Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

УДК 618.396:612.112.94+576.8.097.3:615.373.3

03.00.09 - імунологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Антифосфоліпідні антитіла та їхня регуляція системою ідіотип-антиідіотип

Донський Борис Владиславович

Київ - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Державній установі "Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України".

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Чернишов Віктор Павлович, Інститут педіатрії, акушерства і гінекології АМН України завідувач лабораторії імунології.

Офіційні опоненти:

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бичкова Ніна Григорівна, головний науковий співробітник лабораторії імунології, Інституту проблем патології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця;

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Алексєєва Ірина Миколаївна, завідуюча відділом імунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця, НАН України.

Захист дисертації відбудеться "23" вересня 2008 року о ______ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, просп. Академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 433.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ім. Максимовича Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "6" липня 2008 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук О.В. Молчанець.

Анотація

Донськой Б.В. Антифосфоліпідні антитіла та їхня регуляція системою ідіотип-антиідіотип. - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.09 - імунологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2008.

Антифосфоліпідні антитіла (АФА) викликають невиношування вагітності, а також знижують ефективність ін вітро фертилізації (ІВФ). Анти-ідиотипові антитіла проти АФА (АіАФА) є важливою ланкою регуляції АФА. Одним з варіантів терапії АФА є інфузія інтравенозного імуноглобуліну (ІвІг), хоча механізми впливу ІвІг на імунну систему вивчені недостатньо. В роботі ми досліджували вплив низькодозової терапії ІвІг на систему АФА - АіАФА у ІВФ пацієнток. Досліджувались зразки сироваток крові у АФА позитивних пацієнтів ІВФ клініки, взяті безпосередньо до інфузії ІвІг та через п'ять днів після. В сироватках до та після інфузії ІвІг аналізували вміст АФА (анти-кардіоліпін та анти-фосфатидилсерин), АіАФА, IL4, IL6, TNFб, sTNFR1, ЦІК, IgG, IgM, IgA. З сироватками, взятими до інфузії ІвІг, проводили тест на інгібіцію АФА внаслідок інкубації з препаратом ІвІг. В попередніх дослідженнях було виявлено достовірне зниження АіАФА у АФА позитивних пацієнток ІВФ групи. У цій роботі нами було показано, що інфузія ІвІг призводить до зниження рівня АФА та підвищення рівня АіАФА (p<0,05). Ці зміни зворотно корелюють між собою (коефіцієнт кореляції = 0,55) (p<0,05). Рівні IL6, TNFб, sTNFR1, ЦІК, IgG, IgM, IgA не змінювались достовірно. Концентрація IL4 в сироватці знижувалась на 28% (p<0,05) порівняно з показниками до інфузії. Інкубація АФА-позитивної сироватки з препаратом ІвІг призводила до зниження рівня АФА (p<0,05). Це зниження прямо корелювало зі зниженням АФА у сироватці на п'ятий день після інфузії ІвІг (коефіцієнт кореляції = 0,77)(p<0,05). Результати засвідчують, що інфузія низьких доз ІвІг не має системного впливу на Тh1-систему та незначно пригнічує Th2. Основним імунологічним механізмом при низькодозовій терапії ІвІг пацієнтів з АФА є анти-ідиотипова інгібіція. Успішність пригнічення АФА внаслідок інфузії ІвІг можливо прогнозувати за інгібіцією АФА при інкубації з ІвІг. Це може мати прогностичне значення при виборі терапії та для коригування дози. Результати також вказують на можливу стратегію отримання більш специфічних імуноглобулінових препаратів для супресування автоантитільних патологій за механізмом антиідиотипової інгібіції.

Ключові слова: антифосфоліпідні антитіла, моноклональні антитіла, ін вітро фертилізація, антиідіотипові антитіла, інтровенозний імуноглобулін.

Аннотация

Донской Б.В. Антифосфолипидные антитела и их регуляция системой идиотип-антиидиотип. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.09 - иммунология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2008.

В работе проводилось изучение спектра антигенной специфичности антифосфолипидных антител (АФА) с использованием мышиных кофакторзависимых (КЗ) и кофакторнезависимых (КН) моноклональных АФА (МАФА). Было показано, что как КЗ, так и КН АФА имеют широкую перерекрестную реактивность к разным фосфолипидам. На примере МАФА мы продемонстрировали гетерогенность КЗ и КН АФА. Фосфолипидсвязующие сывороточные белки (кофакторы), выступающие обязательным условием для взаимодействия КЗ АФА с фосфолипидами, могут вступать в конкурентные взаимодействия с КН АФА и тем самым осложнять их детекцию. Также было показано, что использование стандартной методики определения АФА приводит к снижению выявляемости части не бета2-гликопротеин-зависимых АФА. Это, в свою очередь, является причиной существенных противоречий в литературных данных по частоте встречаемости и клиническому значению АФА. Нами предложена модификация иммуноферментной методики детекции АФА, разработанная на основе изучения антигенсвязывающих свойств МАФА. Данная модификация позволяет существенно расширить спектр специфичностей детектируемых АФА.

Высокая частота выявления антифосфолипидных антител (АФА) характерна как для пациентов с системными аутоиммунными заболеваниями, так и для женщин с бесплодием неподдающимся лечению методом IVF. У пациентов с системными аутоиммунными заболеваниями АФА вызывают тромботические осложнения, тогда как у ИВФ пациентов с АФА не отмечается клинических аутоиммунных признаков. В данном исследовании проводилось сравнение специфичности и кофактор-зависимости (КЗ) АФА у пациентов с системной красной волчанкой (СКВ) и женщин с неудачными попытками ИВФ и пациентами с хроническим вирусным гепатитом В (ХВГВ). Было показано, что АФА у пациентов с СКВ в основном в2гликопротеин-зависимые и кофактор-зависимые в 80% случаев, тогда как у ИВФ пациентов и больных с ХВГВ присутствие в2гликопротеин-зависимых АФА было незначительным. АФА у ИВФ пациенток были КЗ лишь в 28% случаев. Данные результаты могут объяснять причины отсутствие клинических признаков антифосфолипидного синдрома у АФА позитивных ИВФ пациенток, так как тромботические осложнения в основном связаны с присутствием КЗ АФА. Кофактор-зависимость АФА у ИВФ пациенток может быть причиной существенных противоречий в литературных данных о значении АФА при бесплодии, поскольку в ряде диагностических тест-системы кофактор-независимые АФА не детектируются.

