Аутоімунні реакції клітинного типу до нейроантигенів у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Аутоімунні реакції клітинного типу до нейроантигенів у постраждалих внаслідок аварії на чаес з цереброваскулярними захворюваннями

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед проблемних питань сучасної радіобіології залишається дискусійним питання радіаційної детермінованості уражень центральної нервової системи (ЦНС) у постраждалих внаслідок аварії на Чорнобильській атомній електростанції (ЧАЕС) опромінених в діапазоні доз менше 1 Зв. Неврологічні розлади переважно спостерігаються в структурі цереброваскулярної патології [А.И. НягуИ. Нягу, К.Н. ЛогановскийН. Логановский, 1997; Н.В. ДенисюкВ. Денисюк, К.Ю. АнтипчукЮ. Антипчук, К.М. ЛогановськийМ. Логановський та ін., 2005; Н.В. ДенисюкВ. Денисюк, 2006; М. Bomko, 2006; Логановський та ін., 2007].

Доза опромінення понад 250 мЗв є суттєвим фактором ризику розвитку цереброваскулярних захворювань, які реалізуються в молодому віці. Через 8-10 років в 1,6 рази (1,2-2,1) підвищився ризик цереброваскулярної патології [О.Я. ПироговаЯ. Пирогова, 2007; В.А. БузуновА. Бузунов и др., 2004]. Надлишковий відносний ризик (ERR) для цих захворювань становить 0,45 / Гр (95% довірчий інтервал (CI)=(0,11; 0,80)). Значимий ризик цереброваскулярних захворювань був визначений для доз зовнішнього опромінення більших ніж 150 мГр [V. Ivanov et al., 2005, 2006; V. Ivanov, 2007].

Застосування сучасних клінічних нейропсихіатрічних, нейрофізіологічних та нейровізуалізацій-них методів досліджень ЦНС дозволило виявити детерміновані ефекти опромінення у учасників ліквідації наслідків аварії (УЛНА) з дисциркуляторною енцефалопатією (ДЕП) при дозах більше 0,3 Зв. У таких випадках рекомендується діагностувати екзогенно-соматогенні енцефалопатії [К.М. ЛогановськийМ. Логановський та ін., 2005; 2007; М.О. Бомко М.О., 2005; К.Ю. АнтипчукЮ. Антипчук, 2005;]. Але механізми їх розвитку до кінця не вивчені. Ряд досліджень пов'язують ушкодження ЦНС у опромінених в інтервалі малих доз іонізуючого випромінювання з аутоімунними механізмами [Ю.П. ЗозуляП. Зозуля та ін., 1998; М.І. Лісяний, Л.Д. ЛюбичД. Любич, 2001; І.В. Степаненко, 2004].

Імунопатологічним підґрунтям для аутоімунних реакцій можуть бути зміни в імунній системи, які реєструються у постраждалих навіть через 20 років після аварії на ЧАЕС. У віддалений період після опромінення у значної кількості потерпілих зберігається дисбаланс морфофункціонального стану імунної системи, у більшій мірі виражений дефіцитом тимус-залежної ланки, що супроводжується змінами поверхневих структур, субпопуляційної організації, проліферації та функціональної активності Т-лімфоцитів, депресії Т-ланки з високим ступенем кореляції числа CD3H+LA-DR-клітин з дозою опромінення. Встановлено пороги збереження радіаційно індукованих імунних порушень на рівні доз в 200-350 мЗв. [Е.А. ЖербинА. Жербин, А.Б. ЧухловинБ. Чухловин, 1989; И.В. ОрадовскаяВ. Орадовская и др., 1995; Н.В. БеляеваВ. Беляева, Д.А. БазыкаА. Базыка, А.А. ЧумакА. Чумак, 1996; К.П. ЗакП. Зак, З.А. БутенкоА. Бутенко и др., 1996; Yаrіlin et al., 1996; Л.И. ВинницкийИ. Винницкий и др., 1997; А.А. ЧумакА. Чумак, 1998; І.В. Степаненко, 2004; Н.А. ГолярникА. Голярник, 2006]. Зміни в імунній системі розглядаються дослідниками як результат реалізації прямої дії іонізуючого опромінення на імунну систему та опосередкованої через порушення у трьох основних системах адаптації: нейропсихічній, нейроімунній та нейроендокринній [Є.М. Горбань, 1996; Л.П. Дерев'янкоП. Дерев'янко, 1997; Н.І. Афанасьєва, 1997; И.С. НикольскийС. Никольский, 1998]. Одним з варіантів виснаження компенсаторних і адаптаційних можливостей вищевказаних систем може бути розвиток аутоімунних реакцій до аутоантигенів власного організму в цілому і до антигенів ЦНС зокрема. Аутоімунні реакції гуморального типу до антигенів головного мозку при дії радіаційного опромінення достатньо добре вивчено [Ю.П. ЗозуляП. Зозуля та ін., 1998; М.І. Лісяний, Л.Д. ЛюбичД. Любич, 2001; І.В. Степаненко, 2004]. Але клітинні аутоімунні реакції до нейроспецифічних антигенів залишаються не вивченими, тому метою даної роботи є дослідження аутоімунних реакцій клітинного типу до нейроспецифічних антигенів ЦНС при дії доз опромінення, які не перевищують 1 Зв.

Окреслені питання обумовили вибір напрямку проведеного дослідження, яке направлене на з'ясування особливостей аутоімунних реакцій клітинного типу до нейроантигенів ЦНС (протеїну S-100 (S-100) - маркеру глії та основного білку мієліну (ОБМ) - маркеру мієліну) у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС з цереброваскулярною патологією. Це може представляти значний інтерес у клініко-діагностичній практиці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є самостійним, завершеним, комплексним науковим дослідженням, яке виконане у відділі клінічної імунології Інституту клінічної радіології (ІКР) Наукового центру радіаційної медицини (НЦРМ) АМН України. Дослідження виконані в рамках комплексної науково-дослідної роботи НЦРМ АМН України:

1) «Вивчення впливу комплексу радіаційних і нерадіаційних факторів на основні системи адаптації організму людини в умовах проживання на в 30-кілометровій зоні Чорнобильської АЕС» (№ держреєстрації 01.9.10 051562); співвиконавець.

2) «Вивчення причин і механізмів пошкодження і відновлення адаптаційних систем організму людей, які знаходяться в умовах зони відчуження» (0196U010195); співвиконавець.

3) «Моніторинг і вивчення патогенезу порушень здоров'я персоналу зони відчуження» (0196U005993); співвиконавець.

4) 1999-2002 рр. науково-дослідна робота 17/11 Н-99.09 «Вивчення особливостей перебігу та закономірностей виникнення, механізмів розвитку найбільш розповсюджених захворювань у постраждалих, що віднесені до критичних груп. Розробка системи лікувально-реабілітаційних заходів, первинної та вторинної профілактики патологічних станів», № держреєстрації 0199U003595, співвиконавець.

5) 2006-2009 рр. науково-дослідна робота №435 «Вивчити зв'язок процесів апоптозу та довжини теломерів мононуклеарів периферичної крові при формуванні клітинних ефектів дії іонізуючого випромінення», співвиконавець.

