Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Особливості будови тимуса білих щурів після імуностимуляції та імуносупресії в різні вікові періоди

Загальна характеристика роботи

тимус щур імуностимуляція

Актуальність теми. Необхідність вивчення будови і функцій органів імунної системи обумовлена потребами сучасної практичної медицини. В останні десятиліття в світі збільшилася кількість захворювань, етіологія і патогенез яких прямо або опосередковано пов'язані з порушеннями діяльності імунної системи (В.П. Лесков, 1999; Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, 2000; А.В. Пичугин, А.С. Апт, 2005; C. Ferri et al., 2006). Провідна роль імунної системи організму в боротьбі з різними інфекціями і неконтрольованою проліферацією власних клітин експериментально обґрунтована і є загальновизнаною (Ю.И. Бородин, 1996; Р.В. Петров и соавт., 1999; Н.А. Волошин и соавт., 2002; А.А. Ярилин, 2003; В.А. Труфакин, А.В. Шурлыгина, 2006; R. Rezzani et al., 2008). Ряд досліджень вказують на те, що імунна система є високоспеціалізованою та знаходиться в стані постійної модифікації (Г.Г. Касымова, К.Р. Тухтаев, 2001; В.І. Шепітько, 2003; М.Р. Сапин, М.Г. Ткачук, 2005; В.В. Маляр, А.С. Головацький, 2008). У зв'язку з цим, будь-яка ендогенна або екзогенна дія обов'язково призводять до морфологічних змін в будові і функції органів, що входять в її склад. При цьому пошкодження імунної системи може виявлятися посиленням або супресією функцій організму, або взагалі не виявлятися клінічно (Я.Я. Боднар та співавт., 2007; G. Fahy, 2003; L. Dakshayani et al., 2007). Пригнічення імунітету призводить до збільшення поширеності інфекційних захворювань, ослаблення механізмів протипухлинного захисту. Ряд дослідників указують на те, що різні прояви дій ушкоджувальних чинників на функціонування імунної системи залежать не тільки від сили і часу впливу чинника, але і від загального стану організму, рівня його метаболічних реакцій і захисних сил. Останнє положення особливе актуально у зв'язку з ослабленням імунного захисту населення внаслідок погіршення стану екосфери планети і значного превалювання серед мікроорганізмів їх патогенних або опортуністичних форм. Промисловий регіон Донбасу є одним з найбільш забруднених в екологічному плані на території України, що само по собі служить причиною формування різноманітних вторинних імунодефіцитних станів (В.М. Фролов, Г.М. Драннік, 2003).

Фундаментальними дослідженнями доведено, що тимус є первинним регулятором імунних процесів в організмі у зв'язку з тим, що саме в тимусі визначається майбутня доля Т-лімфоцитів як функціонально активної популяції. Дані літератури свідчать про те, що тимус активно реагує на будь-яку екзогенну або ендогенну дію, що виявляється змінами в його будові і функціях (В.К. Сырцов, 1998; А.М. Камышный, 2002; Ю.А. Гриневич и соавт., 2005; T. Boehm, 2008). Якщо на функції тимуса впливають численні фактори, отже, можна керувати його роботою шляхом цілеспрямованої дії речовинами і чинниками, що підвищують або пригнічують функції імунітету. В доступній літературі широко описані результати вивчення впливу різноманітних дій на органи імунної системи, проте, вітчизняні і зарубіжні автори, в основному, роблять акцент на імунологічні та імуногістохімічні дослідження, тоді як морфологічний напрям залишається недостатньо висвітленим. Незважаючи на значну роль тимуса в організмі тварин і людини, вивченню його морфогенезу приділяється недостатня увага. Відомості, що стосуються морфологічних змін в будові тимуса після застосування сучасних імуномодулюючих препаратів останнього покоління, створених з використанням нанотехнологій, на сьогоднішній день повністю відсутні в доступних джерелах інформації. Також в літературі немає цілісного уявлення про морфореактивність тимуса після імуносупресії в експерименті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно плану наукових досліджень Луганського державного медичного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми кафедри гістології, цитології та ембріології «Особливості будови деяких органів імунної, ендокринної та нервової систем під впливом екзогенних чинників», державний реєстраційний номер 0106U006009. Тема дисертації затверджена на засіданні Вченої ради ЛугДМУ (протокол № 2 від 07.02.2008 р.) та Проблемної комісії «Морфологія людини» АМН та МОЗ України (протокол № 83 від 12.02.2008р.).

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження явилося виявлення особливостей змін в будові тимуса щурів на макро-, мікро- і ультраструктурному рівнях після застосування імуностимулюючого лікарського засобу (імунофан) та імуносупресивного препарату (циклофосфан).

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні завдання:

1. Використати експериментальні моделі індукції імуностимульованого та імунодефіцитного стану на лабораторних тваринах в морфологічному експерименті із підтвердженням змін, що розвиваються, в тимусі щурів різних вікових груп і при різній тривалості досліду.

2. Вивчити зміни в морфологічній будові тимуса експериментальних тварин статевонезрілого віку і репродуктивного періоду контрольної групи і під впливом імуноактивного стану, що індукується за допомогою імунофану.

3. Дослідити особливості макро- і мікроскопічної будови тимуса щурів статевонезрілого віку і репродуктивного періоду контрольної групи і під впливом імунодефіцитного стану, що викликаний за допомогою циклофосфану.

4. Вивчити особливості щільності розташування клітин в субкапсулярній зоні кіркової речовини тимуса статевозрілих щурів-самців після застосування імуномодулятора, імуносупресора і в контролі.

5. Дослідити особливості ультрамікроскопічної будови тимуса статевозрілих тварин в контролі, після імуностимуляції, що викликана застосуванням імунофану та імуносупресії, що індукується введенням циклофосфану.

6. Оцінити стан імунного статусу організму піддослідних щурів за допомогою аналізу кількості Е-розеткоутворюючих клітин в периферичній крові після застосування імунофану та циклофосфану, а також визначити особливості складу периферичної крові статевозрілих щурів після вказаних дій і в контрольній групі тварин.

Об'єкт дослідження: морфогенез тимуса білих щурів різного віку в умовах імуностимуляції та супресії, особливості складу периферичної крові тварин репродуктивного періоду.

Предмет дослідження: морфологічні зміни в будові тимуса білих щурів різного віку в умовах імуностимуляції і супресії.

