Диференційна діагностика епітеліальних дисплазій шийки матки та інтраепітеліальної карциноми

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ДИФЕРЕНЦІЙНА ДІАГНОСТИКА ЕПІТЕЛІАЛЬНИХ ДИСПЛАЗІЙ ШИЙКИ МАТКИ ТА ІНТРАЕПІТЕЛІАЛЬНОЇ КАРЦИНОМИ

14.03.02 - патологічна анатомія

ПЛІТЕНЬ ОКСАНА МИКОЛАЇВНА

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському національному медичному університеті МОЗ України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор, МАРКОВСЬКИЙ Володимир Дмитрович, Харківський національний медичний університет МОЗ України, професор кафедри патоморфології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, ЯКІМОВА Тамара Петрівна, Харківська медична академія післядипломної освіти МОЗ України, професор кафедри клінічної лабораторної діагностики;

доктор медичних наук, професор, ГАСЮК Анатолій Петрович, Вищий державний навчальний заклад України «Українська медична стоматологічна академія» МОЗ України, завідувач кафедри патологічної анатомії з секційним курсом.

Захист відбудеться «25» грудня 2008 р. о 13.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.600.01. при Харківському національному медичному університеті за адресою: (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Харківського національного медичного університету (61022, м. Харків, пр. Леніна, 4).

Автореферат розісланий «25» листопада 2008 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, професор В.В. Лазуренко

АНОТАЦІЯ

Плітень О.М. Диференційна діагностика епітеліальних дисплазій шийки матки та інтраепітеліальної карциноми. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.02 - патологічна анатомія. Харківський національний медичний університет МОЗ України, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню морфо-функціонального стану багатошарового плоского епітелію шийки матки, його базальної мембрани, строми при дисплазіях різного ступеня тяжкості, інтраепітеліальній карциномі та інвазивному раку для удосконалення патоморфологічної диференціальної діагностики даних станів.

У нашому дослідженні виявлено закономірні зміни в багатошаровому плоскому епітелії, базальної мембрани і стромі шийки матки залежно від стадії канцерогенезу. Установлено, що збільшення морфометричних параметрів багатошарового плоского епітелію шийки матки з посиленням морфо-функціональної і проліферативної активності епітеліоцитів та інтенсифікацією процесів масової клітинної загибелі шляхом апоптозу прямо пропорційні ступеню збільшення тяжкості канцерогенезу.

Залежно від стадії канцерогенезу визначені зміни, які відбуваються в базальній мембрані і стромально-судинному компоненті: виразність базальної мембрани і строми, наявність інфільтрації, присутність певних видів колагену, деякі ознаки новоутворення судин.

Виявлений взаємозв'язок між ступенем канцерогенезу шийки матки і рівнем експресії імуногістохімічних маркерів біологічних властивостей крові - Ki-67 (показник проліферативного потенціалу) і p16^INK4a (індикатор злоякісної трансформації клітин).

У результаті проведеного комплексного дослідження виділено найбільш істотні показники, які можуть служити патоморфологічними критеріями диференціальної діагностики епітеліальних дисплазій шийки матки, інтраепітеліальної карциноми та інвазивного раку.

Ключові слова: шийка матки, плоскоклітинні інтраепітеліальні ураження, епітеліальні дисплазії, інтраепітеліальна карцинома, рак.

АНОТАЦИЯ

Плитень О.Н. Дифференциальная диагностика эпителиальных дисплазий шейки матки и интраэпителиальной карциномы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.02 - патологическая анатомия. Харьковский национальный медицинский университет МЗ Украины, Харьков, 2008.

Диссертация посвящена изучению морфо-функционального состояния многослойного плоского эпителия шейки матки, его базальной мембраны, стромы при дисплазиях различной степени тяжести, интраэпителиальной карциноме и инвазивном раке для усовершенствования патоморфологической дифференциальной диагностики данных состояний.

Исследовано 110 образцов ткани шейки матки с неизмененным многослойным плоским эпителием, с различными степенями тяжести эпителиальной дисплазии, интраэпителиальной карциномой и инвазивным раком. Проведен ретроспективный анализ частоты встречаемости и факторов риска развития плоско клеточных интраэпителиальных поражений и рака шейки матки на основе изучения архивного биоптического и операционного материала, в процессе которого было выявлено 182 случая дисплазий, интраэпителиальной карциномы и инвазивного рака.

