосередньої участі у виконанні експериментів. Зокрема автором самостійно проведено виділення геномної ДНК із зразків периферійної крові хворих на дистрофії строми рогівки, підібрано умови проведення полімеразної ланцюгової реакції, рестрикційного аналізу та електрофоретичного розділення фрагментів ДНК, виділення фрагментів ДНК для аналізу послідовностей гена TGFBI та поліморфних локусів D5S393, D5S396, D5S399, D5S500. Роботи пов'язані із визначенням нуклеотидної послідовності фрагментів ДНК проведено спільно з Д. Д. Угриним, аналіз зчеплення мутацій гена TGFBI з алельними варіантами локусів D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 - спільно із С.А. Кравченком, аналіз деяких ділянок кератоепітеліну - спільно із Ф. О. Терещенком. Аналіз клінічних даних проведено спільно з Г.І. Дрожжиною, В.В. Вітом, Н.Є. Думбровою (Інститут очних хвороб та тканинної терапії імені В.П. Філатова АМН України, м. Одеса), з якими автор має спільні публікації. Слова щирої вдячності автор висловлює науковому керівникові завідувачу відділу геноміки людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, д.б.н., проф. Л.А. Лівшиць за допомогу у розробці стратегії досліджень, аналізі та узагальненні результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи доповідались на вітчизняних та зарубіжних з'їздах та конференціях: X-му з'їзді офтальмологів України (Одеса, 2002), на конференції “European Human Genetics Conference 2005” (Прага, Чеська Республіка, 2005), II-й міжнародній науковій конференції офтальмологів Причорномор'я (Одеса, 2004), науково-практичній конференції “Вопросы офтальмогенетики” (Москва, Російська Федерація, 2005), XI-му з'їзді офтальмологів України (Одеса, 2006), Міжнародній науковій конференції “Сучасні аспекти клініки, діагностики та лікування очних хвороб” (Одеса, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 16 друкованих праць, зокрема - 8 статей у спеціалізованих наукових виданнях, із них 4 у фахових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України, та тези 8 доповідей на вітчизняних та міжнародних конференціях і з'їздах.

Обсяг та структура роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, експериментальної частини, яка має три розділи, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків та списку використаних джерел (148 найменувань), додатків. Роботу викладено на 131 сторінці стандартного друкованого тексту та проілюстровано 20 рисунками та 14 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень. Матеріалом дослідження були зразки крові хворих на спадкові форми дистрофії строми рогівки та членів їхніх родин. Зразки крові пацієнтів та членів їхніх родин були надані Інститутом очних хвороб та тканинної терапії імені В.П. Філатова АМН України (м. Одеса) за умов інформованої згоди.

Виділення ДНК. Геномну ДНК із зразків свіжої крові виділяли за допомогою стандартного методу - шляхом гідролізу лізатів клітин протеіназою К з подальшою фенольною екстракцією (Sambrook et al., 1989).

Ампліфікація послідовностей ДНК in vitro. Ампліфікацію in vitro деяких ділянок гена TGFBI та локусів D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 проводили за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (Saiki et al.,1988).

Рестрикційний аналіз ДНК. Для ідентифікації мутацій гена TGFBI застосовували метод рестрикційного аналізу продуктів ПЛР, отриманих для відповідних ділянок даного гена. Реакції рестрикції проводили в об'ємі 10-20 мкл після додавання 5-10 одиниць відповідної ендонуклеази рестрикції за умовами, рекомендованими фірмами-виробниками. Продукти гідролізу ДНК аналізували після електрофоретичного розділення в 10 %-му поліакриламідному гелі (ПААГ) в розчині трис-боратного буфера.

Електрофоретичне розділення флуоресцентно мічених продуктів ПЛР. Електрофоретичне розділення продуктів ПЛР, праймери для яких мітили флуоресцентною міткою Су5 проводили на автоматичному лазерному флуориметрі “ALF express ” (“Amersham Pharmacia Biotech”). Після сканування отриманні дані обробляли за допомогою програми FM2.1 (Fragment Manager Software V2.1, Pharmacia).

Секвенування ДНК. Визначення нуклеотидної послідовності всіх екзонів гена TGFBI та фрагментів ДНК локусів D5S396, D5S399, D5S500 було проведено з обох кінців з використанням набору “ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequincing Ready Reaction Kits” на приладі ABI Prism 3110 Genetic Analyser (Applied Biosystems).

Результати досліджень та обговорення

Клініко-генеалогічний аналіз у родинах пацієнтів із спадковими дистрофіями рогівки. Група досліджуваних осіб складалась із дев'яносто чотирьох пацієнтів, які звернулися із проблемами зору в Інститут очних хвороб і тканинної терапії імені В.П. Філатова АМН України. За результатами клінічних досліджень цим пацієнтам було поставлено попередній діагноз дистрофія рогівки. На підставі анкетування з'ясувалося, що в усіх пацієнтів, окрім двох, один із батьків мав подібні ознаки захворювання. Таким чином, було встановлено, що дистрофія строми рогівки в усіх цих пацієнтів, окрім двох, мала сімейний анамнез і може бути спадковою. За результатами генеалогічного аналізу із складанням родоводів визначено аутосомно-домінантний тип успадкування. За результатами диференційного клінічного аналізу хворих на дистрофію строми рогівки та членів їхніх родин виявлено, що клінічні форми даної патології зустрічаються у такому співвідношенні: гратчаста дистрофія строми рогівки (тип IIIА) - 41,6 %, гратчаста дистрофія строми рогівки (тип I) - 35,4 %, вузликова дистрофія - 10,4 %, дистрофія Рейса-Бюклера - 4,2 %, атипічна дистрофія рогівки - 8,4 %.

