Патогенетична роль катехоламінергічної системи надниркових залоз у розвитку експериментального цукрового діабету

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Луганський державний медичний університет

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

14.03.04 - патологічна фізіологія

ПАТОГЕНЕТИЧНА РОЛЬ КАТЕХОЛАМІНЕРГІЧНОЇ СИСТЕМИ НАДНИРКОВИХ ЗАЛОЗ У РОЗВИТКУ

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЦУКРОВОГО ДІАБЕТУ

Количева Наталія Леонідівна

Луганськ - 2009

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гормони в цілісному організмі виступають не тільки як біологічні регулятори фізіологічних функцій клітин різних органів та тканин, але й також є універсальними месенджерами міжсистемних взаємодій. Остання їх властивість найбільш яскраво проявляється у взаємовідносинах нервової, імунної та ендокринної систем, які відіграють ключову роль у регуляції механізмів адаптації організму до дій екзогенних та ендогенних факторів різноманітного генезу, а також всіх форм стресу (Пшенникова М.Г. та ін., 2002; Roske I. et al., 2002; Sabban E.L. et al., 2004). Адаптація організму до факторів зовнішнього середовища в більшості випадків визначається адекватністю та збалансованістю стрес-реакції, яка, в свою чергу, залежить від гармонійності взаємодії стрес-реалізуючих та стрес-лімітуючих систем. Одну з важливих складових стрес-реалізуючої системи формують ендокриноцити коркового шару надниркових залоз, які синтезують глюкокортикоїди та мінералокортикоїди, котрі забезпечують гормональні механізми тривалої адаптації до дії різних стресорних факторів (Балаболкин М.И., 2000; Nijaradze L., 2001; Miller W.L. et al., 1995). Відомо, що тривалий стрес, експериментальна та клінічна терапія великими дозами глюкокортикоїдів, хвороба Кушинга супроводжуються гіперкортицизмом і призводять до формування інсулінорезистентності та розвитку стероїдного діабету (Балаболкин М.И., 2000; Miller W.L. et al., 1995). Разом із тим, хоч у пацієнтів із цукровим діабетом та тварин із експериментальним діабетом відмічається підвищений рівень кортикостероїдів у крові, гістофізіологія кори надниркових залоз при цих станах досліджена недостатньо (Балаболкин М.И., 2000; Nijaradze L., 2001).

На сучасному етапі вивчення патогенезу цукрового діабету велике значення надають впливу нейроендокринної системи на шляхи та механізми регуляції ендокринної функції підшлункової залози. Зокрема, показана роль гіпоталамічних нейропептидів у модуляції синтезу та секреції інсуліну в нормі та при експериментальному цукровому діабеті (Колесник Ю.М. та ін., 1995, 2004). У той же час, відсутні дані про роль катехоламінергічної системи в даному процесі, хоча гіперглікемічна спрямованість ефектів катехоламінів добре відома. З іншого боку, роль катехоламінергічної системи надниркових залоз надзвичайно велика, бо саме вона забезпечує адаптацію організму до гострого та хронічного стресу різного ґенезу, реагуючи на стресорні впливи посиленням синтезу та секреції катехоламінів (Пшенникова М.Г. та ін., 2002; Roske I. et al., 2002; Sabban_E.L. et al., 2004). У доступній літературі відсутні дані про розподіл біогенних амінів (адреналіну та норадреналіну) в надниркових та підшлунковій залозах, плазмі крові щурів у динаміці розвитку цукрового діабету, а також про особливості функціональної реакції ендокриноцитів мозкового шару надниркових залоз на зміни вуглеводного гомеостазу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами. Дисертація є фрагментом планових наукових робіт кафедри патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету «Роль порушень нейро-імуно-ендокринних взаємовідносин у розвитку експериментальної і клінічної патології (експериментально-клінічне дослідження» (№ держреєстрації 0103U000937) та «Нейро-імуно-ендокринні механізми розвитку та вікові особливості формування ендокринної патології та метаболічних порушень внаслідок пренатальної дії патогенних факторів» (№ держреєстрації 01080005114). Дисертантка є співвиконавцем комплексних тем.

Мета і задачі дослідження: встановлення ролі катехоламін-залежних механізмів у розвитку стрептозотоцин-індукованого цукрового діабету.

Для досягнення мети були поставлені наступні задачі:

1. Вивчити біохімічні характеристики функціонального стану надниркових та підшлункової залоз щурів у нормі та в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету.

2. Вивчити морфофункціональні характеристики мозкового та коркового шарів надниркових залоз щурів у нормі та в динаміці розвитку експериментального цукрового діабету.

3. Вивчити вплив хронічного введення модуляторів синтезу моноамінів L_тирозину та б_метил_L_тирозину на біохімічні характеристики та морфофункціональний стан катехоламінергічної системи надниркових залоз щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті.

4. Встановити патогенетичну роль катехоламінергічної системи надниркових залоз у розвитку експериментального цукрового діабету та її вплив на наступні етапи перебігу патологічного процесу.

Об'єкт дослідження: патогенез цукрового діабету.

Предмет дослідження: патогенетична роль катехоламінергічної системи надниркових залоз.

Методи дослідження: патофізіологічні, біохімічні, морфометричні, гістохімічні, імунофлюоресцентні, методи статистичного аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлені фундаментальні факти, які характеризують закономірності реакції катехоламінергічної системи надниркових залоз у початковий період розвитку експериментального цукрового діабету. Показано, що гостра гіпоглікемія, зумовлена стрептозотоцин-індукованою загибеллю бета-клітин та гіперінсулінемією на першу добу розвитку експериментального діабету, призводить до підвищення функціональної активності катехоламінергічної системи надниркових та підшлункової залоз, що проявляється високим вмістом катехоламінів у гомогенатах та їх підвищеною концентрацією в плазмі крові. Встановлено, що початковий період розвитку експериментального діабету супроводжується фазною динамікою змін концентрації біогенних амінів у плазмі крові, надниркових та підшлунковій залозах із домінуванням вмісту адреналіну в пулі катехоламінів, який негативно корелює з рівнем глікемії.