Методи дослідження: органометричний - визначення маси піддослідних тварин і досліджуваного органу, його лінійних розмірів; морфометричний - вивчення морфометричних параметрів органу на гістологічних зрізах; гістологічний - дослідження структури тимуса на світлооптичному рівні; цитологічний - визначення щільності розташування клітин в субкапсулярній зоні кіркової речовини тимуса; електронномікроскопічний - дослідження ультраструктурних змін в будові тимуса тварин після вказаних дій; метод спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана - для визначення рівня Т-лімфоцитів в периферичній крові (Е-розеткоутворюючих клітин); визначення гемограми і лейкоцитарної формули крові щурів при змодельованих станах - для виявлення особливостей складу периферичної крові.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше визначений вплив імуномодулятора тимічного походження останнього покоління на показники морфометрії тимуса білих щурів, а також встановлені морфологічні особливості будови тимуса в умовах імунодефіциту, що індукується одноразовим введенням циклофосфану.

Вперше були вивчені особливості кількості клітин в субкапсулярній зоні кіркової речовини тимуса статевозрілих тварин після застосування імунофану і циклофосфану.

Вперше були виявлені особливості ультрамікроскопічної будови тимуса щурів статевозрілого вікового періоду після імуносупресії і імуностимуляції.

Вперше проведена оцінка імунологічного статусу організму тварин, а також досліджений склад периферичної крові статевозрілих щурів після застосування імунофану і циклофосфану.

Практичне значення отриманих результатів. Робота направлена на виявлення адаптаційних можливостей тимуса при різних імунореактивних станах організму і покликана розкрити складні аспекти будови структурних компонентів тимуса.

Отримані результати дозволили з'ясувати особливості морфофункціональних змін в будові тимуса при різних станах імунітету у тварин двох вікових періодів. Ці дані, враховуючи активну роль органу в регуляції діяльності організму, можуть бути використані для з'ясування деяких ланок етіології та патогенезу ряду захворювань і при проведенні комплексу лікувально-профілактичних заходів в імунології, алергології, педіатрії, онкології. Отримані результати можуть знайти застосування в наукових дослідженнях, а також в учбовому процесі на кафедрах гістології, цитології, ембріології, анатомії людини і патологічної анатомії, фізіології, імунології, алергології, інфекційних хвороб медичних ВНЗ України.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно виконаний патентно-інформаційний пошук, визначені мета і завдання дослідження, методичні підходи, згідно яких автором особисто виконані експериментальні дослідження, гістологічна обробка матеріалу, мікрофотографування, морфометричні вимірювання, статистична обробка результатів, оформлення їх у вигляді таблиць, графіків, мікрофотографій, проведений аналіз отриманих результатів, а також сформульовані основні положення і висновки роботи. Провідною є участь автора в підготовці сумісних статей до друку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційного дослідження були представлені на ІІІ Всеукраїнській морфологічній науковій конференції «Карповські читання», м. Дніпропетровськ, 11-14 квітня 2006 р.; Всеукраїнської науково-практичної конференції студентів і молодих вчених «Досягнення фундаментальної та прикладної медицини (англійською мовою)», м. Луганськ, 20 грудня 2007 р.; на Всеукраїнській науковій конференції «Актуальні проблеми сучасної морфології», м. Луганськ, 10-11 квітня 2008 р.; на ІХ Конгресі міжнародної асоціації морфологів, м. Бухара, Узбекистан, 14-17 травня 2008 р.; на науково-практичній конференції «Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень», м. Тернопіль, 29-30 травня 2008 р.; на конгресі «5^th Balkan Congress of Immunology, June 01-03, 2008, Ohrid, Republic of Macedonia; на ХІІ Конгресі Світової федерації українських лікарських товариств, м. Івано-Франківськ, 25-28 вересня 2008 р.; на симпозіумі «Морфогенез органів і тканин під впливом екзогенних чинників», м. Алушта, 2-3 жовтня 2008 р.; на науково-практичній конференції «Медична наука-2008», м. Полтава, 10-11 грудня 2008 р.; на Всеукраїнській конференції молодих вчених і студентів «Actual problems of fundamental and clinic medicine (in english)», м. Луганськ, 25-26 грудня 2008 р.; на ІІІ міжнародній науково-практичній конференції «Проблеми та перспективи методичних підходів до аналізу стану здоров'я», м. Луганськ, 26-27 березня 2009 р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 19 наукових робіт, які повністю відображають зміст проведеного дослідження. З них 8 статей в наукових фахових виданнях, рекомендованих ВАК України, з яких 6 самостійних; 11 публікацій в матеріалах і тезах конференцій, конгресів, з'їздів, в тому числі 3 - міжнародних.

Структура та обсяг дисертації. Матеріали дисертації викладено на 169 сторінках машинописного тексту, з яких власне залікового принтерного тексту - 121 сторінка. Робота включає вступ, аналітичний огляд літератури, опис матеріалу і методів дослідження, 4 розділи результатів власних досліджень, їх аналіз і узагальнення, висновки та список використаних джерел. Дисертаційна робота ілюстрована 18 макро- і мікрофотографіями, 14 електронограмами, 30 графіками, 14 таблицями та 1 схемою. Перелік використаних літературних джерел містить 300 найменувань вітчизняних та зарубіжних авторів, з яких 209 викладено кирилицею, 91 - латиницею.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Експеримент виконаний в сертифікованій морфологічній лабораторії кафедри гістології, цитології та ембріології Луганського державного медичного університету (свідоцтво №РЬ105/2008 від 01.07.2008 р.). Дослідження проведене на 336 білих безпородних щурах-самцях 2 вікових груп, отриманих з віварію лабораторних тварин Луганського державного медичного університету. Дослідження виконувалося відповідно до принципів Гельсінської декларації, прийнятої Генеральною асамблеєю Всесвітньої медичної асоціації (2000), Конвенції Ради Європи про права людини і біомедицини (1997), Міжнародної ради медичних наукових суспільств, Міжнародного кодексу медичної етики (1983), затвердженого І Національним конгресом з біоетики (Київ, 2001). При роботі з тваринами керувалися положеннями брифінгу Європейського наукового співтовариства «Використання тварин в дослідженнях» (2000) та етичного Кодексу лікаря України, Законом України «Про захист тварин від жорстокого поводження» від 21.02.2006 р. № 3447-IV. Експеримент схвалений комісією з питань біоетики Луганського державного медичного університету (протокол № 1 від 19.01.2009 р.).