Молекулярно-генетичний аналіз мутацій в екзонах гена TGFBI серед хворих із дистрофіями строми рогівки. Мутація Arg124Cys (c.370C>T) зумовлена транзицією цитозину на тимін, в результаті чого триплет CGC, який кодує амінокислоту аргінін у положенні 124 білка TGFBI змінюється на триплет TGC, який кодує амінокислоту цистеїн. Результатом даної заміни є утворення сайту впізнавання для ендонуклеази рестрикції PstI. Тому для детекції мутації Arg124Cys проводили ампліфікацію in vitro нуклеотидних послідовностей 4-го екзону методом ПЛР з подальшим гідролізом продуктів ПЛР ферментом PstI та електрофоретичним розділенням рестрикцій них фрагментів у 10 %-ному поліакриламідному гелі (рис. 1). Розмір ампліфікованих фрагментів становить 132 п.н. В результаті рестрикції ампліфікованих фрагментів ДНК здорових осіб утворюються два фрагменти, розмір одного з них становить 39 п.н. (на електрофореграмі його не видно), а іншого 93 п.н., тобто фрагменти ДНК здорових осіб мають константний сайт рестрикції. А після рестрикції фрагментів ДНК, отриманих від гетерозиготних носіїв мутації Arg124Cys, утворюються додатково ще два фрагменти розміром 17 п.н. (на електрофореграмі його не видно) і 76 п.н. Отже, на електрофореграмі у гетерозиготних носіїв мутації Arg124Cys спостерігаємо два фрагменти, один з яких має розмір 76 п.н., а інший - 93 п.н. В результаті молекулярно-генетичного аналізу мутацію Arg124Cys було ідентифіковано у тридцяти дев'яти хворих із попереднім клінічним діагнозом гратчаста дистрофія рогівки (тип I) із шістнадцяти неспоріднених родин. Окрім, того дану мутацію виявлено в 11-ти річної дитини, в якої ще не спостерігались клінічні прояви захворювання. Мутацію Arg124Cys була також ідентифіковано у двох хворих із однієї родини з попереднім клінічним діагнозом дистрофія Рейса-Бюклера і також у пацієнта з попереднім клінічним діагнозом гратчастої дистрофії (тип IIIА).

Мутація Thr538Arg (c.1613C>G) є місенс-мутацією в екзоні 12 гена TGFBI, в результаті якої треонін у положенні 538 протеїну TGFBI замінюється на аргінін. Для детекції даної мутації проводили ампліфікацію in vitro нуклеотидних послідовностей 12-го екзону методом ПЛР з подальшим гідролізом продуктів реакції ферментом HinfI. Продукти рестрикції аналізували в 10 %-ному поліакриламідному гелі (рис. 2).

Розмір ампліфікованих фрагментів становить 131 п.н. В результаті рестрикції ампліфікованих фрагментів ДНК здорових осіб утворюються три фрагменти, розмір першого і другого з них становить 30 п.н. і 35 п.н. відповідно (на електрофореграмі їх не видно), а третього - 66 п.н., тобто фрагменти ДНК здорових осіб мають два сайти для ендонуклеази рестрикції HinfI. В результаті мутації Thr538Arg утворюється ще один сайт впізнавання для ферменту HinfI. Після рестрикції фрагментів ДНК, отриманих від гетерозиготних носіїв мутації Thr538Arg, утворюються додатково ще два фрагменти розміром, один з них має розмір 8 п.н., а інший - 57 п.н. Отже, на електрофореграмі у гетерозиготних носіїв мутації Thr538Arg спостерігаємо два фрагменти, один з яких має розмір 57 п.н., а інший - 66 п.н. Мутацію Thr538Arg було ідентифікувано у однієї хворої з попереднім клінічним діагнозом гратчаста дистрофія строми рогівки (тип IIIA) та в її сина без клінічних проявів захворювання.

Мутація Arg555Trp (c.1663C>T) є результатом заміни цитозину на тимін, в результаті чого триплет CGG, який кодує амінокислоту аргінін у положенні 555 білка змінюється на триплет TGG, який кодує амінокислоту триптофан. Для детекції даної мутації проводили ампліфікацію in vitro послідовностей ДНК 12-го екзону за допомогою методу ПЛР. Продукти реакції ПЛР обробляли ендонуклеазою рестрикції BstXI, сайт впізнавання для якої виникає в результаті мутації. Продукти рестрикції аналізували в 10%-ному поліакриламідному гелі. Розмір ампліфікованих фрагментів становить 131 п.н. Після проведення рестрикції ампліфікованих фрагментів ДНК здорових осіб ці фрагменти лишаються інтактними і їхній розмір становить 131 п.н. А після рестрикції фрагментів ДНК, отриманих від гетерозиготних носіїв мутації Arg555Trp, утворюються додатково ще два фрагменти розміром, один з них має розмір 45 п.н. (на електрофореграмі його не видно), а інший - 86 п.н. На електрофореграмі у гетерозиготних носіїв мутації Arg555Trp спостерігаємо два фрагменти, один з яких має розмір 86 п.н., а інший - 131 п.н. (рис. 3). В результаті молекулярно-генетичного аналізу мутацію Arg555Trp було ідентифіковано в усіх дев'яти пацієнтів із п'яти родин, в яких був поставлений попередній клінічний діагноз вузликова дистрофія (тип I).

