Поширення ротавірусів на території України та удосконалення методичних підходів до їх визначення в водних об’єктах довкілля

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. На початку ХХІ століття, ротавірусна інфекція (РВІ) залишається однією з найважливіших проблем сучасної медичної науки та практики охорони здоров'я населення, що значною мірою зумовлено повсюдним поширенням ротавірусів (РВ), їх здатністю викликати тяжкі дегідратуючі діареї переважно у дітей віком до 5 років, негативними наслідками та значними економічними збитками, які вони спричиняють. Щорічно в світі реєструється більше 114 млн. випадків РВІ, 2,4 млн. випадків госпіталізацій дітей з тяжкими формами захворювання, з яких біля 610 тис. завершуються летально (Glass R. et al., 2006).

У США кожного року серед населення всіх вікових груп реєструється понад 3,5 млн. випадків РВІ, 70-100 тис. госпіталізацій та 125-150 випадків смерті. Прямі та непрямі економічні збитки від цього захворювання сягають 1 млрд доларів на рік, з них 500 млн доларів витрачаються на патогенетичну терапію (Grey J., 2008).

У більшості країн Європи РВІ поряд з ВІЛ-інфекцією/СНІДом, гепатитом С, туберкульозом віднесена до першої десятки найбільш небезпечних інфекційних захворювань людини (Дзюблик І.В. і співавт., 2004). В 2006 році тільки в країнах Європейського Союзу було зареєстровано 3,6 млн. випадків РВІ, 87 тис. госпіталізацій, 231 летальний випадок (Soriano-Gabarro M. et al., 2006).

У Росії щороку реєструється близько 2 млн. випадків гострих кишкових інфекцій (ГКІ), з яких майже 300 тис. випадків зумовлені РВ. При цьому економічні витрати на лікування хворих на РВІ становлять більше 253 млрд. рублів на рік (Львов Д.К., Колобухина Л.В., 2008).

В Україні майже половина випадків ГКІ (28381-46134 щорічно) залишається нерозшифрованою. Через відсутність системи епідеміологічного нагляду за поширенням РВ в Україні, недосконалість лабораторної діагностики РВІ визначити реальну картину захворюваності на РВІ в країні неможливо (Кракович А.В., 2006; Чернишова Л.І., 2007).

Зареєстровані спалахи РВІ у м. Одеса та в Одеській області на початку 2001 року із залученням до епідемічного процесу понад 4400 осіб, з яких 3062 дитини, у м. Києві у 2003 році - 500 дітей, при яких головними чинниками передачі РВ стали забруднена питна вода і деякі продукти харчування, неоднозначно засвідчили активізацію епідемічного процесу, наявність існування реального ризику інфікування населення як безпосередньо через питну воду, так і через воду відкритих водоймищ (Бондаренко В.І., Задорожна В.І., Дзюблик І.В., 2002; Мокієнко А.В. і співавт., 2008).

Таким чином, в Україні існує нагальна необхідність реально оцінити особливості поширення РВ у водних об'єктах довкілля та удосконалити методичні підходи до їх визначення в стічних водах, воді поверхневих та підземних водоймищ, питній воді. Враховуючи значну небезпеку РВІ, особливо для дітей перших років життя, у багатьох країнах впроваджується специфічна профілактика РВІ, проте повна відсутність будь-якої інформації щодо генотипів циркулюючих РВ серед хворих на ГКІ унеможливлює впровадження адекватних профілактичних заходів та попередження зростаючого числа спалахів ГКІ у країні.

Мета і завдання дослідження. Мета: удосконалити методичні підходи до визначення ротавірусів людини у воді та вивчити регіональні особливості їх поширення у водних об'єктах довкілля на території України та серед хворих на гострі кишкові інфекції, дати молекулярно-генетичну характеристику виділеним збудникам.

Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Вивчити в експериментальних умовах сорбційні властивості стандартизованого вітчизняного препарату гідрогелю метилкремнієвої кислоти та на цій основі розробити спосіб концентрації ротавірусів із води.

2. Провести порівняльні дослідження сучасних методів виявлення ротавірусів людини та запропонувати нові методичні підходи до їх індикації у пробах води.