Мета дослідження. З'ясування особливостей аутоімунних реакцій клітинного типу до нейроантигенів ЦНС - протеїну S-100 та основного білку мієліну у хворих на цереброваскулярну патологію у віддаленому періоді після зовнішнього опромінення або комбінації його з опроміненням щитоподібної залози радіоактивними йодом, та розробка заходів щодо покращення діагностики та оптимізації комплексної судинно-ноотропної терапії.

Завдання дослідження. 1. Дати комплексну характеристику стану імунної системи у хворих на цереброваскулярну патологію УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. у віддалений період після опромінення та мешканців Чорнобильської зони відчуження.

2. Визначити особливості активаційних реакцій лімфоцитів за експресією HLA-DR антигенів та за даними ДНК-цитометрії у відповідь на S-100 та ОБМ у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр., хворих на цереброваскулярну патологію, у віддалений період після опромінення залежно від дози зовнішнього опромінення.

3. Визначити особливості активаційних реакцій лімфоцитів за експресією HLA-DR антигенів та за даними ДНК-цитометрії у відповідь на S-100 та ОБМ у мешканців Чорнобильської 30-кілометрової зони відчуження з цереброваскулярною патологією залежно від доз зовнішнього опромінення, доз опромінення щитоподібної залози, а також показників інкорпорації цезію-137.

4. Визначити вплив факторів, модифікуючих залежність «доза-ефект» (вік, тяжкість цереброваскулярної патології (ступень ДЕП), інша патологія ЦНС) та особливості активаційних реакцій лімфоцитів УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. у віддалений період після опромінення.

5. Визначити взаємний зв'язок імунологічних та гематологічних показників у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС з цереброваскулярною патологією в залежності від дози опромінення.

6. Дослідити особливості змін вищенаведених показників під впливом комплексної судинно-ноотропної терапії у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. з цереброваскулярною патологією.

Об'єкт дослідження. Хворі на цереброваскулярну патологію УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр., опромінені в діапазоні доз 45-940 мЗв, та мешканці Чорнобильської зони відчуження, опромінені в діапазоні доз 78-480 мЗв в умовах хронічного опромінення.

Предмет дослідження. Аутоімунні реакції клітинного типу у відповідь на нейроантигени (S-100, ОБМ) у хворих на цереброваскулярну патологію УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. у віддалений період після опромінення та мешканців Чорнобильської зони відчуження.

Методи дослідження.

1. Цитофлуориметричні (проточна цитометрія)

- вивчення субпопуляційного складу та експресії поверхневих антигенів імунокомпетентних клітин (ІКК) периферичної крові за допомогою моноклональних антитіл;

- ДНК-цитометрія

2. Серологічні - визначення рівнів сироваткових імуноглобулінів основних класів (IgA, IgG, IgM); концентрації дрібно - та великодисперсних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК 4% і 7%).

3. Культуральні - дослідження експресії активаційних антигенів ІКК в короткочасовій культурі лімфоцитів.

4. Статистичні - варіаційний та регресійно-кореляційний аналіз.

Наукова новизна. Проведено комплексне дослідження особливостей активаційних реакцій лімфоцитів за експресією HLA-DR антигенів та за даними ДНК-цитометрії у відповідь на S-100 та ОБМ у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС (мешканців Чорнобильської зони відчуження та УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. у віддалений період після опромінення) з цереброваскулярною патологією. Встановлено достовірне збільшення активаційних реакцій лімфоцитів до вищевказаних НСБ, яке вказує на порушення проникності ГЕБ та важливу роль аутоімунних реакцій клітинного типу в розвитку цереброваскулярної патології, як одного з патогенетичних механізмів пострадіаційного ураження ЦНС.

Виявлено вірогідно більшу інтенсивність активаційних реакцій лімфоцитів у відповіль на вищевказані нейроантигени при зовнішньому опроміненні у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. через 11-12 рр. після опромінення по відношенню до мешканців Чорнобильської зони відчуження, що зазнавали хронічного опромінення в малих дозах.

Вперше встановлно вірогідне збільшення рівня експресії HLA-DR антигену лімфоцитів у відповідь на S-100 у УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями у віддалений період після опромінення з більшими дозами опромінення (від 300 до 940 мЗв) у порівнянні з тими пацієнтами, які були опроміненi в меншому діапазоні доз (до 300 мЗв).

У УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями встановлено асоціацію коефіцієнту зафарблення (КЗ) ДНК ядер лімфоцитів у відповідь на S-100 з тяжкістю захворювання - тенденцію при ДЕП-І ст. та вірогідне збільшення при ДЕП-ІІ та ІІІ ст.

У мешканців Чорнобильської зони відчуження з цереброваскулярною патологією визначено вірогідне зменшення активації HLA-DR+ лімфоцитів у відповідь на S100 із зростанням показників інкорпорації цезію-137.

Встановлено, що активаційні реакції лімфоцитів за експресією HLA-DR антигенів та даними ДНК-цитометрії у відповідь на S-100 та ОБМ у УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярною патологію, без гострих порушень мозкового кровообігу не відрізнялись від аналогічних реакцій УЛНА на ЧАЕС з захворюваннями, які супроводжуються порушеннями прохідності ГЕБ.

Показано, що традиційна комплексна судинно-ноотропна терапія у УЛНА на ЧАЕС з ДЕП призводить до достовірного збільшення активації HLA-DR+ лімфоцитів у відповідь на S-100, відносної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів та зменшення відносної і абсолютної кількості CD4-8+-Т-супресорів, що супроводжується вірогідним збільшенням співвідношення хелпери / супресори.

Практичне значення одержаних результатів. На основі отриманих даних про значення аутоімунних реакцій клітинного типу до антигенів ЦНС (S-100 та ОБМ) в патогенезі цереброваскулярних захворювань у осіб, які постраждали внаслідок аварії на ЧАЕС, розроблено заходи з покращення діагностики аутоімунних процесів та оптимізації терапевтичних підходів до цієї категорії хворих.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно проведено аналіз наукових літературних даних, обґрунтована актуальність і необхідність дослідження, його мета і задачі, сформовано групи обстеження. Особисто розроблено алгоритм дослідження, обґрунтовано і відібрано методи дослідження, розроблено протокол для систематизації та фіксації результатів, структуру бази даних. Самостійно проведено клініко-імунологічне обстеження відібраних контингентів, культуральні та цитофлуориметричні дослідження: імунофенотипічний аналіз субпопуляційного складу ІКК, заповнена база даних, проведений статистичний аналіз та інтерпретація отриманих результатів. Особисто виконано інформаційний пошук, написання всіх розділів, створення ілюстрацій та формування висновків.

Особисто проведено експериментальні дослідження in vitro із формуванням короткочасових культур клітин. Заповнена база даних з подальшою статистичною обробкою та аналізом отриманих результатів. Особисто виконано написання всіх розділів дисертаційної роботи, створення ілюстративного матеріалу та формування висновків і практичних рекомендацій.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень наукової роботи викладено на Вченій раді Інституту клінічної радіології ДУ «Науковий центр радіаційної медицини» АМН України 27.04.2008 р., 2-й Міжнародній конференції «Віддалені медичні наслідки Чорнобильської катастрофи» (Київ, 1998), Міжнародній конференції «П'ятнадцять років Чорнобильської катастрофи. Досвід подолання» (Київ, 2001), школі-семінарі «Актуальные вопросы проточной цитометрии», 3-му Міжнародному симпозіумі «Хронічне опромінення: біологічні та медичні наслідки» (Челябінськ, 2005), Ювілейній науково-практичній конференції до 20-річчя гематологічного відділення ІКР НЦРМ АМН України «Радіаційна гематологія: етапи становлення, основні досягнення та перспективи розвитку» (Київ, 2007).

