Роль Са2+-залежної месенджерної системи в розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Весельський Станіслав Павлович, НДІ фізіології імені академіка Петра Богача біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, старший науковий співробітник відділу загальної фізіології;

- доктор медичних наук, професор Скляров Олександр Якович, Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького МОЗ України, завідувач кафедри біохімії.

Захист дисертації відбудеться " 23" лютого 2009 року о 14.00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, просп. академіка Глушкова, 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.

Поштова адреса: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка біологічний факультет, спеціалізована вчена рада Д 26.001.24.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розіслано "21" січня 2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Т.Р. Андрійчук

Анотації

Кравченко О.О. Роль Са²⁺-залежної месенджерної системи в розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2009.

Досліджено функціональний стан основних елементів Са²⁺-залежного сигнального шляху (фосфоліпази С, фосфоліпідів, Са²⁺, протеїнкінази С та Са²⁺/кальмодулінзалежної протеїнкінази) та окремих ланок інших месенджерних систем (NO-синтази, протеїнкінази А, протеїнкінази G та тирозинової протеїнкінази) за умов формування коліт-асоційованого канцерогенезу. Охарактеризовано особливості коливання вмісту фосфоліпідів плазматичних мембран, пулу внутрішньоклітинного кальцію на фоні відповідних змін акти- вностей досліджуваних протеїнкіназ в мембрані та цитозолі епітеліоцитів слизової оболонки кишечника у певні строки розвитку патології. Відмічено участь Са²⁺ та NO-синтази у формуванні первинних проявів запалення при виразковому коліті. Показано накопичення токсичних ТБК-активних продуктів пероксидації на фоні зниження активності каталази, супероксиддисмутази і активації глутатіонової складової системи антиоксидантного захисту. Досліджено також внутрішньоклітинний вміст білків-регуляторів мітохондріальної ланки апоптозу (Вах та Bcl-2) за умов колоректального канцерогенезу. Показано накопичення як про-, так і антиапоптичного протеїнів на пізніх строках формування онкопатології.

Отримані результати доводять вирішальну роль порушення функціонування сигнальних систем у розвитку як запалення, так і спричиненої ним злоякісної трансформації клітин слизової оболонки товстого кишечника.

Ключові слова: коліт-асоційований канцерогенез, протеїнкіназа С, протеїнкіназа А, протеїнкіназа G, тирозинова протеїнкіназа, Са²⁺/кальмодулінзалежна протеїнкіназа, NO-синтаза, фосфоліпіди, епітеліоцити слизової оболонки товстої кишки (колоноцити).

Кравченко О.О. Роль Са²⁺-зависимой месенджерной системы в развитии колит-ассоциированного канцерогнеза. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2009.

Работа посвящена исследованию функционального состояния основных элементов Са²⁺-зависимого сигнального пути (фосфолипазы С, фосфолипидов, Са²⁺, портеинкиназы С и Са²⁺/кальмодулинзависимой протеинкиназы), а также некоторых звеньев других мессенджерных систем (NO-синтазы, протеинкиназы А, протеинкиназы G, тирозиновой протеинкиназы) в условиях формирования колит-ассоциированного канцерогенеза.

Установлены особенности колебаний содержания фосфолипидов в плазматических мембранах, пула внутриклеточного кальция на фоне соответствующих изменений активности исследуемых протеинкиназ в мембране и цитозоле эпителиоцитов слизистой оболочки кишечника в каждый из сроков развития патологии. Показано участие Са²⁺ и NO-синтазы в формировании первичных признаков воспаления при язвенном колите. Зафиксировано накопление токсичных ТБК-активных продуктов пероксидации на фоне снижения активности каталазы, супероксиддисмутазы и активации глутатионзависимых ферментов антиоксидантной защиты. Исследовано также внутриклеточное содержание белков-регуляторов митохондриальной составляющей апоптоза (Вах и Bcl-2) в условиях колоректального канцерогенеза. Показано чрезмерное накопление как про-, так и антиапоптического протеинов на поздних сроках действия канцерогена.

Полученные результаты доказывают принципиальное значение нарушения функционирования сигнальных каскадов в развитии, как воспаления, так и стимулированного им злокачественного перерождения клеток слизистой оболочки толстого кишечника.

Ключевые слова: колит-ассоциированный канцерогенез, протеинкиназа С, протеинкиназа А, протеинкиназа G, тирозиновая протеинкиназа, Са²⁺/кальмодулинзависимая протеинкиназа, NO-синтаза, фосфолипиды, эпителиоциты слизистой оболочки толстого кишечника (колоноциты).

Kravchenko O.O. Role of Ca²⁺-dependent messenger system in colitis-associated carcinogenesis development. - А manuscript.

Dissertation for the candidate biological sciences degree in specialty 03.00.04 - biochemistry. - Kyiv National Taras Shevchenko University, Kyiv, 2009.

The dissertation is dedicated to the study of the functional state of major Ca²⁺-dependent signal pathway elements (phospholipase C, phospholipids, Ca²⁺, protein kinase C, Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase) and individual components of another messenger systems (NO-synthase, protein kinase A, protein kinase G, tyrosine protein kinase) under colitis- associated carcinogenesis.

The conducted study provided us with the proof that on the third day of inflammation development under the experimental ulcerative colitis, the statically evident decrease of phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine in cytoplasmic membranes of large intestine mucosa epithelial cells of laboratory rats was observed. The like dynamics change of major structural membrane components was preserved in all the latter periods of inflammation. Such a disfunction was accompanied by the increase of one of the key ferment activity, which is responsible for the phospholipids hydrolyze - phospholipase C.

