Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ОДЕСЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

14.03.05 -- фармакологія

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ФАРМАКОКІНЕТИКА ПОХІДНИХ ТІОБАРБІТУРОВОЇ КИСЛОТИ

КАРПИНЧИК НАТАЛІЯ ЛЕОНІДІВНА

Одеса -- 2009

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Пошук нових лікарських засобів (ЛЗ), яким притаманні висока ефективність фармакологічної дії і найменші побічні ефекти, залишається основним завданням експериментальної фармакології та медичної хімії [Головенко Н. Я., 2004; Машковский М. Д., 2008]. Успішним результатом у даному напрямі є синтез нового похідного пропілтіобарбітурової кислоти -- 2-(-діетиламіно)-етилмеркапто-5-ізопропіл-3,4-дигідропіримідино-6-он-4-ол гідрохлориду (сполука I), що має низьку токсичність і виразний антигіпоксичний та антиоксидантний ефекти в умовах гіпоксії різної етіології [Плотников М. Г. и соавт., 1988; Богатский А. В. и соавт., 1993; Николаев В. И. и соавт., 1999]. Необхідність використання лікарських препаратів, що мають даний фармакологічний спектр, зумовлена, по-перше, тим, що гіпоксичний синдром відіграє ключову роль у розвитку різних захворювань, у тому числі екстремальних станів, а також виникає у специфічних умовах роботи людини (високогір'я, низькі та високі температури тощо) [Fyles A. et al., 2002; Cheng D. et al., 2007]. По-друге, багатоспрямованість структурно-функціонально-метаболічних пошкоджень при гіпоксії (порушення енергетичного метаболізму, антиоксидантно-прооксидантної рівноваги, синтезу похідних арахідонової кислоти, вуглеводного обміну тощо) зумовлює необхідність застосування ЛЗ із багатогранною фармакодинамікою, які здатні одночасно корегувати різні ланки патогенезу цього патологічного стану [Савченкова Л. В., 1998; Michiels C. et al., 2002; Лук'янчук В. Д. і співавт., 2007; Yeung H. M. et al., 2007]. Незважаючи на достатньо великий арсенал лікарських препаратів з антигіпоксичною дією (біофлавоноїди, похідні ксантину, блокатори кальцієвих каналів, ноотропи та ін.), фармакотерапія гіпоксичних станів недостатньо ефективна [Беневольская Н. Г. и соавт., 2004; Frede S. et al., 2007]. У зв'язку з цим розробка нового антигіпоксанту -- похідного пропілтіобарбітурової кислоти -- актуальною і доцільною.

Експериментальна оцінка фармакокінетики нових потенційних ліків -- обов'язковий етап їх доклінічного дослідження [Стефанов О. В., 2001]. Вивчення фармакокінетичного профілю досліджуваних сполук та їх метаболітів дозволяє встановити перспективні шляхи і способи введення біологічно активної речовини (БАР), обрати орієнтовну схему дозування і прогнозувати спектр її фармакологічної та токсичної дії [Boroujerdi M., 2002; Gibaldi M., 2006]. Інформація, отримана на даному етапі, є обов'язковою передумовою для подальшого вивчення на пацієнтах у клініці [Danhof M. et al., 1993; Smith D. A. et al., 2000]. Невід'ємний елемент цього етапу дослідження БАР -- адекватне математичне моделювання фармакокінетичних процесів, отже, подальша розробка математичних методів [Theil F., 2003; Головенко Н. Я., 2004]. Незважаючи на існування сьогодні достатньо простих регресійних методів оцінки масопереміщення БАР у системі «кров - тканина» [Зіньковський В. Г. і співавт., 2008; Годован В. В. і співавт., 2008], деякі питання залишаються нерозв'язаними. Так, сучасний математичний апарат не пристосовано до виявлення і кількісної оцінки внеску в загальну кінетичну схему «швидких» процесів розподілу БАР, внаслідок чого їх наявність ігнорується. Подальша розробка дискримінаційних і регресійних методів їх аналізу дасть можливість підвищити ефективність інтерпретації дослідних даних і може послужити основою для вивчення механізмів цих явищ. Все вищевикладене зумовлює актуальність досліджень у даному напрямі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертації є фрагментами науково-дослідної роботи кафедри фізіології людини та тварин Одеського національного університету (ОНУ) ім. І. І. Мечникова МОН України за темою «Вивчення можливостей використання препаратів синтетичного і природного походження, фізичних і хімічних факторів, що впливають на компенсаторні й адаптаційні системи організму» (№ держреєстрації 0106V001680). Дисертант є співвиконавцем цієї теми.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягає в експериментальному визначенні фармакокінетичного профілю оригінальної біологічно активної речовини -- похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів.

Для досягнення зазначеної мети вирішувалися такі задачі:

1. Розробити й оптимізувати систему методів кількісного визначення похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів у біологічних середовищах іn vіtro та іn vіvo.

2. Вивчити основні шляхи метаболізму досліджуваної сполуки в організмі експериментальних тварин різних видів (миші, щури).

3. На підставі позамодельного аналізу визначити особливості процесів розподілу похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів у організмі тварин й з'ясувати видові (миші, щури) відмінності їх масопереміщення.

4. Розробити методи аналізу «швидких» процесів розподілу, за допомогою яких оцінити внесок цих процесів у загальну кінетичну схему масопереміщення досліджуваних сполук у системі «кров тканина».

5. Провести порівняльну характеристику розподілу пропілтіобарбітурату та його основного метаболіту в організмі тварин.

6. Вивчити процеси екскреції пропілтіобарбітурату з організму щурів та мишей і з'ясувати їх видові особливості.