Як експериментальні тварини білі щури були обрані по наступних ознаках:

ь тимус щурів добре розвинений;

ь за принципом гістологічної будови орган неістотно відрізняється від тимуса людини;

ь імунна система щурів відрізняється низьким поліморфізмом генів головного комплексу гістосумісності, що дозволяє екстраполювати результати.

Експеримент поставлений на щурах-самцях щоб уникнути циклічного впливу статевих гормонів на імунну систему піддослідних тварин.

Проведено п'ять серій дослідів. Перші чотири були присвячені вивченню впливу імунофану і циклофосфану на будову тимуса статевонезрілих і статевозрілих тварин. У п'ятій серії було проведено електронномікроскопічне дослідження тимуса і аналіз крові статевозрілих щурів після імуностимуляції та імуносупресії.

У кожній серії тварини були розподілені на 6 груп залежно від тривалості спостереження. Тварин виводили з експерименту на 1, 3, 7, 15, 30, 90 добу після закінчення введення препарату. Контролем служили щури, яким вводили 0,9% розчин натрію хлориду в еквівалентних об'ємах та за тими ж схемами.

Кров для аналізу отримували в асептичних умовах із стегнової вени тварин безпосередньо перед забоєм, для запобігання згортання до пробірки додавали гепарин (в кількості 20 од. на 1 мл крові).

Імуностимуляцію у тварин моделювали шляхом введення імунофану, що є представником IV покоління похідних тимічних гормонів. Імунофан є першим представником нового класу лікарських засобів, створених за допомогою нанотехнологій. Його автори (В.В. Лебедев, М.П. Зубков, В.А. Комаров) висунуті на здобуття Нобелівської премії в області медицини в 2008 р. Фармакологічна дія препарату заснована на досягненні корекції імунної і окислювально-антиокислювальної систем організму, а також направлена на відновлення порушених показників клітинного і гуморального імунітету.

Для створення імуносупресивного стану в експерименті на щурах був використаний циклофосфан, що є алкилюючим цитостатичним препаратом. Клітинами-мішенями для нього є В-лімфоцити, Т-гелпери, попередники Т-супресорів, зрілі Т-супресорні лімфоцити, попередники ефекторних клітин. Ефект високих доз циклофосфану (200 мг/кг маси тіла) обумовлений його здатністю зупиняти проліферацію будь-яких клітин, що швидко діляться, в тому числі імунокомпетентних (М.Н. Михайлова и соавт., 2006; Е.В. Удут и соавт., 2007).

Розрахунок дозування лікарського препарату, що вводився щурам, проводили з урахуванням рекомендацій Ю.Р. і Р.С. Риболовлєвих (1979). Формула розрахунку має такий вигляд:

де r - коефіцієнт видової витривалості для щура = 3,62; R - для людини =0,57.

Після закінчення терміну спостереження тварин виводили з експерименту методом декапітації під ефірним наркозом. З урахуванням наявності циркадних ритмів в лімфоїдних органах забій проводили в один і той же час доби (Э.Н. Баркова и соавт., 1992). Відразу після екстракції тимус зважували на торсійних вагах, мінімально торкаючись органу, щоб уникнути появи артефактів, визначали розміри за допомогою штангенциркуля ШЦ-1, фіксували в 10% розчині нейтрального формаліну. При заборі, фіксації і подальшій обробці органу керувалися положеннями, викладеними в методичних рекомендаціях (М.Р. Сапин и соавт., 1990; Ф.В. Судзиловский и соавт., 1995; Л.П. Горальський та співавт., 2005; Н.А. Волошин и соавт., 2008).

Отримані парафінові зрізи товщиною 3-5 мкм і мазки-відбитки тимуса забарвлювали гематоксилін-еозином, азур II - еозином, деталі гістологічної будови тимуса вивчали за допомогою мікроскопа Olympus CX-41.

Морфометричне дослідження об'єктів проводили на комп'ютерному комплексі, до складу якого входять: мікроскоп Olympus CX-41, цифровий фотоапарат Olympus SP 500UZ з шестимегапіксельною матрицею, персональний комп'ютер, обладнаний відеотюнером, сполучений з цифровою камерою за допомогою USB інтерфейсу і відеокабелю.

Мікрофотографії отримували в декількох режимах збільшення: при об'єктивах PlanC N 10^x/0.25 ?/-/FN22, PlanC N 40^x/0.65 ?/0.17/FN22, PlanC N 60^x/0.80 ?/0.17/FN22, використовували наближення об'єктиву zoom 132, 142. Мікрофотографії гістологічних препаратів тимуса зберігалися на жорсткому диску персонального комп'ютера у вигляді графічних файлів формату JPG і TIFF. Морфометричні дослідження об'єктів проводили шляхом завантаження отриманих цифрових зображень в комп'ютерну програму АСКОН «Компас-3D 6.0» (ліцензія №324564890-KOFH45673427).

В тимусі робили підрахунок гістоструктур у шести полях зору кожного зрізу, аналізувалися шість зрізів з кожного об'єкту. Для переведення піксельної системи координат в реальну використовувався калібрувальний файл, дані для якого були отримані шляхом зйомки об'єкт-мікрометра (ГОСТ 2 07513-55 2) в тих же режимах збільшення. Отримані дані морфометричного дослідження експортувалися в програму Microsoft Office Excel (ліцензійний № RDXT28B73FH3WM4KHXP8WXCVW) для збереження. Статистичну обробку даних досліджень проводили за допомогою пакету прикладних статистичних програм «Statistika 5.5» (ліцензійний номер № AX908A290603AL). Підпорядкованість даних нормальному закону розподілу перевіряли за допомогою критерію згоди Шапіро-Уілкі. Достовірність відмінностей середніх величин визначали по критерію Стьюдента-Фішера при р<0,05.

В тимусі визначали ширину (мкм) і площу кіркової і мозкової речовини (процентне відношення останніх до площі часточки); кірково-мозковий індекс, що є відношенням площі кіркової речовини до площі мозкової; щільність розташування клітин на стандартній площі субкапсулярної зони кіркової речовини (10⁴ мкм²), а також кількість тимоцитів і епітеліоретикулоцитів на даній площі.