Публікації. За результатами досліджень опубліковано 5 наукових праць, із них - 3 статті у фахових виданнях, 1 - розділ, складова частини книги, 1 тези доповіді.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, 9 розділів основної частини (аналітичний огляд літератури, матеріал та методи, шість розділів результатів власних досліджень, аналіз та узагальнення результатів досліджень) висновків, практичних рекомендацій та списку використаних літературних джерел. Робота ілюстрована 85 таблицями і 13 рисунками. Повний обсяг дисертації - 213 сторінок, із них 187 сторінок складає основна частина. Список літератури викладений на 26 сторінках та містить 221 джерело (126 кирилицею та 95 латиницею). Додатки викладені на 85 сторінках.

Основний зміст роботи

опромінення лімфоцит антиген цереброваскулярний

Матеріал і методи дослідження. Матеріалом дослідження слугувала кров постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС, які проходили обстеження і лікування в клінічних підрозділах НЦРМ АМН України, а також кров осіб контрольної групи. Всього було обстежено 200 осіб. Група постраждалих включала 134 пацієнта з цереброваскулярною патологією (церебральний атеросклероз - І67.2, гіпертонічна енцефалопатія - І67.4, дисциркуляторна енцефалопатія - І67.8) та рядом захворювань нервової системи. Клінічний діагноз було встановлено у відділі радіаційної психоневрології ІКР НЦРМ АМН України. Аналіз проявів ДЕП проводили з використанням діагностичних критеріїв та класифікацій, які застосовують у цьому відділі та викладено у літературі [К.М. ЛогановськийМ. Логановський та ін., 2005; М.О. Бомко, 2005; К.Ю. АнтипчукЮ. Антипчук, 2005]. Контрольна група складалася з 66 практично здорових осіб.

У відповідності до мети і основних завдань дослідження постраждалі внаслідок аварії на ЧАЕС були розподілені на три групи. До основної - І групи було включено 108 УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. з цереброваскулярними захворюваннями, які не мали ускладнень свого захворювання у вигляді гострих ішемічних та геморагічних інсультів, або іншої супутньої патології, яка могла би спричинити до порушення ГЕБ. До аварії на ЧАЕС вони вважали себе практично здоровими. Середній вік (М±m) І групи становив 48,78±0,81 роки. Індивідуальні дози опромінення коливались від 45 до 940 мЗв (М±m - 353,10±26,60 мЗв). 90 хворих І групи мали прояви ДЕП. У відповідності до відсутності або наявності ДЕП, а також ступеня ДЕП, хворі І групи були розподілені на чотири підгрупи, а саме з ДЕП-0, ДЕП-І, ДЕП-ІІ і ДЕП-ІІІ ст. відповідно. Підгрупа ДЕП-0 включала 18 хворих з цереброваскулярними захворюваннями без ознак ДЕП, підгрупи з ДЕП І, ІІ і ІІІ ступеня налічували 27, 53 і 10 пацієнтів відповідно. Середній вік (М±у) хворих з ДЕП-0 становив 46,67±2,14 років, пацієнтів з ДЕП-І ст. - 48,26±6,02 роки, з ДЕП-ІІ ст. - 48,09±8,41 роки та з ДЕП-ІІІ ст. - 57,60±8,34 роки відповідно. Середні дози зовнішнього опромінення (М±у) у хворих з ДЕП-І ст. становили 444,00±226,60 мЗв, з ДЕП-ІІ ст. -271,90±154,40 мЗв, з ДЕП-ІІІ ст. - 484,50±213,30 мЗв, а в групі без ознак ДЕП - 331,20±286,70 мЗв. Хворі І групи на момент обстеження не отримували лікування.

До ІІ групи увійшли 13 УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр., які перенесли гострі порушення мозкового кровообігу, мали оперативні втручання з приводу захворювань ЦНС або аутоімунні захворювання нервової системи з наявністю контакту антигенів мозку з ІКК внаслідок порушення ГЕБ. ІКК цієї групи були передсенсибілізовані до НСБ, що дало можливість використати ІІ групу в якості контрольної групи з пошкодженнями ГЕБ. Середній вік (М±m) ІІ групи становив 39,77±3,24 роки. Хворі ІІ групи на момент обстеження отримували лікування за життєвими показаннями.

З 13 мешканців Чорнобильської зони відчуження з цереброваскулярними захворюваннями була сформована ІІІ група. Пацієнти ІІІ групи не мали ускладнень основного захворювання у вигляді інсультів та інших захворювань ЦНС, що могли би спричинити до порушення ГЕБ і стати причиною сенсибілізації ІКК до нейроантигенів. Середній вік (М±m) пацієнтів ІІІ групи становив 61,23±4,04 роки. Індивідуальні дози опромінення встановлено ДП «РАДЕК» за участю В.І. Марченко, А.К. Сухоручкіна і Ю.П. Іванова, які розробили підхід до оцінки доз опромінення осіб, що несанкціоновано повернулися на проживання до Чорнобильської зони відчуження. Діапазон доз зовнішнього опромінення коливався від 78 до 480 мЗв (М±m - 185,50±40,60 мЗв), доз на щитоподібну залозу - від 360 до 1720 мЗв (М±m - 652,50±145,60 мЗв), показників інкорпорації цезію-137 за даними ЛВЛ - від 30 до 878 Бк (М±m - 179,92±75,03 Бк).

До контрольної групи увійшло 66 практично здорових осіб без функціональних і органічних порушень ЦНС, які не зазнавали впливу іонізуючого випромінювання, яке перевищувало б значення природного фону. Середній вік (М±m) пацієнтів контрольної групи склав 35,77±1,40 роки.

Пацієнти І групи були вірогідно старші за віком від хворих ІІ групи (t=3,495; р?0,001), але не мали статистично значимих розбіжностей за дозою зовнішнього опромінення (t=1,270; р?0,21). Пацієнти І групи відрізнялись від хворих ІІІ групи за віком (t=-4,607; p?0,001) та дозою зовнішнього опромінення (t=2,650; p?0,01). Пацієнти І та ІІІ груп також відрізнялись за віком від контрольної групи (t=8,638; p?0,001 і t=7,049; p?0,001).

З метою вивчення впливу традиційної комплексної судинно-ноотропної терапії на деякі гематологічні показники, клітинний і гуморальний імунітет та стан сенсибілізації лімфоцитів до нейроантигенів була обстежена в динаміці група УЛНА на ЧАЕС з ДЕП І-ІІ ст. (21 особа). Терапія включала вазоактивні (вінпоцетин, пентоксифілін, нікотинова кислота), ноотропні (піроцетам), церебролізин та вітамінні препарати. Дослідження виконувались до лікування і на 15±2 день лікування. Середній вік хворих становив 47,62±2,17 років. Середня доза опромінення - 315,90±63,80 мЗв.