Детекція мутації Arg555Gln (c.1664G>A) базується на використанні методу сайт-спрямованого мутагенезу, при якому для проведення ампліфікації in vitro за допомогою методу ПЛР на ДНК-матриці, яка є послідовністю, що оточує кодон 555, в реакційну суміш вносять два олігонуклеотидні праймери, один з яких має неповну гомологію на 3`-кінці. В результаті ПЛР ампліфікований фрагмент може мати сайт рестрикції для ендонуклеази рестрикції Bgl II, який виявляється в результаті мутації Arg555Gln. Продукти рестрикції аналізували в 10 %-ному поліакриламідному гелі (рис. 4). Розмір ампліфікованих фрагментів становить 131 п.н. В результаті рестрикції ампліфіковані фрагменти ДНК здорових осіб розщеплюються на два фрагменти, розмір одного з яких становить 19 п.н. (на електрофореграмі його не видно), а розмір іншого - 112 п.н. А після рестрикції фрагментів ДНК, отриманих від гетерозиготних носіїв мутації Arg555Gln, утворюються додатково ще два фрагменти, один з них має розмір 23 п.н. (на електрофореграмі його не видно), а інший - 89 п.н. Отже, на електрофореграмі у гетерозиготних носіїв мутації Arg555Gln, спостерігаємо два фрагменти, один з яких має розмір 89 п.н., а інший - 112 п.н. Мутацію Arg555Gln було ідентифіковано у трьох пацієнтів з однієї родини, яким був поставлений попередній клінічний діагноз дистрофія Рейса-Бюклера.

Мутація His626Arg (c.1877A>G) є транзицією в екзоні 14 гена TGFBI, в результаті якої гістидин в положенні 626 білка TGFBI замінюється на аргінин. Для детекції даної мутації за допомогою ПЛР в якості ДНК-матриці використовували послідовність, що оточує кодон 626, а синтетичні олігонуклеотиди, що використовувались як праймери, були гомологічні послідовностям, що фланкують ДНК-матрицю. Продукти реакції ПЛР обробляли ендонуклеазою рестрикції NlaIII. Продукти рестрикції аналізували в 10 %-ному поліакриламідному гелі (рис. 5).

Розмір ампліфікованих фрагментів становить 152 п.н. В результаті рестрикції ампліфікованих фрагментів ДНК здорових осіб утворюються три фрагменти, розмір першого з них становить 24 п.н. (на електрофореграмі його не видно), другого - 54 п.н., а третього - 74 п.н., тобто фрагменти ДНК здорових осіб мають два сайти рестрикції. А після рестрикції фрагментів ДНК, отриманих від гетерозиготних носіїв мутації His626Arg додатково виникає фрагмент розміром 98 п.н., оскільки в результаті даної мутації зникає один із сайтів впізнавання для ендонуклеази рестрикції NlaIII. На електрофореграмі у гетерозиготних носіїв мутації His626Arg спостерігаємо три фрагменти, перший з яких має розмір 54 п.н., другий - 74 п.н., третій - 98 п.н. Мутацію His626Arg було знайдено у двадцяти шести пацієнтів з попереднім клінічним діагнозом гратчастої дистрофії строми рогівки (тип IIIA) із п'ятнадцяти родин. Цю мутацію також було виявлено у семи молодих родичів пацієнтів, у яких ще не було клінічних проявів хвороби.

Серед досліджуваних хворих була група пацієнтів, у яких ми не виявили досліджувані мутації і які мали такі симптоми дистрофії рогівки, які раніше не були описані в літературі. Група складалась із дев'яти пацієнтів та шести родичів пацієнтів із чотирьох родин. Після секвенування продуктів ПЛР, які охоплюють послідовності всіх 17-ти екзонів гена TGFBI, було ідентифіковано раніше неописану нуклеотидну транзицію с.1673T>C у п'яти пацієнтів із чотирьох неспоріднених родин (рис. 6). Дана мутація призводить до заміни лейцину в позиції 558 на пролін в білку TGFBI (Leu558Pro).

