Мікробіологічне обгрунтування розробки і застосування поживних середовищ для культивування мікобактерій туберкульозу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державна установа "Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова

Академії медичних наук України"

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Мікробіологічне обгрунтування розробки і застосування поживних середовищ для культивування мікобактерій туберкульозу

Колодій С.А.

03.00.07 - мікробіологія

Харків - 2009

Вступ

Актуальність теми. Туберкульоз експертами ВООЗ проголошено глобальною небезпекою. Цю недугу вважають найпоширенішою в світі інфекційною патологією, що займає перше місце в структурі смертності від інфекційних хвороб. З 1995 р. епідемія туберкульозу була зареєстрована в Україні (Фещенко Ю. І., 2002; Мельник В. М., 2006; Ткаченко Т. Е., 2006 та ін.). У нашій країні туберкульоз багато авторів вважають не тільки медичною, але і соціальною проблемою, яка становить національну небезпеку. Епідеміологічні показники цього захворювання погіршуються. Економічні збитки обумовлені великим рівнем смертності, втратою тимчасової і стійкої працездатності. Ця недуга руйнує суспільний устрій країни, охоплюючи найбідніші та найвразливіші прошарки населення (Хрулёва Т. С., 2004; Ільницька І. І., 2005; Ільницький І.Г., 2007 та ін.).

Вдосконалення методів діагностики і лікування хворих на туберкульоз залежить від подальшого розвитку бактеріологічних методів дослідження. Виявлення мікобактерій туберкульозу має вирішальне значення при мікробіологічному підтвердженні діагнозу туберкульозу (Александров А.А., 2006; Черенько С.О., 2008 та ін.).

Велике значення надається виявленню не лише типових, але і змінених форм мікобактерій, розкриттю біологічних властивостей збудника і особливостей його взаємовідношення з макроорганізмом. Рутинні методи мікробіологічної діагностики туберкульозу на даному етапі вважають неспроможними через виникнення змін в бактеріальній популяції під впливом застосування антимікробних хіміотерапевтичних засобів. Актуальним залишається пошук методів по виявленню варіантів М. tuberculosis, які зазнали змін з різноманітних причин (Киншт В.Н., 2005; Голышевская В.И., 2006; Сибірна Р.І., 2006 та ін.).

Мікробіологічне обґрунтування розробки і застосування поживних середовищ для культивування мікобактерій туберкульозу, їх застосування у поєднанні з найновішими експрес методами діагностики туберкульозу залишаються актуальними завданнями.

Таким чином, цей напрям досліджень є актуальним для розробки та застосування поживних середовищ для ізоляції мікобактерій туберкульозу з досліджуваного матеріалу.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом науково-дослідної теми № 7 кафедри мікробіології та технології переробки Вінницького державного аграрного університету, а саме "Вивчення проблем туберкульозу. Розробка методів діагностики туберкульозу" Міністерства аграрної політики України (№ державної реєстрації 0199U004037). Дисертантка особисто працювала над підбором компонентів та їх концентрацій при розробці нового поживного середовища та розробляла спосіб виділення збудника туберкульозу після поглибленого вивчення його біологічних властивостей. Тема дисертації затверджена на засіданні Вченої ради Вінницького державного аграрного університету (протокол № 9 від 29.06.2006 р.).

Мета наукового дослідження: мікробіологічне обґрунтування ефективного застосування нових способів діагностики та поживних середовищ для виділення з біологічного матеріалу мікобактерій туберкульозу.

Відповідно до поставленої мети визначено основні завдання:

Вдосконалити спосіб підготовки біологічного матеріалу для виділення чистої культури збудника туберкульозу;

Розробити поживне середовище для виділення чистої культури збудника туберкульозу;

Вивчити ефективність застосування розчинів антисептиків декаметоксину, мірамістину для знезараження посівного біологічного матеріалу під час мікробіологічної діагностики туберкульозу;

Дослідити ефективність експрес методики виділення з біологічного матеріалу чистої культури збудника туберкульозу;

Провести поглиблене вивчення біологічних властивостей мікобактерій туберкульозу.

Об'єкт дослідження - тест-культури Mycobacterium tuberculosis H37 RV, Mycobacterium tuberculosis (резистентний до протитуберкульозних препаратів), Mycobacterium tuberculosis (чутливий до протитуберкульозних препаратів), Mycobacterium bovis та їх біологічна характеристика.

Предмет дослідження - поживні середовища для бактеріологічної діагностики мікобактерій туберкульозу, лікарські антисептичні препарати декаметоксин, мірамістин.

Методи дослідження: мікробіологічні (виділення чистої культури; вивчення деконтамінуючих властивостей антисептиків), біохімічні (ідентифікація бактерій), фізико-хімічні, математико-статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі проведеного поглибленого вивчення біологічних властивостей збудника туберкульозу виявлено, що в процесі життєдіяльності мікобактерії потребують підвищеного вмісту лінолевої кислоти та заліза. Розроблено поживне середовище з найбільш оптимальним вмістом поживних речовин, з додаванням сухої адаптованої молочної суміші Nestogen. Введення даного компоненту дало можливість значно покращити якість діагностики на туберкульоз та скоротити терміни постановки діагнозу (попередні результати дослідження можна отримати через 24-48 год.). Створено новий спосіб виділення збудника туберкульозу.

Показано, що застосування 0,1% розчинів декаметоксину та мірамістину для передпосівної обробки патологічного матеріалу при дослідженні на туберкульоз є оптимальним, оскільки дає можливість подавити ріст супутньої мікрофлори і не пригнічувати ріст мікобактерій.