Для електронномікроскопічного дослідження шматочки тимуса об'ємом 1 мм³ занурювали в 2,5% розчин глутаральдегіда на 0,1 М фосфатному буфері з рН 7,2 - 7,4 по M. Karnovsky на 24 години, потім поміщали в 1% тетраксид осмію по G. Palade на 1 годину. Після дегідратації в етанолі зростаючої концентрації і абсолютному ацетоні матеріал заливали сумішшю епоксидних смол (епон-аралдіт). Полімеризацію проводили протягом 36 годин при 60°С. Ультратонкі зрізи готували на ультрамікротомі УМТП-4 Сумського ПО «Електрон», контрастували в розчині уранілацетату і цитрату свинцю по E. Reynolds і переглядали в електронному мікроскопі ЕМ-125.

Імунологічне дослідження крові тварин виконувалося на базі відділу екологічної генетики і імунології Українського наукового центру медичної генетики АМН України. Клінічне дослідження крові експериментальних тварин проводилося за допомогою автоматичного гематологічного аналізатора «Sysmex» (США) Луганської діагностичної лабораторії.

Результати дослідження та їх аналіз. Досліджені морфологічні параметри органів імунної системи тварин показали, що їх показники надзвичайно лабільні і залежать від віку і застосованих дій, що підтверджується відомостями літератури (Н.А. Волошин, Е.А. Григорьева, 2000; С.А. Кащенко, 2003, 2004; В.Т. Хомич, В.В. Мельник, 2008). В даний час визнано, що морфологічні зміни в будові тимуса є одним з основних показників при оцінці порушень імунного статусу організму (Ю.И. Бородин и соавт., 1996, 2004; W. Savino, 2007).

Максимальну абсолютну масу має тимус після досягнення щурами віку 3 - 4 місяців - 338,33±8,30 мг, тоді як відносна маса тимуса контрольних тварин досягає максимуму на 4 - 5 тижні життя тварини - 3,19±0,26 мг/г. Лінійні розміри органу (довжина, ширина, товщина) статевонезрілих тварин сягають 19,88±0,61 мм, 10,02±0,11 мм і 4,58±0,08 мм відповідно. Розміри тимуса статевозрілих щурів менші, ніж в попередній групі: 18,85±0,13 мм, 8,87±0,05 мм і 4,15±0,08 мм відповідно. У щурів контрольної групи найбільшу ширину кіркова речовина тимуса займає у тварин статевонезрілого віку - до 260,66±4,95 мкм, у статевозрілих - до 250,90±1,27 мкм. Найбільшу площу перетину кіркова речовина тимуса тварин контрольної групи займає в статевонезрілому віці - до 80,66±1,30%, а після досягнення статевої зрілості даний показник дещо знижується до рівня 78,50±0,04%. Динаміка змін площі перетину мозкової речовини має протилежну спрямованість. Показник кірково-мозкового індексу тимуса має максимальне значення у статевонезрілих щурів (4,17-4,21), у щурів репродуктивного періоду він знижується (3,62-3,65). Гістологічна будова тимуса білих щурів досить близька до описаних в літературі даних. Таким чином, за даними наших досліджень тимус білих щурів має морфологічні особливості, характерні для кожного вікового періоду тварин.

Застосування імунофану, як імуномодулюючого препарату нового покоління, створеного з використанням нанотехнологій, зустрічається лише в одиничних роботах (А.С. Логинов и соавт., 1998; В.В. Лебедев, В.И. Покровский, 1999; П.Ф. Забродский, 2005; А.Н. Беловол, И.И. Князькова, 2008). В основному, публікації стосуються клінічного, зокрема імунологічного, досвіду застосування препарату. Морфологічні відомості про вплив імунофану на органи імунної системи взагалі відсутні як у вітчизняних, так і в зарубіжних джерелах.

Введення імунофану викликає однонаправлені зміни морфометричних параметрів тимуса як тварин статевонезрілого віку, так і репродуктивного періоду. Характерною особливістю є той факт, що максимальні статистично значимі зміни цифрових параметрів виникають в пізні терміни спостереження, тоді як до 15 доби відмінності не були статистично значимими. Цей факт частково підтверджується даними літератури про механізми дії препарату (В.В. Лебедев, В.И. Покровский, 2005; М.Д. Машковский, 2008). Були встановлені значимі відмінності між показниками абсолютної маси тимуса статевонезрілих тварин експериментальної і контрольної груп на 15 - 90 діб спостереження (14,16% - 16,16%). В аналогічні терміни спостереження статистично значимо збільшувалася і відносна маса тимуса (20,89% - 27,66%).

Застосування імунофану в групі статевонезрілих тварин викликало статистично значимі зміни розмірів органу на пізніх термінах спостереження: збільшення найбільшої довжини складало 13,65% і 16,49%, ширини - 9,96% і 20,75%, товщини - на 12,60% і 18,12% щодо контрольних даних відповідно 30 і 90 добам.

Проведене дослідження показало, що ширина кіркової речовини тимуса статевонезрілих щурів, які отримували імунофан, достовірно перевищує контрольні показники на пізніх термінах спостереження (15 - 90 діб) на 7,15% - 23,71%. Динаміка площі перетину кіркової речовини пов'язана із зміною його ширини. Виявлені відмінності носили статистично значимий характер на 15 - 90 добу спостереження (9,30% - 12,58%), в той час, як на 1 - 15 добу істотної різниці між експериментальними і контрольними даними не виявлено. Підвищення об'єктивності і наочності отриманих результатів досягалося розрахунком кірково-мозкового індексу, зміни якого носили статистично значимий характер через 15 - 90 діб після введення препарату (40,87% - 54,58%).

Отримані результати можуть свідчити про високий ступінь реактивності тимуса статевонезрілих тварин після імуностимуляції, що виявлялося збільшенням всіх морфометричних параметрів в порівнянні з контрольними даними.

Тимус статевозрілих щурів також активно реагує на введення імунофану. Так, статистично значиме збільшення показників абсолютної і відносної маси органу на 15 - 90 добу спостереження на 10,83% - 16,40% і 9,45% - 26,41%, відповідно, дозволяє судити про ступінь вираженості реакції. Лінійні розміри тимуса щурів репродуктивного періоду після застосування імунофану статистично значимо перевищували показники контрольної групи тварин на 30 і 90 добу спостереження: найбільша довжина частки - на 7,37% і 17,47%, ширина - на 15,71% і 18,30%, товщина - на 10,74% і 21,45% відповідно. Зміни показників ширини і площі перетину кіркової речовини говорять про збільшення функціонального навантаження на орган. При цьому, статистично значимі відмінності між показниками ширини кіркової речовини на 15 - 90 добу спостереження складають 15,40% - 33,33%, а його площі - 12,13% - 20,21%. Зміни кірково-мозкового індексу в аналогічні терміни спостереження складають 35,53% - 61,75%.