Оскільки мутація Leu558Pro зумовлює зникнення сайту рестрикції для ендонуклеази HinfI, було проаналізовано ДНК цих пацієнтів та їхніх родичів, і також п'ятдесяти осіб із загальної популяції методом поліморфізму довжини рестрикцій них фрагментів (ПДРФ) (рис. 7). Розмір ампліфікованих фрагментів становить 131 п.н. В результаті рестрикції ампліфікованих фрагментів ДНК здорових осіб утворюються три фрагменти, розмір першого з них становить 30 п.н., другого - 36 п.н. (на електрофореграмі їх не видно) а третього - 66 п.н., тобто фрагменти ДНК здорових осіб мають два сайти рестрикції. А після рестрикції фрагментів ДНК, отриманих від гетерозиготних носіїв мутації Leu558Pro, додатково з'являється фрагмент розміром 101 п.н., оскільки в результаті даної мутації зникає один із сайтів впізнавання для ендонуклеази рестрикції HinfI. Отже, на електрофореграмі у гетерозиготних носіїв мутації Leu558Pro спостерігаємо два фрагменти, перший з яких має розмір 66 п.н., другий - 101 п.н. Фрагменти розміром 30 п.н. і 35 п.н. на електрофореграмі не видно. Мутація Leu558Pro була виявлена у дев'яти пацієнтів із атипічною дистрофією строми рогівки і в трьох осіб, у яких ще не спостерігались клінічні ознаки захворювання. Ця мутація не була виявлена в інших здорових родичів та в осіб із загальної популяції, що виключає існування нейтрального поліморфізму.

За результатами аналізу, проведеного серед дев'яносто чотирьох пацієнтів із спадковими дистрофіями строми рогівки та сорока двох членів їх родин із сорока восьми неспоріднених родин, були виявлені мутації Arg124Cys (екзон 4), Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln, Leu558Pro (екзон 12), Hys626Arg (екзон 14) в гені TGFBI. Встановлено, що у досліджуваній групі хворих на дистрофію строми рогівки найпоширенішими є мутації Arg124Cys та Hys626Arg, які зустрічаються із частотою 37,5 % та 31,3 % відповідно. Менш поширеними є мутації Thr538Arg, Arg555Thr, Arg555Gln, які зустрічаються з частотами 2,1 %, 10,4 % та 2,1 % відповідно. Ідентифікована нова мутація Leu558Pro в гені TGFBI в досліджуваній групі родин зустрічається з частотою 8,3 %. Частота поширення дистрофії рогівки та її клінічних форм в більшості популяціях світу на даний час невідома. Існують лише поодинокі дані по цьому питанню. Наприклад, в популяції Японії найпоширенішою є дистрофія Авеліно, яка становить більше ніж 70 % від загальної кількості дистрофій рогівки (Fujiki et al., 2001). Відповідно до об'єднаних даних дослідників з таких країн як Швейцарія, Італія, Німеччина, Велика Британія, Іспанія, США, які обстежили 61 родину, найбільш поширеними є гратчаста дистрофія (тип I) та вузликова дистрофія (тип I). Дані клінічні форми зустрічаються з частотою 18 % та 19 % відповідно. В даній вибірці високий відсоток (31 %) складають різні атипічні форми гратчастої дистрофії, які відмінні від класичної форми - гратчастої дистрофії (тип I) (Munier et al., 2002). Такі відмінності спектру та частоти клінічних форм дистрофій строми рогівки серед пацієнтів з України та хворих із Західної Європи і США, на нашу думку, пов'язані з популяційними особливостями досліджуваних груп пацієнтів.

Дослідження зчеплення мутацій Arg124Cys, Arg555Trp, Leu558Pro, His626Arg гена TGFBI з мікросателітними локусами D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 з хромосомної ділянки 5q31. Для гаплотипування мутантних хромосом з метою визначення їхнього походження від одного предка або декількох предків-засновників був проведений аналіз поліморфізму кількості СА-повторів мікросателітних маркерів D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 у всіх доступних для аналізу членів родин. Приклад такого аналізу наведено на рис. 8.

В подальшому аналізували зчеплення певних мутацій з мінігаплотипами по всіх 4-х мікросателітних локусах. Було виявлено три різні мінігаплотипи, які зчеплені з мутацією Arg124Cys, та три різні мінігаплотипи, які асоційовані з мутацією Arg555Trp. Ці дані можуть свідчити про незалежне виникнення мутацій Arg124Cys та Arg555Trp в різних популяціях. Мутація His626Arg у всіх обстежених пацієнтів спостерігалась на фоні гаплотипів, які відрізнялись лише алельними варіантами локусу D5S500. Враховуючи те, що більшість пацієнтів з даною мутацією родом із Чернігівської області, можна припустити існування одного предкового гаплотипа. Таке припущення є достатньо виправданим, оскільки на даний момент є чисельні дані про те, що для мікросателітних локусів є характерним високий мутаційний рівень (10^-4 -10^-3 на локус на гамету на покоління) (Кравченко та ін., 2007). В результаті аналізу алельних варіантів мікросателітних локусів D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 в чотирьох родинах, в яких було ідентифіковано нову мутацію Leu558Pro, виявлено, що всі хромосоми з даною мутацією мали однаковий мінігаплотип. Даний факт може свідчити про походження мутації Leu558Pro від одного предка-засновника.

Аналіз асоціації між мутаціями гена TGFBI та клінічними формами спадкової дистрофії строми рогівки. У переважної більшості пацієнтів із проаналізованих нами вісімнадцяти родин з мутацією Arg124Cys були виявлені клінічні ознаки характерні для гратчастої дистрофії (тип I). Мутацію Arg124Cys було також ідентифіковано у дитини віком одинадцять років, в якої ще не проявились в повній мірі симптоми, характерні для дистрофії рогівки і в якої ще не був поставлений клінічний діагноз. Юний вік двох пацієнтів з однієї родини, в яких клінічна картина захворювання була ще слабо виражена і яким було поставлено попередній клінічний діагноз дистрофії Рейса-Бюклера, став причиною помилкового діагнозу. Виявлення мутації Arg124Cys у цих хворих стало підставою для перегляду попереднього клінічного діагнозу. Результати наших досліджень узгоджуються з даними інших авторів про те, що в переважній більшості випадків мутація Arg124Cys асоційована з гратчастою дистрофією (тип I) (Aldave et al., 2007).