В работе исследовались АФА и антитела, специфичные к идиотипам АФА (АиАФА) у женщин, которым проводится ИВФ. Нами было продемонстрировано достоверное присутствие АиАФА в сыворотках крови пациентов. Уровень АиАФА у женщин с ИВФ был достоверно снижен у АФА-позитивных пациенток по сравнению с пациентками без АФА той же клинической группы. Инфузия интравенозного иммуноглобулина (ИвИг) пациенткам с АФА приводила к достоверному снижению уровней АФА и повышению уровней АиАФА. Падение уровней АФА и повышение значений АиАФА достоверно коррелировали между собой. В работе продемонстрировано значение системы идиотип-антиидиотип в регуляции продукции АФА.

Ключевые слова: антифосфолипидные антитела, моноклональные антитела, ин витро фертилизация, антиидиотипические антитела, интравенозный иммуноглобулин.

Summary

Donskoi B.V. Antiphospholipid antibodies and anti-idiotypic regulation.- Manuscript

Thesis for the for degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.09 - Immunology. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2008.

The antigenic specificity of antiphospholipid antibodies (APA) is a matter of intensive investigation. Difference in the reported involvement of APA in clinical manifestation may be due, in part, to the polyclonal nature of these antibodies and the use of serum and serum fractions for analysis. To circumvent this issue, we generated mouse monoclonal APA and compared their antigen binding patterns and conditions of this reaction.

MAPA 5A1 and 1B10 reacted with cardiolipin in a в2-glycoprotein 1 - dependent manner. The epitope for these antibodies consisted of в 2-glycoprotein1 bound to cardiolipin or immobilized on plastic plates. The specificity is similar to the autoimmune anticardiolipin antibodies described in patients with SLE, APS and other autoimmune diseases. MAPA 510, 183, 238 reacted with cardiolipin in the absence of в 2-glicoprotein1. в 2-glicoprotein1, either in the fluid phase or bound to cardiolipin, inhibited the binding of these antibodies. MAPA 510 was cofactor-independent In contrast; MAPA 183 and 238 reacted with cardiolipin only in the presence of human serum. The results of this study indicate that APA comprise a highly heterogeneous population of antibodies with respect to the antigens they recognize, as well as depending for presence serum components. High frequency of antiphospholipid antibodies (APA) has been observed in patients with systemic autoimmune disease as well as in women undergoing IVF. APA in systemic autoimmune disease patients are associated with thrombotic complications but such association was not observed in APA positive IVF patients and patients with infection. In this study we investigated the specificity and cofactor-dependence of APA in systemic lupus erythematosus patients in comparison with APA in women undergoing IVF and chronic viral hepatitis B patients (HVHB). We had showed that APA in SLE patients are generally в2GP1-dependent. APA in IVF and HVHB patients was generally в2GP1-independent. APA in SLE patients was cofactor-dependent in 80% cases and only 28% in women undergoing IVF. This data can explain absence of thrombotic complication in APA positive IVF patient, because its complications associated rather with cofactor-dependent APA. It also can explain a lot of controversial results about significance of APA on IVF result.

Antiphospholipid antibodies (АPА) and anti-idiotypic antiphospholipid antibodies (AiAPA) were also studied in women undergoing IVF. АPА (IgG аCL, аPS, аPE, аPA, аPG, аPC) levels in serum has been defined. Sera IgG fraction was also examined for the presence of AiAPA by three different methods: indirect binding of AiAPA in ELISA with mouse monoclonal cofactor-independent APA (mAPA), AiAPA neutralization of binding of human affinity isolated APA and mAPA with phospholipids. We had found significant difference in levels of AiAPA between APA+ and APA- women undergoing IVF. In APA+ women undergoing IVF, the mean level of AiAPA was lower than in APA- women among the same group (p<0,05). IvIg infusion significant decrease the APA as well as increase the AiAPA level in APA+ women undergoing IVF. Result of this study confirmed possibility of AiAPA participation in down regulation of cofactor-independent APA production in women undergoing IVF.

Key words: antiphospholipid antibodies, monoclonal antibodies, in vitro fertilization, anti-idiotypic antibodies, intra venous immunoglobulin.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми

На сучасному етапі розвитку імунології дослідження в галузі імунофізіології та імунопатології репродукції набувають все більшого поширення, що обумовлено їх теоретичним та практичним значенням. Незважаючи на значні успіхи у вивченні молекулярних і генетичних механізмів імунологічної толерантності до власних антигенів та значне просування у розумінні функціонування імунної системи під час вагітності, проблема антифосфоліпідних антитіл (АФА) залишається недостатньо вивченою у більшості аспектів. Незрозумілим залишається сам феномен імунної відповіді до автологічних фосфоліпідних детермінант.

Питання про патологічність або фізіологічність гуморальної відповіді до фосфоліпіпідних антигенів, що ставилися на початку вивчення цього аспекту, не знайшли остаточної відповіді до сьогодні. Численні клінічні дослідження ілюструють асоціацію АФА з тромботичними патологіями, порушеннями репродуктивних функцій, відторгненням трансплантатів та хронічними вірусними і бактеріальними інфекціями. Проте відомості щодо клінічного значення АФА містять надзвичайно велику кількість суперечливих фактів, нетипову для сучасних наукових робіт. Основною причиною численних розбіжностей у результатах досліджень є висока гетерогенність АФА. Відмінність антигензв'язуючих властивостей між різними АФА робить їх діагностику складним науково-практичним завданням.

Дослідження останніх десяти років змінили розуміння ролі імунної системи в репродукції ссавців. На даний час відомо, що розпізнавання ембріону імунною системою матері відбувається на 3-5 добу після запліднення і є ключовим етапом в процесах імплантації I. Sargent 2006 та інвазії трофобласта E. Maquoi 2005.

Непліддя є найбільш поширеною репродуктивною патологією. Допоміжні репродуктивні технології набули надзвичайно широкої розповсюдженості та залишаються єдиним можливим способом лікування більшості форм непліддя. Незважаючи на це, вони залишаються неефективними у 25-50% випадків. Найбільш розповсюдженим імунним фактором неефективності ін вітро фертилізації (ІВФ) вважаються АФА C.B. Coulam 1997. Хоча і до цього часу аспект викликає дискусію W. Branch.