Виявлено, що початковий період розвитку експериментального діабету супроводжується збільшенням щільності ендокриноцитів пучкової та сітчастої зон коркового шару надниркових залоз, зростанням у них концентрації РНК та підвищенням рівня кортизолу в крові, віддзеркалюючи стресорний характер реакції надниркових залоз на розвиток патологічного процесу. Доведено, що в надниркових залозах тварин при діабеті відмічається підвищення активності NO-синтази та концентрації стабільних метаболітів NO, що в поєднанні зі зменшенням вмісту катехоламінів слід розглядати як стрес-лімітуючу ланку, спрямовану на обмеження активації симпатоадреналової та адренокортикальної систем при цукровому діабеті. Вперше встановлено, що введення інтактним щурам попередника синтезу моноамінів L_тирозину протягом десяти днів призводить до збільшення концентрації адреналіну та норадреналіну в крові, а також підвищення концентрації глюкози до верхніх порогових значень норми. В той же час, введення тваринам із діабетом L_тирозину не впливає на рівень глюкози та інсуліну в крові, але призводить до зниження концентрації адреналіну та норадреналіну в крові та надниркових залозах.

Досліджено вперше, що введення інтактним тваринам та щурам при цукровому діабеті блокатора синтезу катехоламінів б_метил_L_тирозину протягом десяти днів пригнічує синтез моноамінів у надниркових залозах та призводить до зниження сумарного пулу катехоламінів у залозах та крові, що поєднується з вірогідним зниженням рівня глікемії.

Практичне значення одержаних результатів. У результаті проведеного дослідження встановлений ступінь участі катехоламінергічної системи надниркових залоз у патогенезі початкових стадій розвитку експериментального цукрового діабету. При цьому є очевидним стресорний характер реакції наднирників на процес індукції діабету, викликаної стрептозотоцин-індукованою гіперінсулінемією та гіпоглікемією. В той же час, формування стійкої гіперглікемії супроводжується підвищенням у надниркових залозах активності NO_ергічних механізмів, які слід розглядати як стрес-лімітуючу ланку, спрямовану на обмеження активації симпатоадреналової та адренокортикальної систем при цукровому діабеті. Отримані результати можуть бути використані в роботі наукових лабораторій, які займаються проблемами нейроендокринної регуляції функцій при патології, а також у навчальному процесі в медичних вищих навчальних закладах. Теоретичні результати досліджень впроваджені протягом 2007-2009 років у навчальний процес кафедр патофізіології державних медичних університетів: Запорізького, Луганського, Буковинського та Донецького національного ім. М. Горького, що підтверджено відповідними актами впровадження.

В процесі виконання роботи дисертантка брала безпосередню участь у розробці нових методів біохімічного визначення адреналіну та норадреналіну в одній пробі біологічного матеріалу, а також методики визначення активності ферменту NO-синтази в гомогенатах тканини, на які були отримані патенти України № 11450 (G01N33/48) і 13132 (G01N33/48). Запатентовані методики впроваджені в роботу Центральної науково-дослідної лабораторії Запорізького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійною науково-дослідною роботою, в якій авторкою особисто проведені патентний та літературний пошуки, виконана експериментальна частина, статистична обробка результатів та їх аналіз, написані всі розділи дисертації та автореферат. Вибір теми, формулювання мети та задач наукового дослідження, планування роботи здійснені спільно з науковим керівником - д.мед.н., професором А.В._Абрамовим.

Апробація роботи. Результати роботи доповідалися та обговорювалися: на V національному Конгресі патофізіологів України «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів» (Запоріжжя, 2008), VII зґїзді ендокринологів України, присвяченому 100-річчю від дня народження В.П. Комісаренка (Київ, 2007), науково-практичній конференції з міжнародною участю «Експериментальна та клінічна ендокринологія: від теорії до практики» (Шості Данилевські читання) (Харків, 2007); науково-практичній конференції з міжнародною участю «Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи» (Сьомі Данилевські читання) (Харків, 2008), на всеукраїнській науково-практичній конференції студентів та молодих вчених «Сучасні аспекти медицини та фармації» (Запоріжжя, 2008), на спільному засіданні колективів кафедр патологічної фізіології, нормальної фізіології, патоморфології, фармакології, гістології та ембріології, мікробіології, вірусології та імунології, Центральної науково-дослідної лабораторії Запорізького державного медичного університету (Запоріжжя, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 16 наукових праць, із них: 9 статей у журналах, які відповідають вимогам Вищої атестаційної комісії України та надруковані згідно вимог, викладених у пункті 3 Постанови ВАК України від 15 січня 2003 р. за №7 - 05/1, з яких 2 одноосібні; 2 патенти України; 5 тез у матеріалах конгресів, зґїздів, конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 132 сторінках компґютерного тексту й складається зі вступу, огляду літератури, розділу, який висвітлює матеріали та методи дослідження, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів і висновків. Матеріали дисертації проілюстровані 23 таблицями. Список літератури включає 146 джерел вітчизняних та іноземних авторів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми дисертаційного дослідження, сформульовано мету, завдання, об'єкт, предмет та методи дослідження. Висвітлено наукову новизну, теоретичне та практичнее значення роботи. Наведені дані про особистий внесок, апробацію, впровадження результатів дослідження, структуру дисертації.

В першому розділі, який складається з трьох підрозділів, наведений аналітичний огляд наявних літературних даних щодо сучасних уявлень про структурну організацію катехоламінергічної системи надниркових залоз та її роль у регуляції функціонального стану організму в нормі та при патології.