Due to the fact that aforementioned enzyme provides us with the formation of secondary messenger - inositolthreephosphate, which controls the release of Са²⁺ iones out of the intercellular depositaries, we have investigated the content of these cations in cytoplasm of large intestine mucosa epithelial cells and showed their anomalous accumulation in the cells on the 3-7^th days of inflammation development.

It shall also be mentioned that we were unable to notice the decrease of inositolthreephosphate in epithelial cells of membranes. It provides us with the assumption that excessive accumulation of intracellular Са²⁺ might result due to its flux out of extracellular areas, caused by membrane integrity breach, which indirectly confirms the stated accumulation of toxic TBA reactive substances, generated due to the lipids peroxidation intensification. Similar changes are associated with the decrease of SOD and catalase activity, as well as simultaneous activation of glutathione dependent ferments of antioxidant protection.

With the further influence of the specific carcinogen, the decrease of cytoplasm Са²⁺ level with the diminishing quantity of inositolthreephosphate in membranes and growth of phospholipase C activity was determined.

Analysis of Ca²⁺-dependent protein kinase activity in plasmatic membranes and cytosol of epithelial cells of the large intestine, revealed that protein kinase C as well as calmodulin-dependent protein kinase activity have decreased in membranes on the 1-3-rd days of the experiment, but these data remained almost unchanged in cytosol. On a latter stages of the inflammation and during the carcinogenesis initiation, hyperactivation the aforementioned kinases in cytosol was noticed, together with the alternate fluctuation of their activity in fraction of plasmatic membranes.

The activity of cyclonucleothyde- dependent protein kinase was similar to the aforementioned dynamics changes in cytosol and membrane of colonocytes.

Alongside with this, the activity of tyrosine protein kinase in the inflammation period desreased in cytosol and increased in membranes. In the following stages of oncopathology development, the activity of cytosol forms of tyrosine kinase increased considerably.

The important role in regulation of alimentary canal functioning pertains to nitric oxide (NO), which formation is provided by enzyme (NO-synthase). It is well known that NO with protein kinase G are able to depress the intestinal peristalsis and tone as well as neutralize the tyrosine remains, rendering the impossibility of its phosphorylation by the correspondent protein kinase. The conducted experiments allowed us establish the growth of activity of NO synthase on the first day in the inflammation development. The subsequent carcinogen introduction led us to the stabilization of the given values in the initial stages and its statically reliable growth on the tenth week of the experiment, when diagnosed adenocarcinoma.

Since NO, Са²⁺, active oxygen species and protein kinase influence the regulation of apoptosis; the protein-grids of mitochondrial constituent of aforementioned process were studied. The excessive accumulation of pro- (Bax), as well as antyapoptotical (Bcl-2) proteins on the tenth week of the carcinogen influence was indicated.

The received results prove us the principal significance of the dysfunction of signal cascades in development of inflammation and in stimulated malignant large intestine mucosa cells degeneration.

Key words: colitis-associated carcinogenesis, protein kinase C, protein kinase A, protein kinase G, tyrosine protein kinase, Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase, NO-synthase, phospholipids, epitheliocytes of colonic mucosa (colonocytes).

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Виразковий коліт (ВК) - є хронічним захворюванням, яке характеризується дистрофічними та атрофічними деструктивними змінами слизової оболонки товстої кишки і супроводжується порушенням її секреторних і моторних функцій [Фарелл Р. та ін., 2003; Daniel K. et al., 2002]. Наслідком виразкового коліту, що обумовлений генетичною схильністю, тривалим запаленням та несприятливими екологічними факторами, є розвиток колоректального раку [Itzkowitz S. H. et. al., 2004; Xie J. et. al., 2008].

Необхідно відзначити, що в складний і багатоступеневий процес запалення та неопластичної трансформації клітин залучені численні механізми, що включають порушення експресії певних генів, аномальну продукцію цитокінів, гіперекспресію їх рецепторів, спотворення передачі регуляторних сигналів від специфічних рецепторів до ядра клітини. До таких механізмів також слід віднести зміни у функціонуванні ряду внутрішньоклітинних сигнальних систем, ключовими ланками яких є Са²⁺-залежні протеїнкінази, рівень і активність яких може змінюватись під впливом різних факторів [Strober W. et. al., 2007]. Відомо, що іони Са²⁺, виконуючи роль універсального внутрішньоклітинного месенджера, впливають на активність Са²⁺, фосфоліпідзалежної протеїнкінази (ПКС), Са²⁺/кальмодулінзалежної протеїнкінази (КМ-ПК) та конститутивних форм NO-синтази [Зинченко, 2003]. Підвищення проникності мембран, викликане дією цитотоксичних факторів, призводить до зростання концентрації вільного кальцію в цитоплазмі та порушення функціонування кальцієзалежних сигнальних ферментів. Наслідком даних процесів є розлади в регуляції диференціації, проліферації та апоптозу клітин [D'Haens G. E. al., 2006].

За таких умов особливого значення набувають дослідження структурно-функціонального стану мембран, який визначається вмістом ліпідних компонентів, інтенсивністю процесів вільнорадикального окиснення, функціонуванням системи антиоксидантного захисту та активністю мембранозв'язаних ферментів, зокрема протеїнкіназ [Хендерсон, 1997].

На сьогоднішній день в літературі відсутні дані щодо комплексного дослідження ролі Са²⁺-залежної месенджерної системи та її зв'язків з окремими елементами інших сигнальних каскадів, які можуть бути залученими у розвиток запалення і трансформації клітин слизової оболонки товстого кишечника. Тому дослідження біохімічних механізмів порушень у роботі систем внутрішньоклітинної передачі сигналів надасть можливість виявити найбільш чутливі ланки, розлади у функціонуванні яких обумовлюють розвиток запалення і початкові етапи канцерогенезу. Такі дослідження відкриють перспективу ранньої діагностики та направленої терапевтичної корекції патологічних процесів за умов коліт-асоційованого канцерогенезу. Описане вище стало основою для формування мети та постановки задач дослідження даної дисертаційної роботи.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка у рамках науково-дослідної теми,,Визначення біохімічних, генетичних, імунологічних та цитологічних маркерів розвитку патологічних станів організму з метою розробки засобів направленої корекції і профілактики" (№ д/р 0106U005750).

