Експериментальне обґрунтування доцільності комбінованого застосування протипухлинної вакцини з інтерфероном різного походження

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Експериментальне обґрунтування доцільності комбінованого застосування протипухлинної вакцини з інтерфероном різного походження

Трохименко Н.В.

03.00.09 - імунологія

Київ - 2009

Вступ

Актуальність проблеми. Проблема ефективного лікування онкологічних хворих є однією з найактуальніших у сучасній клінічній і експериментальній медицині. Основними її складовими є розкриття механізмів виникнення і прогресування злоякісних пухлин, розробка засобів посилення протипухлинних реакцій організму і підвищення на цій основі якості лікування хворих.

Класичні методи лікування онкологічних хворих (оперативне видалення пухлини, хіміо-, променева терапія) досить часто виявляються недостатньо ефективними і мають значні побічні ефекти. Це вимагає від сучасної науки пошуку додаткових засобів, спрямованих на підвищення ефективності лікування онкологічних хворих. Подальший прогрес у лікуванні таких хворих можливий на основі поєднаного застосування засобів цитотоксичної терапії та лікувальних стратегій, що забезпечують зміну патофізіологічного співвідношення "пухлина-організм" на користь останнього. Особливого значення тепер набуває біотерапія (зокрема, імунотерапія) хворих на злоякісні пухлини (Rosenberg S.A., et. al., 2004). Тому розробка ефективних засобів біотерапії є актуальною як з наукової, так і практичної точки зору.

Важливим елементом імунотерапії є розробка протипухлинних вакцин (ПВ) на основі пухлиноасоційованих антигенів (Rosenberg S.E., et. al., 2004), цільних та геномодифікованих пухлинних клітин (Bioley G. et al, 2009), дендритних клітин (Aarnitzen E.H., et al., 2008), цитокінів, Т-клітинної адоптивної імунотерапії та ін.

Успіхи в конструюванні ПВ та ефективність їх застосування залежать від багатьох факторів - антигенного складу пухлини, стадії пухлинного процесу (генералізації) тощо. В багатьох випадках призначення ПВ супроводжується застосуванням імуномодуляторів різної природи, серед яких звертають на себе увагу мікробні та рослинні (Потебня Г.П. та ін., 2008; 2009), а також цитокінів, які здатні підвищувати ефективність протипухлинної вакцинотерапії (Belardelli F. et al., 2004; Kirkwood I.M., et. al., 2009). Крім того, в літературі з'явилися роботи, автори яких пропонують застосовувати вакцинотерапію у поєднанні з цитокінотерапією, зокрема з інтерфероном (ІФН) (Жильчук В.Є. та ін., 2009). І хоча такі повідомлення поки що носять поодинокий характер, вони, на нашу думку, є безсумнівно обґрунтованими: адже ІФН, як відомо, є поліпотентним цитокіном (Ершов Ф.И. 1996; Воронцова А.Л., Кудрявец Ю.И., 2000), і його вплив не обмежується тільки імуномодулюючим ефектом (завдяки якому він може виконувати роль імуноад'юванта при вакцинотерапії), але розповсюджується і на інші регуляторні механізми протипухлинної резистентності, що має сприяти підвищенню ефективності лікування. Отже, експериментальне дослідження доцільності застосування вакцинотерапії у поєднанні з ІФН-терапією є безумовно актуальною проблемою, і саме цій проблемі присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі імуномодуляції ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт інституту за темою: "Фундаментальне обґрунтування нових підходів по удосконаленню протипухлинних аутовакцин, виготовлених за допомогою компонентів B. subtilis B-7025" (2004-2006 рр., державний реєстраційний номер 0104U000590).

Мета дослідження. На моделях експериментального пухлинного росту встановити ефективність комбінованого застосування протипухлинної вакцини з інтерфероном різного походження шляхом дослідження їх комбінованого впливу на динаміку пухлинного росту, стан імунної системи та середню тривалість життя тварин.

Задачі дослідження.

Дослідити вплив ПВ в комбінації з б-ІФН миші на динаміку пухлинного росту, тривалість життя тварин та окремі ланки протипухлинного імунітету.

Визначити ефективність застосування ПВ в комбінації з індуктором ендогенного ІФН - аміксином на експериментальних моделях пухлинного росту - карциномі легені Льюїс та саркомі-37.

Вивчити вплив комбінованого застосування ПВ з пробіотиком субалін на активність ефекторних клітин імунного нагляду, динаміку пухлинного росту та тривалість життя тварин.

Порівняти ефективність комбінованого застосування ПВ з б-ІФН, індуктором ендогенного ІФН - аміксином та пробіотиком субаліном.

Об'єкт дослідження. Експериментальні тварини - миші лінії С57Bl/6 та Balb/c з перещепленими модельними пухлинами - карциномою легені Льюїс та саркомою-37.

Предмет дослідження. Протипухлинна ефективність комплексного застосування ПВ з екзогенним та ендогенним ІФН, стан ефекторних клітин імунного нагляду.

Методи дослідження. Мікроскопічні - світлова мікроскопія; імунологічні - визначення функціональної активності основних клітинних ефекторів специфічного та неспецифічного протипухлинного захисту (макрофаги, лімфоцити) та аналіз гуморальної ланки імунної відповіді (рівні IgG-антитіл і середньо-молекулярних циркулюючих імунних комплексів у сироватці крові); вірусологічні - визначення титру ІФН за ступенем пригнічення цитопатогенної дії тест-вірусу везикулярного стоматиту; методи експериментальної онкології - визначення протипухлинної ефективності ПВ в комбінації з ІФН різного походження; методи статистичної обробки та аналіз результатів дослідження - оцінка достовірності одержаних даних за допомогою t-критерію Ст'юдента.

