Вплив кріоконсервованих фетальних клітин на прояви хронічного отруєння алкоголем (експериментальне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія НАУК України

іНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРіОБіОЛОГії і КРіОМЕДИЦИНи

Вплив кріоконсервованих фетальних клітин на прояви хронічного отруєння алкоголем (експериментальне дослідження)

14.01.35 - кріомедицина

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Ковальов Геннадій Олександрович

УДК: 615.361.013.31.8:616.099

Харків-2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Сандомирський Борис Петрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу експериментальної кріомедицини, м. Харків.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Бездітко Павло Андрійович, завідувач кафедри офтальмології Харківського національного медичного університету;

доктор медичних наук, професор Малахов Володимир Олександрович, завідувач кафедри реабілітації і психотерапії Харківської медичної академії післядипломної освіти.

Захист дисертації відбудеться «21» жовтня 2008 р. о 1330 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 64.242.01 в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, Харків, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий «20» вересня 2008 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

член-кореспондент НАН України

А. М. Гольцев

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. За останні декілька десятиріч споживання алкоголю значно зросло в багатьох регіонах світу (И. А. Бабюк и др., 2004; Ю. Е. Разводовский, 2005; І. В. Лінский та ін., 2006). Алкоголь і продукти його метаболізму мають системну дію, однак головними органами-«мішенями», безумовно, є печінка (А. О.Буеверов, 2005; S. Sougioultzis et al., 2005), в якій відбувається метаболізм основної кількості етанолу і найбільш небезпечного його метаболіту - ацетальдегіду, та головний мозок (Э. Н. Попова и др., 1984; И. В. Дамулин и др., 2005; В. А. Малахов, 2006), ураження якого можна пояснити його інтенсивною васкуляризацією і високою проникністю гематоенцефалічного бар'єру для алкоголю. Терапія наслідків хронічного отруєння алкоголем (ХОА) досі є недостатньо ефективною і вимагає пошуку нових методів лікування.

Фетальні клітини мають високу проліферативну активність і пластичність, низьку імуногенність (R. Edwards, 2004; В. И. Цымбалюк и др., 2005; О. Л. Кухарчук та ін., 2007), що робить їх зручними для клінічного застосування. Вельми важливо, що розроблені ефективні методики кріоконсервування фетальних клітин, які уможливлюють їх тривале зберігання до моменту трансплантації (В. И. Грищенко и др., 2006), а отже, їх можна накопичувати і повноцінно тестувати для безпечного застосування. Терапевтична ефективність фетальних клітин вже доведена для різних патологічних процесів, зокрема й тих, що відбуваються в печінці і головному мозку. З огляду на комплексний характер негативної дії етанолу та його метаболітів на організм, видається перспективним використання кріоконсервованих клітин фетальної печінки (КФП) і клітин фетального мозку (КФМ) в корекції наслідків ХОА.

Методи, які нині використовують для введення фетальних клітин, досить складні, і є одним з важливих чинників, які стримують використання цих клітин. На сучасному етапі для кожного виду фетальних клітин існує своя ділянка введення, розташована безпосередньо близько від зони ураження. Наприклад, КФМ звичайно трансплантують під час виконання нейрохірургічних операцій (В. И. Цымбалюк и др., 2005). Ураховуючи те, що на 5-12-му тижні внутрішньоутробного розвитку у фетальній печінці поряд із печінковими стовбуровими клітинами визначаються високі концентрації ранніх і пізніх комітованих попередників кровотворення (А. Ю. Петренко, 2005), видається можливою трансплантація КФП шляхом їх внутрішньовенного введення. Відомо також, що нервові клітини в процесі ембріогенезу здатні мігрувати, отже, внутрішньовенний шлях введення, ймовірно, можна використати і для трансплантації КФМ.

З огляду на викладене вище, трансплантація фетальних клітин шляхом їх внутрішньовенного введення вигідно відрізняється простотою та доступністю і може значно розширити галузь застосування методу, втім досі такий шлях введення практично не досліджений. Залишається також відкритим питання про долю донорських фетальних клітин різної природи в організмі реципієнта. Досі недостатньо вивчено механізм дії фетальних клітин, його пов'язують з високим вмістом в них біологічно активних речовин, які забезпечують стимуляцію регенерації пошкоджених тканин реципієнта (О. П. Рябчиков и др., 1998; K. Peggs, 2006), або зі здатністю вбудовуватися замість загиблих клітин і виконувати їх специфічні функції (K. Chu et al., 2003; В. М. Семенова и др., 2007). Для з'ясування цього питання як один з варіантів контролю використовували цитозоль фетальних тканин (ЦФТ) людини того ж терміну розвитку, що і фетальні клітини.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами і темами. Дослідження було проведено згідно з планом науково-дослідних робіт ІПКіК НАН України у рамках тем: № 19 «Біорегулятори стовбурових клітин» № ДР 0104U006440; № 7 «Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їх кріочутливості та механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів» № ДР 0102U002026; № 5 «Вивчення впливу і механізму дії кріоконсервованих тканинних препаратів ксеногенних органів на перебіг ряду патологічних процесів в організмі» № ДР 0102U002035.

Мета і завдання дослідження. Визначити вплив введення клітин фетальної печінки і мозку, а також цитозолю фетальних тканин на морфофункціональний стан печінки і головного мозку при хронічному отруєнні алкоголем.

У відповідності до поставленої мети були сформульовані такі завдання:

1. Розробити модель ХОА щурів, при якій є ураження печінки і головного мозку.

2. Проаналізувати зміни загального стану організму, величин біохімічних показників функціонального стану печінки і рівня маркерів цитолізу в плазмі крові після введення кріоконсервованих фетальних клітин щурам з ХОА.