3. Розробити схеми та алгоритми санітарно-вірусологічного дослідження стічних вод, води поверхневих та підземних водоймищ, питної води на ротавіруси людини.

4. Дати оцінку способу концентрації ротавірусів людини на основі гідрогелю метилкремнієвої кислоти з води в умовах його практичного застосування на території 20 областей України (в польових умовах).

5. На моделі 6 міст України визначити особливості циркуляції ротавірусів серед хворих на гострі кишкові інфекції. Дати молекулярно-генетичну характеристику виділеним штамам.

1. Матеріали та методи дослідження

Для реалізації мети і конкретних завдань даної роботи, в її основу було покладено принцип удосконалення методичних підходів до визначення ротавірусів в водних об'єктах довкілля та в клінічному матеріалі від хворих на гострі кишкові інфекції (ГКІ), в якому поєднувались експериментальні, вірусологічні, молекулярно-генетичні та статистичні методи наукового аналізу.

Для проведення експериментальних досліджень було використано РВ людини та тварин - штами SA-11 з інфекційним титром 7,5 lg ТЦД50/мл, НRV-134 та HRV-320 з інфекційною активністю 3,5 lg ТЦД50/мл, 8 штамів - ізолятів 7-го пасажу РВ людини, 210 ізолятів РНК для молекулярно-генетичних досліджень. У роботі було використано перещеплювані культури клітин СНЕВ, Нер-2.

В дослідженнях використовували гідрогель метилкремнієвої кислоти (ГГМКК), вітчизняного виробництва ЗАТ «Екологоохоронна фірма «КРЕОМА-ФАРМ», бентоніт Курцовського родовища (Україна).

Фекальний матеріал від хворих з діагнозом ГКІ отримано з міст Одеса, Київ, Умань, Львів, Суми, Харків.

Проби води різного виду водокористування з водних об'єктів довкілля Вінницької, Волинської, Дніпропетровської, Донецької, Житомирської, Закарпатської, Івано-Франківської, Київської, Кіровоградської, Луганської, Львівської, Одеської, Полтавської, Рівненської, Сумської, Херсонської, Хмельницької, Чернігівської, Чернівецької областей, Автономної Республіки Крим та міста Києва. Молекулярно-генетичні дослідження здійснювали за методом Новікової Н.Л., Подколзіна О.Т. (Москва, 2007).

Аналіз й обробка статистичних даних проведених досліджень проводилась на персональному комп'ютері з використанням пакета прикладних програм STATISTICA 6.0 та MS Excel XP.

2. Результати отриманих досліджень

На початок проведення наших досліджень в Україні не існувало нормативних документів державного рівня, які б регламентували санітарно-вірусологічні дослідження водних об'єктів довкілля щодо кишкових вірусів, в тому числі РВ. За умови відсутності регламенту проведення відповідних досліджень, кількість випадків виділення кишкових вірусів з води була значно меншою за реальну, а виділення РВ взагалі не проводилось. Враховуючи вищевикладене для дослідження води на вміст РВ, мали бути вирішеними, в першу чергу, питання розробки ефективного, простого та доступного для виконання в умовах практичної вірусологічної лабораторії СЕС способу концентрації РВ із значних об'ємів досліджуваних проб води, чітких схем та алгоритмів санітарно-вірусологічного дослідження та їх широка апробація в умовах так званих «польових досліджень» в різних регіонах України. Ось чому стартовим моментом даної роботи стало експериментальне дослідження адсорбційної ефективності стандартизованого препарату вітчизняного виробництва ГГМКК по відношенню до штамів РВ людини та тварин і розробка на цій основі нового способу концентрації РВ. Вибір ГГМКК в якості предмету дослідження був обумовлений фізико-хімічними властивостями сорбенту, стандартизованою формою його випуску в Україні, доступністю для придбання в мережі аптечних установ та попередніми дослідженнями по застосуванню ГГМКК (Ентеросгелю) для лікування хворих на РВІ, проведеними в НМАПО за участі кафедри вірусології.