В роботі обґрунтовано методику мікробіологічної діагностики для моніторингу захворювання на туберкульоз для впровадження в мережу лікувально-профілактичних протитуберкульозних установ.

Практичне значення отриманих результатів. Обґрунтовано доціль-ність систематичного мікробіологічного обстеження осіб з підозрою на захворювання туберкульозом з використанням вдосконалених способів виділення збудника цього захворювання. Обґрунтовано застосування нового ефективного поживного середовища для мікробіологічної діагностики туберку-льозу. На середовище ВКГ із стимулятором росту для прискореного виявлення мікобактерій туберкульозу одержано сертифікат про державну реєстрацію № 221/00 - 3002.00.000. Середовище серійно виробляє ДЕЗМП Інституту біоорганічної, неорганічної хімії Національної Академії Наук України спільно з Закритим акціонерним товариством "Ганза". Наказом МОЗ України від 06.02.2002р. за №45 затверджено Інструкцію з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції та виявлення мікобактерій за допомогою середовища ВКГ (стимулятор росту і середовище ВКГ). Отримано три патенти на корисні моделі по вдосконаленню поживного середовища та способу виділення збудника туберкульозу. Розроблено методичні рекомендації МОЗ України: Сучасні підходи до діагностики туберкульозу. - К, 2006. Одержані результати досліджень впроваджено в роботу лабораторії мікробіології туберкульозу ДУ "Інститут фтизіатрії і пульмонології ім. Ф. Г. Яновського АМН України" та навчальні програми на кафедрах мікробіології, вірусології та імунології Вінницького національного медичного університету ім. М. І. Пирогова МОЗ України, Луганського державного медичного університету МОЗ України, медичного інституту Сумського національного медичного університету МОН України, на кафедрі мікробіології та технології переробки Вінницького аграрного університету МАП України.

Особистий внесок здобувача. Дисертант самостійно проаналізувала наукову літературу та провела патентно-інформаційний пошук з проблеми мікробіологічної діагностики туберкульозу. Особисто поглиблено вивчила біологічні властивості мікобактерій; з'ясувала підвищену потребу мікобактерій у лінолевій кислоті та залізі. Автор самостійно проводила пошук різноманітних складових компонентів нового поживного середовища, підбирала дослідним шляхом їх співвідношення. Здобувачем доведена оптимальна концентрація антисептиків декаметоксину і мірамістину для передпосівної обробки біологічного матеріалу. Мікробіологічні дослідження та забір матеріалу проведені автором особисто. Дисертанту належить вирішальна роль у визначенні мети та завдання дослідження, шляхів їх реалізації, плануванні та проведенні експериментальних досліджень, обробці результатів, інтерпретації та узагальненні одержаних даних, формуванні основних положень та висновків, а також оформлення дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні фрагменти дисертації повідомлено і обговорено на міжнародних наукових конференціях "Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни" (Львів, 2006, 2007), ХI конгресі Світової Федерації Українських Лікарських Товариств (Полтава - Київ - Чикаго, 2006), IV Міжнародній науково-практичній конференції "Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів" (Київ, 2006), IX з'їзді Всеукраїнського Лікарського Товариства (Київ, 2007), 22 та 23 науково-практичних конференціях вищих медичних закладів освіти Вінницького регіону (Київ - Вінниця, 2006; Вінниця, 2007), II та V Міжнародних науково-практичних конференціях "Наука и образование - 2007", "Стратегические вопросы мировой науки - 2007 (Днепропетровск, 2007), науково-практичній конференції з міжнародною участю спеціалістів "Актуальні питання стратегії, тактики застосування та дослідження антибіотиків, антисептиків, дезінфектантів" (Вінниця, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 29 наукових робіт, серед яких 6 статей в наукових фахових журналах за переліком, затвердженим ВАК України, одні методичні рекомендації МОЗ України, 3 патенти України на корисні моделі, лабораторний практикум з мікробіології для самостійної роботи студентів, 14 робіт в збірниках матеріалів, з'їздів, конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 161 сторінці комп'ютерного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали та методи дослідження", 4 розділів власних досліджень, аналізу і обговорення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій та списку використаних джерел (всього 236 найменувань, з яких 42 іноземних). Роботу ілюстровано 12 таблицями обсягом 11 сторінок та 11 рисунками обсягом 9 сторінок.

1. Основний зміст роботи

У вступі проаналізовано стан проблеми туберкульозу в світі та Україні, обґрунтовано актуальність теми дисертації, визначено зв'язок роботи з науково-дослідною темою, викладено мету та наукові задачі, які розв'язувались при виконанні дисертаційної роботи, розкрито наукову новизну та практичне значення отриманих результатів, визначено особистий внесок здобувача, наведено дані про апробацію і публікації результатів роботи, вказані її структура та обсяг.

Огляд літератури містить три розділи, в яких стисло викладено відомості про епідеміологічну ситуацію з туберкульозу в Україні, біологічні властивості мікобактерій туберкульозу, сучасні методи мікробіологічної діагностики туберкульозу.