Матеріали та методи досліджень. Дослідження проведені на 120 статевозрілих щурах-самцях лінії Вістар вагою 250-300 г. Матеріалом для дослідження були надниркові залози, ендокринна частина підшлункової залози та периферична кров. У ході експериментального дослідження використовували стрептозотоцинову модель цукрового діабету. Стрептозотоцин вводили щурам внутрішньочеревно в дозі 50 мг/кг, розчинений у 0,5 мл 0,1 М цитратного буферу (рН 4,5). У тварин у плазмі крові до введення стрептозотоцину та на всіх наступних етапах розвитку цукрового діабету визначали концентрацію глюкози в крові глюкозо-оксидазним методом за допомогою глюкометра Glucocard (ARKRAY Inc., Японія). З метою вивчення впливу катехоламінергічної системи на перебіг цукрового діабету використовували метод хронічного введення модуляторів синтезу катехоламінів. Вивчали ефекти впливу L_тирозину та б_метил-L_тирозину. Нормальним тваринам введення модуляторів синтезу катехоламінів здійснювали внутрішньочеревно протягом 10 днів, а тваринам із діабетом - починаючи з першої доби після введення стрептозотоцину. Щоденна доза для кожного з модуляторів складала: для L_тирозину - 100 мг/кг, для б_метил-L_тирозину - 10 мг/кг. Через 24 години після останньої ін'єкції L_тирозину або б_метил-L_тирозину тварин виводили з експерименту. Концентрацію адреналіну та норадреналіну в плазмі крові та гомогенатах оцінювали за розробленою та запатентованою нами методикою (Колесник Ю. М. та ін., 2005). Для оцінки інтенсивності вільнорадикального окислення в плазмі крові, тканинах надниркових та підшлункової залоз визначали ступінь окислювальної модифікації білку (ОМБ) за методом Halliwell B at al. (1999). Стан антиоксидантної системи оцінювали за активністю каталази (Королюк М. А. та ін.,1998). Цикл оксиду азоту вивчали за накопиченням стабільних метаболітів NO, активністю NO-синтази в тканині. Стабільні метаболіти визначали за якісною реакцією з реактивом Грису (Горбунов Н. В., 1995), активність NO-синтази - флуорометрично (Колесник Ю. М. та ін., 2005). Концентрацію гормонів у плазмі крові визначали імуноферментним методом із використанням комерційних наборів для визначення інсуліну та кортизолу. Для гістологічного дослідження з надниркових залоз на ротаційному мікротомі MICROM HR-360 (Microm, Німеччина) виготовляли серійні зрізи товщиною 5 мкм, які забарвлювали галоціанін-хромовими квасцями за Эйнарсоном (Пирс Э., 1962). Морфометричний та денситометричний аналіз проводили на мікроскопі Axioskop (Ziess, Німеччина). Аналіз зображення проводили в автоматичному режимі за допомогою програми, розробленої професором А.В. Абрамовим. Для імунофлюоресцентного визначення білку с-Fos у клітинах коркового та мозкового шарів надниркових залоз аналіз гістологічних зрізів проводили на системі цифрового аналізу зображення VIDAS-386 (Kontron Electronik, Німеччина) на базі люмінесцентного мікроскопу AXIOSKOP (Zeiss, Німеччина).

Отримані експериментальні дані обробляли на IBM-сумісних персональних комп'ютерах за допомогою пакету прикладних та статистичних програм VIDAS-2.5 (Kontron Elektronik, Німеччина) та EXCEL (Microsoft Corp., США).

Результати досліджень та їх обговорення. Введення стрептозотоцину експериментальним тваринам призводило до масової загибелі в-клітин підшлункової залози та вивільнення з них інсуліну, в результаті чого концентрація гормону в крові зростала практично в 2 рази (p_St<0,05) (таблиця 1). Це призводило до вираженої гіпоглікемії на 1-шу добу після індукції діабету. Розвиток патологічного процесу з 3-тьої по 10-ту добу супроводжувався зниженням концентрації інсуліну на 13_34 % (p_St<0,05).

Таблиця 1. Концентрація глюкози, інсуліну та кортизолу в плазмі крові щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті (М±m)

? - вірогідні відмінності (p_St<0,05) стосовно групи інтактних щурів.

Починаючи з третьої доби розвитку діабету, збільшувалася концентрація глюкози в крові понад 7,0 мМоль/л із піком гіперглікемії на 3-тю добу, що було зумовлено епізодичним зниженням концентрації інсуліну в крові на 34,2 % (p_St<0,05). У наших дослідженнях встановлено поступове підвищення концентрації кортизолу в крові тварин із діабетом на 39-89 % (p_St<0,05) (табл.1).

Стан катехоламінергічної системи щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. Розвиток експериментального діабету в щурів призводив до вірогідного підвищення концентрації катехоламінів у периферичній крові на 1-шу добу: рівень адреналіну підвищувався на 20 % (p_St<0,05), а норадреналіну - на 5,8 % (p_St<0,05) (таблиця 2). При цьому плазмовий коефіцієнт адреналін/норадреналін збільшувався на 13 % (p_St<0,05). Ці зміни проходили на тлі епізодичного (1-ша доба) гіпоглікемічного стану в щурів (табл.1).

Очікуваною була реакція катехоламінергічної системи надниркових залоз, яка характеризувалася підвищенням вмісту адреналіну в тканині наднирників на 32,7 % (p_St<0,05), при зниженні концентрації норадреналіну на 14 % (p_St<0,05). При цьому коефіцієнт адреналін/норадреналін вірогідно збільшувався в 1,5 рази (p_St<0,05) (табл.2). На 7-му добу в надниркових залозах концентрація адреналіну знижувалася на 14,2 % (p_St<0,05), а норадреналіну - на 37,6 % (p_St<0,05), у порівнянні з інтактними тваринами. Це свідчило про поступове зменшення процесів біосинтезу в ендокриноцитах медулярної зони надниркових залоз та характеризувалося негативною кореляційною залежністю між рівнем глікемії та концентрацією адреналіну (r = _0,82). Одночасно знижувалася концентрація адреналіну в плазмі крові на 11,7%, в той час, як його вміст у гомогенатах підшлункової залози інтактних тварин був вищим на 12 % (p_St<0,05).

Таблиця 2. Концентрація катехоламінів у плазмі крові, гомогенатах підшлункової та надниркових залоз щурів при експериментальному цукровому діабеті (М±m)

? - вірогідні відмінності (p_St < 0,05) стосовно групи інтактних щурів.