Пацієнтам виконані гематологічні дослідження периферичної крові, проаналізовано стан імунної системи, її субпопуляційну організацію, а також проведені дослідження аутоімунних реакцій клітинного типу у відповідь на S-100 та ОБМ. Гематологічні дослідження крові проводили на гематологічному аналізаторі «Sysmex» (Японія). Дослідження імунного статусу включали вивчення субопуляційного складу імунокомпетентних клітин (ІКК), рівнів сироваткових імуноглобулінів A, G, M, концентрації дрібно- і великодисперсних циркулюючих імунних комплексів (ЦІК 4% i 7%). Дослідження субпопуляційної організації ІКК проводили за допомогою проточно-цитометричного аналізу на лазерному проточному цитофлуориметрі FACScan. Концентрацію імуноглобулінів основних класів в сироватці крові визначали методом простої радіальної імунодифузії. Визначення рівнів ЦІК проводили методом cелективної преципітації у градієнті поліетиленгліколю з визначенням щільності преципітату.

Субпопуляційнний склад ІКК і експресію поверхневого фенотипу вивчали методом проточної цитофлуориметрії у прямому імунофлуоресцентному тесті за допомогою панелі моноклональних антитіл (МКАТ) серії Leu (Becton Dickinson, США) методом дво - та трьохкольорового аналізу. Набори IMK Plus включали МКАТ для двоколірного аналізу МПК, помічені флюоресцеїну ізотіоціанатом (FITC) або фікоеритрином (РЕ), у тому числі комбінації МКАТ anti-Leu4-FITC (CD3) /anti-Leu12-PE(CD19) для визначення загальної кількості Т - та В-клітин; anti-Leu3a-FITC(CD4) /anti-Leu2-PE(CD8) для оцінки регуляторних субпопуляцій Т-лімфоцитів; anti-Leu4-FITC (CD3) / anti-HLA-DR - (PE) для виявлення стабільних і активних Т-клітин, та активних В-клітин; anti-Leu4-FITC (CD3) /anti-Leu11-PE(CD16) та anti-Leu19-PE(CD56) для оцінки ЦТЛ та субпопуляції ПК-клітин. Контролем слугували мікросфери «Calibrite» (Becton Dickinson, США), помічені відповідно FITC чи PE, та МКАТ до імуноглобулінів миші (FITC + PE).

Венозну кров відбирали в пробірки, оброблені гепарином у концентрації 20 од/мл. На дно пластикової пробірки вносили МКАТ у кількості 10 мкл та цільну периферичну кров у кількості 50 мкл. Змішування протягом 3 секунд на вортекс-міксері та інкубували при кімнатній температурі 20-30 хвилин у темряві. Для лізису еритроцитів використовували розчин, що готувався за рецептурою фірми «ОRTHO», після чого проби були готові для аналізу на протічному цитофлуориметрі. Цитофлуориметричний аналіз проводили у лінійному режимі підсилення для показників переднього і бічного світлорозсіювання, та у логарифмічному для інтенсивності флюоресценції у зеленому спектрі (FITC) - перший канал флюоресценції і у червоному спектрі (PE) - другий канал флюоресценції. Коефіцієнти електронної компенсації спектрів флюоресценції складали 0,9% для FL-1 та 17,2% для FL-2. Математична обробка первинних даних проводилась за програмою LYSYS II на комп'ютері HP340 (Hewlett Packard, США).

Стан активації лімфоцитів оцінювався за кількістю клітин, що експресують на своїй мембрані активаційний маркер (АМ) - антиген гістосумісності ІІ класу (HLA-DR). Для дослідження активаційних реакцій популяцію мононуклеарів відокремлювали з венозної крові у одноступеневому градієнті фікол-верографіну (d = 1,076-1,078 г./мл). Суспензію мононуклеарів периферичної крові (МПК) готували в концентрації 5 х 106 клітин/мл в повному живильному середовищі на основі RPMI-1640 («SIGMA», США) з додаванням до 10% ембріональної телячої сироватки («SIGMA», США), L-глутаміну - 300 мкг/мл, гентаміцину («PHARMACHIM», Болгарія) - 60 мкг/мл, HEPES («SIGMA», США). МПК інкубували у присутності конканаваліну А (Кон A) в концентрації 5 мкг/мл. Після цього МПК відмивали, ресуспендували у 20 мкл забуференого фізіологічного розчину, та інкубували з МКАТ (Becton Dickinson, США) до кластерів диференціювання CD3, CD4 (FITC) та HLA-DR (PE). Аналіз проводили методом проточної цитофлуориметрії.

Дослідження активаційних реакцій клітинного типу у відповідь на мозкові антигени проводили у відповідності до методичних рекомендацій МОЗ України «Профілактика і корекція порушень імунного статусу при зовнішньому і внутрішньому опроміненні» (1993 р.) розроблених фахівцями Українського наукового центру радіаційної медицини МОЗ і АН України.

Венозну кров в кількості 5 мл, розводили в 2 рази з забуференим розчином Хенксу (0,1 М фосфатний буфер, pH - 7,4). Cуспензію мононуклеарів виділяли на рефрижераторній центрифузі (К-80 (НДР) або РС-6) в градієнті щільності фікол-верографину (Pharmacia Diagnostics), d - 1,076. Суспензію доводили до концентрації 1000000 клітин в 1 мл на проточному цитоаналізаторі типу Laborscale PSL-1/PSA-1 (Угорщина).

Мозкові антигени протеїн S-100 (Human S-100 protein 500 мкг, «Calbiochem», CША) та ОБМ (Myelin Basic Protein 500 мкг, «Millipore», США) розчиняли до робочої концентрації (1:10). В дослідні лунки вносили по 10 мкл робочого розчину протеїну S-100 або таку ж кількість ОБМ. До лунок планшету додавали по 20 мкл суспензії лімфоцитів в концентрації 1х106/мл. Після змішування на вортекс-міксері додавали 150 мкл розчину Хенксу та знову перемішували на вортекс-міксері. Планшет накривали кришкою і інкубували у термостаті 18 годин при 37°С. Після цього додавали забуферений фізіологічний розчин і ставили на вортекс-міксер на декілька секунд. Центрифугування проводили при 100 g протягом 5 хвилин.

Для ДНК-цитометрії після центрифугування видаляли супернатант та додавали по 10 мкл барвника (пропідію йодиду) у робочій концентрації. Інкубацію проводили при 4оС на протягом 10 хв. Знову додавали 150 мкл розчину Хенксу і змішували на вортекс-міксері декілька секунд, центрифугували при 100 g протягом 5 хвилин, видаляли супернатант і додавали по 50 мкл забуференого фізрозчину, ставили на вортекс-міксер на 2 хвилини.