В результаті аналізу асоціації між мутацією Thr538Arg та клінічними проявами дистрофії рогівки було виявлено, що клінічна картина в родині, в якій була ідентифікована дана мутація, є подібна до клінічних проявів гратчастої дистрофії (тип I), але спостерігається більш пізній прояв захворювання. З іншого боку, хвороба починає маніфестацію в більш ранньому віці, ніж при гратчастій дистрофії (тип IIIA).

Аналіз асоціації між мутацією Arg555Trp та клінічними проявами дистрофії рогівки показав, що в усіх пацієнтів - носіїв даної мутації спостерігаються симптоми дистрофії рогівки, які характерні для вузликової дистрофії (тип I). Наші результати підтверджують дані інших дослідників, які виявляють саме цю мутацію у більшості пацієнтів з вузликовою дистрофією (Aldave et al., 2007).

У пацієнтів, які мали мутацію Arg555Gln, спостерігались симптоми захворювання, які характерні як для дистрофії Рейса-Бюклера, так і дистрофії Тіля-Бенке. При біомікроскопії клінічні картини при дистрофія Тіля-Бенке та Рейса-Бюклера дуже схожі. Обидві дистрофії вражають один і той самий шар, мають подібну клінічну картину і відрізняються лише морфологічно. На матеріалі рогівки, видаленої під час кератопластики, були проведені морфологічні дослідження і визначено, що в даній родині має місце дистрофія Тіля-Бенке.

Для фенотипічного прояву мутації His626Arg характерною є клінічна картина захворювання, яка схожа на гратчасту дистрофію (тип IIIA). Проте у чотирьох пацієнтів із неспоріднених родин спостерігався асиметричних перебіг захворювання, тобто враженим є одне око, а у другому оці патологічних змін не виявлено, або очі відрізняються за тяжкістю патологічних змін. Цікавим є той факт, що у хворих родичів пацієнтів з асиметричним перебігом клінічна картина в обох очах суттєво не відрізнялась, тобто спостерігалась варіабельність клінічної картини в межах однієї родини.

У носіїв мутації Leu558Pro спостерігались клінічні ознаки захворювання, які за своєю клінічною картиною, перебігом та особливостями морфологічних проявів суттєво відрізнялись від усіх раніше описаних у літературі клінічних форм дистрофії рогівки. Для цієї клінічної картини захворювання характерними були напівпрозорі щільно розташовані округлі помутніння, які локалізовані в глибоких та середніх шарах строми. Ці помутніння займали центральну зону рогівки. По краям цієї зони помутніння можна спостерігати нечисленні тонкі граткоподібні структури в середніх шарах строми. Морфологічні дослідження дисків рогової оболонки виявили депозити амілоїдної природи. Початок прояву симптомів захворювання припадає на третє-четверте десятиліття життя. Відсутність ерозій рогівки, розташування депозитів в глибоких і середніх шарах строми рогівки свідчать про те, що мутація Leu558Pro асоційована з глибокою формою дистрофії рогівки.

Частоти поширення виявлених мутацій в досліджуваній групі хворих наведено в таблиці.

Таблиця. Мутації гена TGFBI, ідентифіковані у хворих з України з дистрофіями строми рогівки

Результати наших досліджень свідчать про те, що у хворих із спадковими дистрофіями строми рогівки клінічних і морфологічних даних може бути недостатньо для правильної постановки діагнозу. На ранніх стадіях захворювання, коли клінічні симптоми виражені слабо, так і на пізніх стадіях розвитку захворювання, коли в клінічній картині переважають вторинні дегенеративні зміни, визначити вид і тип дистрофії досить важко. Проведення молекулярно-генетичних досліджень і виявлення мутацій, з якими асоційовані певні види і типи дистрофій, дозволяє з високою точністю встановити діагноз навіть на досимптоматичній стадії і підібрати відповідну тактику лікування.

ВИСНОВКИ

Вирішення поставлених у роботі завдань дозволило визначити спектр, поширення і походження мутацій гена TGFBI серед хворих із спадковими дистрофіями строми рогівки, і також вивчити асоціацію мутацій з певними клінічними фенотипами, що відкриває перспективи для прогнозу та диференційної діагностики певних клінічних варіантів дистрофії строми рогівки.

1. Вперше визначено спектр мутацій гена TGFBI, які спричинюють спадкові дистрофії строми рогівки у пацієнтів з України. Виявлено мутації Arg124Cys (екзон 4), Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln (екзон 12), Hys626Arg (екзон 14) гена TGFBI.

2. Вперше ідентифіковано нову мутацію Leu558Pro (екзон 12) в гені TGFBI у пацієнтів з атипічною дистрофією строми рогівки.