Матеріали та методи дослідження. Проведено вивчення протимікробної активності лікарських антисептичних препаратів декаметоксину, мірамістину на 17 штамах мікроорганізмів. Охарактеризовано фізико-хімічні властивості декаметоксину, мірамістину, які належать до четвертинних амонієвих сполук, які серійно випускає вітчизняна медична промисловість для профілактики та лікування гнійно-запальних інфекційних захворювань. Деконтамінуючі властивості декаметоксину, мірамістину на супутню мікрофлору біологічного матеріалу вивчали в порівнянні з розчинами їдкого калію (4%), сірчаної кислоти (5%).

В експериментальному дослідженні мікробіологічною моделлю був набір референтних штамів S. aureus ATCC 25923, S. albus Wood 46, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae NCTC 5055, P. aerugenosa ATCC 27853, E. faecalis ATCC 6783, B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 669, B. megaterium ATCC 6542, C. albicans ATCC 10231, M. tuberculosis H37 Rv, M. bovis 8, M. bovis BCG, а також клінічні штами S. epidermidis 57, B. anthracoides 1312, P. morgani 1702, C. albicans 669/1080, виділені від хворих з гнійно-запальними захворюваннями різної локалізації.

Мікобактерії туберкульозу потребують складних поживних середовищ, які містять білковий субстрат, гліцерин, вуглець, хлор, сірку, фосфор, азот, іони магнію, калію, натрію та заліза. Крім необхідних поживних речовин вони використовують достатню кількість вітамінів (біотин, рибофлавін, нікотинову кислоту та ін.).

З метою порівняння для посіву патологічного матеріалу застосовували яєчні середовища Левенштейна-Єнсена, Фінна 2, ВКГ із стимулятором росту, метод мікрокультивування мікобактерій за Прайсом.

Для приготування поживних середовищ і реактивів готували наважки речовин, для чого використовували торсійні ваги, які дозволяли визначати масу речовини з похибкою 0,0001. Перевірку вимірювальних приладів проводили своєчасно, що вказано в перевірочних сертифікатах метрологічного контролю.

Мікобактерії туберкульозу на різних поживних середовищах характери-зувались наступними культуральними ознаками. На поживному середовищі Левенштейна-Єнсена ознаки росту мікобактерій туберкульозу виявляли на 20-40 добу з утворенням зморшкуватих, сухуватих, крихких з нерівними краями колоній матового кольору, які іноді нагадували цвітну капусту.

На поживному середовищі Фінна 2 сухі зморшкуваті колонії мікобактерій туберкульозу з'являлись на 20-30 добу, які спочатку мали колір слонової кістки, а пізніше забарвлювались в жовтий колір.

На кров'яному поживному середовищі за Прайсом в мазках виявляли харак-терні мікроколонії, які забарвлювались у червоний колір і нагадували переплетені джгути, що складались з великої кількості притиснутих одна до одної клітин.

На поживному середовищі ВКГ візуально виявляли характерні поодинокі соскоподібні колонії у вигляді крапель через 24-48 годин, на 4-5 добу реєстрували характерний газонний ріст мікобактерій туберкульозу.

На поживному середовищі САМСУМ реєстрували появу воскоподібних колоній через 24-48 годин. На 2-3 добу виявляли на поверхні поживного середовища газонний ріст мікобактерій туберкульозу.

Ідентифікацію мікобактерій туберкульозу проводили на підставі трива-лості утворення колоній, ніацинового тесту, нікотинамінідазної активності, відновлення нітратів, наявності каталази, пероксидази, формамідазної активності, а також біологічним методом на тваринах.

Для виявлення мікобактерій туберкульозу застосовували звичайну бактеріоскопію мазків, пофарбованих по Цілю-Нільсену, люмінесцентну і комп'ютерну мікроскопію. Для комп'ютерної мікроскопії використовували мікроскоп МБР-1 з відеокамерою Quick Cam Home фірми Philips та персональним комп'ютером Pentium з мінімальною конфігурацією.

Препарати мікобактерій туберкульозу для електронної мікроскопії готували за загальновживаною методикою. Мікобактерії фіксували у 1% забуференому розчині чотирьохокису осмію протягом 2-3 годин при температурі 4 єС. Після чого бактеріальні клітини відмивали у буферному розчині, дегідратували у спиртах зростаючої концентрації, ацетоні та вносили у суміш епоксидних смол (ероп-аралдіт). Полімеризацію здійснювали в термостаті при 60 єС протягом двох діб. Ультратонкі зрізи готували на ультра мікротомі УМТП-6. Після контрастування цитратом свинцю препарати вивчали під електронним мікроскопом з прискорюючою напругою 75 кВ.

Числові величини підлягали статистичній обробці за загальноприйнятими методами варіаційної статистики на комп'ютері з застосуванням програми Statgraf. Показник вірогідності вираховували за t-критерієм Стьюдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Результати досліджень викладено у третьому-шостому розділах. Встановлено, що розчини антисеп-тиків декаметоксину, мірамістину не володіють протимікробною дією на мікобактерії туберкульозу. Доведено, що декаметоксин, мірамістин мають високу мікробоцидну активність по відношенню до мікроорганізмів, які входять до складу супутньої мікрофлори досліджуваного матеріалу (табл. 1, рис. 1).