3. Оцінити дію кріоконсервованих фетальних клітин на вираженість алкоголь-індукованого оксидативного стресу в печінці щурів.

4. Охарактеризувати терапевтичний патоморфоз печінки після введення кріоконсервованих фетальних клітин щурам з ХОА.

5. Дослідити дію кріоконсервованих фетальних клітин на рівні показників прооксидантно-антиоксидантної системи головного мозку щурів з ХОА.

6. Визначити вплив кріоконсервованих фетальних клітин на морфологічну картину ушкодження головного мозку щурів алкоголем.

7. Вивчити органоспецифічність впливу і характер розподілу кріоконсервованих фетальних клітин на моделі ХОА щурів.

Об'єкт дослідження. Структурно-метаболічні процеси в печінці і головному мозку щурів з хронічним отруєнням алкоголем при введенні кріоконсервованих клітин фетальної печінки і головного мозку, а також цитозолю фетальних тканин.

Предмет дослідження. Кріоконсервовані клітини фетальної печінки і головного мозку, а також цитозоль фетальних тканин при хронічному отруєнні алкоголем.

Методи дослідження. Для вирішення поставлених завдань було залучено біохімічні, морфологічні, генетичні і статистичні методи. В роботі використовували такі методи: спектрофотометричні - для дослідження рівнів біохімічних показників у сироватці крові і гомогенатах печінки і головного мозку; кінетичні - для визначення активності ферментів у гомогенатах печінки і головного мозку; світлової мікроскопії - для дослідження препаратів печінки і головного мозку; метод полімеразної ланцюгової реакції - для визначення міток донорських фетальних клітин в організмі щурів. Детоксикаційну функцію організму оцінювали шляхом визначення тривалості гексеналового сну. Для опрацювання та аналізу отриманих результатів застосовували статистичні методи, зокрема, кореляційний аналіз.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведена можливість застосування КФП і КФМ шляхом внутрішньовенного введення при ХОА щурів. Вперше показана ефективність кріоконсервованих КФП і КФМ при роздільному і поєднаному застосуванні у випадках ХОА. Встановлено характер розподілу міток кріоконсервованих КФП і КФМ після їх внутрішньовенного введення при ХОА. Виявлені окремі механізми реалізації терапевтичної ефективності при роздільному і поєднаному використанні кріоконсервованих КФП і КФМ в умовах цієї патології. Вперше показаний односпрямований характер дії фетальних клітин і ЦФТ, що вказує на те, що терапевтичний ефект внутрішньовенного введення фетальних клітин при ХОА переважно обумовлений впливом біологічно активних речовин, які вони містять. Вперше виявлена стимуляція кріоконсервованими КФМ системи мононуклеарних фагоцитів при ХОА.

Практичне значення одержаних результатів. Запропонована оригінальна експериментальна модель ХОА, яка не суперечить принципам біоетики, що підтверджено Комітетом із біоетики ІПКіК НАН України. Розроблено спосіб диференційованої оцінки ступеня ушкодження гепатоцитів при хронічному отруєнні алкоголем (Пат. України 11013,U7A61B10/00. Спосіб диференційованої оцінки ступеня ушкодження гепатоцитів при хронічному отруєнні алкоголем / Т. П. Якимова, Г. О. Ковальов; заявник і патентовласник ХМАПО. - Заявл. 18.04.2005; Опубл. 15.12.2005; Бюл. №12). Отримані результати сприяють з'ясуванню механізмів ушкодження печінки і головного мозку при ХОА. Здатність кріоконсервованих фетальних клітин значно зменшувати тяжкість ушкодження печінки і головного мозку, а також поліпшувати загальний стан організму щурів при ХОА, може служити експериментальним обґрунтуванням їх клінічного застосування. Дані, описані в роботі, можуть бути використані для розробки нових методів лікування ХОА, основаних на застосуванні фетальних клітин.

Матеріали дисертаційного дослідження впроваджені в навчальний процес кафедри загальної та клінічної патології медичного факультету Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна МОН України, використовуються співробітниками кафедри наркології Харківської медичної академії післядипломної освіти МОЗ України при підготовці і проведенні курсів лекцій, а також проведенні семінарських і практичних занять, використовуються співробітниками лабораторії патологічної анатомії з прозектурою Державної установи «Інститут загальної і невідкладної хірургії» АМН України в практичній діяльності лікарів-патологоанатомів.

Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Спільно з керівником здійснено наукове планування експериментів, визначена мета, завдання дослідження і способи їх вирішення, інтерпретовані отримані результати і зроблені остаточні висновки. Особистий внесок дисертанта в роботах, опублікованих разом із співавторами, полягає:

в роботі [1] у плануванні експерименту, моделюванні ХОА, вимірюванні значень показників печінкових проб, первинному аналізі даних і їх статистичному опрацюванні, підготовці до друку;

в роботах [2-10, 15,17,18] у розробці плану експерименту, моделюванні ХОА, проведенні експерименту, первинному аналізі даних та їх статистичному опрацюванні, підготовці до друку;

в роботі [11] у плануванні експерименту, моделюванні ХОА, аналізі результатів морфологічного дослідження, первинному аналізі даних і їх статистичній обробці;