7. У порівняльному аспекті відзначити відмінності процесів виділення пропілтіобарбітурату та його основного метаболіту з організму тварин.

Об'єкт дослідження: пошук і створення нових високоефективних антигіпоксантів.

Предмет дослідження: встановлення особливостей процесів розподілу, біотрансформації і виведення оригінального похідного пропілтіобарбітурової кислоти з антигіпоксичною активністю в експерименті.

Методи дослідження: фармакокінетичні, радіометричні, математичні, статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджена кінетика екстракції похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів із біологічних субстратів залежно від рн середовища в експериментах in vitro та in vivo. Розраховано метрологічні характеристики двофазової екстракції, що стало передумовою вивчення кількісних аспектів процесів біотрансформації досліджуваної сполуки.

Вперше вивчено процес метаболізму оригінального похідного пропілтіобарбітурату в організмі тварин. Встановлено, що дана сполука в організмі щурів і мишей піддається значній біотрансформації з утворенням 5-ізопропілтіобарбітурової кислоти (сполука II) і 5-ізопропілбарбітурової кислоти (сполука III). Вперше з'ясовано особливості процесів біотрансформації цих сполук у різних видів тварин, які проявляються тільки кількісними відмінностями.

Вперше проведено порівняльний аналіз кінетичних схем процесів розподілу похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів у органах і тканинах мишей і щурів, визначено позамодельні параметри, що характеризують процеси масопереміщення сполук у системі «кров тканина». Встановлено відмінності у розподілі вихідної сполуки (пропілтіобарбітурату) та її основного метаболіту -- ізопропілтіобарбітурової кислоти в організмі тварин.

Вперше розроблено і використано метод визначення наявності та внеску «швидких» процесів у кінетичну схему розподілу БАР. Проведена порівняльна оцінка ефективності даних процесів у мишей і щурів при введенні їм сполуки I та її метаболіту -- сполуки II. За цими даними отримано висновок про видачу патенту України з міжнародною участю «Спосіб визначення наявності та параметрів швидких процесів розподілу лікарських засобів між кров'ю і тканинами організму» (заявл. № u200814214 від 10.12.2008 р.).

Вперше визначено характеристики процесів екскреції досліджуваної БАР та її метаболітів з організму щурів і мишей. Порівняльний аналіз показників виведення вихідної сполуки та її метаболітів, а також видових відмінностей виділення цих речовин дозволив встановити загальні закономірності, що визначають інтенсивність процесів екскреції сполук з організму тварин, їх середній час утримання в усій біологічній системі, позитивно характеризують фармакокінетичний профіль нового потенційного ЛЗ.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані експериментальні дані щодо фармакокінетики оригінального похідного пропілтіобарбітурової кислоти дозволяють у подальшому розробити оптимальну лікарську форму, дозовий режим, визначити можливість раціонального комбінування з іншими ЛЗ. Встановлені закономірності й відмінності фармакокінетичного профілю біотрансформації, розподілу і виведення вихідної сполуки та її метаболітів є основою для подальшого вивчення їх фармакодинамічних ефектів, прогнозування можливих механізмів дії, впровадження в клінічну практику.

Виявлені особливості фармакокінетики досліджуваної БАР у різних видів тварин розширюють уявлення про генетичну детермінованість фармакокінетичних процесів і є передумовою для більш точної екстраполяції експериментальних даних на організм людини.

Розроблено нові методи математичного аналізу «швидких» процесів розподілу сполук в організмі, які дозволяють оцінити їх внесок у фармакокінетичні процеси, отже, підвищити точність і вірогідність фармакокінетичних досліджень.

Отримані результати впроваджено у науковий і навчальний процес кафедри загальної і клінічної фармакології Одеського державного медичного університету, кафедр фармакології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова, Дніпропетровської державної медичної академії, в наукову роботу Опольського університету (Польща).

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено патентно-інформаційний пошук, визначено мету, задачі й алгоритм дослідження, опрацьовані дослідні моделі, проведено експериментальні дослідження. Виконано статистичну обробку результатів, оформлення таблиць і рисунків, сформульовано висновки, опубліковано основні результати роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи були оприлюднені на міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених «Вчені майбутнього» (Одеса, 2005), ІІІ Національному з'їзді фар-макологів України «Фармакологія-2006 -- крок у майбутнє» (Одеса, 2006), 4-й міжнародній конференції «Биологические основы индивидуальной чувстви-тельности к психотропным средствам» (Москва, 2006), Thirteenth National Conference “Applications of Mathematics in Biology and Medicine” (Serpelice nad Bugiem, 2007).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 праць, із них 4 статті у профільних наукових журналах, ліцензованих ВАК України, 1 позитивний висновок про видачу патенту України, 4 -- тези доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційну роботу викладено на 128 сторінках комп'ютерного тексту. Вона складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів, висновків, списку використаної літератури. Роботу ілюстровано 16 таблицями, 30 рисунками. Бібліографія містить 184 джерела, у тому числі 41 вітчизняне і російськомовне, 143 - іноземних.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У роботі використовувались радіоактивні аналоги сполук: ¹⁴С-2-(-діетиламіно)-етилмеркапто-5-ізопропіл-3,4-дигідропіримідино-6-он-4-ол гідрохлорид (сполука І), 2-¹⁴С-5-ізопропіл-2-тіобарбітурова кислота (сполука ІІ), синтезовані під керівництвом к. х. н. С. Г. Соболєвої у проблемній науково-дослідній лабораторії № 5 ОНУ ім. І. І. Мечникова. Визначення питомої активності та радіохроматографічної чистоти синтезованих зразків виявило високий ступінь їх чистоти (99,6 %); питома активність сполук I і II становила 0,77 і 1,0 Ci/mol відповідно. Як мітчик використовувався можливий метаболіт сполуки ІІ -- 5-iзопропіл-2-барбітурова кислота (сполука ІІІ).