За 25-річний період вивчення антифосфоліпідних антитіл пережило декілька етапів. На першому етапі в роботах E.N. Harris та G.R. Hughes було показано наявність антитіл проти фосфоліпідних детермінант, але нe було остаточно зрозуміло, яким чином може розвиватися автоімунна відповідь до таких антигенів. Пізніше було виявлено, що велика частина антифосфоліпідних антитіл специфічна не до фосфоліпідів, а до білкового компоненту фосфоліпід-білкового комплексу, і саме такі антитіла асоціюються з більшістю автоімунних клінічних проявів. Такі дані спонукали до невиправданого спрощення цього питання. Так, певний час вважалося, що АФА - це антитіла, специфічні до фосфоліпідзв'язуючих білків, вони характерні для пацієнтів із системними автоімунними захворюваннями та викликають у них тромботичні явища M. Galli 1995. Антифосфоліпідні антитіла, які реагували з фосфоліпідом безпосередньо, вважалися артефактом методу визначення або результатом перехресної специфічності низькоспецифічних імуноглобулінів. Такі антитіла вважалися клінічно незначущими O. Amegual 1996. Починаючи з середини 90-х все більше отриманих результатів ставили під сумнів такий підхід. Так, на сьогодні відомо, що АФА, які реагують з фосфоліпідом безпосередньо, - це своєрідна група антитіл. Такі антитіла насправді не викликають тромботичних порушень, на відміну від АФА, специфічних до фосфоліпідзв'язуючих білків. Але саме такі "дійсно антифосфоліпідні" антитіла беруть участь у цілій низці патофізіологічних процесів і мають важливе клінічне значення за трансплантації органів, в механізмах репродукції J.A. McIntyre 2003. Незрозумілими залишаються питання щодо природи цих антитіл та механізмів їх продукції та регуляції.

Такий стан проблеми викликає необхідність всебічного вивчення АФА та причин їхнього виникнення. Особливий науковий та практичний інтерес викликає саме система імунорегуляції продукції АФА та розробка терапевтичних патогенетичних підходів для зниження рівня та запобігання надмірної продукції цих антитіл.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана в рамках науково-дослідних робіт Інституту педіатрії, акушерства і гінекології АМН України: Національна програма "Вивчити стан репродуктивної функції у жінок із захворюваннями, що передаються статевим шляхом, та розробити заходи щодо їх профілактики та реабілітації" Шифр ВК 20.00.08.02. № держреєстрації 01.02 U 003480

Мета і задачі дослідження. Розкриття механізмів регуляції антифосфоліпідної відповіді та розробка методів діагностики антифосфоліпідних антитіл. Встановлення клінічного значення антифосфоліпідних антитіл у пацієнток з непліддям, що проходять лікування методом ін вітро фертилізації та вивчення механізмів дії інтравенозного імуноглобуліну.

Для досягнення поставленої мети були визначені та вирішені наступні задачі.

Отримати мишачі моноклональні АФА та дослідити антигензв'язуючі властивості моноклональних АФА.

Використовуючи моноклональні АФА, розробити метод визначення АФА у сироватках людини з підвищеними показниками чутливості та специфічності.

Встановити клінічне значення АФА у пацієнток, що проходять лікування від непліддя методом ін вітро фертилізації.

Вивчити специфічність та кофакторзалежність АФА серед пацієнтів з наявними або відсутніми автоімунними патологіями.

Розробити метод визначення антиідіотипових антитіл, специфічних до ідіотипів АФА.

Дослідити фізіологічну роль антиідіотипових антитіл.

Розкрити механізми терапевтичного впливу інтравенозного імуноглобуліну на продукцію АФА.

Об'єкт дослідження: антифосфоліпідні антитіла та система ідіотип-антиідіотип у регуляції АФА, механізми імунотерапевтичної дії інтравенозного імуноглобуліну.

Предмет дослідження: моноклональні АФА миші та поліклональні АФА людини, сироватки крові людини.

Методи дослідження: в роботі використані сучасні методи імунологічного дослідження. Для отримання моноклональних АФА використовували гібридомну технологію. Для аналізу чистоти клітинних популяцій використовували методи проточної цитофлюориметрії.

Імуноферментні методи використовували для визначення специфічності, афінності, кофакторзалежності АФА, рівня АФА та концентрації цитокінів. Афінну та гельпроникну хроматографію у поєднанні з біохімічними та біофізичними методами використовували для виділення, фракціонування та модифікації білків. Також використовували сучасні статистичні методи та комп'ютерні програми для обробки та математичного аналізу отриманих результатів.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше досліджено роль антиідіотипових антитіл у регуляції імунної відповіді проти фосфоліпідних антигенів. Отримані новітні дані про специфічність та антигензв'язуючу активність моноклональних АФА. Вперше висвітлені конкурентні взаємодії, що впливають на реакцію АФА різної специфічності з фосфоліпідними молекулами. Показано що, подібні взаємодії призводять до суттєвих діагностичних розбіжностей у виявленні АФА різними методами. Це, в свою чергу, пояснює численні протиріччя в наукових відомостях з цієї проблеми. На основі отриманих даних розроблена оригінальна модифікація імуноаналізу, що дає змогу визначати АФА різного типу. Вперше досліджена специфічність антифосфоліпідних антитіл, що містяться в сироватках пацієнтів з АФА-асоційованими патологіями за відсутності автоімунних порушень. Отримані в роботі результати підтвердили раніш опубліковані дані N. Gleicher та E. Geva та частково суперечать результатам D.W. Branch щодо клінічного значення АФА. Вперше були розроблені та випробувані методи визначення антиідіотипових антитіл проти АФА у сироватках людини. Цими методами було підтверджено присутність антиідіотипових антитіл проти АФА, та показано фізіологічну роль цих антитіл у регуляції АФА-відповіді. Новими є отримані в роботі результати щодо механізмів терапевтичної дії інтравенозного імуноглобуліну та виявлено ефект пасивної імунізації антиідіотиповими антитілами за умов його застосування. Вперше був досліджений прямий вплив препарату інтравенозного імуноглобуліну на рівень антифосфоліпідних антитіл в сироватці крові людини. Також виявлено асоціацію між прямим впливом препарату на сироватку крові та ефектом терапії інтравенозним імуноглобуліном. Це може дозволити попередньо визначити терапевтичний ефект за зазначеного лікування. На підставі отриманих результатів запропоновано оригінальну гіпотезу щодо продукції кофакторнезалежних АФА у Т-незалежний спосіб та їх регуляції системою антиідіотипових антитіл, що, в цілому узгоджується з даними наукової літератури.