Таблиця 1 Мінімальна мікробоцидна активність декаметоксину, мірамістину по відношенню до мікроорганізмів супутньої мікрофлори досліджуваного матеріалу (мкг/мл)

З наведених у табл. 1 та на рис. 1 даних видно, що декаметоксин проявляв високу мікробоцидну активність по відношенню до S. aureus АТСС 25923 (0,24±0,01 мкг/мл), S. albus Wood 46 (0,48±0,02 мкг/мл), S. epidermidis 57 (0,48±0,04 мкг/мл); Е. coli АТСС 25922 (15,6±0,1 мкг/мл), Е. faecalis АТСС 6783 (1,95±0,3 мкг/мл), В. subtilis АТСС 6633 (1,95±0,02 мкг/мл), В. megaterium АТСС 6542 (7,8±0,4 мкг/мл), С. albicans АТСС 10231 (3,9±0,5 мкг/мл), С. albicans 669/1080 (3,9±0,3 мкг/мл). Чутливими до декаметоксину виявились P. aeruginosa АТСС 27853 (62,5±4,8 мкг/мл), В. anthracoides 1312 (15,6±0,5 мкг/мл), К. pneumoniae NCTC 5055 (15,67±0,27 мкг/мл), P. morgani 1702 (15,6±3,6 мкг/мл).

Антисептик мірамістин (табл. 1, рис. 1) проявляв високу антимікробну активність до S. aureus АТСС 25923 (0,96±0,02 мкг/мл), S. albus Wood 46 (1,95± 0,02 мкг/мл), S. epidermidis 57 (1,95±0,03 мкг/мл); Е. faecalis АТСС 6783 (7,8± 0,1 мкг/мл), В. subtilis АТСС 6633 (3,9±0,3 мкг/мл), В. cereus АТСС 669 (7,8± 0,1 мкг/мл). Встановлено, що помірно чутливими до мірамістину були В. megaterium АТСС 6542 (15,6±0,2 мкг/мл), С. albicans АТСС 10231 (15,6± 2,8 мкг/мл), С. albicans 669/1080 (15,6±2,9 мкг/мл); чутливими до мірамістину виявились К. pneumoniae NCTC 5055 (31,2±3,5 мкг/мл), В. anthracoides 1312 (31,2±0,5 мкг/мл), Е. соїі АТСС 25922 (62,5±4,8 мкг/мл).

Розчин сірчаної кислоти (5 %) проявляв надійну деконтамінуючу активність на супутню мікрофлору досліджуваного матеріалу, що дозволило з 60 проб виділити у 58 випадках мікобактерії туберкульозу (96,7%) на середовищі Левенштейна-Єнсена. В аналогічних умовах розчин їдкого калію (4%) забезпечував деконтамінацію супутніх мікроорганізмів.

Рис. 1. Мінімальна мікробоцидна активність декаметоксину, мірамістину по відношенню до тест-мікроорганізмів.

Так, з 57 проб (всього було 60 проб) були ізольовані після деконтамінації мікобактерії туберкульозу (95%), що свідчить про досить високий рівень ізоляції збудника туберкульозу з досліджуваного матеріалу (рис. 2).

Відоме живильне середовище для ізоляції чистої культури збудника туберкульозу, яке містить сухий ферментативний пептон, агар-агар і воду. Проте це середовище не має достатнього набору інгредієнтів, необхідних для розвитку мікобактерій.

Рис. 2. Вплив деконтамінації антисептичними розчинами досліджуваного матеріалу на висівання МБТ

В роботі наводяться результати розробки та застосування живильного середовища для ізоляції культури збудника туберкульозу, що містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду, яке додатково містить суху адаптовану молочну суміш із залізом - Nestogen при такому співвідношенні, мас.%: агар-агар 1-2; сухий ферментативний пептон8-12; Nestogen 1-3; вода - решта.

Введення до складу поживного середовища Nestogen активізувало ріст мікобактерій, збагачувало його лінолевою кислотою та залізом, яких недостатньо в ферментативному пептоні у кількості заліза (0,06-0,18) мг, лінолевої кислоти (0,04-0,1) мг на 100 мл готового живильного середовища.

Поживне середовище використовують для культивування мікобактерій туберкульозу, їх прискореного виявлення в інфікованому матеріалі. Ефективність запропонованого середовища забезпечували його компоненти. Одночасно з цим збільшувався вихід мікобактерій туберкульозу на живильному середовищі, що забезпечувало високу точність діагностики туберкульозу.

Співвідношення компонентів дозволяло скоротити тривалість вирощування мікобактерій до 24 годин, а час мікробіологічної діагностики туберкульозу зменшити в декілька разів.

В результаті досліджень встановлено, що на середовищі, що використане як прототип, ріст мікобактерій спостерігали через 20-60 діб. На запропонованому середовищі через 24 години після термостатування реєстрували ріст усіх культур. Через 72 години спостерігали газонний ріст колоній мікобактерій.

Якісний та кількісний вміст усіх компонентів є необхідним та оптимальним для оцінки їх позитивних властивостей та досягнення мікробіологічного результату. Встановлено, що поживне середовище дозволило скоротити тривалість бактеріологічного дослідження у 30-90 разів у порівнянні з загальновживаними елективними середовищами, які застосовують для виділення чистої культури збудника туберкульозу.

Виділення збудника на новому досліджуваному середовищі здійснюють у наступній послідовності. Для виділення збудника туберкульозу готують живильне середовище, здійснюють підготовку патологічного матеріалу для його висіву на живильне середовище. Посівний матеріал попередньо обробляють за загальновідомою методикою. Контролем служили живильні середовища Левенштейна-Єнсена, Фінна 2.

Досліди проводили на тест-штамах мікроорганізмів, а саме: Mycobacte-rium tuberculosis H37Rv, Mycobacterium tuberculosis, виділений від хворих, резистентний до протитуберкульозних хіміотерапевтичних препаратів, Mycobacterium bovis BCG. Як супутню мікрофлору використовували тест-штами мікроорганізмів (табл. 1).