На 10-ту добу перебігу діабету концентрація катехоламінів у надниркових залозах відповідала рівню інтактних тварин (p_St<0,05). Аналіз гомогенатів підшлункової залози експериментальних тварин показав, що на 1-шу добу концентрація катехоламінів збільшувалася на 34-38 % (p_St<0,05) у порівнянні з вихідними показниками, а коефіцієнт адреналін/норадреналін підвищувався (табл.2). Надалі показники вмісту катехоламінів у підшлунковій залозі відновлювалися до вихідних значень. Подальший розвиток патологічного процесу та формування стійкої гіперглікемії сприяли збереженню підвищеної концентрації адреналіну та норадреналіну в підшлунковій залозі, показники яких на 10-ту добу перебігу діабету залишалися підвищеними приблизно на 60 % (p_St<0,05) у порівнянні з інтактними тваринами, що поєднувалося зі збільшенням вмісту адреналіну та норадреналіну в плазмі на 14 % (p_St<0,05) та 8 % (p_St<0,05), відповідно (табл.2).

Стан системи синтезу монооксиду азоту щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. Перша доба розвитку діабету характеризувалася підвищенням концентрації стабільних метаболітів NO (нітритів) у плазмі на 33,8 % (p_St<0,05) та в підшлунковій залозі в 1,5 рази (p_St<0,05) на тлі зниження даного показника в надниркових залозах на 15,2% (p_St<0,05) (таблиця 3). Подібні зміни концентрації нітритів у досліджуваних тканинах супроводжувалися підвищенням активності NO-синтази в надниркових залозах на 57 % (вихідний показник - 9,43±0,71 мкМ/г білкуЧхв., p_St<0,05) та в підшлунковій залозі на 58 % (вихідний показник - 17,31±1,20 мкМ/г білкуЧхв., p_St<0,05). Подальший розвиток експериментальної патології та формування стійкої гіперглікемії в щурів супроводжувалися 2,5 - кратним підвищенням концентрації стабільних метаболітів NO в плазмі, а також понад 2 - кратним збільшенням вмісту нітритів у надниркових та підшлунковій залозах (табл.3). При цьому в тканинах ендокринних залоз зберігалася вірогідно висока активність NO-синтази, максимальне значення якої відмічалося в надниркових залозах на 10-ту добу развитку діабету (в 2 рази вище, ніж у інтактних щурів; вихідний показник - 9,43±0,71 мкМ/г білкуЧхв., p_St<0,05) та в підшлунковій залозі на 3-тю добу (на 80 % вище, ніж у інтактних тварин; вихідний показник - 17,31±1,20 мкМ/г білкуЧхв., p_St<0,05).

Таблиця 3. Концентрація нітритів у плазмі крові, гомогенатах підшлункової та надниркових залоз щурів при експериментальному цукровому діабеті (М±m)

? - вірогідні відмінності (p_St<0,05) стосовно групи інтактних щурів.

Стан окислювальної модифікації білку в щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. На 1-шу-3-тю добу розвитку діабету в плазмі крові відмічалося збільшення концентрації альдегідфенілгідразонів (АФГ) та кетонфенілгідразонів (КФГ) на 20-30 % (p_St<0,05 в обох випадках), тоді, як на 7-му добу рівень АФГ та КФГ при спонтанній ОМБ збільшувався на 40-50%, стосовно показників інтактних тварин (p_St<0,05). У плазмі крові тварин із діабетом спостерігалося значне підвищення концентрації АФГ і КФГ при стимульованій ОМБ - в 1,5 та 2,5 рази (p_St<0,05 в обох випадках). Вивчення показників ОМБ у гомогенатах надниркових залоз на 1-шу та 3-тю добу свідчило про незначне підвищення вмісту її продуктів по відношенню до контрольної групи тварин, тоді як на 7-му та 10-ту добу рівень АФГ та КФГ при спонтанній ОМБ підвищувався в 1,5 та 1,6 рази (p_St<0,05 в обох випадках).

Характеристика ендокриноцитів медулярної зони надниркових залоз у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. Морфометричні показники мозкового шару надниркових залоз на першу добу розвитку цукрового діабету свідчили про збільшення щільності ендокриноцитів на 9 % (p_St<0,05) (таблиця 4). При цьому в клітинах у 2,9 рази збільшувалась концентрація РНК на тлі зниження її вмісту в ядерцях у 1,5 рази (p_St<0,05). Подальший розвиток цукрового діабету та підвищення рівня глюкози не впливали на показник щільності ендокриноцитів (табл.4). Поряд із тим на 7-му добу на 17,3 % (p_St<0,05) зменшувалася площа ядер, залишаючись такою до кінця дослідження.

Таблиця 4. Морфометрична характеристика ендокриноцитів медулярної зони надниркових залоз щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті (M±m)

? - вірогідні відмінності (p_St<0,05) стосовно групи інтактних щурів.

Протягом 3 -тьої - 7 -мої діб перебігу патологічного процесу спостерігалося поступове зменшення концентрації РНК в ендокриноцитах, у порівнянні з першою добою. З 7-мої по 10-ту добу даний показник на 50% перевищував такий у інтактних тварин. У цей час в ядерцях відмічалася тенденція до відновлення концентрації РНК, але показник залишався на 16,3% нижчим (p_St<0,05), ніж у інтактних тварин (табл. 4).

Щільність с-Fos-імунопозитивних клітин у мозковому шарі наднирників через добу після індукції діабету знижувалася на 46% (p_St<0,05) у поєднанні зі зменшенням у них концентрації білку с-Fos у 2,5 рази (p_St<0,05) (таблиця 5).

Таблиця 5. Характеристика с-Fos-імунопозитивних ендокриноцитів медулярної зони надниркових залоз щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті (M±m)

? - вірогідні відмінності (p_St < 0,05) стосовно групи інтактних щурів.