в роботі [12] у розробці плану, підготовці до друку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на: Другому національному конгресі з біоетики (Київ, 2004); Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених і фахівців «Від фундаментальних досліджень до медичної практики» (Харків, 2005); науково-практичній конференції молодих вчених «Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини» (Харків, 2005); конференції з міжнародною участю «Актуальні проблеми і досягнення кріобіології і кріомедицини. Структурна і функціональна організація стовбурових клітин за умов дії низьких температур» (Харків, 2005); конференції молодих вчених «Холод в біології і медицині» (Харків, 2005); другій міжнародній конференції студентів і аспірантів «Молодь та поступ біології» (Львів, 2006); конференції молодих вчених «Холод в біології і медицині» (Харків, 2006); Третьому всеросійському симпозіумі з міжнародною участю «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва, Росія, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 10 статей у наукових фахових виданнях, затверджених ВАК України, 7 тез і 1 декларативний патент України.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 181 сторінці машинопису. Робота складається зі вступу, огляду та аналізу літератури, опису матеріалів і методів дослідження, 2 розділів результатів власних досліджень і їх обговорення, узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаної літератури. Бібліографічний список викладений на 29 сторінках і складається з 286 джерел, з них 146 зарубіжних. Робота проілюстрована 33 рисунками і 36 таблицями.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи дослідження. Робота виконана на базі ІПКіК НАН України. Експерименти проводили за регламентом, затвердженим біоетичним комітетом ІПКіК НАН України, який розроблений відповідно до «Загальних принципів експериментів на тваринах», схвалених I Національним конгресом з біоетики (Київ, Україна, 2001) і погоджених з положеннями «Європейської конвенції з захисту хребетних тварин, що використовуються в експериментальних та інших наукових цілях» (Страсбург, Франція, 1986). Формування ХОА виконували у 3-місячних білих безпорідних щурів-самиць відповідно до розробленої триетапної моделі (Г. А. Ковалев, и др., 2004). Споживана доза етанолу на етапі інтенсивної алкоголізації (одинадцять тижнів) складала 14-18 г/кг маси тіла на добу. Кріоконсервовані фетальні клітини, а також ЦФТ одержували з низькотемпературного банку ІПКіК НАН України. Проби відігрівали на водяній бані при 40С безпосередньо перед внутрішньовенним введенням: доза фетальних клітин складала 107/0,3 мл кріозахисного середовища (КЗС), ЦФТ - 0,3 мл/100 г маси тіла.

Для оцінки загального стану організму піддослідних щурів враховувалися стан шерстного покриву (А. Ю. Петренко и др., 2005), маса тіла і смертність. Детоксикаційна функція організму оцінювалася за тривалістю гексеналового сну (С. М. Дроговоз и др., 1994). Амінотрансферазну активність плазми крові (H. Bergmeyer et al., 1978) визначали за допомогою експрес-наборів («Біокон», Росія). Вміст альбуміну в плазмі крові тварин (D. Webster et al., 1974) вимірювали за допомогою експрес-наборів (“Sigma”, USA). Протромбіновий час визначали за методом Квіка (В. В. Меньшиков, 1987). Прооксидантно-антиоксидантну систему печінки і головного мозку оцінювали на підставі базального рівня ТБК-активних продуктів (А. В. Арутюнян и др., 2000), інтенсивності індукованого ПОЛ (Ю. А. Владимиров и др., 1972), каталазної (М. А. Королюк и др., 1988) і глутатіонпероксидазної активностей (J. Rotruck, et al., 1973). Вміст білка визначали біуретовим методом (A. Gornall et al., 1949). Про стан монооксигеназної системи печінки судили за вмістом цитохрому Р-450 (T. Matsubara et al., 1976) і N-диметилазною активністю (T. Nash, 1959).

Матеріал для гістологічного дослідження фіксували в 10%-ому нейтральному розчині формаліну, після чого препарати промивали, зневоднювали в батареї спиртів висхідної концентрації, просвітлювали в ксилолі і заливали в парафін. Зрізи тканини печінки і головного мозку завтовшки 4-5 мкм готували загальноприйнятим методом. Препарати печінки зафарблювали гематоксиліном та еозином, за методом Ван Гізона, суданом III, зрізи головного мозку зафарблювали гематоксиліном і еозином (В. Г. Елисеев, 1967). При виконанні морфологічного аналізу враховували характер ушкодження тканини печінки і головного мозку на клітинному і тканинному рівнях (А. И. Струков, 1999). Підраховували кількість явно нежиттєздатних гепатоцитів і нейронів - уже лізованих, а також тих, що перебувають в парабіозі і ще не закінчили повний лізис. Решту клітин - морфологічно не ушкоджених і з ознаками дистрофії різного ступеня вираженості, позначали як життєздатні. Чисельність лізованих клітин, а також тих, що перебувають у процесі лізису, та життєздатних клітин виражали у % від загальної кількості, відповідно, гепатоцитів і нейронів, для чого підраховували по 100 клітин у трьох різних ділянках кожного препарату, враховували середнє значення. Для більш точної оцінки тяжкості ушкодження гепатоцитів застосовували оригінальний спосіб морфологічної оцінки ступеня ушкодження гепатоцитів при ХОА (Пат. 11013 Україна, A61B10/00). Враховували також і процеси регенерації, для чого підраховували в часточках кількість клітин, які діляться мітотично, і число двоядерних гепатоцитів (N. Fausto, 2004). Крім того, оцінювали стан кровоносного русла органа і реакцію системи мононуклеарних фагоцитів на ушкодження тканини печінки шляхом підрахунку кількості зірчастих ретикулоендотеліоцитів на 100 гепатоцитів (А. И. Струков, 1999). При вивченні головного мозку досліджували морфологічну картину м'яких оболонок, шлуночків і пірамідного шару нейронів сенсомоторної зони фронтальної кори (Э. Н. Попова и др., 1984). Систему мононуклеарних фагоцитів у корі головного мозку оцінювали шляхом підрахунку кількості клітин мікроглії на 100 нейронів.

Дослідження термінів переживання і характеру розподілу донорських фетальних клітин в організмі тварин виконували методом полімеразної ланцюгової реакції (С. Херрингтон и др., 1999), як мітку використовували ген SRY, який завжди знаходиться в у-хромосомі. Тест-системи були отримані із Інституту біології гена РАН і мали детекцію продуктів полімеразної ланцюгової реакції за допомогою гельелектрофорезу в 1,5%-му агарі.