Вивчення сорбційних властивостей гідрогелю метилкремнієвої кислоти щодо ротавірусів та науково-методичне обґрунтування його застосування для концентрування ротавірусів з води. Вивчали процеси адсорбції РВ людини і тварин штамів SA-11, HRV-134, HRV-320 сорбентом ГГМКК залежно від біологічних характеристик вірусу, дози сорбенту, рН та катіонного складу реакційного середовища. Встановлено, що внесення ГГМКК в дозах від 10 мг/10 мл до 200 мг/10 мл у досліджувані проби рідких середовищ та проби води, що містили РВ мавп SA-11, призводило до адсорбції глобулами гелю від 78,5% до 99,7% вірусу. Аналогічні результати були отримані і при вивченні адсорбційних властивостей ГГМКК по відношенню до РВ людини НRV-134 та НRV-320. При цьому максимальний відсоток адсорбованих глобулами ГГМКК вірусу складав відповідно для НRV-134 - 94,9±1,0%, НRV-320 - 95, 9±1,0%.

Показано, що збільшення дози сорбенту до 500 мг/10 мл та додаткове внесення одно- та двовалентних катіонів у проби води суттєво не впливали на ефективність адсорбції ГГМКК вірусу.

Встановлено вплив рН реакційного середовища на ефективність адсорбції штамів SA-11, HRV-134, HRV-320 сорбентом ГГМКК: оптимальні значення рН для ефективної адсорбції знаходились в інтервалі 5,0-5,5. При цих значеннях рН адсорбувалось: РВ HRV-134 - від 93,7±0,2% до 96,4±0,4%; РВ SA-11 - від 93,4±0,3% до 97,9±0,7%.

Важливою ланкою у розробці нового способу концентрації РВ з проб води стало вивчення умов елюції РВ з глобул ГГМК без значних втрат, що забезпечить у подальшому якісну індикацію збудника, його виділення та ідентифікацію в живій системі, здійснення молекулярно-генетичних досліджень. Ефективність елюції РВ різними елюючими сумішами досліджували методами електронної мікроскопії, РНГА із специфічним еритроцитарним діагностикумом та титруванням вірусу в культурі клітин за ЦПД. Було встановлено, що найбільшу елюючу здатність виявили: 0,05М трис-буфер (рН 9,0); 0,14М фосфатно-сольовий буфер рН (8,5), 0,05М фосфатно-сольовий буфер (рН 8,4-9,0); 1М глікоколевий буфер (рН 8,8). Максимальні титри інфекційної активності вірусу отримували при застосуванні елюючих сумішей з рН 8,4-9,0.

Визначені нами умови адсорбції та елюції стали науково-методичним підгрунттям до розробки нового способу та схем концентрації РВ з використанням ГГМКК з проб питної води, води поверхневих та підземних водоймищ та стічної води.

Вивчення ефективності та оцінка способу концентрації ротавірусів на основі гідрогелю метилкремнієвої кислоти з води в різних регіонах України (дослідження в польових умовах). Апробацію розробленого та запропонованого способу та схем концентрації РВ на основі ГГМКК було проведено в 20 регіонах України в умовах роботи практичних вірусологічних лабораторій СЕС міського та обласного підпорядкування. Було відібрано 2188 проб води різного виду водокористування та ступеня забруднення. Концентрацію ротавірусів за допомогою ГГМКК проводили за запропонованими нами схемами. В якості методів порівняння застосовували бентонітовий метод.

В порівняльних дослідженнях встановлено, що застосування способу та схем концентрування РВ на основі ГГМКК підвищувало ефективність виявлення РВ у пробах води, відібраних в м. Одесі та Одеській області в 5,2 рази, в пробах води Житомирської області - в 3,9 рази, Івано-Франківської області - у 6 разів, Рівненської та Сумської - в 5 разів, Автономної Республіки Крим - в 3 рази.

Апробація способу та схем концентрування РВ в польових умовах в цілому показала їх високу ефективність при застосуванні проб води різної якості, з різних регіонів України та в умовах роботи практичних вірусологічних лабораторій СЕС. Показано, що застосування способу концентрації РВ на основі ГГМКК за ефективністю мало значну превагу над методом порівняння при дослідженні питної води - в 9,0 разів, стічної води і для води поверхневих (відкритих) водоймищ - в 4,4 рази, що було статистично достовірно р<0,05.