Розвиток діабету на 3-тю добу характеризувався відновленням щільності с_Fos-імунопозитивних ендокриноцитів до рівня інтактних щурів, а на 10-ту добу цей показник зменшувався. При цьому концентрація білку с-Fos залишалася на 43-58 % нижче, ніж у інтактних тварин, та добре корелювала (r = +0,86) зі зміною щільності імунопозитивних клітин та рівнем глікемії (r = +0,8).Слід відзначити високу негативну кореляцію між концентрацією адреналіну в надниркових залозах та щільністю с_Fos-імунопозитивних ендокриноцитів (r = _0,99), а також концентрацією білку с-Fos у клітинах (r = _0,80) у динаміці розвитку діабету.

Характеристика адренокортикоцитів надниркових залоз щурів у нормі та при експериментальному цукровому діабеті. При морфометричному аналізі пучкової зони коркового шару наднирників відмічалося поступове збільшення щільності клітин, чисельність яких через добу після введення стрептозотоцину збільшувалась на 40% (p_St<0,05) у порівнянні зі щільністю ендокриноцитів у інтактних тварин, а на 10-у добу - збільшувалась на 57% (p_St<0,05), на той час як вихідний показник інтактних тварин складав 5477±129 мм^2.. На 1-шу - 3-тю добу після введення стрептозотоцину спостерігалося збільшення приблизно на 70 % (p_St<0,05) концентрації РНК в ендокриноцитах пучкової зони (вихідний показник - 262±1 мкО_ОЩ). У подальшому даний показник дещо знижувався, але на 10-ту добу перебігу діабету концентрація РНК у клітинах була на 60 % (p_St<0,05) вища, ніж у ендокриноцитах контрольних тварин. Разом із тим розвиток цукрового діабету в щурів призводив до зменшення концентрації РНК в ядерцях ендокриноцитів пучкової зони на першу добу, яка складала 962±13 мкО_ОЩ (p_St<0,05), показник інтактних тварин дорівнював 1163±7 мкО_ОЩ. На 7-му - 10-ту добу розвитку експериментальної патології досліджуваний показник поступово відновлювався до рівня інтактних тварин (1156±8 та 1009±7 мкО_ОЩ відповідно, p_St<0,05). Зростання щільності ендокриноцитів у гіперглікемічний період перебігу цукрового діабету в пучковій зоні позитивно корелювало з динамікою клітинної концентрації РНК (r=+0,75) і характеризувалося негативною кореляційною залежністю стосовно діаметру ядер клітин (r=-0,99). Морфометричні показники адренокортикоцитів сітчастої зони свідчили, що розвиток цукрового діабету в тварин характеризувався вірогідним збільшенням щільності ендокриноцитів, чисельність яких через добу після введення стрептозотоцину збільшувалася на 49% (p_St<0,05), а на 10-ту добу - на 68 % (p_St<0,05), стосовно показника кількості клітин інтактних щурів (5928±111 мм²). На 1-шу та 7-му добу в ендокриноцитах сітчастої зони відмічалися вірогідні ознаки гіпертрофії ядер із вірогідним збільшенням на 8-10 % (p_St<0,05) концентрації РНК в ядерцях у ці строки (вихідний показник - 1111±6 мкО_ОЩ). При цьому в самих клітинах на 3-тю добу вдвічі збільшувалась концентрація РНК, причому й на 10-ту добу даний показник залишався на тому ж рівні (p_St<0,05), у інтактних тварин він складав 240±2 мкО_ОЩ. Збільшення щільності ендокриноцитів сітчастої зони в гіперглікемічний період позитивно корелювало з динамікою концентрації РНК у клітинах (r=+0,84) і характеризувалося негативною кореляційною залежністю по відношенню до діаметру ядер адренокортикоцитів (r=-0,97). Проведення морфометричного аналізу адренокортикоцитів клубочкової зони показало, що в динаміці розвитку експериментального діабету відбувалися фазні зміни щільності клітин із підвищенням їх питомої чисельності на на 4-7 % (p_St<0,05) на 1-шу та 10-ту добу перебігу патологічного процесу та зниженням даного показника на 7-12 % (p_St<0,05) на 3-тю - 7-му добу (вихідний показник - 8103±110 мм²). Через добу після індукції діабету спостерігалося зменшення вмісту РНК у цитоплазмі клітин у 2 рази, але в той же час відмічалося підвищення в 1,2 рази концентрації РНК в ядерцях (p_St<0,05), для інтактних тварин показники складали 285±1 та 1082±5 мкО_ОЩ, відповідно. Зміни в адренокортикоцитах після формування гіперглікемії, починаючи з 3-тьої доби, позитивно корелювали з динамікою змін діаметру ядра клітин (r = +0,51) та супроводжувалися фазними змінами концентрації РНК у клітинах. Визначення концентрації білку c-Fos у корковому шарі надниркових залоз тварин із діабетом продемонструвало зменшення даного показника до 60% (p_St<0,05) від рівня інтактних тварин - 1,15±0,02 О_ІФ. Протягом першого тижня в корковому шарі приблизно в 4,5 рази зменшувалася площа матеріалу, імунореактивного до білку c-Fos, але на 10-ту добу цей показник вірогідно збільшувався на 42 % (p_St<0,05) та перевищував показник інтактних тварин (вихідний показник - 5,25±0,12 ‰). Слід відзначити, що в гіперглікемічний період перебігу діабету показник площі матеріалу, імунореактивного до білку c_Fos, позитивно корелював із динамікою щільності ендокриноцитів пучкової та сітчастої зон кори надниркових залоз (r = +0,87 і r = +0,81, відповідно), в той час, як між концентрацією білку c-Fos та РНК в ендокриноцитах кореляції практично не спостерігалося. Відсутність значимої кореляційної залежності відмічалася між концентрацією білку c-Fos у корковому шарі надниркових залоз і рівнем кортизолу в крові (r = _ 0,4). Крім того, висока кореляційна залежність між рівнем білку c-Fos в ендокриноцитах і концентрацією глюкози (r = + 0,71) та інсуліну в крові тварин при діабеті свідчила про підвищення функціональної активності коркового шару надниркових залоз.