Наукова новизна. У роботі вирішена важлива наукова задача - підвищення ефективності імунотерапії злоякісних новоутворень шляхом комбінованого застосування протипухлинної вакцини, створеної на основі пухлинних клітин та цитотоксичного лектину B. subtilis B-7025, з препаратами інтерферону, його індуктором - аміксином та пробіотиком субаліном, що підтверджувалось суттєвим гальмуванням пухлинного росту КЛЛ та саркоми-37, зростанням середньої тривалості життя експериментальних тварин на тлі активації імунологічних показників.

Встановлено, що максимальний протипухлинний ефект має місце за умов застосування ПВ з екзогенним б-ІФН (63 % гальмування росту КЛЛ та 88,5 % - саркоми-37), що вірогідно перевищувало ефективність введення ПВ в монорежимі. Водночас показано, що використання ПВ у поєднанні з індуктором ІФН - аміксином, а також з пробіотичним препаратом субалін (рекомбінантний штам B. subtilis, який містить ген б-ІФН людини) також супроводжувалось підвищенням ефективності вакцинотерапії (гальмування росту КЛЛ сягало 60,6 % та 67,3 %, а саркоми-37 - 80,6 % і 77,3 % відповідно). Аналогічні закономірності зареєстровані при аналізі даних про тривалість життя піддослідних тварин.

Показано, що дані препарати активували всі типи лімфоцитів-ефекторів: ЦТЛ і ПКК, а також активацію Мф. Саме при комбінованому веденні ПВ з б-ІФН на 28 добу пухлинного росту зареєстровано підвищення функціональної активності ЦТЛ і Мф. Ведення ПВ з аміксином в дозі 25 мг/кг супроводжувалось підвищенням активності Мф та зниженням рівня ЦІК, що свідчить про сприятливий прогноз перебігу захворювання. Суттєве підвищення активності ЦТЛ спостерігали при введенні ПВ с пробіотиком субалін в середній та пізній терміни пухлинного росту. Тобто динаміка імунологічних ефектів, викликаних комбінованим застосуванням ПВ з б-ІФН, аміксином та субаліном у більшості випадків була односпрямованою та проявлялась за рахунок суттєвого підвищення реакцій, опосередкованих клітинами лімфоцитарного та макрофагального ряду.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати обґрунтовують доцільність використання комбінованих схем введення ПВ з препаратами б-ІФН, індуктором ІФН - аміксином та пробіотиком субаліном при лікуванні хворих на пухлини. Встановлений стимулюючий вплив ПВ з ІФН різного походження на імунну систему тварин з пухлинним процесом може бути використаний при розробці схем біотерапії злоякісних пухлин та їх моніторингу при клінічному застосуванні ПВ.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто була сформульована мета роботи, поставлені основні завдання та підібрані методи дослідження, які необхідні для виконання поставлених задач. Зібрана та проаналізована сучасна наукова література за темою дисертації, самостійно сплановані та проведені експериментально-онкологічні та імунологічні дослідження, зроблено аналіз отриманих даних. Особисто проведено узагальнення результатів дослідження та сформульовано основні наукові положення та висновки дисертаційної роботи. Робота виконана спільно із співробітниками відділу конструювання засобів біотерапії раку ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Продукцію ІФН досліджували спільно з співробітниками відділу інтерферону та імуномодуляторів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (чл.-кор. НАНУ, проф. М.Я. Співак).

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представленні на: VI Всеукраїнській конференції студентів і аспірантів "Біологічні дослідження молодих вчених в Україні" (Київ, 2006); IV з'їзді онкологів та радіологів країн СНД (Баку, 2006); Міжнародному науково-практичному міждисциплінарному семінарі та дискусійному науковому клубі "Нові технології в медицині та експериментальній біології" (Тайланд, 2007); 14-th International Student Congress of Medical Sciences (Groningen, Netherlands, 2007); V з'їзді онкологів та радиологів країн СНД (Ташкент, 2008); IX Міжнародній конференції молодих онкологів " Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології" (Київ, 2008).

Публікації. Основний зміст дисертації викладений у 11 публікаціях, у тому числі 6 статтях у провідних фахових журналах, рекомендованих ВАК України, 5 - у матеріалах вітчизняних та міжнародних з'їздів та конференцій.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 3 розділів експериментальних досліджень, аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних літературних джерел. Дисертаційна робота викладена на 140 сторінках, ілюстрована 23 рисунками та 21 таблицею. Список використаних літературних джерел містить 164 найменувань, з них 84 українською та російською мовами та 80 англійською.

1. Основний зміст

Матеріали та методи дослідження. Представлені в роботі дані одержані на експериментальному матеріалі. Дослідження проводили на мишах ліній C57Bl/6 та Balb/c (віком 2,5 - 3,5 міс., масою 19-21 г), які були одержані з розплідника віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Утримання мишей та робота з ними здійснювались у відповідності до загальноприйнятих міжнародних правил проведення робіт з експериментальними тваринами. В експериментальних дослідженнях використовували наступні моделі пухлинного росту: саркому 37 (С-37) та карциному легені Льюїс (КЛЛ). Перещеплення пухлинних клітин здійснювали шляхом внутрішньом'язевого (в/м) введення (5 х 105/тварину).