Для дослідження експресії активаційних антигенів після інкубації клітин з мозковими антигенами та центрифугування, надосадову рідину обережно струшували і вносили по 20 мкл моноклональних антитіл анти-HLA-DR ИКО-1 (ОНЦ РАМН) в робочому розчині. Після 45 хвилин інкубації при постійному змішуванні на вортекс-міксері, планшет центрифугували при 100g протягом 5 хвилин та відмивали 0,9% розчином натрію хлориду. В дослідні і контрольні лунки вносили по 20 мкл мічених флуоресцеїну ізотіоціанатом антитіл до Fab-фрагментів імуноглобулінів миші, інкубували 60 хвилин в темноті при перемішуванні. Після інкубації суспензію клітин відмивали фізіологічним розчином, попередньо перевіреним на відсутність флюоресценції, в лунках залишали по 20 мкл клітинної суспензії. Виміри флюоресценції проводили на спектрофотометрі-флуориметрі для 96-лункових планшетів типу «Sumal PE2» виробництва Carl Zeiss (Німеччина). Виміри проводили при довжині хвилі збудження 488 нм, світофільтрі фотопримножувача з максимумом трансмісії 530 нм, в якості стандартного зразка використовували темне поле, опірних - 3 лунки, заповнених 0,9% розчином натрію хлориду. Результати отримували у вигляді показників для кожної проби, коефіцієнти розраховували по формулі:

K = А/b

Результати досліджень та їх обговорення.

Дослідження гематологічних показників, субпопуляційного складу ІКК периферичної крові та показників гуморального імунітету в комплексі з активаційними реакціями лімфоцитів на S-100 і ОБМ (за даними ДНК-цитометрії і активації HLA-DR лімфоцитів) проведені в 1997-1998 рр., дозволили охарактеризувати стан клітинного і гуморального імунітету та особливості активаційних реакцій лімфоцитів на вищенаведені НСБ у хворих на цереброваскулярні захворювання УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. з у віддалений період після опромінення (І група) та мешканців Чорнобильської зони відчуження (ІІІ група). Оскільки пацієнти І і ІІІ груп та особи контрольної групи вірогідно відрізнялись за віком, то одночасно були проведені аналогічні дослідження опозитних груп, стандартизованих за віком. З цією метою з числа пацієнтів І і контрольної груп були відібрані особи відповідного віку (21 пацієнт з І групи та 65 осіб з контрольної групи). Середній вік (М±у) пацієнтів відібраних з І групи становив 37,29±2,90, а з контрольної групи - 35,77±11,32; t=0,606; p=0,55. Таким же чином були сформовані стандартизовані за віком групи з числа пацієнтів ІІІ групи і осіб контрольної групи відповідного віку (cередній вік (М±у) пацієнтів ІІІ групи (n=13) - 61,23±14,56; контрольної групи (n=12) - 53,25±8,60; t=1,649; p=0,11), а також І та ІІІ груп відповідно (cередній вік (М±у) пацієнтів І групи (n=33) - 59,00±3,58 р.; ІІІ групи (n=13) - 61,23±14,57 р.; t=-0,831; p=0,41).

Порушення імунного статусу постраждалих характеризуються змінами клітинного (переважно Т-ланки) і гуморального імунітету порівняно з контролем. У пацієнтів І групи реєструються зменшення відносної кількості CD3+19-Т-лімфоцитів (р?0,001) і CD3+DR-Т-стабільних лімфоцитів (р?0,02), підвищення відносної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,02) та відносної і абсолютної кількості CD3-16+56+-ПК (р?0,001 і р?0,02). На відміну від відносної, абсолютна кількість CD3+DR-Т-стабільних лімфоцитів крові була вірогідно підвищена (р?0,01). У пацієнтів І групи спостерігались тенденції до збільшення відносної кількості CD19+-В-лімфоцитів (р?0,07) і зменшення відносної кількості CD3-DR+-В-активованих лімфоцитів (р?0,06) порівняно з контрольною групою.

В опозитних групах, стандартизовані за віком, були виявлені схожі, але і дещо інші ніж в попередньому дослідженні залежності. У пацієнтів І групи також відмічено вірогідне зменшення відносної кількості CD3+19-Т-лімфоцитів (р?0,001) і тенденції до зниження CD3+DR-Т-стабільних лімфоцитів (р?0,07). Абсолютна кількість CD3+DR-Т-стабільних лімфоцитів мала тенденцію до збільшення (р?0,06). У пацієнтів І групи відповідного з контрольною групою віку було достовірно збільшено відносну кількість CD19+-В-лімфоцитів (р?0,04) (аналогічна тенденція спостерігалась в попередньому дослідженні).

У хворих ІІІ групи порівняно з особами контрольної групи були виявлені вірогідні зміни у Т-ланці імунітету, які полягають у зниженні відносної кількості CD3+19-Т-лімфоцитів (р?0,04),

CD4-8+-Т-супресорів (р?0,01), відносної і абсолютної кількості CD3+16+56+-ЦТЛ (р?0,002 і р?0,03) та підвищенні співвідношення хелпери / супресори (р?0,01). У них спостерігались тенденції до зниження абсолютної кількості CD4-8+-Т-супресорів (р?0,07) та відносної і абсолютної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,09 і р?0,07).

В порівнюваних групах, стандартизованих за віком, виявлено ряд особливостей порівняно з попереднім дослідженням. У пацієнтів ІІІ групи була вірогідно знижена відносна кількість CD4-8+-Т-супресорів (р?0,05) та відносна і абсолютна кількість CD3+16+56+-ЦТЛ (р?0,001 і р?0,002), але абсолютна кількість CD3+DR-Т-стабільних лімфоцитів (р?0,02) була достовірно підвищена. У них зберігалась тенденція до зменшення абсолютної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,09) порівняно з особами контрольної групи відповідного віку.

Зміни у Т-ланці імунітету носили більш окреслений характер у пацієнтів ІІІ групи порівняно з хворими І групи. У пацієнтів ІІІ групи було вірогідно підвищено співвідношення хелпери / супресори (р?0,03). У них спостерігались тенденції до зниження відносної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,06), відносної і абсолютної кількості CD4-8+-Т-супресорів (р?0,07 і р?0,10) та CD3+16+56+-ЦТЛ (р?0,09 і р?0,09). В опозитних групах, стандартизованих за віком, тенденції, які спостерігались у попередньому дослідженні, набули достовірного характеру. У пацієнтів ІІІ групи також спостерігалось вірогідне підвищення співвідношення хелпери / супресори (р?0,01), зниження відносної і абсолютної кількості CD4-8+-Т-супресорів (р?0,02 і р?0,08) та CD3+16+56+-ЦТЛ (р?0,01 і р?0,02), а також відносної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,03) порівняно з пацієнтами І групи відповідного віку.

Зміни гуморального імунітету пацієнтів І групи характеризувались вірогідним зменшенням вмісту імуноглобуліну М (р?0,002) порівняно з контролем. В опозитних групах, стандартизованих за віком, було виявлено аналогічну залежність (р?0,007). У хворих ІІІ групи встановлено тенденції до зменшення вмісту імуноглобуліну А (р?0,06) та збільшення ЦІК 7% (р?0,10) порівняно з контролем. Але в порівнюваних групах, стандартизованих за віком, виявлено тенденцію до зменшення вмісту імуноглобуліну М (р?0,06) та достовірне збільшення вмісту ЦІК 7% (р?0,02) у пацієнтів ІІІ групи відповідного з контролем віку. У пацієнтів ІІІ групи було вірогідно зменшено вміст імуноглобуліну А (р?0,04) та збільшено вміст ЦІК 7% (р?0,001) у порівнянні з пацієнтами І групи. Аналогічні результати отримано при опозитних групах, стандартизованих за віком (р?0,01 і р?0,001).