Ефекти введення модуляторів синтезу катехоламінів інтактним тваринам. Концентрація глюкози в плазмі крові тварин із введенням L_тирозину була вищою на 37 % (p_St<0,05) у порівнянні з показниками контрольної групи (3,65±0,08 мМ/л) та на 59 % (p_St<0,05) відносно показника щурів із введенням б_метил_L_тирозину (2,98±0,11 мМ/л). Підвищення рівня глікемії у щурів із введенням L_тирозину відбувалося на тлі зниження рівня інсуліну у порівнянні з контролем на 8 % (p_St<0,05) (вихідний показник - 1,41±0,04 мкМО/мл), в той час, як у групі з введенням б_метил_L_тирозину рівень інсуліну вірогідно підвищувався на 59 % (p_St<0,05) у порівнянні з показником групи з введенням L_тирозину, який складав 1,09±0,04 мкМО/мл. Введення L_тирозину щурам призводило до вірогідного підвищення концентрації адреналіну (на 7,8±1,8 %) та норадреналіну (на 17,2±1,9 %) в плазмі крові, вихідні показники катехоламінів - 5,54±0,06 та 5,19±0,03 нМ/л, відповідно. Вміст біогенних амінів у гомогенатах надниркових залоз знижувався (на 19,5±1,6 % і 47,6±1,1 %, відповідно), вихідні показники дорівнювали 115,86,7 і 133,88,7 нМ/г. Введення б_метил_L_тирозину викликало зниження (на 12,9±1,3 %, p_St<0,05) концентрації норадреналіну в плазмі крові. При цьому вміст катехоламінів у тканині надниркових залоз знижувався на 40-50%, що було вірогідним (p_St< 0,05) стосовно показника щурів із введенням L_тирозину (вихідний показник для адреналіну - 93,2±1,9 і норадреналіну - 70,1±1,6 нМ/г). Введення L_тирозину призводило до понад 2_кратного підвищення активності NO-синтази в надниркових залозах, що супроводжувалося вірогідним зростанням концентрації нітритів як у самих залозах, так і в крові. Введення б_метил_L_тирозину не викликало подібного ефекту в тканині наднирників, хоча концентрація нітритів у крові тварин перевищувала вихідні показники інтактних щурів. Вивчення стану ОМБ свідчило про те, що в групі тварин із введенням L_тирозину відмічалося вірогідне збільшення концентрації продуктів вільнорадикального окислення в порівнянні з контрольною групою тварин, як у крові, так і в тканині надниркових залоз. Активація процесів ОМБ у плазмі крові тварин із введенням б_метил_L_тирозину супроводжувалася вірогідним збільшенням вмісту АФГ і КФГ, як при спонтанній, так і при стимульованій ОМБ у порівнянні з показниками інтактних тварин та щурів із введенням L_тирозину.

Характеристика ендокриноцитів медулярної зони надниркових залоз нормальних щурів та тварин із введенням модуляторів синтезу катехоламінів. У тварин із введенням L_тирозину протягом десяти діб відмічалося підвищення щільності ендокриноцитів на 10% (p_St<0,05), зниження діаметру ядра на 5% (p_St<0,05), на тлі підвищення вмісту РНК на 74% (p_St<0,05) стосовно контролю (вихідні показники - 6594±136 мм², 5,80±0,04 мкм, 221±1 мО_ОЩ).

Хронічне введення б_метил_L_тирозину призводило до зменшення щільності ендокриноцитів на 7% (p_St<0,05) стосовно контролю та на 15% (p_St<0,05) стосовно показника щурів із введенням L_тирозину, який дорівнював 7290±200 мм². Діаметр ядра в клітинах зменшувався у незначній мірі, але спостерігалося збільшення концентрації РНК в ядрі на 60% (p_St<0,05), у порівнянні з інтактними тваринами (вихідний показник - 221±1 мО_ОЩ), та зменшення на 36 % стосовно показника тварин із введенням L_тирозину (p_St<0,05), який дорівнював 856±3 мО_ОЩ. Щільність с_Fos-імунопозитивних клітин на тлі введення L_тирозину збільшувалася на 32% (p_St<0,05); показник інтактних тварин - 3,78±0,15 ‰. Одночасно в клітинах зменшувався вміст білку с_Fos на 21% (p_St<0,05) стосовно показника інтактних тварин (1633±67 мО_ІФ). Щільність с_Fos-імунопозитивних клітин у щурів із введенням б_метил_L_тирозину зменшувалася на 13% (p_St<0,05) стосовно показника інтактних тварин (вихідний показник - 3,78±0,15 ‰) і на 41% (p_St<0,05) стосовно показника тварин із введенням L_тирозину (вихідний показник - 5,57±0,24 ‰). Відмічалося зниження концентрації білку с_Fos на 57% (p_St<0,05) стосовно показника нормальних тварин (вихідний показник - 1633±67 мО_ІФ) та на 47% (p_St<0,05) стосовно показника тварин із введенням L_тирозину (вихідний показник - 1289±59 мО_ІФ).

Ефекти введення модуляторів синтезу катехоламінів тваринам при експериментальному цукровому діабеті. У групі тварин при діабеті та з введенням L_тирозину не відмічалося підвищення рівня глікемії та концентрації інсуліну в плазмі крові. Концентрація глюкози в плазмі крові тварин із діабетом та введенням б_метил_L_тирозину вірогідно знижувалася стосовно показника щурів із цукровим діабетом та введенням L_тирозину (на 14 %, p_St<0,05), вихідні показники - 7,86±0,26 та 7,90±0,29 мМ/л відповідно, на тлі вірогідного збільшення вмісту інсуліну в плазмі крові, у порівнянні з показниками тварин тих самих груп (на 21 % і на 29 %; вихідні показники - 1,23±0,07 та 1,11±0,05 мкМО/мл, відповідно). Введення щурам L_тирозину супроводжувалося зниженням концентрації адреналіну та норадреналіну в плазмі крові на 11% (p_St<0,05) (вихідні показники тварин із діабетом - 6,34±0,11 та 5,62±0,11 нМ/л, відповідно). Паралельно відмічалося зниження вмісту норадреналіну в тканині надниркових залоз на 29 % (p_St<0,05) у порівнянні з показником тварин при діабеті; вихідний показник складав 116,93,6 нМ/г. Введення б_метил_L_тирозину щурам із діабетом призводило до зменшення вмісту адреналіну та норадреналіну в плазмі крові відносно показника щурів із патологічним процесом (на 21 % і 13 % відповідно, p_St<0,05); вихідні показники дорівнювали 6,34±0,11 та 5,62±0,11 нМ/л. Введення блокатора синтезу моноамінів сприяло вірогідному зниженню вмісту адреналіну в плазмі крові на 11 % (p_St<0,05) та в тканині надниркових залоз на 18 % (p_St<0,05), стосовно прказника тварин, яким вводили L_тирозин (вихідні показники - 5,63±0,07 нМ/л та 120,9±2,7 нМ/г, відповідно). В обох групах тварин відмічалося підвищення вмісту нітритів як у плазмі крові, так і в гомогенатах надниркових залоз, на тлі активації NO-синтази.