ПВ виготовляли з пухлинної тканини з використанням цитотоксичного лектину B. subtilis B-7025 за стандартним методом (Потебня Г.П та ін., 2001), виходячи із співвідношення 0,2 - 0,5 мг лектину на 0,9 х 107 - 1,1 х 107 пухлинних клітин в 1 мл вакцини. ПВ вводили підшкірно в об'ємі 0,3 мл/тварину на 1-, 4-, 8-, 11- і 15-у до добу після перещеплення пухлини. Тваринам контрольної групи вводили підшкірно фізіологічний розчин хлориду натрію.

Препарат ІФН, одержаний у відділі експериментальних клітинних систем ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України і наданий для досліджень д.б.н. Кудрявцем Ю.Й., готували ex tempore і водили внутрішньоочеревинно (в/ч) по 1000 од. в об'ємі 0,5 мл фізіологічного розчину за 24 год до введення ПВ. Аміксин, наданий Фізико-хімічним інститутом ім. О.В. Богатського НАН України, вводили per os по 0,5 мл/тварину за 2 год до введення ПВ у дозах 25 та 10 мг/кг.

Розчин субаліну готували ex tempore, вводили per os по 2,5 х 108 або 1,0 х 108 колонієутворюючих одиниць (КУО) в об'ємі 0,5 мл/тварину. Препарат розроблений в Інституті мікробіології і вірусології НАН України разом з науково-дослідним конструкторсько-технологічним Інститутом біологічно активних речовин НПО "Вектор" (Росія).

У всіх групах тварин визначали показники середньої тривалості життя (СТЖ), оцінювали індекс гальмування пухлинного росту (ІГП, %). Імунологічні показники визначали на 7-, 14- та 21-у (або 28-у) добу після початку імунізації. Цитотоксичну активність лімфоцитів (ЦТЛ), макрофагів (Мф) та природних кілерних клітин (ПКК) визначали in vitro з використанням радіометричного методу (Рыкова М.П., 1981). В якості клітин-мішеней (КМ) при визначенні активності ПКК використовували ПКК-чутливі клітини К-562, а ЦТЛ та Мф - пухлинні клітини, гомологічні перещепленим. Киснезалежну бактерицидну активність перитонеальних Мф оцінювали у тесті відновлення нітросинього тетразолію (НСТ-тест) (Передерий В. Г., 1995). Рівень антитіл (Ат) до антигенів пухлинних клітин у сироватці крові визначали методом імуноферментного аналізу (Диденко Г. В., 2003). Крім того, в сироватці крові за методом преципітації (Фролов В. М., 2002) оцінювали вміст середньо-молекулярних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК).

Результати імунологічних досліджень оцінювали як в абсолютних величинах відповідних показників, так і в індексах їх модуляції (ІМ) відносно аналогічних показників контрольних груп тварин: ІМ=[(Д-К)/К] х 100 %. Вірогідність різниці між контрольними та дослідними вимірами оцінювали використовуючи t-критерій Ст'юдента. Різницю між порівнюваними показниками вважали вірогідною при Р < 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення

Проведена експериментальна робота складалась з трьох етапів. На першому етапі досліджували вплив ПВ в комбінації з екзогенним б-ІФН мишей на динаміку росту модельних пухлин, СТЖ тварин та окремі ланки протипухлинного імунітету.

На моделі КЛЛ при комбінованому введенні ПВ і б-ІФН спостерігали вірогідне збільшення тривалості латентного періоду (ЛП) до 13,5 ± 0,3 діб в порівнянні з показниками "контролю перещеплення" - 9,0 ± 0,5 діб (Р < 0,05). У групах тварин, які отримували ПВ і б-ІФН в монорежимі, ЛП складав відповідно 11,1 ± 0,6 та 12,5 ± 0,8 діб, що також вірогідно перевищувало аналогічні показники у "контролі перещеплення".

Результати дослідження динаміки росту КЛЛ свідчать про суттєве гальмування об'єму пухлин при комбінованому застосуванні ПВ та б-ІФН. Так, на 28 добу після комбінованого введення ПВ та б-ІФН об'єм пухлин зменшувався до 2,27 ± 0,31 см3 порівняно як показниками у контрольній групі (7,11 ± 0,98 см3), так і при застосуванні ПВ і б-ІФН в монорежимі (відповідно 4,72 ± 0,65 та 4,27 ± 0,59 см3).

Аналогічні закономірності зареєстровано при аналізі показників СТЖ дослідних тварин. СТЖ тварин, які отримували ПВ та б-ІФН в монорежимі, продовжувалась відповідно до 53,7 ± 2,4 та 54,8 ± 1,4 діб проти 39,8 ± 1,8 діб (Р < 0,05) у контрольній групі. При комбінованому застосуванні ПВ з б-ІФН СТЖ була найвищою і сягала 65,0 ± 3,9 діб (Р < 0,05).

Для вивчення механізмів дії досліджуваних препаратів визначали цитотоксичну активність ПКК та Т-лімфоцитів, а також киснезалежну бактерицидну активність перитонеальних Мф (табл. 1).

Таблиця 1 Активність ефекторів клітинного протипухлинного імунітету у мишей з КЛЛ, які одержували ПВ та б-ІФН в монорежимі та за комбінованою схемою

Примітка: *Р 0,05 порівняно з інтактним контролем;

**Р 0,05 порівняно з "контролем перещеплення".

У тварин, яким вводили б-ІФН в монорежимі, індекс цитотоксичної активності ПКК на 28 добу пухлинного росту залишався на рівні інтактного контролю. Ці показники були вірогідно меншими за показники "контролю перещеплення". При окремому застосуванні ПВ спостерігалось підвищення активності ПКК порівняно як із інтактним контролем, так і "контролем перещеплення". У випадку комбінованого використання ПВ з б-ІФН показники активності ПКК були наближені до таких інтактних тварин, але нижчими ніж у "контролі перещеплення". Відомо, що роль природних кілерів важлива переважно на перших етапах пухлинного процесу, однак по мірі росту пухлини їх роль в деструкції пухлинних клітин зменшується, поступаючи місце іншим клітинам, зокрема ЦТЛ (Бережная Н.М., Чехун В.Ф., 2005).