Удосконалення методичних підходів до індикації ротавірусів у пробах води різного виду водокористування. Відомо, що на завершальному етапі санітарно-вірусологічного контролю якості води після відбору проб води, їх підготовки та етапу концентрування вірусів у пробах, здійснюється виділення та ідентифікація виділеного вірусу. Процес виділення вірусу здійснюється в живих системах, на сучасному рівні переважно в перещеплюваних культурах клітин, чутливих до вірусу. Цей етап вимагає надзвичайно високої професійної кваліфікації, спеціальних вимог для культивування клітин в умовах in vitro, якісних середовищ та дороговартісного обладнання, надто тривалий за часом (від кількох тижнів до 2 місяців) та низькоефективний. В країнах Європейського Союзу все частіше вдаються не до методів виділення вірусу, а до індикації вірусу молекулярно-генетичними методами. Відповідно їх застосування також вимагає умов спеціально обладнаної ПЛР-лабораторії, високої кваліфікації працівників, вони високовартісні, проте більш ефективні у порівнянні з класичними вірусологічними методами. Враховуючи традиції санітарно-вірусологічних досліджень в нашій країні, значні наукові досягнення української школи вірусологів, здобуті під керівництвом професорів В.М. Гиріна та В.П. Широбокова, ми підійшли до розробки алгоритмів санітарно-вірусологічного дослідження води, поєднуючи класичний вірусологічний підхід з новими експресними методами індикації РВ.

Вперше нами запропоновані до застосування у санітарній вірусології на етапі індикації вірусів у пробах води прості/швидкі тести (ПШТ) на основі ІХА та доведена їх ефективність, простота виконання, доступність та експресність в отриманні кінцевого результату. Досліджено 4376 зразків концентратів трьома методами паралельно. Встановлено, що при застосуванні запропонованого нами алгоритму: методом ІФА було виявлено позитивних на РВ зразків - 29,5%, методом ПЛР-ЗТ - 33,0%, ПШТ на основі ІХА - 28,2%. При порівнянні ПШТ на основі ІХА та ІФА були отримані результати, що достовірно не відрізнялись між собою (р>0,05). За специфічністю та чутливістю ПШТ на основі ІХА не поступалися ІФА. Встановлено, що ефективність індикації РВ ПШТ у порівнянні з класичним вірусологічним методом виділення вірусу в культурі клітин Нер-2 підвищувалась в середньому у 5 разів.

Важливим кінцевим результатом проведеної нами роботи стали вперше розроблені та видані Методичні вказівки державного рівня «Санітарно-вірусологічний контроль водних об'єктів», затверджені Наказом Міністра охорони здоров'я України від 30.06.2007 року за №284.

Особливості циркуляції ротавірусів у людській популяції та у водних об'єктах довкілля на території України. За даними ВООЗ, майже 25% населення планети ризикує дістати хвороби, пов'язані зі споживанням неякісної питної води. Це обумовлено загальним погіршенням стану поверхневих (відкритих) і підземних водойм в результаті забруднення господарсько-побутовими стічними водами, які є основними джерелами вірусного забруднення. Все більш помітним стає несприятливий вплив стічних вод і на поверхневі та підземні вододжерела України (Мокієнко А.В. і співавт., 2008; Мокієнко А.В., 2009).

При дослідженні проб води поверхневих (відкритих) і підземних водоймищ РВ були виявлені в 27,5% випадків. Слід відмітити, що у ряді випадків РВ були виявлені із питної води в м. Одеса та Одеській області (10,7%), Житомирської області (8,6%), Івано-Франківської області (12,8%), Рівненської та Сумської областей (по 10,7%), АР Крим (19,5%). Представлені дані свідчать про реальний ризик інфікування населення України як через питну воду, так і через воду поверхневих (відкритих) підземних водойм, що використовуються для культурно-побутових і спортивно-оздоровчих цілей (купання, заняття водними видами спорту, риболовство, зрошення полів тощо).