Мета та завдання дослідження. З'ясувати роль Ca²⁺-залежної внутрішньоклітинної системи передачі сигналу та її зв'язок з іншими регуляторними факторами за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

Для досягнення мети досліджень було поставлено такі завдання:

1. Проаналізувати фосфоліпідний склад плазматичних мембран і активність фосфоліпази С в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки щурів у динаміці розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

2. Дослідити вміст вільного цитозольного Са²⁺ в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки щурів на різних етапах розвитку досліджуваної патології.

3. Визначити вміст ТБК-активних продуктів, відновленого глутатіону та активність ферментів антиоксидантного захисту (СОД, каталази, глутатіонзалежних ензимів: пероксидази, трансферази, редуктази) в колоноцитах при патогенезі колоректальної неоплазії.

4. Оцінити активність Са²⁺-залежних протеїнкіназ: Са²⁺, фосфоліпідзалежної (ПКС) та Са²⁺/кальмодулінзалежної (КМ-ПК) в мембранній та цитозольній фракціях колоноцитів за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

5. Проаналізувати взаємозв'язок різних систем фосфорилювання: Са²⁺-, cAMP-, cGMP-залежних й тирозинового в мембранній та цитозольній фракціях колоноцитів за умов коліт-асоційованого канцерогенезу.

6. Дослідити активність NO-синтази в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки щурів у різні терміни формування коліт-асоційованого канцерогенезу.

7. Дослідити часову динаміку змін вмісту апоптичних білків (Вах і Bcl-2) на різних етапах формування експериментального канцерогенезу.

Об'єкт дослідження - механізми передачі сигналу за умов запалення та неопластичної трансформації.

Предмет дослідження - Са²⁺-залежна система передачі сигналу та її зв'язок з іншими регуляторними факторами за умов запалення і розвитку онкопатології.

Методи дослідження - гістологічні, ультрацентрифугування (виділення клітинних фракцій), спектрофотометричні (визначення активностей антиоксидантних ферментів та вмісту ТБК-активних продуктів тощо), флуориметричні (визначення вмісту відновленого глутатіону, Са²⁺), молекулярно-біологічні (методи білкового електрофорезу в денатуруючих умовах та імуноблотингу), радіоізотопні (визначення активності протеїнкіназ), хроматографічні (дослідження вмісту ліпідів) та методи математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено комплексне дослідження Са²⁺-^-залежного месенджерного каскаду та його функціональних зв'язків з окремими ланками інших сигнальних систем в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки за умов експериментального коліт-асоційованого канцерогенезу. Продемонстровано динаміку змін активності кальцій- та циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ в цитозолі та плазматичній мембрані колоноцитів у відповідні терміни формування патології. Встановлено зміни вмісту основних структурних компонентів плазматичних мембран - фосфоліпідів, на фоні активації фосфоліпази С. Показано зміни вмісту токсичних продуктів перекисного окислення ліпідів, які пов'язані з пригніченням активності ферментів антиоксидантного захисту клітин. Виявлено чутливі ланки у функціонуванні окремих елементів сигнальних систем за умов запалення та наступної злоякісної трансформації, що може бути підґрунтям для розуміння механізмів регуляторних впливів на фізіологічні процеси, які порушуються за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу. Встановлено, що порівняно з клітинами слизової оболонки товстої кишки в нормі, за умов аденокарциноми (10 тиждень дії канцерогену), відбувається надмірне накопичення як проапоптичного (Вах), так і антиапоптичного (Bcl-2) білків модуляторів мітохондріальної ланки апоптозу.

Практичне значення одержаних результатів. Зміни сорбційно-секреторного та проліферативного потенціалу епітеліоцитів є одними з основних факторів ініціації запалення та неопластичної трансформації, дослідження механізмів їх цілеспрямованої регуляції має пріоритетне значення для розробки нових фармакологічних підходів до лікування неспецифічного виразкового коліту та онкопатології. Отримані результати можуть бути основою для науково-обгрунтованої корекції виявлених метаболічних порушень шляхом створення лікувальних препаратів, зокрема, впровадження специфічних інгібіторів протеїнкіназ для застосування при комплексній терапії на різних стадіях розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

Дослідження білків-модуляторів мітохондріальної ланки апоптозу у розвитку онкопатології, використання регуляторів їх синтезу та функціональної активності відкриє перспективи розробки засобів попередження та профілактики злоякісних процесів.

Отримані результати можуть бути впроваджені в навчальний процес.