При аналізі активності ЦТЛ у тварин, яким вводили б-ІФН в монорежимі, спостерігали показники, подібні таким у "контролі щеплення", але вони перевищували показники інтактного контролю. При введенні ПВ активність ЦТЛ підвищувалась, але різниця порівняно з показниками інтактного контролю була не вірогідною. Комбіноване застосування ПВ і б-ІФН призводило до вірогідного підвищення активності ЦТЛ (Р < 0,05) як в порівнянні з "контролем перещеплення", так і з іншими групами тварин, які досліджувались.

У тварин, яким вводили ПВ та б-ІФН в монорежимі, активність Мф (в НСТ-тесті) залишалась на рівні інтактного контролю. Однак при комбінованому використанні ПВ з б-ІФН спостерігали суттєву активацію Мф порівняно як з "контролем перещеплення", так і з введенням ПВ або б-ІФН у монорежимі.

Дослідження ефективності ПВ і б-ІФН на моделі солідної форми саркоми-37 також показало найбільш суттєве гальмування пухлинного росту при комбінованому їх застосуванні, що підтверджувалось вірогідним зменшенням середнього об'єму пухлини, який на 41 добу після перещеплення дорівнював лише 0,72 ± 0,27 см3.

Статистично вірогідна різниця (Р < 0,05) зареєстрована порівняно як з контрольною групою (6,00 ± 0,34 см3), так і з застосуванням ПВ та б-ІФН в монорежимі (відповідно 1,78 ± 0,61 та 2,40 ± 0,4 см3).

Таким чином, у групі тварин, які одержували б-ІФН та ПВ в монорежимі, ІГП дорівнював відповідно 70,7 та 78,4 %. Однак найкращі результати було відзначено у групі тварин з комбінованою схемою введення досліджуваних препаратів, коли ІГП зростав до 88,5 % (Р < 0,05).

Аналіз СТЖ повністю підтвердив цю закономірность: саме при комбінованому застосуванні ПВ з б-ІФН цей показник сягав 92,7 10,4 діб, що вдвічі перевищувало СТЖ мишей контрольної групи (46,8 1,5 діб, Р < 0,05) та було кращим за аналогічні показники тварин при окремому використанні препаратів, які досліджувались (відповідно 79,3 10,9 та 64,7 10,1 діб).

Встановлено, що у мишей групи "контроль перещеплення" відбувалось вірогідне зростання рівня протипухлинних Ат протягом всього періоду дослідження проти інтактного контролю (табл. 2). Слід зазначити, що з 14 доби рівень IgG сягав найбільших значень при застосуванні б-ІФН як в монорежимі, так і при комбінованій схемі введення з ПВ порівняно з інтактним контролем, що свідчить саме про імуноад'ювантну дію препаратів. Незначне зниження рівня антитіл спостерігали на 40 добу пухлинного росту в усіх групах тварин, яким вводили препарати, які досліджувались.

Аналіз даних, наведених у табл. 2, свідчить, що у сироватці крові мишей групи "контроль перещеплення" в пізній термін пухлинного росту (40 доба) підвищувалась концентрація середньо-молекулярних ЦІК. На відміну від цього у мишей, яким вводили ПВ в монорежимі або за комбінованою схемою з б-ІФН, на даний термін дослідження відбувалось вірогідне зменшення рівня ЦІК що є позитивною прогностичною ознакою.

Таблиця 2 Показники рівня IgG та ЦІК в сироватці крові мишей з саркомою-37, які одержували ПВ та б-ІФН в монорежимі та за комбінованою схемою

Примітка: * Р < 0,05 порівняно з "контролем перещеплення";

**Р < 0,05 порівняно з інтактним контролем.

Таким чином, результати проведених досліджень свідчать про можливість вірогідного покращення ефективності ПВ шляхом її комбінованого застосування з препаратом б-ІФН, про що свідчило більш ефективне гальмування пухлинного росту, подовження СТЖ та зареєстровано значне підвищення функціональної активності ЦТЛ та Мф порівняно з групами, яким вводили препарати в монорежимі. Тому на другому етапі досліджень доцільно було вивчити ефективність комбінованої схеми введення ПВ з індуктором ендогенного ІФН - препаратом аміксином.

На моделі солідної форми саркоми-37 у мишей лінії Balb/c було показано, що ПВ та аміксин при введенні в монорежимі здатні вірогідно гальмувати пухлинний ріст (рис. 4). Так, на 41 добу після перещеплення середній об'єм пухлин у мишей, яким вводили ПВ або аміксин в дозах 10 та 25 мг/кг відповідно складав 1,78 0,61 та 2,70 0,90 і 2,13 0,53 см3 проти 6,00 0,34 см3 в групі "контроль перещеплення" (Р < 0,05). При застосуванні ПВ з аміксином у дозі 10 мг/кг середній об'єм пухлини зменшувався до 3,00 0,85 см3. Однак найкращі результати зареєстровано при комбінованому введенні ПВ з аміксином в дозі 25 мг/кг, коли спостерігалось зменшення середнього об'єму пухлини до 1,26 0,61 см3 (Р < 0,05).