Патологічний матеріал (харкотиння, спинномозкова рідина, частини тканин та інші, тест-культури мікроорганізмів) перед висівом обробляли антисептиком та електромагнітним опроміненням. До підготовленого у співвідношенні 1:1, з подальшою обробкою електромагнітним опроміненням, з потужністю 50 Вт, частотою 8 герц протягом 30-60 хвилин, після чого термостатували протягом 24-48 годин при температурі (37±1)°C і висівали отриману суспензію в чашки Петрі на живильне середовище у дозі 1 мл.

Засіяні чашки Петрі розташовували у термостаті, термостатували при температурі (37±1)°C протягом 1-5 діб. Появу росту колоній спостерігали на 1-5 добу, що вказує на позитивний результат. Відсутність росту мікобактерій після 5 діб вважали негативним результатом. Відсутність росту тест-культур супутньої мікрофлори на середовищі протягом 10 діб вказувало на бактерицидну дію антисептика, який забезпечив надійну деконтамінацію.

Таким чином, застосувати розроблене поживне середовище доцільно для виділення чистої культури мікобактерій туберкульозу, оскільки воно дозволяє визначити життєздатність збудника з подальшим дослідженням його чутливості до антибіотиків, хіміотерапевтичних лікарських засобів, антисептиків, дезінфектантів, біохімічної активності, вірулентності.

Досліджуване поживне середовище вивчали в бактеріологічній лабораторії обласного протитуберкульозного диспансеру. Всього було проведено виділення мікобактерій туберкульозу з 60 зразків патологічного матеріалу (рис. 3, табл. 2).

Як видно з даних рис. 3, табл. 2, при мікроскопії досліджуваного матеріалу у хворих фіброзно-кавернозним туберкульозом мікобактерії виявили в 26,6%. На середовищі Левенштейна-Єнсена (контроль) з харкотиння виділили мікобактерії туберкульозу у 46,6% хворих. Посіви патологічного матеріалу на досліджуване середовище дали в 100% випадків ріст мікобактерій туберкульозу. Отже, позитивні результати бактеріологічного дослідження одержано на поживному середовищі, на яке отримали патент № 21719.

Рис. 3. Частота виявлення МБТ у харкотинні хворих фіброзно-кавернозним туберкульозом легень (%)

Можна зробити висновок, що застосування для бактеріологічного дослідження розробленого поживного середовища дозволяє значно покращити якість виділення МБТ з патологічного матеріалу. Важливо відзначити, що детекція МБТ на розробленому поживному середовищі можлива через 24-72 години. На поживному середовищі Левенштейна-Єнсена для виділення МБТ необхідно 30-90 діб.

Таблиця 2 Порівняльна характеристика виявлення мікобактерій туберкульозу

Таким чином, застосування розробленого поживного середовища скорочує тривалість бактеріологічного дослідження, підвищує ефективність ізоляції МБТ у порівнянні з середовищем Левенштейна-Єнсена. На середовище ВКГ зі стимулятором росту для прискореного виявлення амікобактерій туберкульозу одержано сертифікат про державну реєстрацію №221/00-3002.00.000. Середовище серійно виробляє ДЕЗМП Інституту біоорганічної, неорганічної хімії Національної Академії Наук України спільно з Закритим акціонерним товариством "Ганза".

мікобактерія туберкульоз антисептик мікробіологічний

Висновки

У дисертаційній роботі наведено теоретичні узагальнення і вирішення наукового завдання щодо створення нового поживного середовища для виділення з біологічного матеріалу мікобактерій туберкульозу, застосування антисептичних препаратів для деконтамінації посівного матеріалу та способів виділення МБТ.

1. Встановлено, що декаметоксин проявляє мікробоцидну активність по відношенню до S. aureus АТСС 25923 (0,24±0,01 мкг/мл), S. albus Wood 46 (0,48±0,02 мкг/мл), S. epidermidis 57 (0,48±0,04 мкг/мл); Е. coli АТСС 25922 (15,6±0,1 мкг/мл), Е. faecalis АТСС 6783 (1,95±0,3 мкг/мл), В. subtilis АТСС 6633 (1,95±0,02 мкг/мл), В. megaterium АТСС 6542 (7,8±0,4 мкг/мл), С. albicans АТСС 10231 (3,9±0,5 мкг/мл), С. albicans 669/1080 (3,9±0,3 мкг/мл). Чутливими до декаметоксину виявились P. aeruginosa АТСС 27853 (62,5±4,8 мкг/мл), В. anthracoides 1312 (15,6±0,5 мкг/мл), К. pneumoniae NCTC 5055 (15,67±0,27 мкг/мл), P. morgani 1702 (15,6±3,6 мкг/мл).

2. Доведено, що мірамістин мікробоцидно діє на S. aureus АТСС 25923 (0,96±0,02 мкг/мл), S. albus Wood 46 (1,95±0,02 мкг/мл), S. epidermidis 57 (1,95± 0,03 мкг/мл); Е. faecalis АТСС 6783 (7,8±0,1 мкг/мл), В. subtilis АТСС 6633 (3,9± 0,3 мкг/мл), В. cereus АТСС 669 (7,8±0,1 мкг/мл). Встановлено, що помірно чутливими до мірамістину були В. megaterium АТСС 6542 (15,6±0,2 мкг/мл), С. albicans АТСС 10231 (15,6±2,8 мкг/мл), С. albicans 669/1080 (15,6±2,9 мкг/мл); чутливими до мірамістину виявились К. pneumoniae NCTC 5055 (31,2±3,5 мкг/мл), В. anthracoides 1312 (31,2±0,5 мкг/мл), Е. соїі АТСС 25922 (62,5±4,8 мкг/мл).