Досліди були проведені на 84 нелінійних мишах-самцях масою 18-25 г та 112 білих щурах лінії Вістар масою 180-220 г розведення віварію Одеського державного медичного університету. Досліди проводилися відповідно до вимог GLP, методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України Стефанов О. В., 2001 та комісії з біоетики ОНУ ім. І. І. Мечникова (протокол № 1 від 15.12.2008 р.).

Для оптимізації процесів вилучення загального радіоактивного матеріалу й окремих метаболітів сполуки І із біосубстратів була вивчена кінетика рн-залежної рідин-рідинної екстракції хлороформом із водної фази (сечі) вільних метаболітів у дослідах іn vіtro [зиньковский В. Г. и соавт., 1983], що дозволило здійснити іn vіvo селективний витяг основних груп метаболітів сполуки І із заданим ступенем точності та наступну зонну радіохроматографію її окремих метаболітів [Головенко Н. Я. и соавт., 1999; Slater R. J., 2002].

Досліджувані сполуки вводили внутрішьоочеревинно (в/о) в ізотонічному розчині натрію хлориду. При вивченні процесів розподілу досліджуваних сполук в організмі мишей і щурів через 0,25; 1; 2; 4; 6; 8 і 24 год після введення їм сполук І і ІІ дозою 50 мг/кг відбирали зразки органів і тканин для визначення загального вмісту радіоактивного матеріалу. Для вивчення процесів екскреції сполуки І та її метаболітів з організму тварин вводили речовини однократно в/о дозою 100 мг/кг щурам і 50 мг/кг -- мишам. Відбір сечі і калу проводився одноразово на добу протягом 5 діб за методикою [зиньковский В. Г. и соавт., 1983]. Визначення [¹⁴С]-продуктів у досліджуваних біосубстратах проводили на сцинтиляційному фотометрі “Trі Carb 2700 TR” фірми “Сambera Pakkard” (США).

Розрахунок параметрів розподілу досліджуваних сполук здійснювали з використанням методів позамодельного аналізу [Gibaldi M., 1999; Зіньковський В. Г., Щукін С. І., 2005; Годован В. В., 2008]. Площі під фармакокінетичними концентраційними кривими розраховували за методами трапецій і статистичних моментів [Boroujerdi M., 2002].

Усі отримані результати обробляли загальноприйнятими в медико-біологічних дослідженнях методами статистичного аналізу з використанням стандартних пакетів комп'ютерних програм Гланц С., 1999.

Результати дослідження та їх обговорення. Розробка методів екстракції похідних тіобарбітурату з біологічних середовищ і вивчення їх основних шляхів метаболізму в організмі тварин. Розроблено й оптимізовано методи вилучення, радіохроматографічного аналізу і визначення сполуки І та її метаболітів у біологічних субстратах. Метрологічні характеристики кінетики екстракції радіоактивного матеріалу з біосубстратів тварин у модельних експериментах дозволили виконати оптимізацію їх кількісного визначення у сечі щурів і мишей, що є необхідною умовою для вивчення процесів біотрансформації досліджуваних сполук. Зонний радіохроматографічний аналіз виділених вільних метаболітів дозволив визначити основні шляхи біотрансформації як вихідної сполуки, так і основного її метаболіту -- ізопропілтіобарбітурової кислоти (рис. 1). У процентному співвідношенні від введеної дози протягом 24 год у сечі щурів було виявлено близько 60 % вихідної сполуки, близько 30 % ізопропілтіобарбітурової кислоти (сполуки II) і 5 % ізопропілбарбітурової кислоти (сполуки III). На відміну від процесів біотрансформації сполуки II в організмі щурів, для аналогічних процесів у мишей характерним є практично повне перетворення вихідної сполуки на ізопропілбарбітурову кислоту. Це припускає ідентичну схему біотрансформації ізопропілтіобарбітурату, а видова відмінність полягає тільки у кількісних аспектах утворення метаболітів.

Фармакокінетика процесів розподілу сполуки І і продуктів її біотрансфор-мації при введенні мишам. Вивчення процесів фармакокінетики сполуки І у мишей показало, що для розподілу похідного пропілтіобарбітурату та його метаболітів характерна різна динаміка процесів надходження в органи і тканини й елімінації.

Процес надходження вихідної сполуки та її метаболітів завершується протягом 1-го інтервалу відбору проб (30 хв) тільки у печінці та плазмі крові тварин. Серце і головний мозок мишей можна вважати органами із середнім часом надходження сполуки I: фаза абсорбції завершується протягом 2 год експерименту. Для третьої групи органів характерний достатньо тривалий процес надходження БАР: для селезінки і жирової тканини даний процес становить 4 год, для нирок -- 8 год. Аналіз процесів розподілу виявив високу швидкість елімінації загальної радіоактивності з печінки мишей в інтервалі 1-8 год. У даному проміжку часу вміст сполуки I та її метаболітів зменшується, порівняно з максимальним, приблизно у 60 разів, проте від 8 до 24 год експерименту процес виведення сполуки є найповільнішим -- константа швидкості елімінації є найменшою серед усіх досліджених процесів (0,009 год^-1).