Отже, у мишей, які одержували ПВ, ІГП складав 78,4 %, а при застосуванні аміксину в дозах 10 та 25 мг/кг - 68,2 і 75,5 % відповідно, однак різниця між показниками не була вірогідною (Р > 0,05). При комбінованому використанні ПВ з аміксином у дозі 25 мг/кг ІГП складав 80,6 %. Результати застосування ПВ з аміксином у дозі 10 мг/кг були суттєво нижчими (ІГП дорівнював 61,9 %), ніж при окремому введенні ПВ. Механізми такого ефекту потребують подальшого з'ясування. Аналіз показників СТЖ повністю підтвердив встановленну закономірность: найкращі результати спостерігали саме при комбінованому застосуванні ПВ з аміксином в дозі 25мг/кг (95,0 6,2 діб), коли СТЖ практично вдвічі перевищувало СТЖ тварин контрольної групи (46,8 1,5 діб, Р < 0,05). СТЖ тварин при окремому використанні ПВ складало 79,3 10,9 діб. Разом з тим СТЖ при комбінованому введенні ПВ з аміксином у дозі 10 мкг/мл практично не відрізнялась від такої при окремому використанні аміксину у цій же дозі (відповідно 77,0 7,8 та 77,010,1 діб, Р > 0,05), хоча і вірогідно перевищувало показник тварин контрольної групи (Р < 0,05).

У сироватці крові тварин на 14 добу після введення ПВ виявляли рівень IgG, який майже не відрізнявся від показників "контролю перещеплення", коли на 30 та 40 добу рівень антитіл значно перевищував як показники контрольної групи, так і показники інших груп, які досліджували (табл. 3). Використання аміксину в дозі 25 мг/кг призводило до зменшення рівня IgG в порівнянні з показниками групи "контролю перещеплення". Аналогічну закономірність спостерігали і при його комбінованому застосуванні з ПВ, що вірогідно відрізнялось від показників при введенні ПВ в монорежимі. Дана імунна картина схожа на реакцію, яка йде по Тх1 типу, що забезпечує переважно розвиток клітинної імунної відповіді (Дранник Г.Н., 2003).

Дослідження вмісту середньо-молекулярних ЦІК в сироватці крові показало, що на 40-у добу після перещеплення пухлини у "контролі перещеплення" спостерігалось різке зростання рівня ЦІК (табл. 3).

Таблиця 3 Показники рівня IgG та ЦІК в сироватці крові мишей з саркомою-37, які одержували ПВ та аміксин в монорежимі та за комбінованою схемою

Примітка: *Р < 0,05 порівняно з "контролем перещеплення"

У тварин всіх дослідних груп, які за різними схемами отримували ПВ та/або аміксин у дозах 10 мг/мл та 25 мг/мл, навпаки, у відповідний термін зареєстровано зменшення цього показника, що за даними літератури співпадає з сприятливим прогнозом перебігу захворювання. В нашому дослідженні це дійсно супроводжувалось значним гальмуванням пухлинного росту та збільшенням СТЖ тварин.

Результати, одержані на моделі саркоми-37, свідчать про більш високу ефективність застосування ПВ з аміксином у дозі 25 мг/кг, що підтверджується суттєвим гальмуванням росту пухлини, збільшенням СТЖ на тлі покращення показників імунного статусу.

Подібні результати були одержані і на моделі КЛЛ. Так, ІГП при окремому застосуванні ПВ складав 42,1 %, при її комбінованому введенні з аміксином в дозі 10 мг/кг - 48,7 %. У групі тварин, які отримували ПВ з аміксином у дозі 25 мг/кг, ІГП зростав до 60,6 % (Р < 0,05). Окреме застосування ПВ або аміксину у дозах 10 мг/кг та 25 мг/кг сприяло подовженню СТЖ до 47,1 ± 2,1, 42,8 ± 1,6 та 44,7 ± 2,3 діб, відповідно. Як і на попередній модельній пухлині кращі результати досягнуто при комбінованому застосуванні ПВ з аміксином у дозі 25мг/кг (55,0 2,6 діб), що вірогідно перевищували показники контрольної групи ( 34,6 1,3 діб, Р < 0,05).

Дослідження функціональної активності перитонеальних Мф в НСТ-тесті на 7, 14 та 21 добу не виявило суттєвої різниці між показниками груп, які досліджувались порівняно з "контролем перещеплення" (табл. 4).

Таблиця 4 Рівень киснезалежної бактерицидної активності перитонеальних Мф та IgG до антигенів КЛЛ у сироватці крові мишей, які одержували ПВ та аміксин в монорежимі та за комбінованою схемою

Примітка: * - Р < 0,05 порівняно з "контролем перещеплення"

Але при визначенні в сироватці крові рівня IgG до антигенів КЛЛ саме у мишей, які одержували ПВ та аміксин у дозі 25 мг/кг на 7 добу після перещеплення КЛЛ зареєстровано найвищий показник серед усіх дослідних груп, що вірогідно перевищувало рівень IgG у мишей контрольної групи (Р < 0,05). У пізні терміни після прищеплення КЛЛ (21 доба) рівень IgG у сироватці крові всіх груп тварин наближався до такого інтактних мишей і лише при застосуванні ПВ з аміксином (25 мг/кг) перевищував його (Р < 0,05).