Практичне значення одержаних результатів. На основі отриманих результатів запропоновані нові підходи до визначення АФА у пацієнток, що проходять лікування ІВФ. Підтверджено клінічне значення антифосфоліпідних антитіл у патологіях репродукції. Отримано результати щодо механізмів продукції антифосфоліпідних антитіл. Запропоновано метод прогнозування ефекту терапії інтравенозним імуноглобуліном.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто проведено опрацювання літератури, здійснений патентно-інформаційний пошук, визначена мета та основні задачі дослідження, здійснено імунологічне лабораторне обстеження 2000 зразків крові, одержаних від 1600 неплідних жінок, що проходили лікування методом ін вітро фертилізації шляхом ембріотрансферу, 73 контрольних фертильних пацієнток, 80 хворих на хронічний гепатит В та 43 хворих на системний червоний вовчак. У ході роботи у лабораторії було отримано та охарактеризовано 6 гібридомних ліній, що продукували моноклональні АФА. Клінічна характеристика обстежених жінок та оцінка клінічної ефективності застосування терапії інтравенозним імуноглобуліном проведені спільно із співробітниками "Інституту репродуктивної медицини" м. Київ (дир., проф., Ф.В. Дахно) Особисто автором виконана статистична обробка даних, проведено аналіз та узагальнення одержаних в роботі результатів, за результатами роботи написана дисертація, підготовлені друковані праці, зроблено наукові доповіді.

Особлива подяка висловлюється к.б.н. М.О. Водяніку (Університет Вісконсін. Медісон, США)

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи апробовані на наступних наукових форумах: Всеукраїнська науково-практична конференція "Автоімунні захворювання: імунопатогенез, імунопрофілактика, імунотерапія", (Київ, Україна, 2003); X симпозіум по імунології репродукції (Варна, Болгарія, 2003); ІІІ Всеукраїнська науково-практична конференція " Питання імунології в педіатрії " (Київ, Україна, 2003); Європейський конгрес з репродуктивної імунології ( Плзень, Чехія, 2004); V Всеукраїнська науково-практична конференція " Питання імунології в педіатрії " (Форос, Україна, 2005); Міжнародна конференція з імунології репродукції (Іваново, Росія, 2005); Наукова конференція " Актуальні проблеми фармакології та токсикології " (Київ, Україна 2005); Перший науковий семінар спілки EMBIC з питань основ ембріоімплантації (Малінська, Хорватія 2005); XI симпозіум по імунології репродукції (Варна, Болгарія, 2006); Другий науковий семінар спілки EMBIC з питань молекулярних механізмів ембріоімплантації (Печ, Угорщина 2006); Європейський конгрес з репродуктивної імунології (Грац, Австрія 2006). Х Міжнародний конгрес з імунології репродукції (Опатія, Хорватія, 2007);

Публікації. За результатами роботи опубліковано 13 наукових праць: 3 статті у наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК, 1 експериментальна стаття та 1 оглядова стаття у науково-клінічному журналі, 9 тез доповідей у матеріалах наукових конференцій, симпозіумів, конгресів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків та списку використаних джерел літератури, серед яких 4 вітчизняних та 120 іншомовних. Повний обсяг складає 108 сторінок друкованого тексту, що включає 22 рисунки, 6 таблиць.

2. Основний зміст роботи

Матеріал та методи дослідження. Для досягнення мети та розв'язання завдань, поставлених в роботі, використавши гібридомну технологію та оригінальний протокол імунізації, було отримано 6 клонів, що продукували мишачі моноклональні АФА (МАФА). Методами ІФА був проведений аналіз щодо специфічності до різних фосфоліпідів, та кофакторзалежності отриманих МАФА. Вивчався також вплив окремих компонентів ІФА (протеїни, сироватки, Са++) та умов проведення ІФА (рН, t0C, час інкубації) на реакцію МАФА -фосфоліпід. Додатково досліджувались сироваткові компоненти (сироватка крові людини, фракції сироватки крові людини, бичача сироватка, в2глікопротеїн1) щодо здатності вступати в кофакторні або конкурентні взаємодії з МАФА за зв'язування з фосфоліпідами. Для чого попередньо провели розділення сироватки людини методом гель-проникної хроматографії. На підставі отриманих даних було розроблено модифікацію ІФА методу визначення АФА, що у порівнянні зі стандартним методом мала підвищені показники чутливості до отриманих МАФА. Використавши розроблену модифікацію методу було проведено дослідження рівня АФА у сироватках 1600 пацієнток з непліддям, що проходили лікувальний цикл ін вітро фертилізації (ІВФ), також досліджено сироватки 43 пацієнтів з системним червоним вовчаком (група СЧВ) та сироватки 80 хворих на хронічний вірусний гепатит В (група ХГВВ). В якості контролю використовували сироватки здорових фертильних жінок (n =73. В сироватках додатково досліджували кофакторзалежність наявних АФА та вміст антитіл до в2ГП 1.

Для вивчення системи ідіотип-антиідіотип було розроблено 3 незалежні ІФА методи визначення АіАФА, що базувались на використанні епітопів мАФА або поліклональних АФА людини в якості антигену. Для цього попередньо провели афінне виділення та біотинілювання АФА з людських сироваток. Використовуючи ці методи, ми провели визначення рівня АіАФА у сироватках пацієнтів з дослідних груп.