У пацієнтів І групи порівняно з особами контрольної групи (табл. 1), встановлено достовірне збільшення коефіцієнту зафарблення (КЗ) ДНК ядер лімфоцитів у відповідь на S-100 (р?0,001) та коефіцієнту активації (КА) HLA-DR лімфоцитів на S-100 і ОБМ (р?0,001 і р?0,001). В опозитних групах, стандартизованих за віком також зберігалися достовірні відмінності (р?0,002; р?0,001 і р?0,001).

КЗ ДНК ядер лімфоцитів периферичної крові пацієнтів ІІІ групи у відповідь на S-100 вірогідно не відрізнялись від контролю (в т.ч. в опозитних групах відповідного віку). У пацієнтів ІІІ групи відмічено достовірне збільшення КА HLA-DR лімфоцитів на S-100 та ОБМ (р?0,001 і р?0,001). Вірогідні розбіжності зберігалися в опозитних групах, стандартизованих за віком (р?0,003 і р?0,001), що свідчить про їх стійкий і достовірний характер.

У пацієнтів І групи порівняно з хворими ІІІ групи відмічено вірогідне збільшення КЗ ДНК ядер лімфоцитів на S-100 (р?0,001). Аналогічний результат отримано в опозитних групах, які були стандартизовані за віком (р?0,002). У пацієнтів ІІІ групи виявлено вірогідне зменшення КА HLA-DR лімфоцитів на S-100 (р?0,01) та збільшення КА HLA-DR на стимуляцію ОБМ (р?0,001). В опозитних групах, стандартизованих за віком, виявлено достовірне зниження КА HLA-DR лімфоцитів на S-100 і ОБМ (р?0,001 і р?0,002) у пацієнтів ІІІ.

У пацієнтів І групи виявлено ряд вірогідних кореляційнийних залежностей між дозою зовнішнього опромінення та вмістом тромбоцитів (r=0,28), відносною і абсолютною кількістю сегментоядерних лейкоцитів (r=0,38 і r=0,32) та відносною кількістю лімфоцитів (r=-0,26).

У пацієнтів ІІІ групи виявлено ряд вірогідних кореляційних зв'язків: а) між загальною еквівалентною дозою зовнішнього опромінення та відносною кількістю CD3-16+56+-ПК (r=-0,66), абсолютною кількістю CD3+DR+ - Т-активованих лімфоцитів (r=-0,83), вмістом ЦІК 4% (r=-0,63) та абсолютною кількістю CD3-DR+-В-активованих лімфоцитів (r=0,71); б) між дозою на щитоподібну залозу та абсолютною кількістю сегментоядерних лейкоцитів (r=-0,66), Т-супресорів (r=-0,89), Т-стабільних лімфоцитів (r=-0,88) та В-активованих лімфоцитів (r=0,88); в) між показниками інкорпорації цезію-137 та КА HLA-DR лімфоцитів у відповідь на S100 (r=-0,60).

Вищенаведені зміни у пацієнтів І і ІІІ груп з цереброваскулярною патологією вказують на наявність комбінованої імунологічної недостатності, яка є підгрунтям для достовірного збільшення активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 і ОБМ (за даними ДНК-цитометрії та активації HLA-DR). Збільшення активаційних реакцій на НСБ, які є «забар'єрними» анигенами ЦНС, може бути наслідком порушення ГЕБ у пацієнтів з цереброваскулярною патологією, включаючи ДЕП. Можна говорити про більш вагомий модифікуючий вплив радіаційного фактора на деякі гематологічні показники, субпопуляційну організацію лімфоцитів периферичної крові, показники гуморального імунітету та активаційні реакції лімфоцитів на НСБ у пацієнтів ІІІ групи, які на момент обстеження мешкали в Чорнобильській зоні відчуження, ніж у хворих І групи, які зазнали опромінення 11-12 років назад.

Дослідження гематологічних і імунологічних показників в комплексі з активаційними реакціями лімфоцитів на S-100 і ОБМ (за даними ДНК-цитометрії та активації HLA-DR лімфоцитів), проведене у УЛНА на ЧАЕС І та ІІ груп, дозволило виявити тотожність активаційних реакцій лімфоцитів на вищенаведені НСБ, а також вірогідне підвищення відносної кількості CD3+19-Т-лімфоцитів (р?0,05), CD4+8-Т-хелперів (р?0,001) та співвідношення хелпери / супресори (р?0,01) у пацієнтів ІІ групи. Збільшення коефіцієнту хелпери / супресори у пацієнтів ІІ групи притаманне захворюванням ЦНС, що протікають з аутоімунними реакціями спрямованими до власних нейроантигенів. Підґрунтям для цих реакцій є порушення прохідності ГЕБ.

Таким чином, активаційні реакції лімфоцитів на S-100 та ОБМ пацієнтів І групи («без ушкоджень ГЕБ») були достовірно підвищені у порівнянні з особами контрольної групи, але вірогідно не відрізнялись від хворих ІІ групи («з ушкодженнями ГЕБ»). Це є свідченням того, що підвищені активаційні реакції лімфоцитів до вищенаведених НСБ у УЛНА на ЧАЕС І групи, можуть бути наслідком порушення проникності ГЕБ у хворих з цереброваскулярною патологією. Переважну більшість з цієї групи (90 з 108 осіб) становили УЛНА на ЧАЕС з проявами ДЕП І-ІІІ ступеня. Аналогічного висновку дійшли фахівці Інституту нейрохірургії ім. акад. А.П. РомодановаП. Ромоданова, які у хворих з постпроменевою енцефалопатією (ПЕП) встановили, що частота реєстрації антитіл до ОБМ вірогідно перевищувала показники контрольної групи в 4 рази, до S-100 - у 8 разів, до НСE - у 3,5 рази [Ю.П. ЗозуляП. Зозуля та ін., 1998; М.І. Лісяний, Л.Д. ЛюбичД. Любич, 2001; І.В. Степаненко, 2004]. Імовірно у УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярною патологією у віддалений період після опромінення збільшення активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 та ОБМ може бути викликане дисциркуляторними порушеннями гемодинаміки в ЦНС та змінами прохідності ГЕБ. Як наслідок, «забар'єрні» НСБ стають доступними для ІКК, що приводить до розвитку аутоімунних реакцій.

У УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями у віддалений період після опромінення було вивчено відхилення показників гематологічного обстеження, клітинного і гуморального імунітету та активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 і ОБМ (за даними ДНК-цитометрії та активації HLA-DR) залежно від доз зовнішнього опромінення. З числа УЛНА І групи було сформовано дві підгрупи по осіб 30 кожна - №1 та №2. Середній вік (М±у) хворих підгрупи №1 становив 48,23±8,52, а підгрупи №2 - 50,37±6,82 роки (t=-1,070; р?0,29). До підгрупи №1 увійшли хворі з дозами зовнішнього опромінення від 49,8 до 300 мЗв, а до підгрупи №2 - від 300 до 940 мЗв. Середні дози зовнішнього опромінення (М±у) підгрупи №1 становили 191,70±80,10 мЗв, а підгрупи №2 - 522,60 ±167,80 мЗв (t=-9,749; р?0,001).