На даному етапі дослідження визначали титр ІФН в сироватці крові мишей з солідною формою саркоми-37 та КЛЛ (табл. 5). Так на 14 добу у мишей з саркомою-37, яким вводили ПВ в монорежимі спостерігали підвищення титру сироваткового ІФН порівняно як з "контролем перещеплення", так і іншими групами тварин, які досліджувались. Подібні показники спостерігали і на 30 добу, зокрема в групі тварин, яким вводили ПВ в комбінації з аміксином в дозі 25 мг/кг, де рівень ІФН в сироватці крові сягав найвищих значень, та зниження його в пізній термін росту саркоми-37 (40 доба).

У мишей з КЛЛ вміст ІФН у сироватці крові суттєво не змінювався. Слід відмітити, що при комбінованому застосуванні ПВ з аміксином (25 мг/кг) спостерігалось підвищення концентрації сироваткового ІФН на 21 добу.

Таблиця 5 Визначення титрів ІФН в сироватці крові мишей з солідною формою саркоми-37 та КЛЛ, які одержували аміксин в монорежимі та при комбінованому застосуванні з ПВ

Примітка: *Р < 0,05 в порівнянні з "контролем перещеплення"

**Р < 0,05 в порівнянні з інтактним контролем

Отже, одержані на модельних пухлинах (саркома-37, КЛЛ) результати свідчать про можливість покращення ефективності ПВ за рахунок використання не тільки з екзогенним ІФН, а також з його індуктором аміксином.

На наступному етапі досліджень з метою підвищення протипухлинної дії вакцини застосовували пробіотичний препарат субалін. Експерименти проводили за аналогічною схемою.

У мишей з перещепленою КЛЛ зареєстровано позитивний вплив на ефективність ПВ субаліну в дозі 1,0 х 108 КУО. Відзначено суттєве гальмування пухлинного росту: об'єм пухлини на 43 добу складав 1,56 ± 0,01 см3, тоді як у "контролі перещеплення" - 6,3 ± 0,10 см3 (Р < 0,05). Комбіноване застосування ПВ з субаліном у більшій дозі (2,5 х 108 КУО) було менш ефективним (3,28 ± 0,45 см3), але результат також перевищував аналогічний показник у мишей, які одержували ПВ в монорежимі, (4,22 ± 0,51 см3) (рис. 4, А). Отже, найбільш значне гальмування росту КЛЛ відбувалося при застосуванні ПВ у комбінації з субаліном в дозі 1,0х108 КУО.

Однак найбільш суттєва зміна динаміки росту саркоми-37 спостерігалась при комбінованому застосуванні ПВ і субаліну в дозі 2,5 х 108 КУО.

У даному випадку на 31 добу після перещеплення об'єм пухлини складав 2,95 ± 0,35 см3, що значно поступалося відповідним показникам як "контролю перещеплення" (9,70 ± 0,84 см3, Р < 0,05) та групи мишей, які одержували ПВ в монорежимі (8,16 ± 0,41 см3, Р < 0,05), так і тих, що одержували за комбінованою схемою ПВ та субалін у меншій дозі (4,66 ± 0,88 см3, Р < 0,05).

Встановлено, що у мишей з саркомою-37 після застосування ПВ та/або субаліну спостерігалось суттєве подовження СТЖ. Введення ПВ або субаліну (2,5 х 108 КУО) в монорежимі супроводжувалось збільшенням цього показника порівняно з "контролем перещеплення" на 38,8 та 31,2 % відповідно (44,0 ± 4,1 та 41,6 ± 1,9 діб, Р < 0,05), а при застосуванні комбінованої схеми введення препаратів - на 129,1 % (72,7 ± 13,3 діб, Р < 0,05). При цьому введення субаліну в меншій дозі (1,0 х 108 КУО) не сприяло вірогідному подовженню СТЖ ні в монорежимі, ні в комбінації з ПВ (відповідно 35,0 ± 1,7 та 42,5 ± 6,1 діб).

У мишей з перещепленою КЛЛ, навпаки, кращим виявився показник СТЖ при комбінованому застосуванні ПВ та субаліну саме в дозі 1,0х108 КУО, але різниця з СТЖ "контролю перещеплення" не була вірогідною (відповідно 66,0 5,5 та 57,1±3,3 діб).

Результати дослідження СТЖ тварин на обох експериментальних моделях пухлинного росту свідчать про перевагу комбінованого застосування ПВ і субаліну перед використанням цих препаратів у монорежимі.

Результати дослідження протипухлинної цитотоксичності ефекторів клітинного імунітету (Мф, ЦТЛ, ПКК) дозволили виявити деякі відмінності між дослідними групами тварин (табл. 6).

Зокрема встановлено, що у мишей з саркомою-37, яким вводили ПВ та/або субалін, на 21 добу пухлинного росту цитотоксична активність Мф була вірогідно збільшеною в порівнянні з групою "контроль перещеплення" (в середньому у 3,6 рази). Серед особливостей імунних показників при комбінованому застосуванні ПВ з субаліном слід відзначити вірогідне підвищення активності ЦТЛ в середній - 21 доба та пізній - 58 доба термін пухлинного росту. При аналізі цитотоксичної активності ПКК слід відмітити групи тварин, які одержували ПВ окремо або разом з субаліном, де на 10 добу фіксували збільшення цитотоксичного індексу порівняно з "контролем перещеплення".

Таким чином, суттєве гальмування росту саркоми-37 та вірогідне подовження СТЖ мишей, які отримували ПВ та субалін за комбінованою схемою, може бути опосередковано активацією Мф на ранніх стадіях пухлинного процесу та підвищенням активності ЦТЛ та ПКК в термінальні строки росту пухлин.