Особистий внесок здобувача. Пошук та аналіз літературних джерел, проведення експерименту, зведення, обробка та теоретичне обґрунтування первинних результатів досліджень виконані дисертантом особисто. Планування напрямків досліджень та розробка методичних підходів, узагальнення результатів і редагування дисертаційної роботи здійснено за участі наукового керівника. Гістолого-морфологічні дослідження проведено сумісно з к.б.н. Бузинською Н.О. науковим співробітником кафедри цитології, гістології та біології розвитку Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Апробація результатів дисертації. Основні теоретичні положення та результати досліджень були представлені на IV з'їзді Українського біофізичного товариства (Донецьк, 2006), ІХ Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), 2-у з'їзді Товариства клітинної біології (Київ, 2007), ІІ міжнародній конференції молодих вчених "Біологія: від молекули до біосфери" (Харків, 2007), IV Міжнародній науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих вчених "Шевченківська весна" (Київ, 2008), ІХ Міжнародній конференції молодих онкологів України "Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології" (Київ, 2008), IV міжнародній конференції студентів та аспірантів "Молодь і поступ в біології" (Львів, 2008), 5 -th International Symposium On Cell/Tissue Injury and Cytoprotection/Organoprotection (Yalta, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 наукових праць, з яких: 4 - статті у фахових виданнях, затверджених переліком ВАК України, 8 - тез у матеріалах наукових конференцій та з'їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів та трьох розділів результатів власних досліджень з їх обговоренням, заключення, висновків, списку використаних літературних джерел (177 посилань). Дисертація викладена на 177 сторінках (основна частина 157) і проілюстрована 19 рисунками та 3 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. У дослідах використовували самців білих лабораторних нелінійних щурів з початковою масою 160 г. Розвиток експериментального коліт-асоційованого канцерогенезу товстої кишки у піддослідних тварин індукували згідно з методом [Wang J. G. et. al., 2004] шляхом повної заміни питної води на 1,5% розчин декстрансульфат натрієвої солі (далі ДСН, М. м. 35000-50000) і подальшим щотижневим підшкірним введенням специфічного проканцерогену - 1,2- диметилгідразину (далі ДМГ) (20 мг/кг) протягом 2,5 місяців. Розвиток патологій діагностували за симптомами, а ступінь уражень слизової оболонки товстої кишки оцінювали при аутопсії візуально та гістологічно.

Дослідження проводили через одну, три, сім діб розвитку виразкового коліту та через два, чотири, шість, вісім та десять тижнів впливу канцерогену. Епітеліоцити слизової оболонки товстої кишки щурів ізолювали та підраховували за модифікованим методом [Roediger W.E.W. et. al., 1979]. Отримання фракцій цитозолю та плазматичних мембран проводили згідно [Рибальченко, 1988].

Визначення кількісного та якісного складу ліпідів мембран здійснювали методом тонкошарової хроматографії. Ідентифікацію окремих фосфоліпідів проводили за допомогою відповідних стандартів [Kates M., 1986]. Вміст ТБК-активних продуктів визначали згідно з методом [Гаврилов, 1987]. Активність СОД у клітинах визначали згідно з методом [Чевари С., 1985] і виражали в умовних одиницях за 1 хв. на мг білка. Активність каталази в клітинах визначали згідно з методом [Королюк, 1988] і виражали у перерахунку на 1 мкмоль Н ₂О ₂ за 1 хв. на мг білка. Вміст відновленого глутатіону вимірювали за допомогою флуориметричної мітки - ортофталевого альдегіду за методом [Lewis C., 1984] і виражали в нмоль на 1 мг білка. Активність глутатіонзалежних ферментів визначали відповідно до рекомендацій [Власова С.Н. и др., 1990, Колесниченко Л.С. и др., 1987]. Концентрацію вільного цитозольного Са²⁺ вимірювали за допомогою флуорисцентного зонду індо-1АМ і розраховували за двохвильовим параметром R [Grynkiewicz G., 1985]. Активність фосфоліпази С (далі ФЛС) визначали за розщепленням специфічного субстрату. Активність ферменту виражали в нмоль хромогенного продукту за 1 хв. на 1 мг білка [Kurioka S., 1976].

Визначення активності Са²⁺, фосфоліпідзалежних протеїнкіназ проводили за методом [Parames S., 1998]; активності Са²⁺/кальмодулінзалежних протеїнкіназ - за методом [Hunter T. et. al., 1991]; активності циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ - відповідно до рекомендацій [Gill G.N. et. al., 1979]; активності тирозинових протеїнкіназ - як описано в [Brian E., 2001].

Активність всіх досліджуваних протеїнкіназ визначали за включенням ³²Р від г-³²Р-АТФ до відповідних специфічних білкових субстратів внаслідок фосфотрансферазної реакції. Радіоактивність визначали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107. Питому активність ферментів виражали в пмоль ³²Р за 1 хв. на 1 мг білка.

Визначення активності NO-синтази проводили згідно з методом [Hevel J.M. et. al., 1991]. Активність ферменту виражали в нмоль продуктів аеробного окислення оксиду азоту, синтезованого ферментом за 1 хв. на 1 мг білка.

Визначення концентрації білка проводили згідно з методом Bradford M.M., 1976. Електрофорез білків із отриманих зразків проводили в денатуруючих умовах згідно з методом [Laemmli U.K., 1970]. Імуноблот-аналіз досліджуваних препаратів здійснювали згідно з рекомендаціями [Avrameas S., 1993].

Статистичну обробку результатів досліджень проводили загальноприйнятими методами варіаційної статистики, на основі 7 - 12 повторів (M±m, n=7 - 12) [Брандт, 1975]. Для розрахунку результатів досліджень та побудови графіків використовували пакет статистичних програм,,Origin 7.0" та "Microsoft Excel 2007". Достовірність різниці показників оцінювали за допомогою t-критерію Ст'юдента.

Результати досліджень та їх обговорення. Проведені нами морфо-гістологічні спостереження дозволили виявити розвиток гострого запалення через 3 - 7 діб впливу ДСН, що проявлялось в типових симптомах, притаманних виразковому коліту: гіперемії, набряку та нейтрофільній інфільтрації слизової оболонки товстої кишки. Поруч із цим, більш пізні строки (8-10 тиж.) дії специфічного канцерогенезу (ДМГ) характеризувались формуванням потовщень та округлих наростів у товстій кишці, які при гістологічному дослідженні класифіковано як аденокарцинома з проростанням у м'язовий шар.