3. На основі аналізу зчеплення мутацій Arg124Cys, Arg555Trp, Leu558Pro, His626Arg гена TGFBI з алельними варіантами мікросателітних локусів D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 із хромосомної ділянки 5q31 можна зробити припущення, що мутації Arg124Cys, Arg555Thr, His626Arg мають рекурентне походження та походження мутації Leu558Pro від одного предка-засновника.

4. В результаті аналізу асоціації між мутаціями в гені TGFBI та клінічними формами спадкової дистрофії рогівки показано, що певні мутації в гені TGFBI асоційовані з характерними клінічними фенотипами.

5. Створено банк ДНК хворих з України на різні клінічні форми дистрофії строми рогівки.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Пампуха В.М. Дослідження мутацій в 4-му та 12-му екзонах гена TGFBI у хворих із спадковими формами дистрофії рогівки з України / В.М. Пампуха, Г.І. Дрожжина, Л.А. Лівшиць // Доповіді Національної академії наук України. - 2004. - №3. - C.186-190. (Особистий внесок здобувача: розробка модифікованих методів аналізу мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg124Lys, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI ).

2. Пампуха В.Н. Анализ мутаций H626R, A546T, T538R гена TGFBI у больных с решетчатой дистрофией стромы роговицы из Украины / В.Н. Пампуха, Г.И. Дрожжина, Л.А. Лившиц // Цитология и генетика. - 2007. -Т.41,№ 6. - С.56-61. (Особистий внесок здобувача: розробка методів аналізу мутацій Thr538Arg, Ala546Thr,His626Arg гена TGFBI).

3. Спектр мутаций в гене TGFBI у больных с наследственными дистрофиями стромы роговицы из Украины / В.Н. Пампуха, С.А. Кравченко, Ф. Терещенко, Г.И. Дрожжина, Л.А. Лившиц // Генетика. - 2008. - Т.44,№ 10. - С.1392-1396. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln, Leu558Pro, His626Arg гена TGFBI у хворих з спадковими дистрофіями рогівки, аналіз походження мутацій та асоціації мутацій з певними клінічними фенотипами).

4. Пампуха В.М. Дослідження мутацій гена TGFBI у хворих на дистрофію строми рогівки, які проживають в Україні / В.М. Пампуха, Г.І. Дрожжина, Л.А. Лівшиць // Біополімери і клітина. - 2008. - Т.24,№ 1. - С.60-68. (Особистий внесок здобувача: дослідження спектра мутацій гена TGFBI у хворих з України з спадковими дистрофіями рогівки).

5. Молекулярно-генетический и клинико-морфологический анализ больных с решетчатой наследственной дистрофией роговицы / Г.И. Дрожжина, В.Н. Пампуха, В.В. Вит, Н.Е. Думброва, Л.А. Лившиц // Офтальмологический журнал. - 2002. - №6. - C.31-35. (Особистий внесок здобувача: отримання геномної ДНК із зразків хворих на дистрофію строми рогівки та їхніх родичів, молекулярно-генетичний аналіз мутації Arg124Cys гена TGFBI у хворих з гратчастою дистрофією рогівки).

6. Значение молекулярно-генетических методов исследования в дифференциальной диагностике различных видов и типов наследственных стромальных дистрофий роговицы / Г.И. Дрожжина, В.Н. Пампуха, В.В. Вит, Н.Е. Думброва, Л.А. Лившиц // Офтальмологический журнал. - 2004. - №1. - C.22-28. (Особистий внесок здобувача: генеалогічний аналіз в родинах з спадковими дистрофіями рогівки, молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

7. Pampukha V.M. TGFBI gene mutation analysis in families with hereditary corneal dystrophies from Ukraine / V.M. Pampukha, G.I. Drozhyna, L.A. Livshits // Ophtalmologica. - 2004. - V.218,№6. - P.411-414. (Особистий внесок здобувача: генеалогічний аналіз в родинах з спадковими дистрофіями рогівки, молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg124Lys, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

8. Атипичная форма наследственной дистрофии стромы роговицы (клинический, морфологический и молекулярно-генетический анализ) / Г.И. Дрожжина, В.Н. Пампуха, В.В. Вит, Л.А. Лившиц // Офтальмологический журнал. - 2007. - №5. - С.11-19. (Особистий внесок здобувача: генеалогічний аналіз в родинах із атипічною дистрофією рогівки, розробка методу аналізу нової мутації Leu558Pro гена TGFBI).

9. Молекулярно-генетический и клинико-морфологический анализ больных с решетчатой наследственной дистрофией роговицы / Л.А. Лившиц, Г.И. Дрожжина, В.Н. Пампуха, В.В. Вит, Н.Е. Думброва // X з'їзд офтальмологів України, 28-30 травня 2002р.: тези доп. - Одеса, 2002. - С.45. (Особистий внесок: отримання геномної ДНК із зразків хворих на дистрофію строми рогівки та їхніх родичів, молекулярно-генетичний аналіз мутації Arg124Cys гена TGFBI у хворих з гратчастою дистрофією рогівки).

10. Значение молекулярно-генетических методов исследования в дифференциальной диагностике различных видов наследственных стромальных дистрофий роговицы / Г.И. Дрожжина, В.Н. Пампуха, В.В. Вит, Н.Е. Думброва, Л.А. Ливщиц // 2-а Міжнародна конференція офтальмологів Причорномор'я, 8-10 вересня 2004р.: тези доп. - Одеса, 2004. - C.23-24. (Особистий внесок здобувача: генеалогічний аналіз в родинах з спадковими дистрофіями рогівки, молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg555Trp гена TGFBI).