Зміну імунологічних показників встановлено також у тварин з КЛЛ (табл. 7). В групі "контроль перещеплення" на 28 добу пухлинного процесу цитотоксична активність ПКК та ЦТЛ утримувалась на високому рівні - 35,5 ± 2,6% і 24,5 ± 13,8% відповідно, що вірогідно перевищувало такі показники інтактних тварин.

У мишей, які отримували ПВ або субалін окремо, спостерігали суттєву активацію ПКК (в порівнянні з обома контрольними групами), в той час як активність ЦТЛ та Мф залишалась на рівні інтактного контролю. Після комбінованому застосуванні ПВ та субаліну при зниженій активності ПКК спостерігали вірогідну активацію ЦТЛ.

Таблиця 6 Цитотоксична активність клітин-ефекторів протипухлинного імунітету мишей з саркомою-37 при комбінованому введенні ПВ та субаліну (2,5 х 108 КУО)

Примітка: *Р 0,05 в порівнянні з "контролем перещеплення"

При комбінованому введенні ПВ та субаліну спостерігали зниження активності Мф в порівнянні з контролем перещеплення. У мишей, які отримували ПВ або субалін окремо активність Мф залишалась на рівні інтактного контролю.

Заслуговує уваги те, що саме в дослідних групах з комбінованою схемою введення ПВ з субаліном у 20 % тварин пухлини не розвинулись взагалі. Саме у цих тварин на 45 добу після прищеплення КЛЛ (коли всі миші "контролю перещеплення" загинули) зафіксовано суттєву активацію клітин-ефекторів як неспецифічного, так і специфічного захисту. Вірогідно, що такий стан клітинного імунітету дав змогу організму протистояти розвитку пухлини. Так, активність ПКК дорівнювала 11,6 ± 4,1%, ЦТЛ - 26,4 ± 7,2%, що суттєво перевищувало показники інтактного контролю (Р < 0,05). У групі тварин, які отримували комбіноване введення препаратів, активність Мф суттєво не відрізнялась від групи інтактного контролю.

Таблиця 7 Активність клітин-ефекторів протипухлинного імунітету у мишей з КЛЛ, які одержували ПВ та субалін (1,0 х 108 КУО) в монорежимі та за комбінованою схемою

Примітка: 1Р 0,05 порівняно з інтактним контролем; 2Р 0,05 порівняно з "контролем перещеплення".

Таким чином, одержані результати свідчать про можливість підвищення ефективності ПВ за рахунок її комбінованого використання з екзогенним б-ІФН, а також з індуктором ІФН - аміксин, або пробіотичним препаратом субалін, значне гальмування пухлинного росту та збільшення показника СТЖ вакцинованих тварин відбувається шляхом активації основних клітин-ефекторів протипухлинного імунітету: ЦТЛ, ПКК, Мф.

протипухлинний вакцина імунітет пробіотик

Висновки

У роботі вирішена важлива наукова задача - підвищення ефективності імунотерапії злоякісних новоутворень шляхом комбінованого застосування протипухлинної вакцини, створеної на основі пухлинних клітин та цитотоксичного лектину B. subtilis B-7025, з препаратами інтерферону, його індуктором - аміксин та пробіотиком субалін, який містить ген синтезу б-ІФН людини, що підтверджувалось суттєвим гальмуванням пухлинного росту КЛЛ та саркоми-37, а також зростанням середньої тривалості життя експериментальних тварин на тлі активації імунологічних показників.

1. Встановлено, що комбіноване застосування ПВ з б-ІФН у мишей з перещепленими КЛЛ або саркомою-37 викликало вірогідне гальмування пухлинного росту (на 68,0 та 88,5 %, відповідно) та сприяло подовженню СТЖ тварин (на 63 % та 98 %, відповідно), що перевищує ефект використання ПВ або б-ІФН в монорежимі.

2. Показано, що підвищення ефективності вакцинотерапії при комбінованому застосуванні ПВ з екзогенним б-ІФН супроводжувалось активацією показників клітинної ланки імунітету: на 28 добу пухлинного росту спостерігалось суттєве підвищення функціональної активності ЦТЛ (ЦІ = 34,6 ± 2,4) та Мф (0,600 опт. од.), а також зростання рівня протипухлинних антитіл та вірогідне зменшення рівня ЦІК.

3. Проаналізовано, що підсилення ефективності ПВ відбувається при її комбінованому використанні з індуктором ендогенного синтезу ІФН - аміксином в дозі 25 мг/кг. Гальмування пухлинного росту у мишей з саркомою-37 та КЛЛ cягало 80,6 та 60,6 %. СТЖ порівняно з такою у контрольних тварин з пухлинами подовжувалась на 102,9 та 58,9 %, відповідно (Р < 0,05), що перевищувало аналогічні показники мишей, які одержували тільки ПВ (69,4 % та 36,1 %, відповідно). У мишей з комбінованим введенням препаратів в пізній термін пухлинного росту (40 доба) зареєстровано знижений рівень антитіл та ЦІК, що свідчить про сприятливий прогноз перебігу захворювання.

4. Доведено, що введення ПВ в комбінації з пробіотиком субалін мишам з саркомою-37 та КЛЛ сприяє вірогідному підвищенню гальмування пухлинного росту (відповідно на 69,6 та 75,2 %, Р < 0,05) порівняно з таким при використанні ПВ в монорежимі (на 15,9 та 33,0 %). На моделі КЛЛ ефективною виявилася доза субаліну 1,0 х 108 КУО, на моделі саркоми-37 - 2,5 х 108 КУО. У мишей, які отримували ПВ в комбінації з субаліном встановлено підвищення активності ЦТЛ у середній (30,6 ± 4,0 %) та пізній (26,4 ± 7,2 %) терміни пухлинного росту.