Визначення характеристичної величини першого крайового моменту (MRT) розподілу сполуки I в «i-тому» компартменті кінетичної схеми показало, що для плазми крові, нирок, селезінки і серця величина MRT коливається від 12 до 22 год, для жирової тканини -- 43 год. Найповільніші процеси виділення загальної радіоактивності виявлено для печінки та головного мозку. Даний показник дорівнює 69 і 92 год відповідно. Зіставлення таких параметрів процесів розподілу сполуки I між плазмою крові та головним мозком, як рівноважної константи розподілу (К_р), величини питомого дифузійного потоку сполуки з крові в одиницю об'єму досліджуваного компартмента (q_i), константи швидкості зворотного масопереміщення сполуки з органа в кров (k_i1), свідчить, що для транспорту сполуки І у даній системі є характерним повільний процес як надходження, так і виведення з головного мозку.

Величини MRT практично аналогічні характеристичним часам (1/k_e) найповільнішим із спостережуваних процесів елімінації для всіх досліджених органів і тканин, за винятком печінки. Це свідчить про те, що для опису процесів перерозподілу похідного пропілтіобарбітурату та його метаболітів у системі «кров - тканина» адекватна проста одночастинна модель зі всмоктуванням, незважаючи на складнішу кінетичну схему даних процесів. Це можливо, якщо кінетична крива «вироджена» внаслідок присутності у схемі повільнішого процесу, ніж інші, що лімітує швидкість масопереміщення речовини (k_e). Підтвердженням цього є розраховані величини дискримінаційного критерію (ДК 1) і критерію складності кінетичної схеми (N 1). Кінетична схема, що описує процеси розподілу загальної радіоактивності у системі «кров - печінка», є складною комбінованою моделлю.

Для оцінки фармакокінетичних параметрів процесів розподілу досліджуваної сполуки було проведено їх позамодельне моделювання, що дозволяє здійснити аналіз масопереміщення БАР в організмі на підставі незалежної від структури кінетичної схеми [Smith D. A., 2000; Головенко Н. Я., 2004]. За результатами, отриманими методом визначення константи рівноваги (К_Р) процесів розподілу БАР на підставі регресійного аналізу [Годован В. В., 2006; Zinkovsky V. G. et al., 2007], розподіл сполуки I є лінійним для всіх досліджених органів і тканин, за винятком печінки, де відсутня пропорційність між вмістом сполуки I у крові і в даному органі (рис. 2). Для нирок даний параметр вищий за аналогічні показники інших досліджених органів і тканин більш як у 10 разів, що може свідчити про високу тропність до даної тканини вихідної сполуки або її метаболіту -- сполуки ІІ, яка є більш водорозчинною речовиною. Найменше значення К_р відмічено для головного мозку та жирової тканини.

Виявлена нелінійність процесів масопереміщення у системі «кров - пе-чінка» дозволила припустити, що, окрім зворотних процесів першого порядку, в біосистемі відбуваються «швидкі» процеси надходження БАР у периферичні компартменти. Швидкий процес можна визначити як такий, характеристичний час якого на кілька порядків менший найменшого інтервалу часу досліду (вимірювання концентрацій БАР у досліджуваних біосубстратах) і характеристичних часів усіх інших аналізованих процесів.

Для встановлення наявності та кількісної оцінки внеску (відносної ефективності) «швидких» процесів надходження речовин у загальну кінетичну схему процесів їх розподілу нами розроблено нові методи на підставі дискримінаційного і регресійного аналізу, що дозволяють досліджувати характер часових змін відношення інтеграла концентрації БАР у тканині до її концентрації у крові. За допомогою запропонованих методів доведено наявність «швидких» процесів тільки у системі «кров (1) « печінка (і)» тварин. Характерною особливістю процесів розподілу сполуки І між кров'ю та печінкою серед досліджених органів є найменша як величина константи розподілу, так і сума

констант швидкості масопереміщення БАР із компартмента (i) в (1) та її елімінації. Необхідно відмітити, що перевагою цих методів є можливість визначення параметрів при нелінійних процесах розподілу.

Наявність «швидких» процесів у системі «кров - печінка» може бути пояснена явищем первинного проходження всієї дози речовини через печінку або особливостями транспорту сполуки в органи і тканини відкритою (проточною) лімфатичною системою при їх в/о введенні. Цей механізм пояснює необоротність «швидких» процесів.

Фармакокінетика процесів розподілу сполуки І і продуктів її біотрансформації при введенні щурам. Процеси розподілу загальної радіоактивності в організмі щурів при в/о введенні похідного пропілтіобарбітурату продемонстрували істотні відмінності порівняно з аналогічними процесами у мишей. Аналіз кінетики надходження і розподілу сполуки І та її метаболітів у організмі щурів дозволив виділити дві групи процесів: 1) швидкі процеси надходження і перерозподілу (протягом 30 хв експерименту) перебігають у нирках, печінці, селезінці, легенях і жировій тканині; 2) більш повільні процеси абсорбції і перерозподілу -- у плазмі крові та головному мозку.

Визначення рівноважної константи розподілу (К_Р) продемонструвало також інші закономірності порівняно з аналогічними процесами у мишей. Так, даний параметр для всіх досліджених органів і тканин приблизно однаковий, за винятком К_р для процесів в системі «кров - головний мозок», де відмічена найменша тропність до сполуки І. Екскреторні органи (печінка і нирки) характеризуються ідентичними значеннями даного показника (1,7), тоді як для мишей тропність ниркової тканини до сполуки І та її метаболітів порівняно з печінкою більша ніж у 40 разів. Не відмічено у щурів і нелінійності процесів обміну маси сполуки І між печінкою і кров'ю, яка характерна для даної системи у мишей.