Характеристика ендокриноцитів медулярної зони надниркових залоз щурів при експериментальному цукровому діабеті та з введенням модуляторів синтезу катехоламінів. Багаторазове введення L_тирозину тваринам при експериментальному цукровому діабеті призводило до збільшення щільності ендокриноцитів мозкового шару надниркових залоз на 6 % (p_St<0,05) стосовно показника тварин із діабетом, який складав 7164±118 мм². Зміни відмічалися на тлі зменшення діаметру ядра на 4 % (p_St<0,05) та підвищення вмісту РНК у клітинах на 7 % (p_St<0,05); вихідні показники тварин із діабетом - 5,23±0,05 мкм та 328±3 мО_ОЩ, відповідно. У тварин при діабеті після введення б_метил_L_тирозину відмічалося зменшення щільності ендокриноцитів на 7 % (p_St<0,05) стосовно показника в щурів із введенням L_тирозину (вихідний показник - 7636±209 мм²). Діаметр ядра клітин вірогідно збільшувався стосовно показника щурів при діабеті та з введенням L_тирозину (на 5 % і 9 %) (p_St<0,05); вихідні показники складали 5,23±0,05 і 5,03±0,03 мкм, відповідно. Крім того, спостерігалося підвищення концентрації РНК у клітинах на 32 % (p_St<0,05), стосовно показника тварин із цукровим діабетом (вихідний показник - 328±3 мО_ОЩ) та на 36 % (p_St<0,05) у порівнянні з показником щурів із введенням L_тирозину (вихідний показник - 354±1 мО_ОЩ).

ВИСНОВКИ

В дисертації встановлені основні закономірності участі катехоламінергічної системи надниркових залоз у патогенезі початкового періоду розвитку цукрового діабету, а також вплив модуляторів синтезу моноамінів на перебіг цукрового діабету в щурів.

1. Гостра гіпоглікемія, зумовлена стрептозотоцин-індукованою загибеллю бета-клітин та гіперінсулінемією на першу добу розвитку експериментального діабету, призводить до підвищення функціональної активності катехоламінергічної системи надниркових та підшлункової залоз, про що свідчить високий вміст адреналіну та норадреналіну в гомогенатах залоз та підвищена концентрація цих гормонів у плазмі крові.

2. Розвиток експериментального цукрового діабету в щурів супроводжується підвищенням у крові концентрації кортизолу, катехоламінів і стабільних метаболітів NO, посиленням як спонтанної, так і стимульованої окислювальної модифікації білку, віддзеркалюючи стресорний характер реакції надниркових залоз на розвиток патологічного процесу.

3. Початковий період розвитку експериментального цукрового діабету супроводжується фазною динамікою змін концентрації біогенних амінів у плазмі, надниркових та підшлунковій залозах із домінуванням вмісту адреналіну в пулі катехоламінів, який негативно корелює (r = _0,82) з рівнем глікемії. Формування гіперглікемії при діабеті супроводжується деяким зменшенням вмісту моноамінів у надниркових залозах, а її динаміка характеризується зворотньою кореляційною залежністю з щільністю с_Fos-імунопозитивних ендокриноцитів мозкового шару надниркових залоз (r = _0,99) та концентрацією в них білку с-Fos (r = _0,8).

4. Початковий період розвитку експериментального діабету супроводжується збільшенням щільності ендокриноцитів пучковї та сітчастої зон коркового шару надниркових залоз, зростанням у них концентрації РНК та підвищенням рівня кортизолу в крові. При цьому спостерігається висока кореляційна залежність між концентрацією білку с_Fos в ендокриноцитах коркового шару надниркових залоз та концентрацією глюкози (r = + 0,71) та інсуліну (r = _ 0,92) в крові.

5. Введення протягом десяти днів попередника синтезу моноамінів L_тирозину інтактним щурам призводить до збільшення концентрації адреналіну та норадреналіну в крові, а також підвищення концентрації глюкози до верхніх порогових значень норми. В той же час, введення L-тирозину тваринам при діабеті не впливає на рівень глюкози та інсуліну в крові, але сприяє зниженню концентрації адреналіну та норадреналіну та виснаженню пулу катехоламінів у надниркових залозах.

6. Введення протягом десяти днів блокатора синтезу катехоламінів б_метил_L_тирозину інтактним тваринам та при діабеті пригнічує синтез моноамінів у надниркових залозах і призводить до зниження сумарного пулу катехоламінів у залозах та плазмі крові, що поєднується з вірогідним зниженням рівня глікемії та підвищенням концентрації інсуліну в крові.

катехоламін індукований цукровий діабет

ЛІТЕРАТУРА

Колычева Н.Л. Окислительная модификация белков плазмы крови крыс с экспериментальным сахарным диабетом / Н.Л. Колычева // Актуальні питання фармац. та мед. науки та практики: зб. наук. ст. - Запоріжжя, 2008. - Вип. ХХІ, т. 2: клінічна медицина. - С.101-104.

Абрамов А.В. Особенности биосинтеза белка c-Fos и катехоламинов эндокриноцитами мозгового вещества надпочечных желез при сахарном диабете / А.В. Абрамов, Н.Л. Колычева, Ю.М. Колесник // Патологія. - 2008. - Т. 5, № 1. - С. 68-71. (Дисертантка вивчила особливості біосинтезу білку c-Fos та катехоламінів ендокриноцитами мозкового шару надниркових залоз при цукровому діабеті).