5. Показано, що динаміка імунологічних ефектів, викликаних комбінованим застосуванням ПВ з б-ІФН, аміксином та субаліном в більшості випадків була односпрямованою та проявлялась за рахунок суттєвого підвищення реакцій, опосередкованих клітинами лімфоцитарного та макрофагального ряду (ЦТЛ, ПКК та Мф).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Танасієнко О.А. Підсилення ефективності протипухлинної вакцини за допомогою пробіотиків / О.А. Танасієнко, Г.С. Лісовенко, Н.В. Трохименко, Н.Л. Черемшенко // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. - 2006. - № 11. - С. 41-42. Особистий внесок здобувача - автором проаналізовано середню тривалість життя тварин з саркомю-37, вплив комбінованого застосування препаратів на метастазування тварин з карциномою легені Льюїс, статистична обробка отриманих даних.

2. Потебня Г.П. Вплив пробіотика субаліну на ефективність протипухлинної вакцини / Г.П. Потебня, Л.А. Сафронова, Н.Л. Черемшенко, Г.С. Лісовенко, І.Б. Сорокулова, В.О. Приходько, Н.В Трохименко, О.А. Танасієнко, А.В. Бомбін // Мікроб. журн. - 2006. - Т. 68, № 6. - С. 51-58. Особистий внесок здобувача - планування експерименту, виконання всіх його частин (проведення НСТ-тесту, визначення рівня ЦІК, динаміки росту, латентний період), статистичний аналіз результатів експерименту.

3. Potebnya G.P. Experimental study of the efficacy of combined use of cancer vaccine and interferon / G.P. Potebnya , Yu. Y. Kudryavets, G.S. Lisovenko, N.L. Cheremshenko, I.M. Voyekova, N.V. Trokhimenko, T.V. Symchich, L.M. Evstratyeva // Exp Oncol. - 2007. - Т. 29, № 2. - P. 102 - 105. Особистий внесок здобувача - планування експерименту, дослідження впливу вакцини на основі лектину на показники імунної системи, статистичний аналіз результатів експерименту.

4. Потебня Г.П. Способи підвищення ефективності протипухлинної вакцини / Г.П. Потебня, Н.В. Трохименко, В.К. Позур // Вісник Київського національного університету імені Тараса Шевченка. - 2007. - № 49-50. - С. 28-30. Особистий внесок здобувача - автором проаналізовано дані літератури про можливість підсилення ефективності протипухлинних вакцин за рахунок цитокінів та пробіотичних препаратів.

5. Потебня Г.П. Підвищення ефективності протипухлинної вакцини пробіотичним препаратом субалін / Г.П. Потебня, І.М. Воєйкова, Н.Л. Черемшенко, Г.С. Лісовенко, Н.В. Трохименко, В.М. Базась, Л.П. Дідківська, О.М. Караман, З.Д. Савцова // Онкология. - 2008. - Т.10, № 2. - С. 246-251. Особистий внесок здобувача - дослідження протипухлинних ефектів, імунних змін, викликаних протипухлинною вакциною та субаліном, статистичний аналіз результатів експерименту.

6. Potebnya G.P. Elevation of efficacy of cancer vaccine combined with interferon and inducer of endogeneous interferon synthesis amixin / G.P. Potebnya , G.S. Lisovenko, N.V. Trokhimenko, N.L. Cheremshenko, G.V. Didenko, А.S. Reder, S.A Andronati // Exp Oncol. - 2008. - V. 30, № 4. - P. 319-323. Особистий внесок здобувача - підготовлено статтю до друку, проведення імуноферментного аналізу, НСТ-тесту, дослідження протипухлинних ефектів, статистична обробка отриманих даних.

7. Трохименко Н.В. Підвищення ефективності протипухлинної вакцини за допомогою пробіотика субаліну / Н.В. Трохименко // Біологічні дослідження молодих вчених в Україні матеріали VI Всеукраїнської наукової конференції студентів та аспірантів, 21-22 вересня, 2006. - К., 2006. - С. 74.

8. Потебня Г. П. Повышение эффективности противоопухолевой вакцины с помощью пробиотического препарата субалин / Г.П. Потебня, Г.С. Лісовенко, Н.Л. Черемшенко, И.М. Воейкова, Л.А. Сафронова, Н.В. Трохименко // IV съезд онкологов и радиологов СНГ: материалы съезда, 28 сентября - 01 октября, 2006. Баку 2006. - С. 302-303.

9. Trokhуmenko N. V., The efficacy of combined application of cancer autovaccine and interferon in vivo / N.V. Trokhуmenko, G.S. Lisovenko, N.L. Cheremshenko, Y.V. Chishkevich // 14th International student congress of medical sciences, June 6th-9th, Groningen, Netherlands, 2007. - P. 133.

10. Трохименко Н. В. Использование иммуномодулирующего препарата амиксин для повышения эффективности противоопухолевой вакцины / Н.В. Трохименко, В.Н. Базась // Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології тези IX Міжн. конф. молодих онкологів, 23-24 квітня, 2008. К., 2008. С. 108.

11. Потебня Г.П. Комбинированое лечение саркомы-37 противоопухолевой вакциной и иммуномодулирующим препаратом Эрбисол / Г.П. Потебня, О.Н. Николаенко, Г.С. Лисовенко, Н.Л. Черемшенко, Н.В. Трофименко, Г.В. Диденко // V - съезд онкологов и радиологов СНГ: мат. съезда, 14-16 мая, 2008, г. Ташкент, 2008. - С. 538-539.

Размещено на Allbest.ru