Морфологическое исследование включало в себя комплекс гистологических (гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизон), гистохимических (методы Браше, Фельгена-Россенбека, по Маллори, ШИК-реакция, импрегнация азотнокислым серебром), иммуноморфологических (моноклональные антитела к CD₉₅, эндотелину-1, коллагенам I, III, IV типов, белку пролиферации Ki-67, онкопротеину p16^INK4a), морфометрического и цитофотометрического методов.

В препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, производили комплекс морфометрических исследований с измерением толщины эпителиального пласта, толщины слоя базальноклеточной гиперплазии, а также проводили цито- и кариометрию. В препаратах, окрашенных азотнокислым серебром изучали аргирофильные белки, ассоциированные с областью ядрышковых организаторов, для чего проводили подсчет, образующихся гранул. В каждом случае определялось среднее количество гранул серебра на 1 ядро. Кроме того, определяли процентное соотношение клеток с высоким (5 и более) содержанием гранул серебра.

Методом Браше оценивали содержания РНП в цитоплазме эпителиоцитов. Методом Фельгена-Россенбека определяли содержание ДНП в ядрах. Цитофотометрическим методом определяли оптическую плотность содержания РНП и ДНП в зеленой части спектра на срезах, обработанных данными гистохимическими методами. На препаратах, окрашенных методом Фельгена-Россенбека во всех исследуемых случаях также проводилась плоидометрия.

Апоптоз определяли с МКАТ к CD₉₅, а эндотелин-1-продуцирующие клетки выявлялись МКАТ к эндотелину-1 (Novocastra Laboratories Ltd. UK). Коллагены типировали МКАТ к коллагенам I, III, 1V типов. Экспрессию белка пролиферации Ki-67 и онкопротеина p16^INK4a изучали путем определения типа и интенсивности окрашивания, удельного веса клеток с положительной реакцией и оптической плотности содержания данных белков.

В нашем исследования выявлены закономерные изменения в многослойном плоском эпителии, базальной мембраны и строме шейки матки в зависимости от стадии канцерогенеза. Установлено, что увеличение морфометрических параметров многослойного плоского эпителия шейки матки с усилением морфо-функциональной и пролиферативной активности эпителиоцитов и интенсификацией процессов массовой клеточной гибели путем апоптоза прямо пропорциональны степени утяжеления канцерогенеза.

Определены в зависимости от стадии канцерогенеза изменения, происходящие в базальной мембране и стромально-сосудистом компоненте: выраженность базальной мембраны и стромы, наличие инфильтрации, присутствие определенных видов коллагенов, некоторые признаки новообразованности сосудов.

Выявлена взаимосвязь между степенью канцерогенеза шейки матки и уровнем экспрессии иммуногистохимических маркеров биологических свойств крови - Ki-67 (показателя пролиферативного потенциала) и p16^INK4a (индикатора злокачественной трансформации клеток).

В результате проведенного комплексного исследования выделены наиболее существенные показатели, которые могут служить патоморфологическими критерии дифференциальной диагностики эпителиальных дисплазий шейки матки, интраэпителиальной карциномы и инвазивного рака.

Ключевые слова: шейка матки, плоскоклеточные интраэпителиальные поражения, эпителиальные дисплазии, интраэпителиальная карцинома, рак.

SUMMARY

Pliten O.M. Differential diagnostics of epithelial dysplasia of the cervix uteri and intraepithelial carcinoma. - Manuscript.

Dissertation for scientific degree Candidate of Medicine by specialty - 14.03.02 - pathological anatomy. - Kharkiv National Medical University of MHP of Ukrain, Kharkiv, 2008.

Dissertation is devoted to the study of morphofunctional state of multi-layered plane epithelium of cervix uteri, its basal membrane, stroma in dysplasia of different degree of severity, intraepithelial carcinoma and invasive cancer for the improvement of pathomorphological differential diagnostics of these states.

In our research there have been revealed regular changes in a multi-layered plane epithelium, basal membrane and stroma of cervix uteri depending on the carcinogenesis stages. There have been established that increase of morphometric parameters of multi-layered plane epithelium of cervix uteri with strengthening of morphofunctional and proliferative activity of epithelial cells and intensification of processes of mass cellular death by apoptosis were directly proportional to the degree of carcinogenesis severity.