Статистичне опрацювання виконували за допомогою пакету програм «Excel 2003», «Statistica v.5.5» і «SPSS v.13.0». Дані оцінювали, використовуючи непараметричний критерій Манна - Уїтні, і наводили у вигляді M±m. Вірогідно відмінними вважали результати при Р<0,05.

Результати власних досліджень та їх обговорення. Експериментальна модель хронічного отруєння алкоголем. Розроблена модель ХОА характеризувалася комплексом системних порушень в організмі піддослідних щурів. Порушення загального стану тварин проявлялося уповільненням набору маси тіла, погіршенням стану шерстного покриву, пригніченням детоксикаційної функції організму, загибеллю щурів. Алкоголь-індуковане ушкодження гепатоцитів проявлялося підйомом рівня амінотрансфераз у плазмі крові, порушенням синтезу і секреції експортних білків, посиленням пероксидації ліпідів у печінці, пригніченням глутатіонпероксидазної і каталазної активностей, зниженням вмісту цитохрому P-450 і амінопіриндеметилазної активності. Різкі порушення структури печінки на клітинному рівні характеризувалися дистрофічними, атрофічними і некротичними ушкодженнями паренхіматозних клітин (табл. 1). На цьому фоні репаративні властивості печінкової тканини були виражені слабо, а клітини, що вступили в мітоз, піддавалися дистрофічним змінам.

Таблиця 1

Патоморфологічні прояви в печінці на момент закінчення інтенсивної алкоголізації (M±m; n=10)

Ознаки	Група
	інтактна	контроль (ХОА)
Лізовані гепатоцити (%)	1,9±0,4	19,1±1,8*
Гепатоцити в процесі лізису (%)	3,0±0,4	35,3±2,6*
Життездатні гепатоциты (%)	95,1±0,2	45,7±2,6*
Ступень ушкодження гепатоцитів (бали)	-	2,8±0,1*
Зірчасті ретикулоендотеліоцити (%)	19,7±2,6	31,7±1,5*
Двоядерні гепатоцити (%)	3,5±0,6	2,8±0,2

Примітка: *- P<0,05 по відношенню до інтактної групи.

Ушкодження органа на тканинному рівні характеризувалося дискомплексацією балок і часточок. У більшості тварин було відзначено підвищення внутрішньопечінкового і портального тиску. Етанол-індуковане ураження головного мозку характеризувалося посиленням процесів ПОЛ і пригніченням ферментативної ланки системи антиоксидантного захисту - глутатіонпероксидази і каталази. Мікроскопія зрізів головного мозку виявила ушкодження м'яких оболонок і шлуночків в 100,0% випадків. Патоморфологічні ознаки ушкодження м'яких оболонок мозку виявлялися у вигляді повнокров'я і плазматичного просочення судинної стінки, периваскулярного набряку. З боку шлуночків відзначалося ушкодження епендими, набряк стінки, підвищення секреції ліквору.

Вивчення зовнішнього пірамідного шару сенсомоторної зони кори виявило масове вірогідне відносно до к інтактної групи (P<0,05) ушкодження нейронів (рис.1).



Рис. 1. Патоморфологічні прояви в пірамідному шарі сенсомоторної зони кори головного мозку на момент закінчення інтенсивної алкоголізації.

На тканинному рівні мали місце розрідження речовини мозку, повнокров'я судин, периваскулярний і перицелюлярний набряк, плазматичне просочення судинної стінки, лімфоїдна інфільтрація тканини мозку.

Результати введення кріоконсервованих фетальних клітин печінки і головного мозку, а також ЦФТ при ХОА. Внутрішньовенне введення кріоконсервованих фетальних клітин щурам з ХОА продемонструвало їх виражену терапевтичну ефективність. Поліпшення загального стану організму проявлялося в нормалізації набору маси тіла, стану шерстного покриву. Суттєво покращувалась детоксикаційна функція організму (табл. 2).

Таблиця 2

Тривалість гексеналового сну після введення фетальних клітин і ЦФТ (M±m; n=10)

Група	Час сну, хвил.
	через 7 діб	через 14 діб	через 28 діб
Інтактна	8,0±0,4	8,0±0,4	8,0±0,4
Контроль (ХОА)	28,4±0,9*	28,4±0,9*	28,4±0,9*
КЗС	36,4±1,1*#	27,1±0,9*	34,7±1,3*#
КФП	9,5±0,5#^	8,2±0,3#^	12,2±0,5*#^
КФМ	11,0±0,6*#^	9,9±0,3*#^1	17,4±0,6*#^1
КФМ+КФП	13,1±0,5*#^12	13,2±0,4*#^12	-
ЦФТ	14,2±0,5*#^12	14,0±0,5*#^12	-

Примітка. Тут і далі: * - P<0,05 відносно інтактної групи; # - P<0,05 відносно контролю (ХОА);

^ - P<0,05 відносно групи порівняння (КЗС); 1 - P<0,05 відносно КФП; 2 - P<0,05 відносно КФМ;

3 - P<0,05 відносно КФМ+КФП.

Зменшення ступеня тяжкості алкоголь-індукованого ушкодження печінки виявлялося поліпшенням біохімічних показників функціонального стану органа. Значний вплив фетальних клітин і ЦФТ на синтетичну активність гепатоцитів відображався зміною вмісту альбуміну в плазмі крові (табл. 3).