Важливим критерієм оцінки епідемічної ситуації з РВІ в Україні є не тільки моніторинг циркуляції РВ у водних об'єктах довкілля, але і поширення збудника серед окремих груп населення, особливо серед дітей, хворих на ГКІ. За період з грудня 2006 по квітень 2007 рр. нами обстежено 647 дітей з діагнозом ГКІ, які перебували на лікуванні у педіатричних відділеннях міст Києва, Львова, Умані, обласних лікарень Одеської, Сумської, Харківської областей. Етіологічна роль РВ групи А була встановлена у 20,7% випадків. У більшості дітей з РВІ при госпіталізації описано поєднання трьох основних синдромів: блювоти, діареї, гіпертермії, у решти діагностовано поєднання 2-х провідних синдромів: діареї і гіпертермії або діареї і блювоти.

Встановлено, що у віковій групі до 3 років середня частота виявлення ротавірусів по Україні була найвищою (70,1±4,0)%, у віковій групі від 3 до 6 років - дещо нижчою (23,1±3,6)%, у дітей старше 7 років - досить низькою (6,7±2,2)%.

Вперше встановлено циркуляцію вірусів G1-G4, G9 типів серед дитячого населення України в зимово-весняний період 2006-2007 рр. Проведено [P]- і G-типування природних ізолятів РВ з домінуючими і незвичними електрофоретипами РНК. Було досліджено 210 ізолятів геномної РНК РВ, виділених із копрофільтратів від дітей з ГКІ. Були виявлені [Р-] і G-генотипи в 176 (83,8%) та 182 (86,7%) випадках, відповідно. У 3,3% ізолятів не було визначено Р-генотип, у 4,3% - G-генотип і в 5,7% не визначались обидва генотипи, тобто нетиповані.

В 2007-2009 рр. у Києві, Львові, Одесі та Харкові домінуючим був генотип Р[8]G1, який зустрічався в середньому у 70% випадків. Генотип Р[8]G4 мав домінуюче місце у Сумах у 2007 році. Генотип Р[4]G2 посідав перше місце по поширенню в Умані у 2007 р. В сезон 2008 та 2009 рр. РВ генотип Р[4]G2 не виявлено. В м. Одеса був виявлений РВ з рідкісним генотипом Р[8]G9. В деяких клінічних пробах одночасно було виявлено РВ декількох генотипів. Отримані результати можуть бути використанні в подальшому при вирішенні питання впровадження специфічної профілактики РВІ.

Висновки

ротавірус сорбційний гідрогель метилкремнієвий

У дисертації вирішено актуальне наукове завдання - встановлено поширення ротавірусів людини групи А на території України, визначено їх [Р]G-генотипи та удосконалено санітарно-вірусологічний контроль якості води різного виду водокористування і ступеня забруднення по відношенню до її епідемічної безпеки. Експериментально обґрунтовано новий спосіб концентрації ротавірусів з води, удосконалено методичні підходи і схеми концентрування, запропоновано алгоритми санітарно-вірусологічного дослідження стічної, питної та води поверхневих (відкритих) і підземних водоймищ для моніторингу ротавірусної інфекції.

1. Визначено умови адсорбційної взаємодії сорбенту гідрогелю метилкремнієвої кислоти з ротавірусами людини та тварин в залежності від рН і катіонного складу реакційного середовища, дози сорбенту і біологічної характеристики штамів ротавірусів. Визначені основні параметри ефективної адсорбції ротавірусів людини і тварин гідрогелем метилкремнієвої кислоти - рН 5,0-5,5, дози сорбенту 10-20 мг на 1 мл.

2. Встановлено умови елюції ротавірусів людини і тварин з глобул гідрогелю метилкремнієвої кислоти в залежності від хімічного складу елюентів, рН, наявності чи відсутності одно- та двохвалентних катіонів Na+, Са2+ і Мg2+. Запропоновані найбільш ефективні елюючі суміші - 0,05М трис-буфер (рН 9,0); 0,14М фосфатно-сольовий буфер (рН 8,4); 0,05М фосфатно-сольовий буфер (рН 8,4-9,0); 1М глікоколевий буфер (рН 8,8).