Вивчення складу популяції клітин різних зон паренхіми тимуса є предметом ретельного вивчення в імунології, імуногістохімії і набагато рідше - імуноморфології (Ж.А. Шаршембиев, 2004; С.А. Ястребова и соавт., 2004; R. Brelinska et al., 2008). Але лише незначна кількість робіт присвячена вивченню клітинного складу тимуса в умовах застосування імуномодуляторів. Проте подробиці, що стосуються впливу препаратів нового покоління на даний орган, повністю відсутні в літературі. Результати проведеного дослідження свідчать, що зміни щільності розташування клітин в субкапсулярній зоні, як показника рівня проліферативної активності в кірковій речовині, носять статистично значимий характер вже на 15 і, особливо, на 90 добу спостереження. Так, щільність розташування клітин на одиницю площі залози (10⁴ мкм²) значимо перевищує контрольні показники на 6,30% - 33,37% відповідно вищезгаданим термінам спостереження. При цьому, кількість тимоцитів збільшується на 4,97% - 37,71%, епітеліоретикулоцитів - на 6,07% - 17,04%.

Таким чином, введення імуномодулятора статевозрілим тваринам індукує збільшення морфометричних параметрів тимуса щодо контрольних даних, стимулює проліферативну активність клітин в кірковій речовині тимуса в пізні терміни спостереження, що, в цілому, може говорити про інтенсифікацію функціонування органу в цілому.

За даними літератури, різні імуносупресивні дії викликають однонаправлені зміни в будові тимуса експериментальних тварин, причому реактивність органу в статевонезрілому віці виявляється вищою, ніж в репродуктивний період (С.А. Кащенко, 2003; С.П. Малышева и соавт., 2004; В.Г. Ковешников и соавт., 2005). У статевонезрілих тварин спостерігається стійке зменшення маси тимуса (9,90% - 52,89%) на 1 - 30 добу після введення циклофосфану. Через 90 діб після ін'єкції вказаного препарату цей показник статистично значимо не відрізняється від контрольних даних.

Відносна маса тимуса піддослідних тварин змінюється аналогічно динаміці абсолютної маси органу (3,00% - 59,93%) відповідно 1 - 30 добам спостереження. Через 90 діб після введення циклофосфану відбувається відновлення показника до значень норми. На ранніх етапах спостереження були встановлені статистично значимі зміни лінійних розмірів органу: зменшення найбільшої довжини складало 45,39%, 29,95%, 30,88%, 24,08% і 21,31%; ширини - 28,86%, 23,13%, 21,63%, 14,49% і 18,87%; товщини - 34,47%, 35,53%, 37,63%, 31,19% і 13,88% відповідно 1, 3, 7, 15 і 30 добам спостереження.

Зменшення абсолютної та відносної мас тимуса поєднується із зменшенням ширини його кіркової речовини (20,08% - 42,14%), яка простежується на ранніх етапах дослідження (1 - 30 діб). На 7-у добу після введення циклофосфану спостерігається зниження інтенсивності і інверсія забарвлення кіркової речовини, стирання меж між кірковою і мозковою речовиною в часточках тимуса, що може пояснюватися пригніченням проліферативної активності лімфоцитів, масовим викидом їх в кровоносне русло і частковим цитолітичним ефектом циклофосфану. Відновлення забарвлення часточок залози відбувається на 30 добу спостереження, проте межа між кірковою і мозковою речовиною залишається нечіткою.

Встановлені статистично значимі відмінності між показниками площі кіркової речовини тимуса експериментальної і контрольної груп статевонезрілих тварин дозволяють судити про ступінь реакції органу на імуносупресію. Так, їх зменшення на 1 - 30 діб спостереження (6,22% - 18,87%) може свідчити про реакцію тимуса на введення циклофосфану на ранніх термінах, тоді як через 90 діб, мабуть, превалюють процеси адаптації і нормалізації, що позначається на морфометричних параметрах органу.

У ті ж терміни (1 - 30 доби спостереження) зниження кірково-мозкового індексу на 25,42% - 50,30% може свідчити про зміну співвідношення кіркової і мозкової речовини на користь останньої.

Нечисленні і уривчасті відомості літератури про морфологічну реакцію тимуса щурів репродуктивного періоду на імуносупресивну дію повністю не висвітлюють всі аспекти даної проблеми і, найчастіше, носять описовий характер (В.Ф. Пучков и соавт., 1998; С.А. Кащенко, 2003; Q. Vieira et al., 2008). Проведене морфометричне дослідження тимуса тварин репродуктивного періоду після введення великої дози імуносупресора дозволило встановити факт активної реакції органу на екзогенну дію. Так, статистично значимо зменшується його абсолютна маса на 6,30% - 32,20% на 1 - 30 добу спостереження, тоді як через 90 діб після введення препарату цей показник в експериментальній групі перевищує контрольний на 22,02%. Зменшення відносної маси тимуса статевозрілих щурів на 13,56% - 38,58% відповідно 1 - 15 добам спостереження після застосування імуносупресора у вказаному дозуванні також носить статистично значимий характер. Через 30 і 90 діб цей показник в контрольній групі тварин значимо перевищує дані експериментальної групи на 2,59% і 7,56%.

Відмічена вище динаміка параметрів маси тимуса вказує на активну реакцію органу на введення циклофосфану в ранні терміни спостереження (1, 3, 7, 15, 30 діб), тоді як в пізніх відбувається відновлення цифрових показників тимуса до норми.

Застосування циклофосфану викликало виражені зміни органометричних показників тимуса статевозрілих тварин на ранніх термінах спостереження: найбільша довжина частки була статистично значимо менше контрольних даних на 23,76%, 24,18%, 20,04%, 21,02% і 16,37%, ширина - на 19,42%, 13,10%, 1,21%, 7,85% і 16,71%, товщина - на 31,01%, 28,07%, 25,09%, 19,37% і 13,22% відповідно 1, 3, 7, 15 і 30 добам спостереження.