Таблиця 3

Вміст альбуміну в плазмі крові після введення фетальних клітин і ЦФТ (M±m; n=10)

Група	Вміст альбуміну, г/дл
	через 7 діб	через 14 діб	через 28 діб
Інтактна	2,90±0,09	2,90±0,09	2,90±0,09
Контроль (ХОА)	0,95±0,02*	0,95±0,02*	0,95±0,02*
КЗС	1,25±0,04*#	1,44±0,03*#	1,13±0,05*#
КФП	2,26±0,07*#^	2,61±0,06*#^	2,46±0,10*#^
КФМ	1,87±0,05*#^1	2,40±0,06*#^1	1,90±0,07*#^1
КФМ+КФП	1,56±0,04*#^12	1,99±0,06*#^12	-
ЦФТ	1,67±0,05*#^12	2,04±0,07*#^12	-

Мало місце значне зниження рівня маркерів цитолізу в плазмі крові, зменшення оксидативного стресу і вираженості патоморфологічних ознак в органі (табл. 4).

Таблиця 4

Патоморфологічні прояви в печінці через 14 діб після введення фетальних клітин і ЦФТ (M±m; n=10)

Група	Ознаки
	лізовані гепатоцити (%)	гепатоцити у процесі лізису (%)	життєздатні гепатоцити (%)	ступінь ушкодження гепатоцитів (бали)	зірчасті ретикуло-ендотеліоцити (%)	двоядерні гепатоцити (%)
Інтактна	1,9±0,4	3,0±0,4	95,1±0,2	-	19,7±2,6	3,5±0,6
Контроль (ХОА)	19,1±1,8*	35,3±2,6*	45,7±2,8*	2,8±0,1*	31,7±1,5*	2,8±0,2
КЗС	24,1±2,7*	31,5±2,3*	44,5±2,3*	2,5±0,2*#	31,7±3,2*	3,3±0,6
КФП	8,3±1,0*#^	13,1±1,6*#^	78,6±2,4*#^	1,5±0,3*#^	25,3±3,0	6,3±1,1*#^
КФМ	12,3±2,2*#^	19,9±2,8*#^1	67,8±2,5*#^1	1,8±0,2*#^	44,3±4,3*#^1	7,0±0,9*#^
КФМ+КФП	15,3±1,8*^1	24,5±3,5*#^1	60,2±2,7*#^12	1,9±0,2*#^	50,9±7,2*#^1	7,6±0,8*#^
ЦФТ	8,5±0,9*#^3	20,2±2,7*#^13	71,3±2,1*#^13	1,0±0,2*#^3	29,8±3,023	4,1±0,5#23

В головному мозку фіксувалося зниження інтенсивності ПОЛ і підвищення активності системи антиоксидантного захисту (табл. 5).

Таблиця 5

Значення показників прооксидантно-антиоксидантного балансу в головному мозку через 14 діб після введення фетальних клітин і ЦФТ (M±m; n=10)

Група	Біохімічні показники
	базальний рівень ТБК-активних продуктів (пмоль МДА/мг білка)	інтенсивність індукованого ПОЛ (пмоль МДА/мг білка/хвил)	активність глутатіонпероксидази (мкмоль GSSG/мг білка/хвил)	активність каталази (мкмоль Н2О2/мг білка/хвил)
Інтактна	332,9±16,3	36,1±2,2	0,309±0,014	16,3±0,7
Контроль (ХОА)	547,8±35,9*	117,6±8,2*	0,188±0,012*	11,7±0,5*
КЗС	730,1±34,8*#	83,1±5,6*#	0,227±0,016*#	11,3±0,8*
КФП	324,5±18,9#^	30,1±1,8#^	0,279±0,012*#^	13,7±0,6*#^
КФМ	349,1±22,8#^	31,4±2,4#^	0,228±0,008*#1	11,7±0,6*1
КФМ+КФП	482,2±31,6*^12	58,6±3,8*#^12	0,229±0,010*#1	10,6±0,7*1
ЦФТ	507,6±32,4*^12	51,4±3,1*#^12	0,312±0,012*#^123	13,9±0,9*#^23

Значно поліпшувався стан шлуночків і м'яких оболонок мозку. Знижувалася тяжкість ушкодження пірамідного шару сенсомоторної зони кори головного мозку на тканинному і клітинному рівнях (табл.6).

Таблиця 6

Патоморфологічні прояви в пірамідному шарі сенсомоторної зони кори головного мозку через 14 діб після введення фетальних клітин і ЦФТ (M±m; n=10)

Група	Ознаки (%)
	лізовані нейрони	нейрони у процесі лізису	життєздатні нейрони	клітини мікроглії
Інтактна	1,8±0,1	3,8±0,3	94,4±0,3	21,6±0,9
Контроль (ХОА)	14,1±0,9*	17,8±0,9*	68,1±1,5*	25,2±1,2*
КЗС	16,2±0,89*	21,3±1,27*#	62,5±1,45*#	25,6±1,2*
КФП	8,1±0,5*#^	4,0±0,3#^	87,9±0,5*#^	27,1±1,5*
КФМ	3,4±0,17*#^1	12,7±0,55*#^1	83,9±0,60*#^1	31,2±1,60*#^
КФМ+ КФП	7,4±0,36*#^2	12,9±0,51*#^1	79,7±0,61*#^12	29,7±1,5*
ЦФТ	11,7±0,7*#^123	6,7±0,39*#^123	81,6±0,50*#^12	26,2±1,4*

Імунотропний ефект КФМ проявлявся збільшенням чисельності зірчастих ретикулоендотеліоцитів у печінці і клітин мікроглії в пірамідному шарі сенсомоторної зони кори на 14-ту добу спостереження, що можна пояснити їх здатністю синтезувати комплекс специфічних цитокінів і ростових чинників, які мають стимулювальний вплив на систему мононуклеарних фагоцитів.