3. Декаметоксин, мірамістин мають високу деконтамінуючу активність по відношенню до супутньої мікрофлори посівного матеріалу і забезпечують виділення чистої культури МБТ в понад 90% випадків.

4. Розроблено живильне середовище для виділення чистої культури збудника туберкульозу, що містить сухий ферментативний пептон, агар-агар, воду, яке додатково містить суху адаптовану молочну суміш із залізом - Nestogen при такому співвідношенні, мас.%: агар-агар - 1-2; сухий ферментативний пептон - 8-12; Nestogen - 1-3; вода - решта. Введений до складу середовища Nestogen активізує ріст мікобактерій, збагачує його лінолевою кислотою (0,04-0,1 мг), залізом (0,06-0,18 мг) на 100 мл готового живильного середовища.

5. Досліджено властивості МБТ на новому досліджуваному поживному середовищі та показано, що на ньому через 24-72 год. після посіву проводять детекцію МБТ, визначають їх чутливість до антибіотиків, хіміотерапевтичних лікарських засобів. На досліджуваному середовищі скорочується в декілька десятків разів час на одержання ізольованих колоній МБТ в порівнянні з середовищем Левенштейна-Єнсена.

6. Експериментально доведено, що на досліджуваному поживному середовищі МБТ мають класичний стадійний морфологічний розвиток, який доцільно враховувати в процесі проведення бактеріологічного дослідження патологічного матеріалу.

7. Встановлено, що мікробіологічним обстеженням хворих фіброзно-кавернозним туберкульозом в умовах обласного тубдиспансеру з використанням нового досліджуваного поживного середовища з харкотиння виділяють МБТ в 100% випадків в порівнянні з середовищем Левенштейна-Єнсена (46,6%).

Практичні рекомендації

З метою вдосконалення бактеріологічної діагностики, підвищення кількості ізоляції МБТ з досліджуваного матеріалу рекомендується використання 0,1% розчинів антисептиків декаметоксину, мірамістину для деконтамінації супутньої мікрофлори в посівному матеріалі;

Запропоновано застосування розробленого поживного середовища, на яке одержано сертифікат про державну реєстрацію №221/00-3002.00.000. Середовище серійно виробляє ДЕЗМП Інституту біоорганічної, неорганічної хімії Національної Академії Наук України спільно з ЗАТ "Ганза";

Рекомендовано застосування нового способу виділення збудника туберкульозу.

Вдосконалене поживне середовище та спосіб виділення збудника туберкульозу рекомендовано застосовувати у лікувально-діагностичній мережі, що відображено у методичних рекомендаціях МОЗ України "Сучасні підходи до діагностики туберкульозу" (Київ, 2006. - 39с) та лабораторному практикумі "Мікробіологія" для самостійної роботи студентів.

Наказом МОЗ України від 06. 02. 2002р. за № 45 затверджено Інструкцію з бактеріологічної діагностики туберкульозної інфекції та виявлення мікобактерій за допомогою поживного середовища ВКГ (стимулятор росту і середовище ВКГ).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Патоморфологические реакции, вызванные артроспорами микобактерий туберкулёза / В. В. Власенко, И. Г. Власенко, С. П. Василенко, С. А. Колодий, А. П. Лысенко // Вісник морфології. - 2006. - Т. 12, № 1. - С. 46 - 49. (* провела теоретичне обгрунтування дослідження та підбір теоретичного матеріалу; провела частину експериментів; проаналізувала одержані результати).

2. Вивчення морфологічних змін та репродуктивної активності мікобактерій під впливом електромагнітного опромінення / В. В. Власенко, С. А. Колодій, В. В. Блащук, І. Г. Власенко, М. А. Дзюмак, О. П. Фролов // Вісник морфології. - 2007. - Т. 13, № 1. - С. 127 - 130. (* виконала експериментальну частину роботи, статистичну обробку, сформулювала висновки, підготувала матеріал до друку).

3. Цикл розвитку збудника туберкульозу в крові та його виявлення / В. В. Власенко, Г. К. Палій, І. Г. Власенко, С. А. Колодій, С. П. Василенко // Інфекційні хвороби. - 2007. - № 3. - С. 67 - 73. (* провела літературний пошук, проаналізувала експериментальні дані, оформила роботу).

4. Власенко В. В. Диференціація адаптивних форм збудника туберкульозу із використанням реакцій аглютинації та полімеразно-ланцюгової реакції / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій // Вісник Вінниц. нац. мед. ун-ту. - 2008. - Т. 12, № 1. - С. 43 - 45. (* виконала експериментальну частину роботи, статистичну обробку, сформулювала висновки, підготувала матеріал до друку).

5. Метод прискореного виявлення збудника туберкульозу / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, І. В. Березовський С. А. Колодій, О. А. Ткач, К. Д. Мажак // Мікробіологічний журнал. - 2008. - Т. 70, № 4. - С. 39-43. (* провела теоретичне обгрунтування дослідження та підбір теоретичного матеріалу; провела частину експериментів; проаналізувала одержані результати).