В підгрупі №2 встановлено вірогідне збільшення КА HLA-DR лімфоцитів на S-100 (р?0,02). В цій підгрупі було вірогідно збільшено відносну кількість сегментоядерних лейкоцитів (р?0,01) та спостерігались тенденції до збільшення абсолютної кількості сегментоядерних лейкоцитів (р?0,08) і відносної кількості CD19+-В-лімфоцитів (р?0,07), а також зниження відносної і абсолютної кількості CD3+16+56+-ЦТЛ (р?0,08 і р?0,09).

В кожній підгрупі був проведений кореляційний аналіз. В підгрупі №1 встановлено вірогідні кореляції між дозою опромінення та відносною і абсолютною кількістю CD4-CD8+-Т-супресорів (r=0,58 і r=0,56), співвідношенням хелпери / супресори (r=-0,50), відносною кількістю CD3+DR-В-активованих лімфоцитів (r=-0,40) та CD3+16+56+-ЦТЛ (r=0,42), а підгрупі №2 реєструється лише вірогідна кореляція між дозою опромінення та відносною кількістю CD3+16+56+-ЦТЛ (r=0,46).

Вірогідні відхилення КА HLA-DR лімфоцитів на S-100 пацієнтів опозитних підгруп можуть бути пояснені гетерогенними кореляційними зв'язками з дозою зовнішнього опромінення. В підгрупі №1 з ростом дози зовнішнього опромінення спостерігається вірогідне збільшення відносної і абсолютної кількості Т-супресорів та достовірне зниження співвідношення хелпери / супресори. Наслідком зростаючих супресорних впливів, може бути гальмування активаційних реакцій лімфоцитів (експресії HLA-DR антигену) на S-100 у пацієнтів підгрупи №1, які були опромінені в меншому діапазоні доз у порівнянні з хворими підгрупи №2. Це підтверджується зворотним кореляційним зв'язком з імовірністю понад 90% між дозою зовнішнього опромінення та КА HLA-DR лімфоцитів на S-100 у пацієнтів підгрупи №1. На відміну від них, пацієнти підгрупи №2 мають позитивний кореляційний зв'язок між дозою зовнішнього опромінення та КА HLA-DR лімфоцитів на S-100.

В УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями, які були опромінені в більшому діапазоні доз (від 300 до 940 мЗв), спостерігається достовірне збільшення активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 - маркер глії (за даними активації HLA-DR лімфоцитів). Це може свідчити про те, що в більшому діапазоні доз зростає пошкодження гліальних структур ЦНС та ГЕБ. Гліальні клітини разом з ендотеліальними клітинами церебральних судин є складовими елементами ГЕБ. Отримані нами висновки щодо збільшення порушень ГЕБ у УЛНА на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями, що були опромінені в більшому діапазоні доз (від 300 до 940 мЗв), узгоджуються з результатами досліджень інших авторів, які спостерігали збільшення судинних дисциркуляторних порушень з розвитком атрофії білої і сірої речовини головного мозку з порогом їх виникнення 300 мЗв [К.М. ЛогановськийМ. Логановський та ін., 2005; М.О. БомкоМ.О., 2005; К.Ю. АнтипчукЮ. Антипчук, 2005; Н.В. ДенисюкВ. Денисюк, 2006; Логановський та ін., 2007].

Вплив ступеню тяжкості цереброваскулярної патології на формування ефектів опромінення у УЛНА на ЧАЕС було проаналізовано за відхиленнями показників гематологічного, імунологічного обстеження та активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 і ОБМ (за даними ДНК-цитометрії та активації HLA-DR) підгруп ДЕП-І, ІІ і ІІІ у порівнянні з ДЕП-0.

У хворих підгрупи ДЕП-І спостерігалось вірогідне підвищення відносного вмісту CD3-16+56+-ПК та тенденція до зменшення відносної кількості Т-хелперів. КЗ ДНК ядер лімфоцитів на S-100 мав тенденцію до збільшення у порівнянні з хворими підгрупи ДЕП-0.

В підгрупі ДЕП-ІІ відмічалось вірогідне підвищення відносного вмісту паличкоядерних лейкоцитів та тенденція до зменшення співвідношення хелпери / супресори. КЗ ДНК ядер лімфоцитів на S-100 у них був вірогідно збільшеним у порівнянні з ДЕП-0.

В підгрупі ДЕП-ІІІ було вірогідно підвищено відносний і абсолютний вміст паличкоядерних лейкоцитів і еозинофілів, а також спостерігалась тенденція до зменшення співвідношення хелпери / супресори. КЗ ДНК ядер лімфоцитів на S-100 був вірогідно збільшеним у порівнянні з хворими підгрупи ДЕП-0.

При проведенні кореляційного аналізу було встановлено вірогідний кореляційний зв'язок між ступенем ДЕП та віком пацієнтів (r=0,20). Не встановлено вірогідної кореляції між ступенем ДЕП та дозою зовнішнього опромінення.

Таким чином, дослідження активаційних реакцій лімфоцитів на S100 та ОБМ (за даними ДНК-цитометрії та експресії HLA-DR антигену), яке було проведене у УЛНА на ЧАЕС в залежності від тяжкості перебігу цереброваскулярної патології, дозволило за даними ДНК-цитометрії встановити асоціацію показників активації лімфоцитів білком S-100 з тяжкістю захворювання - тенденцію при ДЕП-І ст. та вірогідне збільшення при ДЕП-ІІ та ІІІ ст.

Крім того, при порівнянні середніх групових даних встановлено ряд тенденцій, що, не зважаючи на індивідуальну варіабельність показників, яка приводить до відсутності статистичних розбіжностей при параметричному статистичному аналізі, можуть характеризувати механізми розвитку ДЕП у УЛНА. Встановлено чіткі тренди до ініціального підвищення числа CD3-16+56+ - ПК та, імовірно, пов'язаного з ним процесу підвищення числа CD3+DR+-Т-активованих клітин. Це вказує на початкове включення, перш за все, більш примітивних, не Т-залежних механізмів імунної відповіді з загальними ознаками активації Т-ланки. Тренд до зростання числа CD4+8-Т-хелперних клітин та CD3+16+56+-ЦТЛ, що пов'язані з антитіло-опосередкованою цитотоксичністю, спостерігається на пізніх стадіях ДЕП. Вірогідне збільшення вмісту ЦІК 4% зі ступенем тяжкості захворювання (r=0,56) може свідчити про участь гуморально-імунокомплексних реакцій в патогенезі ДЕП. Так як, у хворих на енцефалопатію нейроаутоімунні реакції можуть розвиватися не за одним, а як мінімум, трьома варіантами перебігу з переважанням клітинних і цитокінових чи гуморально-імунокомплексних реакцій, в яких ЦІК малого розміру відносять до найбільш патогенних [Ю.П. ЗозуляП. Зозуля та ін., 1998; М.І. Лісяний, Л.Д. ЛюбичД. Любич, 2001].