Значення MRT сполуки І та її метаболітів у всіх досліджених органах і тканинах щурів, за винятком плазми крові, порівнянне з величиною зворотної константи елімінації на термінальній ділянці. Отже, дані фармакокінетичної кривої є «виродженими», що дозволяє описати процеси простою одночастинною моделлю. Оцінка складності кінетичної схеми (N) для головного мозку, легенів, селезінки і екскреторних органів наближається до 1, що також підтверджує гіпотезу про виродженість кінетичних кривих розподілу сполуки в організмі. Для процесів розподілу в плазмі крові та жировій тканині, виходячи з даного показника, кінетична схема процесів є складнішою -- як мінімум, це двочастинна модель.

Використання розробленого раніше методу визначення абсолютної до-ступності ЛЗ до тканин організму (W_ai) [Годован В. В. та співав., 2007] дозволило визначити ступінь ізольованості тканин і ефективності дифузного потоку речовин із кров'яного русла до органів, а також існування або відсутність гістогематичного бар'єру. Виходячи з отриманих даних (табл. 1), найбільшою доступністю W_ai, а відповідно і величиною q_i характеризуються жирова тканина, селезінка й екскреторні органи (печінка і нирки).

Таблиця 1. Параметри транспорту сполуки I та її метаболітів між кров'ю і органами щурів

Найменші показники відмічено для легенів і головного мозку. В останньому випадку це дає можливість припустити істотний вплив гематоенцефалічного бар'єру на систему транспорту між кров'ю і головним мозком. Необхідно відзначити, що особливістю даних процесів є і вкрай низька швидкість зворотного надходження (k_i1) речовини з даного органа в кров.

Дискримінаційний метод аналізу процесів розподілу сполуки I в системі «кров - органи (тканини)» продемонстрував наявність «швидких» процесів практично для всіх досліджених органів. Результати аналізу показали, що кількість сполуки І, яка надійшла в одиницю об'єму «i-того» компартмента (печінки і нирок) внаслідок «швидкого» процесу (C_i,0), і сума всіх процесів його масопереміщення (q_i) приблизно рівні (C_i0/_qi 1), отже, практично вся кількість вихідної БАР надходить в них внаслідок «швидкого» процесу в інтервалі, що передує 0,5 год часу експерименту. Для аналогічних процесів у системі «кров - головний мозок» співвідношення величин C_i0/_qi дорівнює 0,192, що демонструє неістотний вплив «швидких» процесів у даній системі на кінетику масопереміщення сполуки.

Для оцінки безпеки ЛЗ істотне значення має визначення параметрів їх незворотного зв'язування з біосубстратами. Проведений аналіз дослідних даних свідчить про відсутність процесів незворотного зв'язування сполуки І в організмі обох видів тварин.

Порівняльний аналіз параметрів процесу розподілу сполуки I та її основного метаболіту -- ізопропілтіобарбітурової кислоти (сполуки II) в організмі тварин показав, що кінетичні характеристики і фармакокінетична схема останньої істотно відрізняються від аналогічних параметрів вихідної сполуки. Для деяких органів (нирок, крові та плазми крові, селезінки і жирової тканини) процес надходження швидкий і завершується протягом півгодини експерименту. Проте швидка фаза зниження його концентрації після абсорбції характерна тільки для крові, плазми крові та селезінки. Для решти тканин з цієї групи процес перерозподілу та елімінації складніший. Так, для жирової тканини і головного мозку спостерігається незначна елімінація, і в подальші інтервали експерименту відбувається зростання загальної радіоактивності. Максимальний вміст загальної радіоактивності для жирової тканини спостерігається через 6 год, для головного мозку -- через 24 год експерименту.

Визначення тропності сполуки ІІ до тканин організму виявило іншу картину, ніж при введенні сполуки I. Так, пропілтіобарбітурова кислота та її метаболіт мають вищі значення рівноважної константи розподілу К_р для всіх досліджених органів і тканин, за винятком головного мозку (рис. 4).

Рис. 4. Графічна інтерпретація регресійного аналізу параметрів розподілу сполуки ІІ у системі «кров - тканина», що дозволяє визначити К_р (тангенс кута нахилу прямих)

Найбільша тропність до сполуки ІІ характерна для печінки (8,6), як і для сполуки I, проте даний параметр для тіобарбітурової кислоти є більшим ніж у 4 рази. Аналогічне значення К_р було визначено і для системи «кров - серцева тканина». Процес перерозподілу між кров'ю та іншим екскреторним органом -- нирками -- припускає складну кінетичну схему без виродженості фармакокінетичної кривої, що не дозволяє кількісно обчислити даний параметр, проте зміна в часі інтеграла вмісту загальної радіоактивності може служити непрямим доказом високої тропності сполук до даного органа. Константа рівноваги для решти органів приблизно однакова і лежить у межах від 3 до 4, що в кілька разів вище, ніж при введенні сполуки I (див. табл. 1, рис. 4).

Винятком у досліджених процесах є украй низький показник К_р для системи «кров - головний мозок», що свідчить про виражений вплив гематоенцефалічного бар'єру на масопереміщення сполуки ІІ. Величина MRT для всіх досліджених органів і тканин, крім головного мозку, коливається від 6 (серце) до 22 год (скелетні м'язи), що не допускає наявності відсіку повільного обміну і депонування досліджуваної сполуки та її метаболіту.