Оскільки структурною основою клітинних мембран є ліпідний бішар, будь-які зміни відносного вмісту його компонентів обумовлюють модифікацію мембранних структур, що призводить до порушення мембранної проникності, функціонування трансмембранних насосів, мембранозв'язаних ферментів та передачі міжклітинних сигналів. Тому у якості показників, що описують стан ліпідного матриксу плазматичних мембран епітеліоцитів слизової оболонки товстої кишки, нами було досліджено вміст основних фосфоліпідів: фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилетаноламіну (ФЕА), фосфатидилінозитолу (ФІ), лізофосфатидилхоліну (ЛФХ) і нейтральних ліпідів (холестерину, ацилгліцеринів та жирних кислот).

Проведені дослідження дозволили виявити збільшення вмісту фракцій ФХ та ФС протягом першої доби впливу запального чинника - ДСН. В наступні терміни розвитку запалення статистично достовірно знижувався вміст основних структурних компонентів плазматичних мембран - ФХ та ФЕА (табл. 1), накопичувались лізоформи, зокрема фосфатидилхоліну, і зростав рівень нейтральних ліпідів (холестерину, ацигліцеролів та жирних кислот). За умов введення канцерогену спостерігалось зменшення кількості ФІ та ФС.

Таблиця 1. Вміст фосфоліпідів в плазматичній мембрані епітеліоцитів слизової оболонки товстої кишки щурів при коліт-асоційованому канцерогенезі (M±m, n=7 - 10)

З метою з'ясування причин виявлених нами кількісних змін ліпідів в мембранах колоноцитів було досліджено активність одного з основних ферментів гідролізу фосфоліпідів - фосфоліпази С (ФЛС). Літературні джерела вказують, що важливим компонентом гідрофобного, в'язкого інтестинального слизу є фосфоліпіди [Хендерсон, 1997]. Відтак, порушення цілісності фосфоліпідного шару не лише мембран клітин, а і, частково, захисної слизової оболонки кишки, внаслідок активації фосфоліпази С може призводити до розвитку запалення та виразкоутворення.

Відомо, що ФЛС задіяна в процеси не лише деструкції фосфоліпідів, а і генерування таких важливих вторинних месенджерів, як ДАГ, інозитолтрифосфат. Останні здатні підвищувати рівень внутрішньоклітинного кальцію, активувати ПКС, інгібувати аденілатциклазу тощо [Еллиот В., 2002].

Проведені дослідження дозволили встановити, що активність вищезазначеного ферменту починає зростати з першої доби експерименту і зберігає таку тенденцію через 4 тижні введення ДМГ. Активація фосфоліпази С в часі збігається з виявленими змінами вмісту мембранних фосфоліпідів (ФХ, ФЕА, ФІ) (табл.1).

Вище зазначено, що фосфоліпаза С генерує інозитолтрифосфат, який слугує внутрішньоклітинним посередником і відповідає за вивільнення іонів Са²⁺ із внутрішньоклітинних депо. Іони Са²⁺, в свою чергу, здатні активувати багато катаболічних процесів (глікогеноліз, ліполіз, протеоліз), стимулювати синтез білка, рухливість, екзоцитоз, іонний транспорт і т. п. [Медведева, 1997]. Стійке підвищення внутрішньоклітинного рівня Са²⁺ призводить до розвитку клітинних патологій, що може відобразитись на здатності даного месенджера впливатина проліферацію, ріст та диференціацію [Крутецкая, 2003]. Виходячи з цього, ми дослідили вміст даного катіону в цитозолі клітин у різні періоди розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу, що дало можливість показати його збільшення в усі терміни спостереження з максимальним накопиченням через 3-7 діб при формуванні запалення. Оскільки у вищезазначені терміни нами не було зафіксовано зменшення вмісту ФІ в мембранах клітин (табл.1), то можна припустити, що надмірне зростання вмісту Са²⁺ відбувається за рахунок його надходження з позаклітинного простору в результаті порушення бар'єрних властивостей плазматичної мембрани.

Таблиця 2. Вміст продуктів перекисного окислення ліпідів, відновленого глутатіону та активність ферментів антиоксидантного захисту в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки щурів за умов коліт-асоційованого канцерогенезу (M±m, n=7 - 11)

З літературних джерел відомо, що порушення окисного гомеостазу, яке характеризуються підвищенням вмісту продуктів перекисного окислення мембранних ліпідів на фоні зниження функціональних можливостей антиоксидантної системи, є одним з патогенних факторів виникнення і рецидиву різних захворювань організму [Seril D. N. et. al., 2003, Tandon J., 2004]. Тому наступним етапом наших досліджень стало визначення основних показників системи перекисного окислення ліпідів та антиоксидантного захисту.

За умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу показано накопичення токсичних продуктів ліпопероксидації не лише в терміни запалення, але і через два тижні дії ДМГ. Виявлені зміни відбувались на фоні зниження активності основних ферментів антиоксидантного захисту - СОД і каталази в усі терміни дослідження (табл. 2).