The changes in basal membrane and stroma-vascular component depending on the stage of carcinogenesis, expressed basal membrane and stroma, presence of infiltration and certain types of collagens, some signs of vascular neoplasms were determined.

Interrelation between the degree of carcinogenesis of cervix uteri and the level of expression of immunohistochemical markers of biological properties of blood - Ki-67 (index of proliferative potential) and p16^INK4a (indicator of malignant transformation) was revealed.

As a result of the complex study there have been defined the most essential indices, which can serve as pathomorphological criteria of differential diagnostics of epithelial dysplasia of cervix uteri, intraepithelial carcinoma and invasive cancer.

Key words: cervix uteri, squamous intraepithelial lesions, epithelial dysplasia, intraepithelial carcinoma, cancer.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Щорічно за даними ВООЗ виявляється близько 500 000 нових випадків раку шийки матки (РШМ), який посідає друге місце за поширеністю серед усіх онкологічних захворювань у світі та перше місце в структурі жіночої онкологічної захворюваності і смертності в країнах, що розвиваються. Це важлива медична й соціальна проблема в усіх економічно розвинених країнах. У складній і розгалуженій проблемі РШМ ключове положення мають три основні напрями: 1) патогенетичне обґрунтування методів профілактики, 2) рання діагностика, 3) удосконалення методів лікування дисплазії (CIN) і преінвазивного раку (CIS) для попередження інвазивного раку. Ці три напрями повинні привести до розв'язання важкої, але реальної задачі - звести до мінімуму захворюваність і смертність від РШМ (Г.Г. Автандилов с соавт., 2004).

У зв'язку із цим підвищуються вимоги до достовірності патологоанатомічних висновків при диференціальній діагностиці доброякісних і злоякісних новоутворень ШМ. Особлива увага приділяється ранній діагностиці початкових пухлинних змін у ШМ з можливо раннім виявленням пограничних (передракових) станів та раннього раку, що необхідно для вибору об'єму операції (Л.В. Гундорова с соавт., 2003).

У ряді випадків важко домогтися одноманітності в оцінці передракових змін і ступеня диференціювання злоякісної пухлини різними фахівцями. Діагностична робота висококваліфікованих патоморфологів виявила різні трактування одних і тих же препаратів з гістологічними картинами дисплазій різного ступеня тяжкості, а також виразності стадій розвитку злоякісних пухлин. Методи морфологічної діагностики, що застосовуються при дослідженні біоптатів ШМ, продовжують ґрунтуватися на описі мікроскопічних змін епітелію, де існує багато суб'єктивізму, що знижує точність діагностики і можливість одноманітного трактування спостережуваних процесів. Це перш за все стосується діагностики важких форм CIN і CIS, а також оцінки початкових ознак інвазії (Г.Г. Автандилов, 2001; Л.В. Гундорова с соавт., 2003).

У зв'язку з вищевикладеним питання профілактики РШМ і ранньої діагностики початкових стадій канцерогенезу як і раніше залишаються найважливішою медичною і соціальною проблемою, що потребує подальшого вдосконалення морфологічних методів дослідження (Г.Г. Автандилов, 2004; М.Г. Рыбакова с соавт., 2003; И.А. Яковлева с соавт., 1981). Визначення ступеня диференціювання новоутворення дуже варіює серед патоморфологів і ці труднощі, що виникають при практичному застосуванні існуючих класифікацій, вимагають створення більш точних методів дослідження і систем для об'єктивної діагностики стадій розвитку пухлин (Г.Г. Автандилов, К.Б. Саниев, 2002). Зростаючі вимоги до точності діагностики стадій канцерогенезу в ШМ пов'язані з новими можливостями лікування онкологічних захворювань (Л.В. Гундорова с соавт., 2003).

Таким чином, обрана тема актуальна, бо в сучасній патоморфології та онкології вона залишається відкритою.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Представлена робота є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Харківського національного медичного університету «Розробка і впровадження ефективних методів і засобів профілактики, діагностики і лікування найважливіших захворювань і травм» (номер державної реєстрації 0101U001900). Автором виконано фрагмент роботи, у якому досліджується морфо-функціональна і проліферативна активність епітеліоцитів багатошарового плоского епітелію ШМ, ступінь виразності онкогенної трансформації, стан базальної мембрани та строми при CIN різного ступеня тяжкості, CIS та інвазивному плоскоклітинному раку (invCa).