Для вивчення механізмів терапевтичного впливу ІвІг нами проведено визначення АФА та АіАФА до та після одноразової інфузії препарату у пацієнток з ІВФ-групи. Також визначено концентрації цитокінів, імуноглобулінів, та циркулюючих імунних комплексів у даних пацієнток. Для вивчення прямого ін вітро ефекту ІвІг на АФА сироватки пацієнток інкубували разом з препаратом, після чого аналізували рівень вільних АФА. Для статистичної обробки отриманих даних використовували: в разі нормального (гаусового) розподілу даних вибірки - критерій Student td; в разі розподілу, відмінного від нормального, - критерій Mann-Whitney U (для оцінки різниці між різними групами), критерій Wilcoxon Т (для оцінки різниці в межах однієї групи в динаміці до або після лікування), метод множинних порівнянь Frideman (для оцінки різниці в динаміці протягом всього обстеження). Зв'язки між показниками оцінювали за коефіцієнтом кореляції Spirman rs (для оцінки зв'язку між кількісними показниками) або крапковим бісекторіальним коефіцієнтом кореляції rpb (для оцінки зв'язку між кількісним і якісним показниками). Всі обчислені критерії вважали за статистично вірогідні, коли рівень значущості Р був менший за 0,05.

Результати досліджень, їх аналіз та узагальнення.

Нами було отримано у вигляді чистої культури 6 стабільних гібридомних клонів, що були здатні продукувати МАФА. Під час аналізу специфічності виявилось, що мАФА510 реагувало з кардіоліпіном безпосередньо, тоді як мАФА238 та мАФА183 взаємодіяли з кардіоліпіном лише у присутності кофакторів СКЛ. МАФА 5А1 та 1Е10 були специфічні до комплексу Кл-в2ГП1, однак впізнавали в2ГП1 і на опроміненому полістиролі.

При вивченні перехресної специфічності МАФА було встановлено, що, як КЗ АФА, так і КН АФА, переважно специфічні до кардіоліпину та фосфатидилсерину, хоча, як правило, спектр специфічності був ширший.

КН АФА510 взаємодіяло майже з однаковою інтенсивністю з Кл, Фс, Фе, та Фк як у відсутності кофакторів, так і за їх присутності в2ГП1 залежні мАФА5А1 та 2Е10 не реагували з жодним фосфоліпідом у відсутності ЛС, однак при наявності в2глікопротеїну 1, що містився в людській сироватці, вони взаємодіяли з Кл Фс Фе та Фк. МАФА 183 також не взаємодіяло з фосфоліпідами за відсутності кофакторів. У присутності сироватки людини МАФА виявляло більш вузький спектр специфічності порівняно з в2ГП1 залежними АФА і реагувало лише з Кл та з Фс. При аналізі специфічності МАФА був виявлений суттєвий вплив сироваткових компонентів на взаємодію МАФА з кардіоліпіном. Цей вплив досліджувався більш детально. Було виявлено, що людська сироватка, як і людський в2глікопротеїн 1, пригнічують зв'язування КН МАФА 510 з кардіоліпіном, тоді як присутність сироватки та в2глікопротеїну 1 є обов'язковою умовою для взаємодії КЗ МАФА 5А1 та 1Е10.

Бичача сироватка мала інгібуючий вплив як на КН АФА 510, так і на КЗ АФА 183. Подібно на реактивність цих антитіл впливала присутність у розчині в2глікопротеїну1. І навпаки, лише присутність мікрограмових концентрацій в2глікопротеїну1 у розчині призводила до взаємодії в2ГП залежних Ат з кардіоліпіном. У цьому й полягає основна дилема методології визначення АФА- Кофактори, що є обов'язковою умовою для реагування одних АФА, мають інгібуючий вплив на реактивність інших АФА

Окремо вивчалися компоненти сироватки, що відповідають за інгібіцію взаємодії КН АФА 510 та відіграють роль кофакторів для КЗ АФА. За допомогою гельпроникної хроматографії вдалося виділити білкову фракцію, в якій містився кофактор для АФА 183.

Максимальна концентрація цього протеїну була у фракціях, еквівалентних 38-36 кДА (рис. 3). АФА 5А1 та 1Е10, що специфічні до в2глікопротеїну 1, не мали перехресної реактивності до інших кофакторів та реагували з кардіоліпіном за присутності у фракціях в2глікопротеїну 1 (51 кДа). Компоненти людської сироватки у фракціях з молекулярною масою 60 - 40 кДа мали виражений інгібуючий влив на реакцію КН АФА 510 з Кл. У цих же фракціях містилися кофактори для КЗ АФА (5А1, 1Е10, 183 та 278). Результати ілюструють принципову складність одночасного виявлення КЗ АФА та КН АФА. Нами були запропоновані певні зміни умов у стандартному методі визначення АФА, які призводили до підвищення чутливості методу як до КН АФА, так і до КЗ АФА

При порівнянні стандартного методу визначення АФА із запропонованою модифікацією було виявлено, що за чутливістю до в2глікопротеїн 1 залежних МАФА (5А1 та 1Е10) обидва методи не відрізняються, також подібні обидва варіанти і за рівнями неспецифічного фонового сигналу за використання контрольних мАт (1С1). Рівень неспецифічного фону в контрольних лунках без кардіоліпіну також був мінімальним в обох варіантах методу. Проте специфічність запропонованої модифікації методу до КН АФА 510 та КЗ АФА 183 була достовірно вищою, ніж специфічність стандартного методу.

Результати засвідчують, що запропонована модифікація методу визначення АФА здатна детектувати КЗ та КН АФА з підвищеною чутливістю порівняно до стандартного методу. В стандартному методі спостерігається недовиявлення АФА з певними показниками специфічності як серед КЗ, так і КН АФА. Як було показано вище, до цього може призводити інгібуючий вплив протеїнів сироватки.

При дослідженні МАФА продемонстровано спектр антигенної специфічності МАФА. Широка перехресна специфічність МАФА пояснює подібну реактивність поліклональних АФА з сироваток пацієнтів. Широка перехресна реактивність КН АФА пов'язана не з низькими показниками специфічності цих антитіл, а можливо, з подібністю антигенних епітопів на фосфоліпідних молекулах.

З'ясовано, що при використанні стандартних протоколів визначення АФА можуть не виявлятися АФА що не є в2 ГП1 залежними. Це може пояснювати принципові розбіжності у літературних даних щодо частоти виявлення та значення АФА в одних і тих самих клінічних групах.