Отримані результати дозволяють говорити про однакову спрямованість впливу фетальних клітин і ЦФТ та про відсутність органоспецифічністі їх дії. Визначення міток кріоконсервованих фетальних клітин в організмі реципієнтів показало, що на відміну від інтактних тварин у щурів з ХОА розподіл донорських клітин не був органотропним, що доводить відсутність їх прямої органозамісної функції. Відсутність органоспецифічністі розподілу введених фетальних клітин у щурів з ХОА може бути викликана автосенсибілізацією організму реципієнта ацетальдегід-білковими комплексами та антигенами клітин, що загибли, і тих, що перебувають у процесі лізису.

висновки

1. У дисертації наведено теоретичне та експериментальне узагальнення, а також нове розв'язання наукового завдання, спрямованого на виявлення шляхів реалізації терапевтичного впливу кріоконсервованих фетальних клітин печінки і головного мозку при введенні щурам з ХОА. Отримані в роботі дані свідчать, що внутрішньовенне введення КФП і КФМ тваринам з ХОА має виражений лікувальний ефект, що виявляється поліпшенням загального стану організму і зниженням тяжкості алкоголь-індукованого ураження печінки і головного мозку.

2. Розроблена експериментальна модель ХОА, при якій розвивається комплекс системних порушень в організмі піддослідних щурів: порушення загального стану організму (погіршення стану шерстного покриву аж до гніздної алопеції, пригнічення детоксикаційної функції організму, 25%-ва смертність), ураження печінки (зростання амінотрасферазної активності плазми крові, пригнічення синтетичної активності, порушення функціонування монооксигеназної системи, оксидативний стрес, патоморфологічні зміни на клітинному і тканинному рівнях), ураження головного мозку (оксидативний стрес, патоморфологічні зміни на клітинному і тканинному рівнях).

3. Застосування кріоконсервованих фетальних клітин значно поліпшувало загальний стан організму піддослідних щурів при ХОА, що проявлялося збільшенням маси тіла, поліпшенням стану шерстного покриву і детоксикаційної функції організму, відсутністю загибелі тварин. Аналіз динаміки загального стану показав, що на 7-му добу найефективнішими були КФМ, на 28-му добу - КФП.

4. Показано значний нормалізуючий вплив фетальних клітин на рівні біохімічних показників функціонального стану печінки і рівень маркерів цитолізу в плазмі крові при ХОА. Стимуляція синтетичної активності гепатоцитів в різні терміни спостереження проявлялася зростанням вмісту альбуміну в плазмі крові в 1,8-2,2 разу після введення КФП і в 1,5-1,7 разу після використання КФМ, а також повна нормалізація протромбінового часу в усі терміни спостереження після введення КФП, і на 14-ту добу після введення КФМ. Функціонування монооксигеназної системи печінки характеризувалося поступовим відновленням вмісту цитохрому P-450 після введення КФП. Рівень маркерів цитолізу (АСТ і АЛТ) чітко знижувався у всіх експериментальних групах, при цьому найсильніший ефект мали КФП.

5. Виявлена здатність фетальних клітин і ЦФТ гальмувати інтенсивність процесів ПОЛ і стимулювати ферментативну ланку системи антиоксидантного захисту і, таким чином, ефективно контролювати розвиток алкоголь-індукованого оксидативного стресу в печінці щурів. На 14-ту добу найбільш активно базальний рівень ТБК-активних продуктів знижувався після введення КФМ або КФП (в 1,8 і 1,5 разу), на 28-му добу більш результативними були КФП. Застосування КФП або КФМ супроводжувалося повною нормалізацією значень індукованого ПОЛ на 28-му добу. Активність глутатіонпероксидази і каталази в печінці через 14 діб після введення КФП, КФМ або КФМ+КФП досягала нормальних значень. Через 28 діб після введення КФП повністю нормалізувався вміст каталази, вплив на глутатіонпероксидазну активність КФП і КФМ був виражений рівною мірою.

6. Терапевтичний патоморфоз печінки після введення фетальних клітин характеризувався відновленням її структури на клітинному і тканинному рівнях, нормалізацією внутрішньопечінкової гемодинаміки. Введення КФМ або КФМ в поєднанні з КФП приводило до проліферації клітин системи мононуклеарних фагоцитів на 14-ту добу. Разом з тим, самостійне введення КФП такого ефекту не мало, і підвищення кількості зірчастих ретикулоендотеліоцитів відбувалося тільки через 28 днів після введення.

7. Введення фетальних клітин і ЦФТ зменшувало інтенсивність прооксидантних процесів в головному мозку, при цьому найбільшу ефективність показали КФП і КФМ (фіксувалася повна нормалізація на 14-ту добу). Стимулювання активності системи антиоксидантного захисту головного мозку на 14-ту добу відбувалося тільки після введення КФП або ЦФТ, стимуляція антиоксидантної системи на 28-му добу після внутрішньовенного введення фетальних клітин і ЦФТ була виражена рівною мірою.

8. Внутрішньовенне введення фетальних клітин мало виражений позитивний вплив на стан м'яких оболонок, шлуночків і шару пірамідних нейронів сенсомоторної зони кори головного мозку щурів з ХОА. При цьому КФМ більшою мірою поліпшували стан шлуночків і м'яких оболонок (до повної нормалізації на 14-ту добу після введення, в цей же термін спостерігався стимулювальний ефект на систему мононуклеарних фагоцитів), КФП найбільш виражено зменшували тяжкість ушкодження нейронів (через 14 діб після введення чисельність клітин лізованих і у процесі лізису зменшувалася в 2,0 і 5,3, а через 28 діб - в 2,7 разу).