Проведене вивчення морфометричних параметрів тимуса дозволяє встановити факт статистично значимої зміни показника ширини кіркової речовини органу після введення імуносупресора. Так, відмінності експериментальних даних від контрольних мають значимий характер на ранніх термінах спостереження (1 - 30 діб) і складають 7,69% - 46,21% з максимумом відмінностей через 15 діб після введення препарату.

У пізні терміни спостереження (90 діб) відмінності між порівнюваними параметрами нівелюються, що може говорити про превалювання процесів адаптації органу до екзогенної імуносупресивної дії.

Показник площі перетину кіркової речовини тимуса, разом з його шириною, служить індикатором функціональної активності органу і зазнає істотні зміни після застосування імуносупресора в порівнянні з контрольними даними.

Статистично значимі відмінності показника площі перетину кіркової речовини тимуса також виявляються на ранніх термінах спостереження (1 - 30 діб - 1,64% - 18,93%), пізній термін спостереження (90 діб) характеризується нормалізацією даного параметра. Зміни кірково-мозкового індексу мають аналогічну динаміку, максимальні відмінності зафіксовані на 1 - 30 добу спостереження.

Зниження щільності розташування клітин на одиницю площі залози (10⁴ мкм²) в субкапсулярній зоні кіркової речовини тимуса статевозрілих щурів на 28,25% - 41,23% через 1 - 30 діб після імуносупресії при синхронному зниженні кількості тимоцитів і епітеліоретикулоцитів може свідчити про виражений вплив препарату на процеси дозрівання і диференціювання тимоцитів.

Нечисленні цитологічні дослідження тимуса експериментальних тварин не дають чіткої картини про закономірності структурних змін в органі і недостатньо систематизовані (М.С. Пушкар, О.І. Тереховська, 2000; В.І. Шепітько, 2003; S.J. Sohn et al., 2007). Отримані дані про активну реакцію тимуса статевозрілих щурів на застосування циклофосфану, що вказують на високий ступінь лабільності показника щільності розташування клітин в субкапсулярній зоні кіркової речовини тимуса, дозволяють говорити про швидкий і безпосередній вплив імуносупресивної дії на орган.

Таким чином, отримані результати морфометричного дослідження тимуса статевонезрілих тварин і щурів репродуктивного періоду після імуносупресії дозволяють говорити про істотні зміни в будові органу, які можна розглядати як безпосередній вплив циклофосфану на структуру тимуса.

Ці факти доповнюють відомості літератури новими морфологічними даними про тимус і можуть бути широко використані в практичній медицині.

Нечисленні відомості в літературі і про особливості ультрамікроскопічної будови тимуса білих щурів після імуностимуляції і імуносупресії (Т.И Дергачёва и соавт., 2000; В.І. Літус, Ю.Б. Чайковський, 2008). При цьому слід підкреслити, що дані про електронномікроскопічну будову тимуса експериментальних тварин після застосування імунофану повністю відсутні в доступних джерелах інформації.

Проведене вивчення ультраструктури тимуса статевозрілих тварин після застосування імунофану та циклофосфану додатково висвітлюють отримані на світлооптичному рівні морфологічні дані про зміни в будові цього органу. Аналіз ультрамікроскопічної будови тимуса в експерименті показав, що введення імунофану в терапевтичній дозі сприяє інтенсивному розвитку органел синтезу в клітинах епітеліоретикулярної строми в пізні терміни спостереження. При цьому, основні зміни стосуються, перш за все, збільшення площі цитоплазми, займаною розвиненою гранулярною ендоплазматичною сіткою, і наявність великої кількості рибосом. Ознаками посиленого синтезу білка в клітинах епітеліоретикулярної строми також може бути деконденсація ядерного хроматину. Тимоцити в досліджувані терміни після застосування імунофану мають класичну будову. На електронограмах зустрічається помірна кількість макрофагів і поодинокі плазматичні клітини. Проте, слід відмітити, що в ранній термін спостереження (1 доба) істотних змін в ультраструктурі тимуса щурів не виявлено.

Застосування циклофосфану призводить до збільшення кількості активних макрофагів з наявністю в їх цитоплазмі різних типів лізосом. Характерно і збільшення популяції плазматичних клітин після імуносупресії, що може говорити про порушення проникності гематотимусного бар'єру. Встановлені ультрамікроскопічні особливості плазмоцитів в умовах застосування циклофосфану дозволили виділити різновиди даних клітин. Виявлені зміни характерні для начальних етапів спостереження (1 доба), тоді як на 30 добу після введення імуносупресора відмінності в будові тимуса експериментальних тварин істотно нівелюються, що може вказувати на розвиток адаптації органу до даної екзогенної дії. Даний факт побічно підтверджується відомостями про фармакокінетику циклофосфану і розширює результати нечисленних досліджень в цій області (О.І. Тереховська, М.С. Пушкар, 2000; Н.О. Мельник і співавт., 2004; М.Н. Михайлова и соавт., 2006).

Об'єктивним критерієм функціональної активності імунної системи є кількість Т-лімфоцитів в периферичній крові, виявлених методом спонтанного розеткоутворення (M. Jondal et al., 1972; З.С. Хлыстова и соавт., 2002). В літературі зустрічаються лише одиничні дані про застосування даного методу для визначення імунного статусу білих щурів. Частіше автори використовують як піддослідних тварин мишей і лінійних щурів (Г.В. Идова и соавт., 2003; H. Fujiwara et al., 2008; F. Mignini et al., 2008).

Висвітлені в наявній літературі результати застосування сучасних імуностимуляторів в умовах експерименту, що стосуються оцінки стану імунної системи, розрізнені, уривчасті, а іноді і суперечливі. Проведене дослідження показало, що введення імунофану викликає достовірну зміну показників рівня Е-розеткоутворюючих клітин. Проте, статистично значимий результат був встановлений на 30 добу спостереження і перевищував на 25,53% контрольних показників. Даний факт може свідчити про відстрочений розвиток імуноактивного стану, що індукується введенням імунофану. Зміни параметрів морфометрії тимуса в ці ж терміни спостереження (15 - 90 доба) свідчать про комплексну реакцію організму на введення імунофану і активізацію механізмів регуляції імунного гомеостазу.