На основі вивчення властивостей МАФА нами запропонована модифікація методу визначення АФА у сироватці крові людини, яка дозволяє виявляти більший спектр специфічностей АФА порівняно зі стандартним методом. За допомогою розробленої модифікації визначення АФА нами було проведено обстеження сироваток крові пацієнтів різних клінічних груп. Були отримані такі результати: в групі пацієнток з непліддям, що проходили лікувальний цикл ін вітро фертилізації (ІВФ), антифосфоліпідні антитіла (до Кл, Фс ) виявлялися у 41% випадків, у пацієнтів з системним червоним вовчаком (група СЧВ)- в 63% , хворих на хронічний вірусний гепатит В (група ХГВВ) - в 37,5%. В контрольній групі АФА виявлялися лише у 8% обстежених. Всі досліджені групи мали достовірно вищий рівень АФА позитивності порівняно з контрольною групою (p<0,05). Анти-в2GP1 IgG антитіла в сироватці крові ІВФ пацієнтів та хворих на СЧВ та ХГВ були виявлені у 14,2%, 47% та 9% відповідно. В сироватках контрольної групи антитіл проти в2глікопротеїну1 не виявилося. IgG фракції, виділені з 24 АФА позитивних сироваток крові пацієнтів групи ІВФ та СЧВ, ми дослідили на кофакторзалежність АФА оригінальним методом. Було виявлено, що АФА в групі ІВФ були кофакторзалежними у 28,5%, тоді як в групі хворих на СЧВ-80%. Таким чином, у групі пацієнток, яким проводили ІВФ, домінують кофакторнезалежні антифосфоліпідні антитіла, тоді як в групі пацієнтів з СЧВ - кофакторзалежні антифосфоліпідні антитіла. Кофакторнезалежність АФА у ІВФ пацієнток, можливо, є причиною численних протиріч в літературних відомостях щодо частоти та значення цих антитіл при ІВФ. Кофакторнезалежність АФА у ІВФ- пацієнток пояснює відсутність у цій клінічній групі тромботичних ускладнень, оскільки клінічні прояви антифосфоліпідного синдрому пов'язані переважно з кофакторзалежними АФА. Можливо, що кофакторнезалежні АФА не є проявом автоімунної реакції, а є свідченням певного порушення імунорегуляції КН АФА продукції. антифосфоліпідний непліддя антитіло фертилізація

Задля аналізу клінічного значення антифосфоліпідних антитіл ІВФ- пацієнтки були розділені на дві групи : 1 групу склали 84 пацієнтки, що мали позитивні рівні АФА до( Кл або Фс або Фе); у другу 120 пацієнток, що не мали Ат проти жодного Фл антигену. Було виявлено, що пацієнтки, позитивні на АФА, мали достовірно більший термін попередньої неплідності (табл. 1). Аналіз ефективності проведення ІВФ в обох групах виявив статистично достовірне зниження частоти розвитку вагітності у пацієнток з АФА 26,1% порівняно з 46,6% у жінок, що не мали АФА. (табл. 1.) Досліджуючи перебіг вагітності у групах, виявили більшу частоту спонтанного переривання вагітності в групі І 27,3% порівняно з 14,2% в групі ІІ. Таким чином, частота пологів на цикл ІВФ у пацієнток з АФА була вдвічі нижча (19%) порівняно з групою АФА негативних жінок (40%).

Таблиця 1.

Клініко-анамнестичні показники та ефективність ІВФ у пацієнток в залежності від наявності АФА

Показники	Група І (пацієнтки з АФА ) n =84	Група ІІ (пацієнтки без АФА) n = 120
Попередній період непліддя (роки)	10,3 0,7 *	7,4 0,3
Частота розвитку вагітності (%)	26,1 (22 / 84)*	46,6 (52 /120)
Частота спонтанного переривання вагітностей (%)	27,2 ( 6 / 22)*	14,2 (8 / 52)
Частота пологів на цикл лікування (%)	19 (16 / 84) *	40 ( 48 / 120)

* достовірна відмінність порівняно з пацієнтками без АФА (група2) ( р <0,05)

Отримані результати підтверджують негативний вплив АФА на процес імплантації при проведенні ІВФ та на подальший перебіг вагітності в цілому. КН АФА не асоціюються з клінічними автоімунними проявами у ІВФ- пацієнток, проте вони суттєво знижують вірогідність імплантації ембріону при проведенні ІВФ. Тому причини утворення КН АФА та регуляції КН АФА продукції викликають як науковий, так і практичний інтерес. Однак ці питання залишаються недослідженими на теперішній час.

Аналізуючи численні, проте не систематизовані наукові відомості та отримані експериментальні результати ми висунули робочу гіпотезу, за якою КН АФА продукуються у Т-незалежний спосіб.

Доказами цієї гіпотези є присутність незначних рівнів сироваткових АФА у більшості нормальної популяції, відсутність фосфоліпід-специфічних Т- лімфоцитів у пацієнтів з КН АФА, суперантигенність фосфоліпідної структури на апоптозних клітинах [Plots P., 2005] Подібні властивості надають Аг можливість викликати поперечну зшивку імуноглобулінових рецепторів на В- лімфоциті та ініціювати синтез Ат без участі специфічних Т- лімфоцитів [M. Shevach, 2003]. Ця гіпотеза також пояснює часту транзиторну появу АФА у здорових індивідуумів, переважну IgM природу КН АФА у експериментальних тварин [Levine J., 1998] та відсутність автоімунних проявів у КН АФА позитивних пацієнтів. Одним з питань, що породжує ця модель, є питання антиген-специфічної регуляції КН АФА продукції. Продукція антитіл у Т- незалежний спосіб відповідно і регулюється Т -незалежно. За нашими результатами та даними наукової літератури, найбільш імовірною ланкою, що здатна здійснювати специфічну регуляцію цієї відповіді, є система антиідіотипових антитіл. Таким чином робочу гіпотезу було розширено - КН АФА продукуються у Т-незалежний спосіб, а специфічна регуляція цієї відповіді здійснюється системою антиідіотипових антитіл згідно з теорії Jerne N.K. Цікаво, що теорія Йерне набула більшості експериментальних підтверджень саме за використання в якості модельних первинних антитіл, імуноглобулінів, специфічних проти небілкових епітопів C. Bona 1979. Окрім теоретичних основ є й експериментальні підтвердження того, що антиідіотипові антитіла можуть брати участь у регуляції гуморальної відповіді Hart D., 1972.