11. Анализ мутаций гена TGFBI у больных с наследственными дистрофиями роговицы / В.Н. Пампуха, Г.И. Дрожжина, Л.А. Лившиц // Материалы научно-практической конференции „Вопросы офтальмогенетики”, 16 ноября 2005г.: тезисы докл. - Москва, 2005. - C.108-113. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg124Lys, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

12. Mutation analysis of the TGFBI gene in families with hereditary corneal dystrophies from Ukraine / V. Pampukha, G. Drozhyna, L. Livshits // Europian Human Genetics Conference 2005, May 7-10, 2005: abstracts. - Prague, 2005. - P.88. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg124Lys, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

13. Молекулярно- генетические аспекты наследственных дистрофий стромы роговицы / В.Н. Пампуха, Г.И. Дрожжина, Л.А. Лившиц // XI съезд офтальмологов Украины, 16-19 мая 2006г.: тезисы докл. - Одесса, 2006. - Офтальмологічний журнал. - 2006. - №3 (II). - C.71-73. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

14. Аналіз мажорних мутацій гена кератоепітеліну TGFBI у хворих із дистрофіями строми рогівки / В.М. Пампуха, Г.І. Дрожжина, Л.А. Лівшиць // IX Український біохімічний з'їзд, 24-27 жовтня 2006р.: тези доп. - Харків, 2006. - Т.1. - C. 58. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Arg124His, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

15. Дослідження мутацій гена TGFBI у хворих з спадковими дистрофіями строми рогівки / В.М. Пампуха, Г.І. Дрожжина, Л.А. Лівшиць // Науково-практична конференція з міжнародною участю „Актуальні питання медичної генетики”: тези доп. - Київ, 2007. - C.101-102. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln гена TGFBI).

16. Спектр мутаций гена TGFBI у больных с наследственными дистрофиями стромы роговицы из Украины / В.Н. Пампуха, Г.И. Дрожжина, Л.А. Лившиц // Международная научная коференция, посвященной 100-летию со дня рождения Н.А. Пучковской „Современные аспекты клиники, диагностики и лечения глазных болезней”, 29-30 мая 2008г.: тезисы докл. - Одесса, 2008. - C.41-42. (Особистий внесок здобувача: молекулярно-генетичний аналіз мутацій Arg124Cys, Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln, Leu558Pro, His626Arg гена TGFBI у хворих з спадковими дистрофіями рогівки, аналіз асоціації мутацій з певними клінічними фенотипами).

АНОТАЦІЯ

Пампуха В.М. Мутації гена TGFBI у хворих з спадковими дистрофіями строми рогівки - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальнісю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2009.

Дисертаційна робота присвячена вивченню молекулярно-генетичної природи спадкової дистрофії строми рогівки. Під час виконання роботи було ідентифіковано мутації Arg124Cys, Thr538Arg, Arg555Gln, Arg555Trp, Hys626Arg в гені TGFBI у хворих з України на спадкові дистрофії рогівки. Також ідентифіковано нову мутацію Leu558Pro у хворих з атипічною дистрофією. Був проведений аналіз гаплотипуваня за допомогою мікросателітних маркерів, які локалізовані навколо гена TGFBI, серед доступних членів родин. На основі аналізу асоціації між мутаціями в гені TGFBI та клінічними формами спадкової дистрофії рогівки показано, що певні мутації в гені TGFBI асоційовані з характерними клінічними фенотипами. Отримані дані свідчать, що проведення молекулярно-генетичного аналізу і виявлення мутацій гена TGFBI у пацієнтів з спадковими дистрофіями строми рогівки дозволяє з високою точністю встановити вид і тип дистрофії, підібрати відповідну тактику лікування.

Ключові слова: ген TGFBI, спадкова дистрофія рогівки, ДНК-аналіз, мутація, генетика.

АННОТАЦИЯ

Пампуха В.М. Мутации гена TGFBI у больных с наследственными дистрофиями стромы роговицы - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2009.

Диссертационная работа посвящена изучению молекулярно-генетической природы наследственной дистрофии стромы роговицы.

Впервые в Украине проведен анализ спектра, частоты и происхождения мутаций гена TGFBI у больных с наследственными дистрофиями стромы роговицы.

В ходе выполнения данной работы был создан банк лейкоцитарной ДНК больных с дистрофиями стромы роговицы (94 образца) и членов их семей (42 образца).

В результате клинико-генеалогического анализа у всех пациентов, кроме двоих, установлен аутосомно-доминантный тип наследования.

Среди пациентов с наследственными дистрофиями роговицы были идентифицированы следующие мутации: Arg124Cys (экзон 4), Thr538Arg (экзон 12), Arg555Gln (экзон 12), Arg555Trp (экзон 12), Hys626Arg (экзон 14). Для анализа мутантных вариантов гена TGFBI проводили специфическую амплификацию in vitro нуклеотидных последовательностей 4-го, 12-го и 14-го экзонов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для дифференциального анализа определенных мутаций проводили гидролиз амплифицированых последовательностей следующими эндонуклеазами рестрикции: PstI, HinfI, BstXI, BglII, NlaIII для мутаций Arg124Cys, Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln, Hys626Arg соответственно.