На роль CD3-16+56+ - ПК та CD3+16+56+-ЦТЛ звертали увагу інші автори, що досліджували імунопатологічні зміни у хворих з ДЕП. За даними їх досліджень у УЛНА, хворих на ДЕП, показано тенденцію до підвищення кількості CD3+16+56+, яка спостерігається навіть через 20 років після опромінення. Поряд з цим, у віддалений період після опромінення встановлена тенденція до зниження CD3-16+56+-ПК, активних, головним чином, до вірус-інфікованих і пухлинних клітин [Д.А. БазикаА. Базика, Н.А. ГолярникА. Голярник, Н.В. Бєляєва, 2007; Д.А. БазикаА. Базика, Н.А., Н.В. Бєляєва, А.А. ЧумакА. Чумак та ін. 2007]. Збільшення популяції CD3+16+56+-ЦТЛ, імовірно сенсибілізованих до «забар'єрних» НСБ внаслідок підвищення проникності ГЕБ, може привести до ушкодження власних тканин за принципом «хибного кола». Тривалий нейроімунний конфлікт сприяє загостренню імунопатологічного процесу, гальмуванню репаративних процесів в ЦНС, включаючи ГЕБ, і може привести до хронізації та прогредієнтного розвитку цереброваскулярної патології.

У постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС було встановлено особливості активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 за даними ДНК-цитометрії, які полягали у тому, що у більшості пацієнтів (у 95 осіб з 134) спостерігалося збільшення КЗ ДНК ядер лімфоцитів на S-100. У них значення КЗ перевищували 1. У решти обстежених (39 осіб) - КЗ ДНК ядер лімфоцитів був менше 1, або дорівнював 1. У постраждалих з КЗ ДНК ядер лімфоцитів >1 встановлено, що збільшення активаційних реакцій лімфоцитів на S-100 за даними ДНК-цитометрії асоціюється з вірогідним збільшенням абсолютної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,04).

Під впливом традиційної комплексної судинно-ноотропної терапії у УЛНА на ЧАЕС з ДЕП І-ІІ ст. спостерігали зміни активаційних реакцій лімфоцитів у відповідь на S-100: тенденція до збільшення КЗ ДНК ядер лімфоцитів (р?0,10) та вірогідне збільшення КА HLA-DR лімфоцитів (р?0,001). Разом з цим спостерігалось збільшення відносної кількості CD3+DR+-Т-активованих лімфоцитів (р?0,02), співвідношення хелпери / супресори (р?0,01), концентрації ЦІК 7% (р?0,03) та зменшення відносної кількості CD4-8+-Т-супресорів (р?0,02). Відмічено тенденції до зменшення абсолютної кількості CD4-8+-Т-супресорів (р?0,06) та зниження вмісту імуноглобуліну G (р?0,07).

В результаті проведеної терапії встановлено покращення основних клінічних показників, самопочуття, загального стану хворих, зменшення проявів основного захворювання, що відповідає літературним даним про вплив вищезазначених препаратів на ЦНС. Але зростання активаційних реакцій лімфоцитів на S-100, в комплексі з іншими показниками клітинного та гуморального імунітету може свідчити про збереження імунологічного патогенетичного підґрунтя, що може бути основою подальшого несприятливого перебігу ДЕП у УЛНА на ЧАЕС.

Висновки

У дисертаційній роботі теоретично обгрунтовано та підтверджено нове вирішення актуального науково-практичного завдання радіобіології, а саме - визначення ролі аутоімунних реакцій клітинного типу до мозкових антигенів - протеїну S-100 та основного білку мієліну у хворих на цереброваскулярну патологію у віддаленому періоді після опромінення в діапазоні доз 45-940 мЗв. Встановлені особливості залежностей «доза-ефект» для активаційних реакцій лімфоцитів за даними ДНК-цитометрії та експресії активаційного антигену HLA-DR в комплексі з показниками гематологічного та імунологічного обстеження. Надано практичні рекомендації щодо підвищення ефективності діагностики та оптимізації лікування хворих на цереброваскулярну патологію УЛНА на ЧАЕС у віддалений період після опромінення.

1. Зміни активаційних реакцій лімфоцитів у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС з цереброваскулярними захворюваннями у відповідь на протеїн S-100 і ОБМ носять чітко окреслений і достовірний характер:

а. - встановлено реакції активації лімфоцитів на протеїн S-100 і ОБМ зі збільшенням коефіцієнтів активації HLA-DR лімфоцитів при зовнішньому опроміненні в діапазоні доз 45-940 мЗв у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. та 78-480 мЗв в умовах хронічного опромінення у мешканців Чорнобильської зони відчуження;

б. - встановлено реакції активації на протеїн S-100 за результатами ДНК-цитометрії лімфоцитів у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. в діапазоні доз 45-940 мЗв;

в. - вірогідно більшa інтенсивність стандартизованих за віком показників активаційних реакцій лімфоцитів встановлена у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр. в порівнянні з особами, що зазнають хронічної дії опромінення як мешканці Чорнобильської зони відчуження.

2. Зміни активаційних реакцій лімфоцитів у постраждалих внаслідок аварії на ЧАЕС (УЛНА 1986-1987 рр. у віддалений період після опромінення і мешканців Чорнобильської зони відчуження) з цереброваскулярними захворюваннями у відповідь на протеїн S-100 і ОБМ, відбуваються на фоні порушення імунного статусу, яке характеризується різноспрямованими змінами клітинного (переважно Т-ланки) і гуморального імунітету у порівняні з контролем. Ці зміни носять більш сталий і окреслений характер у мешканців Чорнобильської зони відчуження у порівнянні з УЛНА на ЧАЕС, обстеженими через 11-12 років після опромінення. Встановлено зниження загальної популяції CD3+19-Т-лімфоцитів, дисбаланс субпопуляцій CD4+, CD8+, цитотоксичних Т-лімфоцитів, зниження вмісту імуноглобуліну М у УЛНА і мешканців Чорнобильської зони відчуження та підвищення концентрації великодисперсних циркулюючих імунних комплексів у мешканців Чорнобильської зони відчуження. У мешканців Чорнобильської зони відчуження у порівнянні з УЛНА на ЧАЕС знижено вміст імуноглобуліну А та збільшена концентрація великодисперсних циркулюючих імунних комплексів. Вищенаведені зміни вказують на наявність комбінованої імунологічної недостатності.

3. У віддалений період після опромінення у УЛНА на ЧАЕС 1986-1987 рр., хворих на цереброваскулярні захворювання, з більшими дозовими навантаженнями від 300 до 940 мЗв встановлено достовірне збільшення активації HLA-DR+ лімфоцитів у відповідь на антигенну стимуляцію протеїном S-100 у порівнянні з тими, які були опромінені в меншому діапазоні доз. В діапазоні доз до 300 мЗв встановлено вірогідні кореляції між дозою опромінення та відносною і абсолютною кількістю CD4-CD8+-Т-супресорів (r=0,58 і r=0,56), співвідношенням хелпери / супресори (r=-0,50), відносною кількістю CD3+DR-В-активованих лімфоцитів (r=-0,40) та CD3+16+56+-ЦТЛ (r=0,42), а у УЛНА на ЧАЕС опромінених в діапазоні доз від 300 до 940 мЗв реєструється лише вірогідна кореляція між дозою опромінення та відносною кількістю CD3+16+56+-ЦТЛ (r=0,46).