Аналіз наявності «швидких» процесів для сполуки ІІ не виявив їх, що іс-тотно відрізняє кінетичну схему розподілу даної БАР від вихідної сполуки. Визначення дискримінаційного критерію (ДК) і критерію складності кінетичної схеми (N) у системі «кров - органи» довело, що тільки для серцевої, жирової тканин, легенів і селезінки характерна виродженість процесів розподілу і проста модель транспорту маси. Для процесів у печінці, плазмі крові, м'язовій тканині та нирках кінетична схема може бути описана складною зірчастою або ланцюговою моделлю. Таким чином, оцінка процесів розподілу в системі «кров - органи» показала, що, на відміну від вихідної сполуки I, кінетична схема розподілу її основного продукту біотрансформації складніша і, можливо, визначається істотним впливом на вказані параметри її метаболіту -- пропілбарбітурової кислоти, яка має інші фізико-хімічні властивості.

Особливості виділення ізопропілтіобарбітурату з організму щурів. Вивчення процесів виведення нових БАР з організму тварин є одним із найважливіших етапів проведення доклінічних фармакокінетичних досліджень. Завдяки визначенню таких параметрів процесів виведення, як середній час утримання (MRT), константа швидкості екскреції (k_e), кількість виведеної сполуки при нескінченній експозиції (В_0-), кількісно оцінено процеси масопереміщення сполуки в організмі тварин. Дослідження процесів та обчислення параметрів виведення похідного пропілтіобарбітурату з сечею і калом щурів, як основними шляхами виділення сполуки, показали, що протягом 5 діб часу досліду з організму щурів вказаними шляхами виділилося (85,509,82) % введеної дози, що свідчить про практично повну екскрецію сполуки протягом періоду дослідження.

Характерною особливістю даного процесу є значно вища швидкість елімінації радіоактивного матеріалу з сечею тварин. Відносна ефективність процесу виведення з сечею становить 91 %. Елімінація ліпофільних метаболітів із калом за досліджений період дорівнює приблизно 8 % радіоактивних продуктів. Це дозволяє нехтувати даним процесом, і для опису кінетики процесів елімінації запропонувати одночастинну схему виведення з організму сполуки І та її метаболітів. Швидкість процесу виведення загальної радіоактивності з організму щурів у інтервалі досліду знижується моноекспоненційно.

Регресійний аналіз дослідних даних швидкостей екскреції нирками сполуки І з організму щурів виявив, що процес її виділення з сечею здійснюється з періодом напіввиведення (Т_1/2), що дорівнює 15,6 год, константою швидкості (k_e), що становить 0,046 год^-1, та даним шляхом виводиться близько 65 % введеної дози. Аналогічний аналіз сумарної екскреції (сеча + кал) ¹⁴С-продуктів з організму щурів не виявив вірогідних відмінностей від параметрів кінетики виведення з сечею, що припускає доцільність запропонованої кінетичної схеми виведення.

Визначення розрахункових меж коливання рівнів загальної радіоактивності в умовах тривалого введення БАР на основі її одноразового введення продемонструвало відсутність процесів накопичення: коливання вмісту в організмі протягом доби становили 70-170 % величини вихідної дози сполуки I.

Визначення величини MRT усієї системи на основі параметрів екскреції вихідної сполуки та продуктів її біотрансформації з організму різними шляхами з використанням запропонованих раніше методів [Зіньковський В. Г., 2007; Годован В. В., 2008] дозволяють охарактеризувати MRT БАР у всіх підсистемах біосистеми. Як видно з рис. 5, процеси виділення загальної радіоактивності шляхом ренальної та сумарної екскреції непаралельні (вплив незначного за величиною процесу виділення через гепатопортальну систему) і визначаються параметрами переважаючого шляху виділення. Середній час утримання сполуки І та її метаболітів для ренальної та сумарної екскреції практично ідентичні й дорівнюють відповідно 20,84 і 20,15 год. Величини MRT невеликі і лише трохи перевищують період напіввиведення (16-17 год), що дозволяє зробити висновок про достатньо високу швидкість виділення сполуки I з організму.

Визначення кількості виділеного продукту при нескінченній експозиції (В_0-?) показало, що дана величина для ренальної екскреції становила (69,33±4,57) %, з сечею і калом сумарно виділяється (80,47±8,95) % введеної дози.

Зіставлення кінетичних схем розподілу і виведення сполуки I з організму щурів виявило близькі за величинами значення постійних швидкостей повільної фази зниження вмісту БАР та її метаболітів в органах (тканинах) і постійної швидкості елімінації загальної радіоактивності з сечею.

Для процесів виділення сполуки I з організму мишей є характерним, як і для організму щурів, практично повне виділення всієї введеної дози в інтервалі часу досліду (табл. 2). Проте істотною відмінністю у мишей є різниця в ефективності виділення загальної радіоактивності з сечею і калом. Початкові швидкості процесів елімінації вірогідно не відрізняються (Р0,01), процеси перебігають моноекспоненційно і паралельно. Відносна ефективність процесу виділення сполуки I та її метаболітів із сечею та калом становить 0,51 і 0,47 відповідно. Прогноз накопичення сумарної радіоактивності в умовах тривалого щодобового введення сполуки, здійснений на підставі одночастинної кінетичної схеми виділення, показав, що її добове коливання при введенні послідовних доз дорівнює 49-149 % введеної дози.

Таблиця 2. Процеси накопичення загальної радіоактивності в екскретах мишей після одноразового введення сполуки І

Аналіз кінетики елімінації сполуки I для кожного дослідженого шляху виділення дозволив здійснити лінійний регресійний аналіз і визначити такі параметри, як MRT, кількість загальної радіоактивності, що виділилася, при нескінченній експозиції (В_0-?), швидкість даних процесів (k_e) (табл. 3).