Кроме того, идентифицирована новая мутация Leu558Pro (экзон 12) у больных с атипичной полиморфной дистрофией роговицы. У пациентов с атипичной дистрофией роговицы продукты амплификации всех 17 экзонов гена TGFBI были просеквенированы. Поскольку данная мутация приводит к исчезновению сайта рестрикции для эндонуклеазы HinfI, был проведен анализ ДНК пациентов и 50 здоровых индивидуумов из общей популяции методом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Мутация была подтверждена у всех больных с атипичной дистрофией роговицы и не была выявлена в группе контроля, что исключает существование редкого нейтрального полиморфизма.

Установлено, что в исследуемой группе больных с наследственными дистрофиями роговицы наиболее распространенными есть мутации Arg124Cys и Hys626Arg, которые встречаются с частотой 37,5 % и 31,3 % соответственно. Менее распространенными есть мутации Thr538Arg, Arg555Trp, Arg555Gln, частота которых составляет 2,1 %, 10,4 % и 2,1 % соответственно. Частота мутации Leu558Pro в исследуемой группе - 8,3 %. Только в 4-х семьях с дистрофиями роговицы не были выявлены исследуемые мутации, а это составляет 8,3 % от общего количества семей.

Для гаплотипирования мутантних хромосом с целью определения происхождения исследуемых мутаций был проведен анализ аллельных вариантов микросателлитных локусов D5S393, D5S396, D5S399, D5S500 среди всех доступних членов семей с помощью метода ПЦР с последующим анализом флуоросцентно меченых продуктов ПЦР на автоматическом лазерном флуориметре “ALF express”. Выявлено три разных минигаплотипа, которые ассоциированы с мутацией Arg124Cys, и три разных минигаплотипа, которые сцеплены с мутацией Arg555Trp. Полученные данные могут свидетельствовать о независимом возникновении этих мутаций. Мутация His626Arg у всех исследуемых пациентов была сцеплена с минигаплотипами, которые различаются только аллельными вариантами локуса D5S500. Учитывая тот факт, что большинство пациентов с данной мутацией родом из Черниговской области, можно предположить существование одного предкового гаплотипа. Данное предположение есть обоснованым, поскольку существуют данные о том, что для микросателлитных локусов характерным есть високий мутационный уровень. Установлено, что пациенты с новой идентифицированой дисертантом мутацией Leu558Pro имеют одинаковый минигаплотип, что свидетельствует о происхождении этой мутации от одного предка-основателя.

Одной из задач данной работы было изучение ассоциации генотипа и фенотипа у пациентов с дистрофиями роговицы. Было показано, что определенные мутации ассоциированы с характерными клиническими проявлениями заболевания. Мутация Arg124Cys ассоциирована с клиническими проявлениями решетчатой дистрофии (тип I), мутация His626Arg - решетчатой дистрофии (тип IIIA), Thr538Arg - с промежуточным вариантом решетчатой дистрофии (тип I/IIIA), мутация Arg555Trp встречалась у пациентов с узелковой дистрофией (тип I), а Arg555Gln - с дистрофией Тиля-Бенке. У пациентов с впервые идентифицированной мутацией Leu558Pro наблюдались клинические проявления дистрофии роговицы, для которой характерны полиморфные биомикроскопические характеристики, амилоидные депозиты в глубоких и средних слоях роговицы и начало манифестации болезни в четвертом десятилетии жизни. Такие особенности клинической картины дистрофии роговицы ранее не были описаны в литературе.

Полученные результаты имеют важное практическое значение. Разработанные методы ДНК-анализа мутаций гена TGFBI позволяют с высокой точностью установить вид и тип дистрофии стромы роговицы. Предложенные методы ДНК-дигностики позволяют проводить исследования на доклинической стадии, помогают подобрать более эффективные методы лечения, проводить дородовую диагностику в семьях высокого риска.

Ключевые слова: ген TGFBI, наследственная дистрофия роговицы, ДНК-анализ, мутация, генетика.

SUMMARY

Pampukha V.M. TGFBI gene mutations in the patients with inherited corneal stromal dystrophies - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.22 - molecular genetics. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2009.

The dissertation is devoted to study the molecular basis of corneal stromal dystrophies. During performance of work Arg124Cys, Thr538Arg, Arg555Gln, Arg555Trp, Hys626Arg mutations of the TGFBI gene were identified in the Ukrainian patients with inherited corneal dystrophies. A new mutation in TGFBI gene, Leu558Pro, was identified in the patients with atypical corneal dystrophy. The haplotypes of four microsatellite markers surrounding TGFBI gene locus were analyzed in available family members. Our study demonstrated that certain mutations in TGFBI gene are distinctly associated with particular clinical forms of corneal stromal dystrophies. The data on association of genotype and phenotype suggest that the analysis of TGFBI gene mutations is important for differential diagnostics of corneal dystrophies and make it possible to select the corresponding treatment tactics.

Key words: TGFBI gene, inherited corneal dystrophy, DNA analysis, mutation, genetics.

Размещено на Allbest.ru