9. Односпрямований характер дії фетальних клітин і ЦФТ вказує на те, що терапевтичний ефект внутрішньовенного введення фетальних клітин при ХОА переважно зумовлений впливом біологічно активних речовин, які вони містять.

перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Ковалев Г. А., Петренко А. Ю. Экспериментальная модель алкогольного поражения печени у самок крыс // Вісник Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна. Серія Медицина. - 2004. - № 617, Вип. 8. - С. 14-18.

2. Петренко А. Ю., Ковалев Г. А., Грищенко В. И. Внутривенное введение эмбриональных нервных клеток крысам с хроническим отравлением алкоголем // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 1. - С. 71-78.

3. Ковалев Г. А., Черкашина Д. В., Петренко А. Ю. Показатели прооксидантно-антиоксидантной системы печени самок крыс при алкогольном поражении // Сучасна гастроентерологія. - 2005. - № 4(24). - С. 51-54.

4. Ковалев Г. А., Черкашина Д. В., Рязанцев В. В., Петренко А. Ю. Влияние внутривенного введения криоконсервированных эмбриональных клеток на прооксидантно-антиоксидантное состояние печени крыс при алкогольном поражении // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 3. - С. 418-421.

5. Петренко А. Ю., Ковалев Г. А. Внутривенное введение клеток эмбриональной печени крысам с алкогольным поражением печени // Вісник Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна. Серія Медицина. - 2005. - № 705, Вип. 11. - С. 30 - 36.

6. Ковальов Г. О., Черкашина Д. В., Петренко О. Ю. Вплив ембріоспецифічних факторів на ступінь алкоголь-індукованого оксидативного пошкодження // Експериментальна і клінічна медицина. - 2007. - № 3. - С. 31-35.

7. Ковальов Г. О., Черкашина Д. В., Петренко О. Ю. Вплив хронічного отруєння алкоголем на прооксидантно-антиоксидантну систему головного мозку щурів // Медична хімія. - 2007. - Т. 9, № 2. - С. 5-9.

8. Петренко А. Ю., Сандомирский Б. П., Якимова Т. П., Ковалев Г. А. Влияние совместного введения эмбриональных клеток печени и головного мозга на тяжесть алкогольного поражения печени // Вісник Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна. Серія Медицина. - 2007. - № 774, Вип. 14. - С. 32-36.

9. Петренко А. Ю., Якимова Т. П., Ковалев Г. А. Влияние клеток эмбрионального головного мозга на морфогенез печени при хроническом алкогольном отравлении // Сучасна гастроентерологія. - 2007. - № 5(37). - С. 10-12.

10. Якимова Т. П., Ковалев Г. А., Сандомирский Б. П., Петренко А. Ю. Морфологическая характеристика изменений в печени при лечении ее алкогольного поражения клетками эмбриональной печени // Проблеми сучасної медичної освіти та науки. - 2007. - № 4. - С. 47-50.

11. Пат. 11013 Україна, A61B10/00. Спосіб диференційованої оцінки ступеня ушкодження гепатоцитів при хронічному отруєнні алкоголем / Т. П. Якимова, Г. О. Ковальов; заявник і патентовласник ХМАПО. - № u200503691; заявл. 18.04.2005; опубл. 15.12.2005; Бюл. № 12.

12. Ковалев Г. А., Петренко А. Ю. Моделирование алкогольного поражения органов. Взгляд с позиций биоэтики // Матеріали Другого національного конгресу з біоетики, 29 вересня - 2 жовтня 2004 р., м. Київ. - С. 170.

13. Ковалев Г. А. Влияние препаратов эмбрионального происхождения на состояние печени при алкогольном поражении в эксперименте // Від фундаментальних досліджень до медичної практики: Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції молодих вчених і спеціалістів (16 листопада 2005р.). - Харків, 2005. - С.71.

14. Ковальов Г. О. Корекція експериментального алкогольного ураження печінки внутрішньовенним введенням ембріональних печінкових клітин // Досягнення молодих вчених - майбутнє медицини: Матеріали науково-практичної конференції молодих вчених, 22 листопада 2005 р. - Харків, 2005. - С. 46.

15. Ковалев Г. А., Черкашина Д. В. Состояние печени крыс при экспериментальном алкогольном поражении после введения эмбриональных нервных клеток // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, № 4. - С. 735-736.

16. Ковальов Г. О. Оцінка стану печінки самок щурів при хронічному отруєнні алкоголем // Молодь та поступ біології: Збірник тез Другої міжнародної наукової конференції студентів і аспірантів (21-24 березня 2006 року). - Львів, 2006. - С. 429-430.

17. Ковалев Г. А., Черкашина Д. В. Модулирование состояния прооксидантно-антиоксидантной системы головного мозга ксенопрепаратами при экспериментальном хроническом алкогольном отравлении / Тезисы конференции молодых ученых „Холод в биологии и медицине 2006” (24-25 мая 2006 г., Харьков) // Проблемы криобиологии. - 2006. - Том 16, № 4. - С. 446.

18. Ковалев Г. А., Черкашина Д. В., Сандомирский Б. П., Петренко А. Ю. Коррекция алкоголь-индуцированного повреждения головного мозга препаратами животного происхождения / Материалы Симпозиума «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Москва, ЦИТО, 25-26 апреля 2007 г. - С. 25.

анотація

кріоконсервований клітина фетальний печінка

Ковальов Г. О. Вплив кріоконсервованих фетальних клітин на прояви хронічного отруєння алкоголем (експериментальне дослідження) - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю - 14.01.35 - кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2008.

Дисертаційна робота присвячена вивченню впливу внутрішньовенного введення кріоконсервованих клітин фетальної печінки (КФП) і клітин фетального мозку (КФМ) на морфо-функціональний стан печінки і головного мозку щурів при хронічному отруєнні алкоголем (ХОА).