Зниження рівня Е-розеткоутворюючих клітин після введення циклофосфану в дозуванні 200 мг/кг маси тіла на 9,42% - 28,54% спостерігається на 1 - 30 добу і може свідчити про виражене зниження імунного статусу щурів. Результати даного дослідження можуть бути зіставлені з відомостями літератури про вплив імуносупресії на тимус експериментальних тварин (Ф.В. Судзиловский, М.Г. Ткачук, 1998; Т.И. Дергачёва, 2000; О.В. Ткачук, 2005).

В літературі зустрічаються нечисленні дані про зміни показників периферичної крові білих щурів після введення циклофосфану у великому дозуванні, а відомості, що стосуються особливостей гемограми і лейкоцитарної формули крові після застосування імунофану, повністю відсутні в джерелах інформації (B. Biolatti et al., 2005; M. D'Elia et al., 2005; F. Mignini et al., 2008). Показником загального стану організму після вказаних дій служить клінічний аналіз крові. Після введення циклофосфану відмічаються ознаки пригнічення кровотворення, що виявляються достовірним зниженням кількості лейкоцитів в периферичній крові щурів в ранні терміни спостереження (1 - 30 доба) на 43,60% - 68,70%. З іншого боку, кількість еритроцитів і рівень гемоглобіну перевищує контрольні показники. Також присутні ознаки ядерного зсуву нейтрофілів вліво. Кількість лімфоцитів достовірно перевищує показник контрольної групи через 1 добу після введення циклофосфану на 8,00%, що пов'язано з викидом клітин з кіркової речовини тимуса. Через 30 діб, навпаки, даний показник знижується по відношенню до контрольних даних на 9,00%.

Динаміка зміни кількості лімфоцитів в периферичній крові після застосування імунофану має прямо протилежний характер. Експериментальні дані перевищують контрольні показники тільки через 30 діб після закінчення введення препарату на 23,00%, тоді як на 1 добу спостереження вони статистично значущо нижче на 13,00%. Цей факт, мабуть, свідчить про стимуляцію лімфоцитарного кровотворення на пізніх термінах спостереження у відповідь на застосування імуномодулятора.

Таким чином, комплексне вивчення центрального органу імуногенезу - тимуса - за допомогою сучасних адекватних методик дозволило встановити виражені морфологічні зміни в будові органу після імуностимуляції та імуносупресії, що підтверджується даними цитологічного аналізу, електронної мікроскопії, результатами оцінки імунологічного статусу і загального стану щурів. Отримані результати переконливо свідчать про важливу роль тимуса в складних і багатогранних процесах регуляції гомеостазу організму і високий ступень реактивності в умовах екзогенних дій.

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі вирішено актуальне наукове завдання - встановлені морфологічні особливості будови тимуса білих щурів при активізації імунної системи після застосування імунофану та при імунодефіцитному стані, викликаному введенням циклофосфану.

1. Використані експериментальні моделі імуностимульованого та імунодефіцитного стану в морфологічному експерименті дозволили виявити динаміку змін органометричних і морфометричних параметрів тимуса експериментальних тварин, що підтверджена даними електронномікроскопічного дослідження і аналізу складу периферичної крові.

2. Морфологічна будова тимуса щурів зазнає істотні зміни після імуностимуляції. У статевонезрілих тварин це виявляється статистично значимим збільшенням показників абсолютної і відносної маси залози на 14,16% - 16,16% і 20,89% - 27,66%, лінійних розмірів на 13,65% - 16,49%, 9,96% - 20,75% і 12,60% - 18,12%, ширини і площі кіркової речовини на 7,15% - 23,71% і 9,30% - 12,58%, а також кірково-мозкового індексу - на 40,87% - 54,58% в різні терміни спостереження. У статевозрілих щурів спостерігається збільшення показників абсолютної (10,83% - 16,40%) і відносної (9,45% - 26,41%) маси органу, лінійних розмірів на 7,37% - 17,47%, 15,71% - 18,30% і 10,74% - 21,45% (30 - 90 доба), ширини, площі кіркової речовини і кірково-мозкового індексу на 15,40% - 33,33%, 12,13% - 20,21% і 35,53% - 61,75%, що свідчить про збільшення функціональної активності органу. Введення імунофану щурам статевонезрілого віку викликає більш виражені реактивні гістологічні зміни з боку тимуса, ніж в групі тварин репродуктивного періоду, що пов'язано з недосконалістю функціонування регуляторних систем молодого організму.

3. Морфологічні зміни тимуса статевонезрілих тварин після імуносупресії носять більш виражений характер в порівнянні з даними в групі щурів репродуктивного періоду. Показники абсолютної і відносної маси органу статевонезрілих тварин експериментальної групи статистично значимо знижені в порівнянні з даними контрольної групи на 9,90% - 52,89% і 3,00% - 59,93% (1 - 30 доба) відповідно, лінійні розміри - на 21,31% - 45,39%, 14,49% - 28,86% і 13,88% - 37,63% відповідно, показники ширини, площі кіркової речовини і кірково-мозкового індексу - на 20,08% - 42,14%, 6,22% - 18,87% і 25,42% - 50,30% (1 - 30 доба). У тварин репродуктивного періоду після введення циклофосфану спостерігається зменшення показників абсолютної (6,30% - 32,20%) і відносної (13,56% - 38,58%) маси органу і ширини кіркової речовини на 7,69% - 46,21%, його площі на 1,64% - 18,93%, показника кірково-мозкового індексу на 7,12% - 50,74% (1 - 30 доба) в порівнянні з даними контрольної групи тварин. На 90 добу превалюють процеси адаптації і відновлення нормальної гістологічної структури і морфометричних параметрів органу.

4. Застосування імунофану спричиняє виражений вплив на процеси дозрівання і диференціювання тимоцитів у тварин репродуктивного періоду, про що свідчить аналіз мазків-відбитків і гістологічних зрізів тимуса, забарвлених гематоксилін-еозином та азур ІІ-эозином. Спостерігається статистично значиме збільшення щільності розташування клітин на одиниці площі зрізу в субкапсулярній зоні кіркової речовини тимуса статевозрілих тварин на 6,30% - 33,37% (15 - 90 доба), що свідчить про стимулюючий вплив препарату. Одноразове введення циклофосфану експериментальним тваринам призводить до зниження щільності розташування клітин на 28,25% - 41,23% (1 - 30 доба).