Колычева Н.Л. Особенности содержания катехоламинов в надпочечных и поджелудочной железах крыс с экспериментальным сахарным диабетом / Н.Л. Колычева, А.В. Абрамов // Патологія. - 2008. - Т. 5, № 3: матеріали V Нац. Конгресу патофізіологів України з міжнар. участю «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів», 17_19 вересня 2008 р. - С. 15-17. (Дисертантка вивчила вміст катехоламінів у надниркових залозах щурів із експериментальним цукровим діабетом, підготувала статтю до друку).

Колычева Н.Л. Особенности синтеза монооксида азота и гормонов надпочечных желез при сахарном диабете / Н.Л. Колычева, Ю.М._Колесник, А.В. Абрамов, О.В. Ганчева // Запорож. мед. журн. - 2008. - № 3. - С. 5-8. (Дисертантка проаналізувала літературні дані, вивчила особливості синтезу монооксиду азоту та гормонів надниркових залоз щурів при цукровому діабеті).

Количева Н.Л. Стан окислювальної модифікації білку в надниркових залозах щурів з експериментальним цукровим діабетом / Н.Л. Количева, А.В._Абрамов // Клініч. та експерим. патологія. - 2008. - Т. VII, № 3. - С._71- 73. (Дисертантка самостійно провела біохімічні дослідження, аналіз та статистичну обробку результатів, підготувала статтю до друку).

Колычева Н.Л. Влияние индукторов синтеза моноаминов на продукцию катехоламинов при сахарном диабете / Н.Л. Колычева, О.В. Ганчева // Запорож. мед. журн. - 2008. - № 5. - С. 31-34. (Дисертантка проаналізувала літературні дані, виконала експериментальну частину, вивчила вплив індукторів синтезу моноамінів на продукцію катехоламінів при цукровому діабеті).

Колычева Н.Л. Морфофункциональная характеристика эндокриноцитов коркового вещества надпочечных желез крыс с экспериментальным сахарным диабетом / Н.Л. Колычева, А.В. Абрамов // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 82- 86. (Дисертантка самостійно провела гістохімічні та морфометричні дослідження, проаналізувала результати, провела статистичну обробку даних).

Количева Н.Л. Характеристика окислювальної модифікації білку в підшлунковій залозі щурів з експериментальним цукровим діабетом / Н.Л._Количева // Укр. мед. альманах. - 2008. - Т. 11, № 6. - С. 88- 89.

Абрамов А.В. Влияние индукторов синтеза моноаминов на морфофункциональное состояние мозгового слоя надпочечников при сахарном диабете / А.В. Абрамов, Н.Л. Колычева, Г.И. Бессараб // Патологія. - 2008. - Т. 5, № 4. - С. 18- 21. (Дисертантка проаналізувала літературні дані, виконала експериментальну частину, вивчила вплив модуляторів синтезу моноамінів на стан ендокриноцитів мозкового шару надниркових залоз, підготувала статтю до друку).

Пат. України на корисну модель № 11450, G01N33/48. Спосіб визначення адреналіну та норадреналіну в одній пробі біологічного матеріалу / Ю.М._Колесник, І.Ф. Бєленічев, А.В. Абрамов, О.В. Ганчева, Н.В._Бухтіярова, Н.Л. Количева, С.В. Павлов. - № u200506909; заявл. 13.07.05; опубл. 15.12.05, Бюл. № 12. (Дисертантка особисто провела патентний пошук, брала участь у постановці методики).

Пат. України на корисну модель № 13132, G01N33/48. Спосіб визначення вмісту ферменту NO-синтази в гомогенатах тканин / Ю.М. Колесник, І.Ф._Бєленічев, А.В. Абрамов, О.В. Ганчева, Н.В. Бухтіярова, Н.Л._Количева, С.В. Павлов. - № u200509119; заявл. 27.09.05; опубл. 15.03.06, Бюл. № 3. (Дисертантка особисто провела патентний пошук, брала участь у постановці методики).

Количева Н.Л. Роль катехоламінергічної системи надниркових залоз в індукції цукрового діабету І типу / Н.Л. Количева, А.В. Абрамов, О.В._Ганчева // Матеріали VII з'їзду ендокринологів України, Київ, травень 2007. - К., 2007. - С._116.

Колычева Н.Л. Зависимость образования оксида азота и секреции катехоламинов от функциональной активности адренорецепторов / Н.Л._Колычева, А.В. Абрамов, И.Ф. Беленичев // Запорож. мед. журн. - 2005. - №3: матеріали всеукр. наук.-практ. конф. з міжнар. представництвом «Нейроендокринні і імунні механізми регуляції гомеостазу в нормі та патології», 18-19 травня 2005 р. - С. 110.

Колычева Н.Л. Модификация белков плазмы крови при экспериментальном сахарном диабете у крыс / Н.Л. Колычева, А.В. Абрамов // Експериментальна та клінічна ендокринологія від теорії до практики (Шості Данилевські читання): матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю, Харків, 22-23 лютого 2007р. - Х., 2007. - С. 63 - 64.

Количева Н.Л. Експресія транскрипційного фактору c - fos у гландулоцитах мозкового шару надниркових залоз щурів з експериментальним цукровим діабетом / Н.Л. Количева, А.В. Абрамов // Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи (Сьомі Данилевські читання): матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю, Харків, 21-22 лютого 2008р. _Х., 2008. - С. 84-85.

Колычева Н.Л. Влияние многократного введения L - тирозина на синтез катехоламинов при экспериментальном сахарном диабете / Н.Л. Колычева // Фундаментальна та клінічна ендокринологія: проблеми, здобутки, перспективи (Восьмі Данилевські читання): матеріали наук.-практ. конф. з міжнар. участю, Харків, 22-23 лютого 2009р. _Х., 2009. - С. 69-70.

Размещено на Allbest.ru