Розроблена експериментальна модель ХОА. Встановлена висока терапевтична ефективність фетальних клітин при ХОА, що проявлялося поліпшенням загального стану організму, зменшенням тяжкості алкоголь-індукованого ушкодження печінки і головного мозку. Виявлена стимуляція кріоконсервованими КФМ системи мононуклеарних фагоцитів. Встановлено односпрямований характер дії фетальних клітин і цитозолю фетальних тканин. Показана відсутність прямої органозамісної функції донорських фетальних клітин при ХОА щурів.

Ключові слова: кріоконсервовані фетальні клітини, кріоконсервований цитозоль фетальних тканин, хронічне отруєння алкоголем, печінка, головний мозок.

АННОТАЦИЯ

Ковалев Г. А. Влияние криоконсервированных фетальных клеток на проявления хронического отравления алкоголем (экспериментальное исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности - 14.01.35 - криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2008.

Диссертационная работа посвящена изучению влияния внутривенного введения криоконсервированных клеток фетальной печени (КФП) и клеток фетального мозга (КФМ) на морфофункциональное состояние печени и головного мозга крыс при хроническом отравлении алкоголем (ХОА).

Разработана экспериментальная модель ХОА, при которой в организме подопытных крыс развивался комплекс системных нарушений в виде резкого ухудшения общего состояния, тяжелого поражения печени и головного мозга. Повреждение печени характеризовалось ростом уровня маркеров цитолиза в плазме крови, угнетением ее функциональной активности. Наблюдались развитие оксидативного стресса и резкие нарушения строения органа на клеточном и тканевом уровнях, характеризовавшиеся дистрофическими, атрофическими и некротическими повреждениями паренхиматозных клеток, дискомплексацией балок и долек, повышением внутрипеченочного и портального давления. Поражение головного мозга проявлялось развитием оксидативного стресса и патоморфологическими проявлениями на клеточном и тканевом уровнях.

Внутривенное введение криоконсервированных фетальных клеток значительно улучшало общее состояние организма крыс с ХОА: улучшались набор массы тела и состояние шерстного покрова, детоксикационная функция организма. Уменьшение тяжести алкоголь-индуцированного повреждения печени проявлялось улучшением биохимических показателей ее функционального состояния, снижением уровня маркеров цитолиза в плазме крови, уменьшением выраженности оксидативного стресса и патоморфологических признаков в органе. Рост содержания альбумина в плазме крови, нормализация протромбинового времени и постепенное восстановление активности монооксигеназной системы печени иллюстрировали стимуляцию синтетической активности гепатоцитов. Уменьшение тяжести оксидативного стресса характеризовалось снижением интенсивности ПОЛ и активизацией ферментативного звена системы антиоксидантной защиты. Гистологическое исследование печени продемонстрировало признаки восстановления структуры органа на клеточном и тканевом уровнях. Введения КФМ или КФМ в сочетании с КФП приводило к пролиферации клеток системы мононуклеарных фагоцитов на 14-е сутки. Снижение тяжести алкоголь-индуцированного повреждения головного мозга проявлялось значительным уменьшением дисбаланса его прооксидантно-антиоксидантной системы, выраженным улучшением морфологической картины пирамидного слоя сенсомоторной зоны коры, мягких оболочек и желудочков. Позитивное влияние на структуру мягких оболочек и желудочков мозга проявлялось в значительном уменьшении частоты обнаружения полнокровия сосудов и плазматического пропитывания их стенки, периваскулярного отека, повреждения эпендимы и повышения секреции ликвора, исчезновении случаев отека стенки желудочков. Значительно снижалась тяжесть повреждения пирамидного слоя сенсомоторной зоны коры на клеточном и тканевом уровнях: падала численность лизированных и лизирующихся нейронов, возрастала доля жизнеспособных нейроцитов. На 14-е сутки после введения КФМ был зафиксирован рост численности клеток микроглии. Однонаправленный характер действия фетальных клеток и цитозоля фетальных тканей указывает на то, что терапевтический эффект внутривенного введения фетальных клеток при ХОА преимущественно обусловлен влиянием содержащихся в них биологически активных веществ. Определение меток фетальных клеток после внутривенного введения показало, что в отличие от здоровых животных у крыс с ХОА полностью исчезала органоспецифичность их распределения, что обусловлено аутосенсибилизацией организма реципиента ацетальдегид-белковыми комплексами и антигенами погибших и лизирующихся клеток и доказывает отсутствие прямой органозаместительной функции донорских клеток.

Ключевые слова: криоконсервированные фетальные клетки, криоконсервированный цитозоль фетальных тканей, хроническое отравление алкоголем, печень, головной мозг.

SUMMARY

Koval`ov G. A. The influence of the cryopreserved fetal cells on the manifestation of the chronic alcohol poisoning (experimental research). - Manuscript.

Thesis for a Candidate's of Medical sciences degree by speciality - 14.01.35 - cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkiv, 2008.

The dissertation is devoted to the study of influencing of intravenous injection of cryopreserved hepatic and cerebral fetal cells on the morphofunctional state of rat liver and brain at the chronic alcohol poisoning (САР).

The САР experimental model has been developed. High therapeutic efficiency of fetal cells at САР has been revealed, that showed the improvement of the general state of organism, by reduction of weight of alcohol-induced damage of liver and brain. Stimulation by the cryopreserved fetal cells of brain the system of mononuclear phagocytes is exposed. The unidirectional effect of fetal cells and fetal tissue cytosol has been revealed. Absence of direct organ substitute function of donor fetal cells at САР in rats is shown.

Key words: cryopreserved fetal cells, cryopreserved fetal tissue cytosol, chronic alcohol poisoning, liver, brain.

Размещено на Allbest.ru

...