Таким чином, за умов експериментальної моделі коліт-асоційованого кацерогенезу було показано, що в клітинах слизової оболонки кишечника щурів відбувається підвищення вмісту ТБК-активних продуктів, що призводить до посилення деструктивних процесів перекисного окислення ліпідів. Зниження активності СОД та каталази в динаміці розвитку даного захворювання свідчить про виснаження антиоксидантного потенціалу клітин слизової оболонки, яке супроводжується компенсаторним зростанням активності ферментів глутатіонової складової системи антиоксидантного захисту: редуктази і пероксидази, призводячи до поступового зменшення пулу відновленого глутатіону (табл.2). Зафіксоване нами порушення прооксидантно-антиоксидантної рівноваги може бути однією з причин цитотоксичних ушкоджень мембран колоноцитів, призводячи до аномального накопичення іонів Са²⁺ в цитозолі. Це може впливати на процеси внутрішньоклітинної передачі сигналів, опосередковані акцепторами кальцію, зокрема Са²⁺-фосфоліпідзалежною протеїнкіназою С (ПКС), Са²⁺/кальмодулінзалежною протеїнкіназою (КМ-ПК) та конститутивною NO-синтазою [McCurbey J.A. et. al., 2000]. З огляду на це нами було досліджено активність ферментів Са²⁺-залежного сигнального каскаду на різних етапах розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

Результати експериментів виявили внутрішньоклітинний перерозподіл активності ПКС між фракцією цитоплазматичних мембран та цитозолем епітеліоцитів при розвитку вищезазначеної патології. Причому активність даної протеїнкінази в мембранній фракції колоноцитів була нижчою за контроль практично протягом всього експерименту, тоді як даний показник цитозольної форми ферменту зростав, досягаючи свого максимуму через два тижні введення канцерогену ДМГ. Ці спостереження узгоджуються з відомостями, що застосування специфічних інгібіторів ПКС при коліті значно зменшує прояви запалення та гострі симптоми патології у щурів [Brown J.F., 1999].

Крім ПКС в клітинах присутня родина серин-треонінових протеїнкіназ, для активації яких необхідний комплекс кальцію з кальмодуліном - це Са²⁺/кальмодулінзалежні протеїнкінази. Відомо, що КМ-ПК інгібує транспорт іонів Na⁺, стимулює секрецію Cl^- і K⁺ через мембрани клітин слизової оболонки кишечника [Kunzelmann K., 2002]. Тому є підстави вважати, що даний фермент може відігравати певну роль у нормальному функціонуванні епітеліоцитів кишечника, і зміни його активності можуть обумовлювати патологічні розлади у функціонуванні клітин і органу в цілому.

Проведені нами дослідження виявили збільшення активності Са²⁺/кальмодулінзалежної протеїнкінази в цитозольній фракції на пізніх строках запалення та подальше її зростання в наступні терміни впливу специфічного канцерогену. Зміни активності мембранозв'язаної форми КМ-ПК мали при цьому різноспрямований характер.

Таким чином, можна припустити, що КМ-ПК регулює процеси, які можуть впливати на трансформацію клітин слизової оболонки товстого кишечника під час розвитку онкопатології.

До ферментів, активність яких визначається комплексом Са²⁺/кальмодулін, крім протеїнкіназ належать також конститутивні форми NO-синтази (NOS), яка відіграє визначальну роль в трансдукції різноманітних регуляторних сигналів. [Shah V., 2004]. Відомо, що виразковий коліт характеризується порушенням не лише сорбційно-секреторних, але і моторних функцій товстої кишки. В процеси регуляції останніх задіяний оксид азоту, який через активацію розчинної гуанілатциклази та ПКG справляє пригнічуючий вплив на тонус і перистальтику кишечника [Takeuchi K., 2007]. Виходячи з важливої ролі NO для функціонування шлунково-кишкового тракту за фізіологічних умов та формування патологій, нами було досліджено активність NO-синтази за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

У ході дослідження було встановлено зростання активності NO-синтази в клітинах слизової оболонки товстої кишки щурів під час ДСН-стимульованого коліту. Так, через три дні впливу запального чинника активність даного ферменту перевищувала контрольні показники майже в 6 разів, а через сім днів - в 7 разів. При дослідженні активності NOS за умов впливу специфічного канцерогену нами показано, що, на відміну від запалення, розвиток онкопатологій характеризувався відсутністю статистично достовірних змін даного показника в клітинах слизової оболонки товстої кишки щурів. Так, лише через 10 тижнів розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу нами було зафіксовано зростання активності NO-синтази в колоноцитах піддослідних щурів. Це може вказувати на важливе значення NO-генеруючих ферментів у розвитку запалення за умов коліту та, частково, на більш пізніх етапах канцерогенезу.

Інтестинальний епітелій відповідає на запальні ураження найрізноманітнішими реакціями, в тому числі: зростанням/пригніченням секретуючої активності колоноцитів та зменшенням абсорбції електролітів. Дані процеси корелюють зі змінами вмісту таких внутрішньоклітинних вторинних месенджерів, як цАМФ та цГМФ, причому, основна функція останніх полягає в активації відповідних протеїнкіназ: ПКА і ПКG [Donomitz M., 1986; Lohi H.,2005].

Враховуючи це, наступним етапом наших досліджень було визначення активності циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ в епітеліоцитах товстої кишки за умов коліт-асоційованого канцерогенезу. Результати дослідження динаміки змін активності цитозольних форм вказаних ензимів показали їх односпрямований характер, у вигляді зниження на 1-3 добу розвитку коліту і різкого зростання через 7 діб дії ДСН та протягом наступних етапів впливу ДМГ. Максимальне значення активності циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ в цитозолі було зафіксовано через 2 та 10 тижнів введення специфічного канцерогену.

Активності даних ферментів мали різноспрямований характер змін у фракції цитоплазматичних мембран протягом експерименту. Так, максимальне значення досліджуваного показника для ПКА зафіксовано на 7 добу розвитку виразкового коліту. Натомість збільшення активності ПКG в плазматичних мембранах показано через 2 тижні впливу специфічного канцерогену, коли активність ПКА зменшувалась порівняно з станом запалення (але не з контролем).

Гіперактивація обох циклонуклеотидзалежних протеїнкіназ у фракції плазматичних мембран, як і в цитозолі, спостерігалась на 10 тиждень розвитку аденокарцином.