3. Вперше розроблено та запропоновано спосіб концентрації ротавірусів з води стандартизованим препаратом гідрогелю метилкремнієвої кислоти вітчизняного виробництва для санітарно-вірусологічного контролю водних об'єктів довкілля. Спосіб дозволяє отримати 500-кратну концентрацію ротавірусів з проб води, простий і доступний для виконання в умовах практичної вірусологічної лабораторії СЕС.

4. Розроблено та запропоновано схеми концентрування ротавірусів з води поверхневих та підземних водойм, із стічної та питної води, які включають в себе етапи обробки проб та їх тривалість, об'єм проби води, оптимальну кількість внесеного сорбенту, величину рН реакційного середовища та загальні затрати часу.

5. Удосконалено методичні підходи та запропоновано нові алгоритми санітарно-вірусологічного дослідження різних типів води. Вперше для санітарно-вірусологічних досліджень на етапі індикації збудника запропоновані прості/швидкі тести на основі імунохроматографічного аналізу (ІХА). Встановлено, що ефективність індикації ротавірусів простими/швидкими тестами у порівнянні з класичним вірусологічним методом виділення вірусу в культурі клітин Нер-2 підвищувалась в середньому у 5 разів.

6. Вперше досліджено водні об'єкти України на наявність ротавірусів та отримані новітні дані щодо їх регіонального поширення у період 2005-2006 рр. Ротавіруси виявлено в 30,3% відібраних проб стічної води та в 27,5% проб води поверхневих та підземних водоймищ 20 областей країни.

7. Досліджено циркуляцію ротавірусів серед дітей, хворих на ГКІ, в шести містах України. За результатами лабораторного обстеження хворих дітей ротавірус виявлено у 20,7% обстежених. Підтверджено зимово-весняну сезонність та встановлено, що у віковій групі дітей до 3-х років середня частота виявлення ротавірусів була найвищою і складала 70,1±4,0%.

8. Вперше проведено молекулярно-генетичні дослідження та аналіз [Р]G генотипів ротавірусів групи А, циркулюючих в Києві, Одесі, Львові, Умані, Чернігові та Сумах. В результаті генотипування 210 ізолятів, виділених за період 2006-2009 рр., визначено особливості територіального поширення п'яти основних генотипів ротавірусів групи А: Р[8]G1, Р[8]G2, Р[8]G3, Р[8]G4, Р[4]G2, що має першочергове значення при вирішенні питання впровадження специфічної профілактики ротавірусної інфекції.

Література

1. Козлова І.А. Спалах ротавірусної інфекції в м. Києві / І.А. Козлова, А.В. Кракович, О.В. Обертинська, Л.А. Колос, Н.І. Миколенко, О.В. Маринюк, І.В.Дзюблик, В.П. Широбоков // Зб. наук. праць співроб. КМАПО. Вип. 14, кн. 2. - К., 2005. - C. 446-451

2. Обертинська О.В. Вивчення та оцінка ефективності розробленого способу концентрування кишкових вірусів із води різного походження в польових умовах / О.В. Обертинська, Н.І. Миколенко, О.В. Маринюк, Є.Ф.Приходько, О.В. Романюк // Збірник наукових праць КМАПО.- К., 2006. - Вип. 15, кн. 2. - С. 589-594.

3. Дзюблик І.В. Ротавірусна інфекція: особливості лабораторної діагностики, клінічного перебігу та профілактики у новонароджених / І.В. Дзюблик, Є.Є. Шунько, О.О. Костенко, О.В. Ковалюк, Обертинська О.В. , І.П. Тунда, В.В. Бобир // Укр. Мед. Часопис. - 2007. - №3 (59). - Т. V-VІІ. - С. 102-106.

4. Надрага О.Б. Вірусні захворювання кишок у дітей / О.Б. Надрага, І.В. Дзюблик, О.В. Обертинська, І.Ф. Самборська, О.В.Ковалюк // Перинатологія і педіатрія. - 2008. - №2 (34). - С. 107-111.

Размещено на Allbest.ru