Для перевірки даної гіпотези нами було проведено детальне експериментальне вивчення системи АФА-антиідіотипових антитіл до АФА та ґрунтовний аналіз літературних відомостей з цієї проблеми. Для чого були розроблені методи детекції антиідіотипових антитіл та досліджена система антиідіотипових антитіл, специфічних до АФА (АіАФА) у різних клінічних групах. АіАФА були виявлені в сироватках та IgG фракціях сироваток крові людини. АіАФА з сироватки людини взаємодіяли з іммобілізованими на твердій фазі МАФА. Про специфічність саме до ідіотипу свідчить той факт, що ця взаємодія майже повністю блокується присутністю вільних мАФА в реакційному розчині, проте є нечутливою до присутності контрольних мишачих мАт (того самого субкласу та ізотипу) у розчині.

Проведення функціонального тесту дало змогу виявити, що АіАФА з IgG фракцій сироватки людини не лише взаємодіють з ідіотипами МАФА, а й інгібують взаємодію між МАФА та кардіоліпіном. Подібний інгібуючий ефект IgG фракції призводили й на аналогічну реакцію між афіновиділеними АФА людини та кардіоліпіном. Такі результати надали підтвердження висунутій гіпотезу щодо регуляторної ролі АіАФА. Для подальшого вивчення системи АіАФА нами було проведено дослідження рівнів АіАФА в залежності від наявності або відсутності АФА. Наші результати показали, що АФА позитивні ІВФ-пацієнтки мають достовірно нижчий рівень АіАФА порівняно з АФА негативними пацієнтками тієї ж групи (р<0,05). Це може свідчити про відсутність належної регуляції АФА продукції з боку системи АіАФА у цих пацієнток, наслідком чого і стає підвищення рівня АФА і в цілому узгоджується із запропонованою гіпотезою. Цікаво, що така достовірна різниця рівнів АіАФА спостерігалась лише в групах, де АФА були переважно кофакторнезалежними (ІВФ та ХВГВ), тоді як у сироватках пацієнтів з СЧВ такої різниці не спостерігалося.

Це дає можливість припустити, що система АіАФА не має особливого значення у продукції " власне автоімунних " КЗ АФА, специфічних до комплексних протеїн-ліпідних епітопів. Причиною цього може бути як висока гетерогенність ідіотипів КЗ АФА порівняно з КН АФА, так і більш агресивний розвиток антитілопродукції при автоімунному зриві Т-клітинної толерантності. Наявність АіАФА в сироватках здорових донорів за відсутності самих АФА цілком вписується у рамки запропонованої гіпотези. Можливо, присутність в нормі надлишку АіАФА над АФА призводить до знешкодження патогенетичних властивостей АФА та унеможливлює їх детекцію в ІФА.

З літературних джерел відомий факт, що термічна обробка нормальних сироваток призводить до появи АФА. Ми провели термічну обробку сироваток людини і виявили, що це призводить до зниження рівня імунних комплексів та до вивільнення АФА з цих комплексів. Ці дані доводять існування фізіологічного АФА-АіАФА балансу в нормі.

Для вивчення імунорегуляторної ролі АіАФА ми дослідили вплив на систему АФА- АіАФА, до якого призводить введення ІвІг (що містить донорські (нормальні, природні) АіАФА, що також було показано в даній роботі). Результати показали, що інфузія ІвІг достовірно знижує рівень АФА та підвищує рівень АіАФА в сироватках АФА позитивних ІВФ пацієнток Індивідуальні показники зниження рівня АФА та підвищення рівня АіАФА на п'ятий день внаслідок інфузії ІвІг достовірно зворотно корелювали між собою (коефіцієнт кореляції r = 0,56 р<0,05). Зазначене вище засвідчує, що ці процеси взаємопов'язані, і система АіАФА відповідальна за зниження КН АФА у ІВФ пацієнток внаслідок використання ІвІг. Аналізуючи показники імунної системи у цих пацієнтів після терапії, ми не виявили суттєвих змін на системному рівні. Що свідчить про безпосередній вплив ІвІг на АФА-АіАФА баланс. Дослідження прямого ефекту ІвІг на сироватки виявило, що інкубація сироватки з ІвІг призводить до блокування АФА. Зниження АФА після терапії ІвІг модулюється ін вітро у блокуванні сироваткових АФА у зразках тих самих пацієнток. Це блокування АФА ін вітро напряму корелює зі зниженням АФА у сироватках пацієнток після інфузії ІвІг ін віво коефіцієнт кореляції = 0,7 р<0,05) Наявність прямого ефекту ІвІг на сироваткові АФА засвідчує переважний антиідіотиповий механізм терапевтичної дії препарату. Подібні результати фактично підтверджують значення АіАФА у системі контролю продукції КН АФА. Потенційно практичне значення має також і можливість прогнозування наслідків лікування ІвІг за ін вітро ефектом на сироваткові АФА та можливість розробки специфічних препаратів ІвІг на основі ідіотип-антиідіотипових взаємодій. Таким чином, аналізуючи отримані результати, можна стверджувати, що запропонована гіпотеза продукції та регуляції КН АФА отримала ґрунтовні підтвердження.

Активація, апоптоз та відмирання клітин постійно потенціюють продукцію КНАФА, проте АіАФА надлишок запобігає надмірному синтезу АФА та появі вільних АФА в сироватці. АіАФА надлишок створюється завдяки ефективності Т-залежної АіАФА відповіді (на відміну від низькоефективної Т-незалежної АФА відповіді). Однак з різних причин АФА -АіАФА баланс може порушуватись в бік надлишку АФА. Саме за цих станів вільні АФА можна діагностувати в сироватках та спостерігати зниження рівня АіАФА.

У нашій роботі такий стан продемонстрований у хворих на хронічний гепатит В та у жінок з репродуктивними порушеннями.

Нещодавно подібну систему регуляції автоантитільної відповіді з боку системи антиідіотипових антитіл було описано у пацієнтів з тромбоцитопенічною пурпурою [Mehta Y. 2003]. Дана модель продукції КН-АФА пояснює отримані нами результати та має всі права на існування, бо знаходить своє підтвердження в інших опублікованих різними авторами даних.