Отже, розвиток виразкового коліту та початкові етапи малігнізації у товстому кишечнику супроводжуються розладами функціонування основних ферментів циклонуклеотидзалежного сигнального каскаду - протеїнкіназ. Причому, залежно від стадії патологічного процесу активність досліджуваних ферментів мала характерні зміни. Зокрема, ранні запальні реакції супроводжувались інгібуванням як ПКА, так і ПКG, більш пізні - активацією обох ферментів, а за ініціації гіперпроліферації активність обох ензимів перевищувала їх контрольні значення.

Велику увагу дослідників привертають також ферменти тирозинового фосфорилювання, які залучені в процеси регуляції клітинної диференціації, проліферації, метаболізму та апоптозу у відповідь на зовнішні та внутрішні стимули. Відомо, що протеїнкінази перебувають у складних функціональних взаємозв'язках, зокрема, ПКС здатна модулювати активність тирозинових протеїнкіназ (ТПК), які активуються різними факторами запалення і є маркерами канцерогенезу [Крутецкая, 2003, Cohen G. et. al., 2006]. Тому наступним етапом нашої роботи було дослідження активності ТПК у фракціях плазматичних мембран і цитозолі епітеліоцитів слизової оболонки товстої кишки щурів за умов розвитку експериментальної моделі коліт-асоційованого канцерогенезу.

За умов запалення спостерігалась активація мембранозв'язаної форми ТПК, у той час як активність її цитозольної фракції знижувалась. Такі зміни узгоджуються із загальноприйнятою думкою про трансмодуляцію активності тирозинових протеїнкіназ протеїнкіназою С. Канцерогенез супроводжувався гіперактивацією як цитозольних форм ТПК, так і ПКС, що може свідчити про порушення взаємних регуляторних впливів між цими ферментами.

Оскільки відомо, що такі фактори, як NO, Са²⁺, активні форми кисню та протеїнкінази можуть впливати на перебіг апоптозу [Белушкина Н.Н. и др., 2001], нами було досліджено експресію білків-модуляторів мітохондріальної ланки регуляції апоптозу (Bax, Bcl-2) за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу щурів. Дані протеїни з молекулярною масою 20 кДа та 26 кДа, відповідно, присутні в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки за фізіологічної норми.

Було показано, що канцерогенез супроводжується зменшенням кількості досліджуваних протеїнів через 2 - 4 тижні впливу ДМГ, що може свідчити про активацію апоптозу. Виявлене збільшення вмісту білків Вах та Bcl-2 через 8 - 10 тижнів дії ДМГ може вказувати на пригнічення апоптозу. Інгібування даного фізіологічного процесу в епітеліоцитах кишечника щурів може призводити до накопичення клітин з мутаціями ДНК, змін міжклітинної адгезії, порушення десквамації епітеліоцитів та формування злоякісних новоутворень [Хомерики, 2001]. Отже, нами було показано, що білки - регулятори мітохондріальної ланки апоптозу (Вах та Bcl-2) залучені до процесів розвитку онкопатологій в товстому кишечнику.

На підставі проведених досліджень нами встановлено, що в патогенез коліт-асоційованого канцерогенезу залучені Са²⁺-залежна месенджерна система та окремі ланки інших сигнальних шляхів. Запальні реакції за умов виразкового коліту є пусковим чинником, який здатен порушувати процеси сигнальної трансдукції за участю різних ферментів фосфорилювання та створювати передумови для стимуляції гіперпроліферації та малігнізації клітин слизової оболонки. Отримані в роботі дані визначили інформативність досліджуваних нами показників для оцінки порушень функціонування різних ланок Са²⁺-залежної месенджерної системи та окремих елементів інших сигнальних систем в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки щурів у динаміці розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

Отримані результати можуть бути основою для створення науково обґрунтованих способів корекції виявлених метаболічних порушень, зокрема за допомогою застосування специфічних інгібіторів протеїнкіназ у комплексній терапії на різних стадіях розвитку і формування коліт-асоційованого канцерогенезу.

Висновки

запалення коліт виразковий канцерогенез

1. Досліджено роль Са²⁺-залежної месенджерної системи, спряжених з нею внутрішньоклітинних сигнальних факторів, процесів пероксидації, антиоксидантного статусу клітин та білків-модуляторів апоптозу в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу.

2. Встановлено, що розвиток коліт-асоційованого канцерогенезу супроводжується змінами вмісту фосфоліпідних компонентів плазматичних мембран епітеліоцитів товстої кишки. Так, за умов запалення зменшується кількість фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну, а за канцерогенезу - фосфатидилінозитолу й фосфатидилсерину.

3. Показано збільшення вмісту цитозольного Са²⁺, гіперактивацію NO-синтази та фосфоліпази С в епітеліоцитах за умов запалення, що супроводжувалось деструктивними змінами в слизовій оболонці товстої кишки.

4. За умов коліт-асоційованого канцерогенезу зміни прооксидантно/антиоксидантного статусу епітеліоцитів слизової оболонки товстої кишки полягали у накопиченні ТБК-активних продуктів, зниженні активності супероксиддисмутази і каталази та одночасній активації глутатіонзалежної системи ензимів у порівнянні з інтактними тваринами.

5. На початкових етапах запалення (1 - 3 доба) виявлено зниження активності Са²⁺-залежних протеїнкіназ (протеїнкінази С та Са²⁺/кальмодулінзалежної протеїнкінази) в цитозольній та мембранній фракціях колоноцитів, що супроводжувалось пригніченням активності циклонуклеотидзалежних та тирозинових протеїнкіназ в цитозолі клітин слизової оболонки товстої кишки.