Таблиця 3. Кінетичні параметри процесу виведення загальної радіоактивності з організму мишей при введенні сполуки I

Порівняльний аналіз отриманих величин для різних шляхів виділення сполуки І не виявив вірогідної різниці між ними (Р0,05). Як і для аналогічних процесів у щурів, Т_0,5 і MRT сумарної радіоактивності в організмі мишей не перевищує 1-ї доби, що свідчить про достатньо швидкий процес екскреції. При нескінченній експозиції розрахунки показали практично повне виділення всієї введеної дози (понад 90 %).

Таким чином, аналіз кінетики виділення сполуки I та її метаболітів з організму щурів і мишей показав, що дані процеси мають загальні закономірності: достатньо висока швидкість виділення сумарної радіоактивності й, у зв'язку з цим, невеликі значення Т_0,5 і MRT; невисокі показники добового коливання введеної дози і відсутність накопичення при можливому багатократному введенні; практично повне виділення всієї введеної дози з організму тварин протягом 5 діб експерименту.

Разом із тим, видові відмінності у біотрансформації сполуки I впливають на ефективність процесів екскреції різними шляхами. Для щурів утворення водорозчинних метаболітів обумовлює практично повне виділення дози ре-нальним шляхом. Для мишей характерна рівна ефективність виділення з калом і сечею, що допускає участь у даних процесах як ліпофільних, так і водорозчинних метаболітів.

Порівняльна характеристика екскреції метаболіту тіобарбітурату -- пропілтіобарбітурової кислоти з організму тварин показала, що характерною рисою кінетики його виділення є висока швидкість елімінації ¹⁴С-продуктів із сечею й калом протягом перших двох діб експерименту. Найбільш виражений даний процес при екскреції сполуки ренальним шляхом, де на 3-тю добу експерименту вміст ¹⁴ С-матеріалу визначається тільки в слідових кількостях.

Як для вихідної сполуки, так і для її метаболіту відмічена рівна ефективність процесів виведення сумарної радіоактивності з сечею і калом.

Результати аналізу кінетики процесу екскреції сполуки ІІ свідчать про високу швидкість виведення радіоактивного матеріалу: період напіввиведення коливається в межах 10-13 год, середній час утримання сполуки становить 17 год, що менше 1-го інтервалу дослідження -- 24 год. Оцінка кількості за- гальної радіоактивності, що виділилася, при нескінченній експозиції (B_0-?) показала, що тільки близько 50 % введеної дози виділяється з організму мишей, що може бути обумовлене подальшою біотрансформацією основного метаболіту сполуки II і, в зв'язку з цим, іншим шляхом його екскреції.

антигіпоксант фармакокінетичний пропілтіобарбітуровий кислота

ВИСНОВКИ

У дисертації наведене нове вирішення важливої наукової задачі фармакології, яке полягає у доклінічному визначенні фармакокінетичного профілю нового потенційного антигіпоксанту -- похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів.

1. Розроблено засновану на об'єднанні рH-залежних екстракцій і зони радіохроматографії систему методів препаративного й аналітичного виділення з біологічних субстратів, очищення й ідентифікації структури оригінального похідного пропілтіобарбітурової кислоти (сполуки І) та його метаболітів. Встановлено, що дана речовина в організмі щурів і мишей піддається значній біотрансформації з утворенням 5-ізопропілтіобарбітурової кислоти (сполука II) і 5-ізопропілбарбітурової кислоти (сполука III). Видова відмінність у тварин полягає тільки в кількісних аспектах утворення метаболітів.

2. У експериментах на мишах відзначено, що сполука І найбільш швидко надходить до плазми крові й печінки (протягом перших 30 хв), а найбільш тривало -- до селезінки, жирової тканини (4 год) й нирок (8 год). Величина MRT цієї БАР для більшості органів становить 12-22 год, а для жирової тканини, печінки і головного мозку -- відповідно 43, 69, 92 год. Позамодельний аналіз даних виявив найвищу (у 10 разів, ніж до інших органів) тропність сполуки І до тканини нирок, найменшу -- до головного мозку і жирової тканини. Характерною рисою процесів масопереміщення даної БАР між печінкою і кров'ю є їх нелінійність.

3. Кінетична схема розподілу сполуки I та її метаболітів для більшості органів і тканин мишей є простою одночастинною моделлю зі всмоктуванням; для головного мозку і нирок -- складною зірчастою; для печінки -- складною комбінованою. За допомогою вперше розроблених методів якісної та кількісної оцінки внеску «швидких» процесів надходження БАР у суму всіх процесів її масопереміщення між центральним і периферичними компартментами біосистеми доведено наявність цих процесів тільки у системі «кров - печінка», що зумовлює особливості кінетичної схеми розподілу сполуки І.

4. Процеси розподілу сполуки І для всіх вивчених органів і тканин щурів, за винятком плазми крові й головного мозку, мають схожі риси: процеси надходження завершуються протягом 1-го інтервалу дослідження (30 хв); практично вся кількість БАР надходить у органи внаслідок «швидкого» процесу в інтервалі, що передує 0,5 год часу експерименту; MRT становить 9-20 год; величина кількісної оцінки тропності (К_р) БАР до органів і тканин знаходиться в межах від 0,6 (для легенів) до 1,75 (для нирок). За винятком плазми крові та жирової тканини, кінетична схема розподілу сполуки І в організмі щурів описується простою одночастинною моделлю.

5. Характерною особливістю розподілу сполуки I в організмі обох видів тварин є істотний вплив на процеси масопереміщення у системі «кров - головний мозок» гематоенцефалічного бар'єру: дуже повільна швидкість її надходження й елімінації з органа в кров, що обумовлює низький вміст і високе значення MRT БАР. Незворотного зв'язування похідного пропілтіобарбітурату тканинами щурів і мишей не виявлено.