6. Власенко В. В. Дослідження впливу автоклавування на життєздатність збудника туберкульозу / В. В. Власенко, С. А. Колодій // Biomedical and biosocial anthropology. - 2008. - № 11. - С. 110 - 113. (* самостійно провела аналіз літературних джерел, підготувала статтю до публікації).

7. Виявлення мікобактерій туберкульозу з використанням середовища ВЛАКОБ / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. П. Василенко, С. А. Колодій, О. П. Фролов, В. В. Блащук, Д. М. Левківський // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Гжицького. - 2006. - Т. 8, № 3(30), Ч. 2. - С. 3 - 6. (* виконала експериментальні дослідження, узагальнила та аналізувала результати, підготувала статтю до публікації).

8. Метод екологічного моніторингу збудника туберкульозу в крові та харчових продуктах / В. В. Власенко, С. А. Колодій, В. В. Блащук, І. Г. Власенко, М. А. Дзюмак, О. П. Лисенко // Проблеми харчування. - 2007. - № 1 (14). - С. 26 - 31. (* провела теоретичне обгрунтування дослідження та підбір теоретичного матеріалу; провела частину експериментів; проаналізувала одержані результати).

9. Дослідження впливу електромагнітного поля антропогенного походження на розвиток збудника туберкульозу за умов in vitro / В. В. Власенко, О. П. Фролов, С. А. Колодій, В. В. Блащук, І. Г. Власенко, М. А. Дзюмак // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Гжицького. - 2007. - Т. 9, № 2(33), Ч. 3. - С. 145 - 151. (* виконала експериментальні дослідження, узагальнила та аналізувала результати, підготувала статтю до публікації).

10. Идентификация адаптивных форм возбудителя туберкулёза / В. В. Власенко, И. Г. Власенко, С. А. Колодий, А. Н. Соломон, А. П. Лысенко, Е. Л. Красникова, В. П. Фролов, А. В. Фролов // Науковий вісник Львівської національної академії ветеринарної медицини ім. С. З. Гжицького. - 2007. - Т. 9, № 3(34), Ч. 1. - С. 11 - 19. (* виконала експериментальну частину роботи, статистичну обробку, сформулювала висновки, підготувала матеріал до друку).

11. Пат. на корисну модель 21719 Україна, МПК С 12 N 1/00. Живильне середовище для виділення збудника туберкульозу / Власенко В.В., Власенко І.Г., Колодій С.А., Блащук В.В., Дзюмак М.А. ; заявитель і патентовласник В. В. Власенко. - u 200613852 ; заявл. 26.12.2006 ; опубл. 15.03.2007, Бюл. № 3. (* приймала участь у проведенні досліджень, підготовці та написанні опису патенту).

12. Пат. на корисну модель 21720 Україна, МПК С 12 N 1/02, С 12 N 1/20. Спосіб виділення збудника туберкульозу / Власенко В.В., Власенко І.Г., Колодій С.А., Блащук В.В., Березовський І.В., Дзюмак М.А. ; заявитель і патентовласник В. В. Власенко. - u2006 13854 ; заявл. 26.12.2006 ; опубл. 15.03.2007, Бюл. № 3. (* приймала участь у проведенні досліджень, підготовці та написанні опису патенту).

13. Пат. на корисну модель 22150 Україна, МПК С 12 N 1/02, С 12 N 1/20. Спосіб виділення збудника туберкульозу на живильному середовищі / Власенко В.В., Власенко І.Г., Колодій С.А., Блащук В.В., Лисенко О.П., Соломон А. М. ; заявитель і патентовласник В. В. Власенко. - u 200700901 ; заявл. 29.01.2007 ; опубл. 10.04.2007, Бюл. № 4. (* приймала участь у проведенні досліджень, підготовці та написанні опису патенту).

14. Сучасні підходи до діагностики туберкульозу : метод. рек. МОЗ України / В. М. Мельник, Л. В. Турченко, І. Г. Власенко, О. П. Лисенко, В. В. Власенко, С. А. Колодій, В. В. Блащук, І. В. Березовський. - Київ, 2006. - 39 с. (* узагальнила та проаналізувала матеріали).

15. Власенко В. В. Мікробіологія : (лабораторний практикум для самостій-ної роботи студентів) / Власенко В. В., Власенко І. Г., Колодій С. А. - Вінниця : Едельвейс і К, 2008. - 86 с. (* приймала участь у написанні всіх розділів книги).

16. Изучение термической устойчивости возбудителя туберкулёза в автоклавированных препаратах / В. В. Власенко, И. Г. Власенко, С. А. Колодий, М. А. Дзюмак, А. Л. Лемиш, Е. Л. Красникова, И. Н. Архипов // Тваринництво ХХІ сторіччя : нові технології, досягнення та перспективи : міжнар. наук.-практ. конф., 3-6 жовт. 2006 р. : тези доп. - Харків, 2006. - № 94. - С. 71 - 77. (* виконала експериментальні дослідження, узагальнила та аналізувала результати, підготувала статтю до публікації).

17. Прискорене виділення адаптивних форм збудника туберкульозу / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій, В. В. Блащук // ХІ конгрес Світової Федерації Українських Лікарських Товариств, 28-30 серп. 2006 р. : тези доп. - Полтава - Київ - Чикаго, 2006. - С. 123 - 124. (* обробила матеріали досліджень та підготовила роботу до друку).