Висновки

У дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове вирішення наукових задач стосовно природи, типів та регуляції імунної відповіді проти фосфоліпідних автоантигенів. Розкрито механізми регуляції кофакторнезалежних антифосфоліпідних антитіл. Проведене дослідження дозволяє зробити наступні висновки

Антифосфоліпідна гуморальна імунна відповідь у пацієнтів та у випадку індукції у експериментальних тварин не є моноспецифічною і представлена перехресно реагуючими антитілами проти фосфоліпідних молекул та антитілами проти фосфоліпід-протеїнових комплексів.

Антифосфоліпідні антитіла у пацієнтів з відсутніми автоімунними патологіями переважно кофакторнезалежні.

Кофакторнезалежні антифосфоліпідні антитіла в фізіологічному стані є частиною нормальної імунної відповіді, що контролюється системою антиідіотипових антитіл.

Розроблений в роботі метод визначення антифосфоліпідних антитіл характеризується підвищеною чутливістю до антифосфоліпідних антитіл різної специфічності.

Кофакторнезалежні антифосфоліпідні антитіла пов'язані з непліддям у жінок, зниженням ефективності методики запліднення ін вітро, але переважно не асоціюються з тромботичними ускладненнями.

Терапевтичний ефект низькодозового інтравенозного імуноглобуліну у пацієнтів з антифосфоліпідними антитілами базується на дії природних антиідіотипових антитіл, що містяться у ньому. Цей ефект моделюється реакцією ін вітро інгібіції сироваткових антифосфоліпідних антитіл внаслідок інкубації з препаратом.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Чернишов В.П., Донськой Б.В. Біологічні властивості та клінічне значення антифосфоліпідних антитіл // Перинатологія та педіатрія - 2001. - №4. - С. 45-48. (Імунологічне дослідження зразків крові, статистична обробка і узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

2. Chernichov V.P., Dakhno F.V., Donskoi B.V. Decrease of pregnancy and birth rate in women undergoing IVF with antiphospholipid antibodies// Abstr. 10nd Int. Forum of Reprod. Immunol - Varna (Bulgaria) 2003. - P. 81 (Імунологічне дослідження зразків крові, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

3. Donskoi B.V., Chernichov V.P., Vodjanik M.A. Antiphospholipid and antiidiotypic antibodies in women undergoing IVF // Eur. Congr. Reprod. Immunol. - Plzen (Czech Republic), 2004. - Amer. J. Reprod. Immunol. - №6(51) - P. - 492. (Імунологічне дослідження зразків крові, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

4. Чернышов В.П., Дахно Ф.В., Донской Б.В., Антифосфолипидные антитела и результаты оплодотворения in vitro// Здоровье женщины - 2004. - №2(18). - С. 137-141. (Дослідження зразків крові, статистична обробка і узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

5. Донской Б.В., Чернышов В.П Изучение специфичности мышиных моноклональных антифосфолыпидных антител // Конференция "Иммунология и репродукция" Иваново (РФР) Russian J of Immunology.-2005. - №2(9). - С. - 162 (проведення дослідження, статистична обробка і узагальнення результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

6. Donskoi B.V., Chernichov V.P. Cofactor-independent antiphospholipide antibodies in women undergoing IVF // Abstr. 1nd Int. Forum of Embryo implantation control-Malinska (Croatia) 2005. - P. 45. (Імунологічне дослідження зразків крові, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

7. Донськой Б.В., Чернишов В.П. Аналіз специфічності антифосфоліпідних антитіл із використанням моноклональних антитіл до фосфоліпідів // Українській біохімічний журнал. - 2005. - №6(77). - 109-116. (проведення дослідження, статистична обробка і узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

8. Донськой Б.В., Чернишов В.П. Кофакорзалежність антифосфоліпідних антитіл у хворих на системний червоний вовчак та жінок з неплідністю// Лікарська Справа.- 2005.-№8(1082).-С.-43-46. (проведення дослідження, статистична обробка і узагальнення результатів, підготовка статті до друку).

9. Chernichov V.P., Dakhno F.V., Donskoi B.V. Аntiidiotypic regulation of antiphospholipid antibodies in IVF women // Abstr. 11nd Int. Forum of Reprod. Immunol- Varna (Bulgaria) 2006. - P. 42 (Дослідження зразків крові, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

10. Donskoi B.V., Chernichov V.P. Аntiidiotypic regulation of antiphospholipid antibodies as possible mechanism of intravenous immunoglobulin treatment // Proc. Abstr. 2nd Int. Forum of Embryo implantation control. - Pecs(Hungary). - 2007. - P. - 33. (Імунологічне дослідження зразків крові, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

11. Chernichov V.P., Donskoi B.V. Idiotype-antiidiopype system in regulation of antiphospholipid antibodies production //// Proc. Eur. Congr. Reprod. Immunol. - Graz (Austria), 2006. - Amer. J. Reprod. Immunol. - №1(56) - P. - 40. (проведення дослідження, статистична обробка і узагальнення результатів, підготовка тез до друку, доповідь).

12. Donskoi B.V., Chernichov V.P., Gordienko I.Y., Tarapurova E.N. Antiphospholipid antibodies in mother and fetus in fetal-placental abnormalities// Proc. Int. Congr. Reprod. Immunol.-Opatia(Croatia) 2007. - Amer. J. Reprod. Immunol. - №6(57). - P. - 452. ( дослідження зразків крові, статистична обробка та аналіз результатів, підготовка тез до друку, доповідь)

Список скорочень

Ат - антитіла

аКл - антикардіоліпінові антитіла

АФА - антифосфоліпідні антитіла

БСА - бичачий сироватковий альбумін

в2ГП1 - в2глікопротеїн 1

ІВФ - ін вітро фертилізація

ІвІг - інравенозний імуноглобулін

КЗ АФА - кофакторзалежні антифосфоліпідні антитіла

КН АФА - кофакторнезалежні антифосфоліпідні антитіла

СЧВ - системний червоний вовчак

СКЛ - сироватка крові людини

ХВГВ - хронічний вірусний гепатит В

Кл - кардіоліпин

МАФА - моноклональні антифосфоліпідні антитіла

мАт моноклональне антитіло

Фс - фосфатидилсерин

Фе - фосфатидилетаноламін

Фк - фосфатидна кислота

Фг - фосфатидилгліцерол

Фх - фосфатидилхолін

Фі - фосфатидилінозітол

ФНП - фактор некрозу пухли

Размещено на Allbest.ru

...