6. Порівняння фармакокінетичних параметрів сполуки I та її основного метаболіту -- ізопропілтіобарбітурової кислоти (сполуки II) демонструє істотні відмінності в їхніх кінетичних схемах: багатофазність розподілу сполуки II протягом часу дослідження, відсутність «швидких» процесів її надходження до органів, більш високу тропність до досліджених тканин, за винятком головного мозку.

7. Для кінетики виділення похідного пропілтіобарбітурової кислоти та його метаболітів з організму щурів і мишей відзначено загальні закономірності, незалежні від виду тварин: досить висока швидкість виділення сумарної радіоактивності (Т_0,5 15 год, MRT 22 год); невисокі показники добового коливання введеної дози (0,5-1,4); відсутність кумуляції при можливому багаторазовому введенні; практично повне виділення всієї введеної дози з організму тварин ( 90 %).

8. Видові відмінності у біотрансформації сполуки I впливають на ефективність процесів екскреції. Для щурів утворення водорозчинних метаболітів зумовлює практично повне виділення дози ренальним шляхом. Для мишей характерна однакова ефективність виділення з калом і сечею, що припускає залучення до даних процесів як ліпофільних, так і водорозчинних метаболітів.

9. Порівняльний аналіз процесів екскреції сполуки ІІ з організму тварин виявив такі її характеристичні риси: рівна ефективність і непаралельність процесів виведення із сечею й калом, висока швидкість (Т_0,5 і MRT менше 24 год) і двофазність процесів екскреції радіоактивних продуктів незалежно від шляху виділення, виведення тільки 50 % введеної дози, що може бути обумовлене подальшою біотрансформацією сполуки II.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Карпинчик Н. Л. Розробка методів екстракції з біологічних середовищ і вивчення метаболізму в організмі експериментальних тварин похідних тіо-барбітурової кислоти / Н. Л. Карпинчик, О. В. Жук // Одеський медичний журнал. -- 2007. -- № 3. -- С. 12-15. Внесок дисертанта -- проведення аналізу джерел літератури, досліджень, статистичної обробки й інтерпретації результатів, написання й оформлення статті.

2. Карпинчик Н. Л. Порівняльний аналіз розподілу ізопропілтіобарбітурату і його метаболіту -- ізопропілтіобарбітурової кислоти в організмі щурів / Н. Л. Карпинчик // Досягнення біології і медицини. -- 2008. -- № 2. -- С. 75-80.

3. Карпинчик Н. Л. Процеси розподілу тіобарбітурату в організмі мишей / Н. Л. Карпинчик, В. В. Годован // Одеський медичний журнал. -- 2008. -- № 6. -- С. 14-19. Внесок дисертанта -- проведення аналізу джерел літератури, досліджень, статистичної обробки та інтерпретації результатів, написання й оформлення статті.

4. Карпинчик Н. Л. Вивчення процесів виведення похідного тіобарбітурової кислоти з організму щурів / Н. Л. Карпинчик, В. В. Годован // Інтегративна антропологія. -- 2008. -- № 2. -- С. 36-39. Внесок дисертанта -- проведення експериментальних досліджень, статистична обробка й інтерпретація результатів, написання й оформлення статті.

5. Пат. Україна, МПК (2009) А61В 10/00. Спосіб визначення наявності та параметрів швидких процесів розподілу лікарських засобів між кров'ю і тканинами організму / О. В. Жук, В. Г. Зіньковський, Н. Л. Карпинчик, В. В. Годован, В. Й. Кресюн, К. Г. Лобашова; заявники та патентовласники Одес. держ. мед. ун-т і Опольськ. ун-т. -- № u200814214; заявл. 10.12.2008; висновок про видачу патенту від 23.01.2009 р. Внесок дисертанта -- проведення експериментів, статистичної обробки результатів, написання патенту.

6. Карпинчик Н. Л. Метаболізм і біокінетика адаптогену ізобарбаміду в організмі експериментальних тварин / Н. Л. Карпинчик // Вчені майбутнього: міжнар. наук.-практ. конф. молодих вчених, 18-19 жовт. 2005 р.: тези доп. -- Одеса, 2005. -- С. 27.

7. Карпинчик Н. Л. Розробка нового універсального методу визначення параметрів кінетики екскреції ксенобіотиків з організму на підставі модифікації методу Мансгельдорфа / О. В. Жук, В. Г. Зіньковський, Н. Л. Карпинчик // Фармакологія-2006 -- крок у майбутнє: ІІІ Нац. з'їзд фармакологів України, 17-20 жовт. 2006 р.: тези доп. -- Одеса, 2006. -- С. 57. Внесок дисертанта -- проведення аналізу джерел літератури, експериментів, статистичної обробки, аналізу й узагальнення результатів, написання й оформлення роботи.

8. Karpinchik N. L. Experimental pharmacokinetics of the psychotropic prodrugs -- izotiobarbamide / N. L. Karpinchik, E. A. Stankevich // Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам: 4-я междунар. конф., 13-16 марта 2006 р.: материалы. -- Москва, 2006. -- С. 111. Внесок дисертанта -- розробка методології експерименту, проведення досліджень, аналізу й узагальнення результатів, написання статті.

9. Karpinchik N. L. The method of separate determination of parameters of the fast irreversible and diffusion processes of xenobiotics mass transfer in the biosystem / V. G. Zinkovsky, O. V. Zhuk, M. Teodorczyk, N. Karpinchik // Applications of Mathematics in Biology and Medicine: Thirteenth National Conference, 18-22 September 2007: article. -- Serpelice nad Bugiem, 2007. -- P. 105-108. Внесок дисертанта -- проведення експериментів, математичних розрахунків результатів, написання статті.

Размещено на Allbest.ru