18. Визначення ефективності середовища ВЛАКОН зі стимулятором росту для культивування збудника туберкульозу / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, І. В. Березовський, В. В. Блащук, С. А. Колодій // Перша медична допомога на догоспітальному етапі : міжвуз. наук.-практ. конф. , 21 квіт. 2006 р. : матеріали доп. - Вінниця, 2006. - С. 92 - 94. (* провела літературний пошук, проаналізувала експериментальні дані, оформила роботу).

19. Використання середовища ВЛАКОН для визначення біологічної безпеки яловичини / В. В. Власенко, М. Д. Гаврилюк, І. Г. Власенко, І. В. Березовський, В. В. Блащук, С. А. Колодій, О. М. Мартинюк // Перша медична допомога на догоспітальному етапі : міжвуз. наук.-практ. конф. , 21 квіт. 2006 р. : матеріали доп. - Вінниця, 2006. - С. 94 - 95. (* виконала експериментальну частину роботи, статистичну обробку, сформулювала висновки, підготувала матеріал до друку).

20. Власенко В. В. Нова скринінг-діагностика туберкульозу по мазку капілярної крові / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій // Перша медична допомога на догоспітальному етапі : міжвуз. наук.-практ. конф., 21 квіт. 2006 р. : матеріали доп. - Вінниця, 2006. - С. 95 - 96. (* зробила аналіз результатів дослідження та підготувала роботу до друку).

21. Використання нового поживного середовища ВЛАКОН для прискореної бактеріологічної діагностики туберкульозу / О. А. Ткач, В. В. Власенко, С. П. Василенко, О. П. Фролов, К. Д. Мажак, І. Г. Власенко, М. А. Дзюбак, І. Л. Платонова, М.Б. Пурська, Н.Р. Гречуха, О. П. Загорян, Н. О. Хоп'як, С. А. Колодій, С. О. Бащук, М. М. Піняга // Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни : наук. конф., травень, 2006 р. : матеріали доп. - Львів, 2006. - С. 93 - 95. (* провела літературний пошук, проаналізувала експериментальні дані, оформила роботу).

22. Використання поживного середовища ВЛАКОН для виявлення збудника туберкульозу в молоці та крові / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій, В. В. Блащук, І. В. Березовський // Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни : наук. конф., тр., 2006 р. : матеріали доп.. - Львів, 2006. - С. 95 - 97. (* обробила дані досліджень та підготовила матеріали до друку).

23. Вивчення впливу тривалості культивування мікобактерій на ліпідний склад і вірулентність штаму М. bovis / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій, В. В. Блащук, А. П. Фролов // ХХІІ наук.-практ. конф. вищих медичних закладів освіти Вінницького регіону, 23 черв. 2006 р. : матеріали конф. - Вінниця, 2006. - С. 21 - 23. (* проаналізувала результати дослідження та підготовила їх до друку).

24. Екологічний моніторинг збудника туберкульозу в системі крові / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, М. А. Дзюмак, С. А. Колодій // Актуальні питання гігієни харчування та безпечності харчових продуктів. Міжнародні, європейські і національні підходи до вирішення. Нові критерії оцінки ризику, показники, методи та регламенти. Питна вода - харчовий продукт № 1. Проблеми функціонального харчування : ІV міжнар. наук.-практ. конф., 22-26 жовт. 2006 р. : тези доп. / Ін-т екогігієни та токсикології ім. Медведя. - Київ, 2006. - С. 12 - 13. (* проаналізувала результати дослідження та підготовила до публікації).

25. Живильне середовище САМОСУМ для виділення збудника туберкульозу з крові та молока породіль / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, О. В. Фролов, С. А. Колодій // ІХ з'їзд Всеукр. лікарського т-ва, 10-12 трав. 2007 р. : тези доп. - Київ, 2007. - С. 229 - 230. (* зробила аналіз матеріалу та підготовила до публікації).

26. Розробка поживного середовища САМОСУМ для прискореної діагностики туберкульозу / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, В. В. Блащук, С. А. Колодій, Ю. О. Капшієнко // Сучасні проблеми епідеміології, мікробіології та гігієни : зб. матеріалів конф., травень 2007 р. : матеріали конф. - Львів, 2007. - Вип. 5. - С. 64 - 67. (* провела теоретичне обґрунтування дослідження, провела експерименти, проаналізувала одержані результати).

27. Живильне середовище САМОСУМ для виділення збудника тубер-кульозу / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій, М. А. Дзюмак, В. В. Блащук // Наука и образование - 2007 : V междунар. науч.-практ. конф., 3-15 янв. 2007 г. : материалы конф. - Днепропетровск, 2007. - Т. 4. - С. 16 - 17. (* провела аналіз даних та підготовила до друку).

28. Нові підходи до виділення збудника туберкульозу / В. В. Власенко, В. В. Блащук, С. А. Колодій, І. Г. Власенко, С. В. Гирич, Г. І Багрій // Стратегические вопросы мировой науки - 2007 : ІІ Междунар. науч.-практ. конф., 15-28 февр. 2007 г. : материалы конф. - Днепропетровск, 2007. - Т. 10. - С. 37 - 39. (* аналіз результатів дослідження та підготовка до друку матеріалів).

29. Власенко В. В. Нове поживне середовище для вивчення збудника туберкульозу / В. В. Власенко, І. Г. Власенко, С. А. Колодій // ХІІІ наук.-практ. конф. вищих медичних закладів освіти Вінницького регіону, червень 2008 р. : матеріали доп. - Вінниця, 2007. - С. 64 - 67. (* проаналізувала експериментальні дані, оформила роботу).

Размещено на Allbest.ru