5. Дослідження ультраструктури тимуса білих щурів після введення імунофану свідчить про інтенсивний розвиток органел синтезу в клітинах епітеліоретикулярної строми (30 діб). Після застосування циклофосфану в паренхімі тимуса спостерігається поява активних макрофагів і плазмоцитів. Присутність останніх вказує на порушення проникності гематотимусного бар'єру. Встановлені зміни характерні для 1 доби спостереження після введення імуносупресора, тоді як через 30 діб після введення циклофосфану відмінності в будові тимуса експериментальних тварин істотно нівелюються.

6. Стан імуностимуляції, що індукується введенням імунофану, проявляється на фоні статистично значимого збільшення рівня Е-розеткоутворюючих клітин на 25,53% (30 діб). Застосування імуносупресора призводить до зменшення рівня Е- розеткоутворюючих клітин на 1 - 30 добу спостереження на 9,42% - 28,54%. Зміни гемограми після імуностимуляції і імуносупресії носять різноспрямований характер залежно від стану гемопоезу.

Практичні рекомендації

1. Отримані дані щодо високого ступеня реактивності тимуса в умовах екзогенних дій можуть бути використані при проведенні лікувально-профілактичних заходів в практичній медицині.

2. Морфологічні зміни в будові тимуса щурів після проведених екзогенних дій свідчать про необхідність комплексного підходу в діагностиці та лікуванні в онкологічній, імунологічній, алергологічній, педіатричній практиках.

3. Факт більш вираженої реакції органу на імуностимуляцію та імуносупресію у статевонезрілих тварин вимагає пильної уваги фахівців при проведенні діагностичних та лікувальних заходів в педіатрії.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Захаров А.А. Особенности строения тимуса половозрелых белых крыс после применения циклофосфана / А.А. Захаров // Таврический медико-биологический вестник. - 2008. - Т. 11, № 3, ч. I. - С. 45-49.

2. Захаров А.А. Морфологические изменения тимуса после иммуносупрессии в эксперименте / А.А. Захаров // Клінічна анатомія та оперативна хірургія. - 2008. - Т. 7, № 4. - С. 15 - 19.

3. Захаров А.А. Особенности строения тимуса неполовозрелых белых крыс после применения имунофана / А.А. Захаров // Світ біології та медицини. - 2009. - № 1. - С. 54 - 57.

4. Кащенко С.А. Органометрические особенности строения тимуса белых крыс после иммуностимуляции и иммуносупрессии / С.А. Кащенко, А.А. Захаров // Український журнал клінічної та лабораторної медицини. - 2009. - Т. 4, № 3. - С. 50 - 52. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка статті до друку).

5. Захаров А.А. Особенности ультрамикроскопического строения тимуса половозрелых белых крыс после применения имунофана / А.А. Захаров // Український медичний альманах. - 2009. - Т. 12, № 1. - С. 75 - 77.

6. Кащенко С.А. Морфологические изменения структуры тимуса и особенности показателей периферической крови половозрелых крыс после введения циклофосфана / С.А. Кащенко, А.А. Захаров // Український морфологічний альманах. - 2007. - Т. 5, № 4. - С. 128. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

7. Lee A.V. Morphological changes of structure of thymus and features of indexes of peripheral blood of mature rats after introduction of cyclophosphan / A.V. Lee, A.A. Zakharov, S.A. Kashchenko // Український медичний альманах. - 2008. - Т. 11, № 1. - С. 186-187. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

8. Кащенко С.А. Особенности строения тимуса экспериментальных животных после иммуносупрессии / С.А. Кащенко, А.А. Захаров // В зб. матеріалів наук.-практ. конфер. «Прикладні аспекти морфології експериментальних і клінічних досліджень», 29-30 травня 2008 р. - м. Тернопіль, «Укрмедкнига». - С. 54-55. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

9. Kashchenko S.A. Changes of thymus structure of mature white rats after cyclophosphanum application / S.A. Kashchenko, A.A. Zakharov // Macedonian journal of medical sciences. - 2008. - № 1 (suppl. 1). - P. 36-37. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

10. Морфологические особенности органов иммунной и эндокринной систем после применения циклофосфана / С.А. Кащенко, И.В. Бобрышева, А.А. Захаров, С.Ю. Штепа // Морфология. - 2008. - Т. 133, № 2. - С. 61. (Особисто здобувачем проведено морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, підготовка тез до друку).

11. Кащенко С.А. Изменения в строении тимуса половозрелых крыс после иммуностимуляции / С.А. Кащенко, А.А. Захаров // В зб. матеріалів наук.-практ. конфер. «Морфологічні основи компенсаторно-пристосувальних процесів і їх структурне забезпечення», 10-11 жовтня 2008 р. - м. Тернопіль, «Укрмедкнига». - С. 33-34. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

12. Кащенко С.А. Особливості будови тимуса експериментальних тварин після імуносупресії / С.А. Кащенко, О.О. Захаров // ХІІ конґрес Світової федерації українських лікарських товариств: тези доповідей. - Івано-Франківськ-Київ-Чікаґо, 2008. - С. 507-508. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

13. Lee A.V. Features of thymus structure of experimental animals after imunofan administration / A.V. Lee, S.A. Kashchenko, A.A. Zakharov // Український медичний альманах. - 2009. - Т. 12, № 1 (додаток). - С. 33 - 34. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

14. Gorlov N.V. Morphological features of thymus structure of immature rats after cyclophosphanum introduction / N.V. Gorlov, S.A. Kashchenko, A.A. Zakharov // Український медичний альманах. - 2009. - Т. 12, № 1 (додаток). - С. 23 - 24. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

15. Zakharov A.A. Morphological changes of thymus structure of immature rats after imunofan administration / A.A. Zakharov // Український медичний альманах. - 2009. - Т. 12, № 1 (додаток). - С. 66 - 67. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

16. Кащенко С.А. Особенности ультрамикроскопического строения тимуса половозрелых белых крыс после применения имунофана / С.А. Кащенко, А.А. Захаров // Мат. ІІІ міжнародної наук.-практ. конф. «Проблеми та перспективи методичних підходів до аналізу стана здоров'я», 26-27 березня 2009 р. м. Луганськ, Луганський державний медичний університет. - С. 37. (Особисто здобувачем проведено забір матеріалу, морфометричний аналіз, статистична обробка отриманих даних, їх узагальнення, підготовка тез до друку).

Размещено на Allbest.ru