6. Пізні терміни запалення (7 доба) і процеси трансформації клітин слизової оболонки товстої кишки щурів (2 - 6 тиж.) характеризувались зростанням активності серин-треонінових і тирозинових протеїнкіназ в цитозолі та різноспрямованими змінами активності даних ферментів в мембранній фракції епітеліоцитів.

7. Встановлено підвищення активності всіх досліджуваних протеїнкіназ в мембранній фракції епітеліоцитів при аденокарциномі, яка визначалась на 10 тиждень впливу канцерогену.

8. Показано зростання внутрішньоклітинного вмісту проапоптичного (Вах) і антиапоптичного (Bcl-2) білків мітохондріальної ланки регуляції апоптозу в кінцеві терміни розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу (8-10 тиж.).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Кравченко О.О. Активність циклонуклеотид залежних протеїнкіназ в клітинах товстого кишечника щурів за умов розвитку виразкового коліту / Кравченко О.О., Гавриш Л.І., Остапченко Л.І., Дробінська О.В. // Фізика живого. - 2007. - Т. 15, № 2. - С. 49-53. (Особистий внесок здобувача- проведено експериментальні дослідження, статистичну обробку та аналіз даних).

2. Кравченко О.О. Вміст цитоплазматичного Са²⁺ в колоноцитах щурів за умов розвитку виразкового коліту / Дробінська О. В., Кравченко О.О., Артеменко О.Ю., Остапченко Л.І. // Ученые записки Таврического национального университета им. В.И. Вернадского. Серия "Биология, химия". - 2007. - Т. 20 (59), № 1. - С. 146-150. (Особистий внесок здобувача - визначення вмісту цитозольного кальцію, підготовка матеріалів до друку).

3. Кравченко О.О. Дослідження активності Na⁺,K⁺-АТФази, Ca²⁺, Mg²⁺-АТФази та 5'-нуклеотидази в мембранних препаратах клітин слизової оболонки товстої кишки за умов експериментальної моделі виразкового коліту / Кравченко О.О., Дробінська О.В., Остапченко Л.І. // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. Серія "Біологія". - 2007. - Вип. 49- 50. - С. 70-71. (Особистий внесок здобувача - виділення клітин, фракцій, аналіз отриманих результатів).

4. Кравченко О.О. Активність протеїнкіназ в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки щурів за умов розвитку коліт-асоційованого канцерогенезу / О.О. Кравченко, О.В. Дробінська, Л.І. Остапченко // Медична хімія. - 2008. - Т. 10, № 3. - С. 26-31. (Особистий внесок здобувача - визначення активності ферментів, аналіз отриманих результатів, підготовка матеріалів до друку).

5. Кравченко О.О. Активність глутатіонзалежних ферментів у клітинах слизової оболонки товстої кишки за умов експериментального коліту / Кравченко О.О., Остапченко Л.І. // IV з'їзд Українського біофізичного товариства, 19-21 груд. 2006 р.: збірник тез. - Донецьк, 2006. - С.60-61.

6. Кравченко О.О. Структурно-функціональний стан плазматичних мембран клітин слизової оболонки шлунку при ульцерогенезі у щурів / Хілько Т. Д., Проценко Т.Л., Якубцова І.В., Гавриш Л.І., Кравченко О.О. // ІХ Український біохімічний з'їзд, 19-23 лист. 2006 р.: матеріали з'їзду. - Х., 2006. - С. 127.

7. Кравченко О.О. Вміст кальцію в епітеліоцитах слизової оболонки товстої кишки за умов розвитку експериментального виразкового коліту / Кравченко О.О., Артеменко О.Ю., Дробінська О.В. // 2-ий з'їзд Українського товариства клітинної біології, 23-26 жовт. 2007 р.: збірник тез. - К., 2007. -С. 162.

8. Кравченко О.О. Активність протеїнкінази А в колоноцитах щурів за умов розвитку експериментального виразкового коліту / Кравченко О.О., Остапченко Л.І. // Біологія: від молекули до біосфери: ІІ міжнародна конф. молодих вчених, 19-21 лист. 2007 р.: тези доп. - Х., 2007. - С. 77-78.

9. Кравченко О.О. Активність тирозинової протеїнкінази в плазматичних мембранах та цитозолі клітин слизової оболонки товстої кишки щурів за умов розвитку експериментального виразкового коліту / Кравченко О.О., Дробінська О.В. // Шевченківська весна: IV Міжнародна науково-практична конф. студентів, аспірантів та молодих вчених, 20 - 23 бер. 2008 р.: збірник тез. - К., 2008. - С. 13-14.

10. Кравченко О.О. Активність cGMP-залежної протеїнкінази в колоноцитах щурів за умов розвитку експериментального коліт-асоційованого канцерогенезу / Кравченко О.О., Дробінська О.В. // Молодь і поступ в біології: IV міжнародна наукова конф. студентів та аспірантів, 7-10 квіт. 2008 р.: збірник тез. - Л., 2008. - С. 38-39.

11. Кравченко О.О. Активність протеїнкінази С за умов експериментального канцерогенезу товстої кишки щурів / О.О. Кравченко, Л.І. Остапченко // Сучасні проблеми експериментальної і клінічної онкології: ІХ міжнародна конф. молодих онкологів України, 23-24 квіт. 2008 р.: збірник тез. - К., 2008. - С. 70.

12. Kravchenko O.O. Role of membrane phosphatidylinositol, intracellular calcium and protein kinase C activity in rat colonocytes under ulceractive colitis development / Kravchenko O.O., Drobins'ka O.V., Ostapchenko L.I., Telegina L.A. // 5^th International Symposium On Cell/Tissue Injury and Cytoprotection / Organoprotection, 17-19 sep. 2008.: abstracts. - Yalta, 2008. - P. 17.