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи є покращення діагностики патологічних станів ШМ (CIN різного ступеня тяжкості та CIS) з подальшою розробкою критеріїв для їх диференціальної діагностики.

Для досягнення вказаної мети передбачається вирішити наступні завдання:

1. Провести ретроспективний аналіз частоти зустрічальності і факторів ризику розвитку плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ, їх вікової характеристики і поєднання з фоновими гіперпластичними процесами, а також провести аналіз клінічних даних досліджуваних груп залежно від стадій канцерогенезу в ШМ.

2. Вивчити морфо-функціональний стан багатошарового плоского епітелію ШМ, його базальної мембрани, строми при дисплазіях різного ступеня тяжкості, CIS та invCa.

3. Вивчити проліферативну активність епітеліальних клітин при передпухлинних і пухлинних процесах епітелію ШМ.

4. Вивчити ступінь виразності онкогенної трансформації при передпухлинних і пухлинних процесах епітелію ШМ.

5. Розробити патоморфологічні критерії диференціальної діагностики CIN різного ступеня тяжкості, CIS та invCa.

Об'єктом дослідження є плоскоклітинні інтраепітеліальні ураження та інвазивний рак ШМ.

Предметом дослідження є морфологічні й імуногістохімічні (ІГХ) особливості незміненого багатошарового плоского епітелію ШМ, епітелію ШМ при CIN різного ступеня тяжкості, CIS та invCa.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети та вирішення завдань використано гістологічний, гістохімічний, цитофотометричний, імуноморфологічний, морфометричний та статистичний методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Уперше на матеріалі біопсій ШМ в результаті комплексного дослідження із застосуванням гістологічного, гістохімічного, цитофотометричного, імуноморфологічного, морфометричного і статистичного методів виявлені закономірні зміни в багатошаровому плоскому епітелії, базальній мембрані і стромі ШМ залежно від стадії канцерогенезу.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Дана робота ґрунтується на результатах комплексного морфологічного дослідження 110 зразків тканини ШМ з незміненим багатошаровим плоским епітелієм, з різними ступенями тяжкості епітеліальної дисплазії, CIS та invCa, отриманих при діагностичній біопсії і при хірургічних втручаннях, проведених у Харківській обласній клінічній лікарні за період 2004-2007р.р. У роботу також уключений ретроспективний аналіз частоти зустрічальності і факторів ризику розвитку плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ і РШМ, проведений на основі вивчення архівного біоптичного й операційного матеріалу патологоанатомічного відділення тієї ж лікувальної установи за період 2001-2005р.р., у процесі якого було виявлено 182 випадки дисплазій, CIS і РШМ.

Весь матеріал був розділений на 6 досліджуваних груп. I-у групу - незмінений багатошаровий плоский епітелій (НБПЕ ШМ) - представлено 20 зразками тканини ШМ з нормальною будовою епітелію, II-у - 16 зразками тканини ШМ з цервікальною інтраепітеліальною неоплазією I ступеня тяжкості (CIN I), III-ю - 15 зразками тканини ШМ з CIN II, IV-у - 17 зразками тканини ШМ з CIN III - важка дисплазія, V-у - 18 зразками тканини ШМ з CIN III - преінвазивна карцинома (CIS), VI-у групу представлено 24 зразками тканини ШМ з інвазивним плоскоклітинним раком (invCa).

Для діагностики уражень ШМ використовували критерії Гістологічної класифікації пухлин жіночої статевої системи, 2-а редакція (1994), у якій диспластичні зміни різних ступенів тяжкості і преінвазивна карцинома ШМ, відносно яких використовуються терміни цервікальна інтраепітеліальна неоплазія (CIN), плоскоклітинні інтраепітеліальні ураження (SIL), підрозділяють на слабкий (CIN I), помірний (CIN II) і важкий (CIN III) ступені. Останній включає і рак in situ (преінвазивна карцинома).

Матеріал фіксували в 10% розчині забуференого нейтрального формаліну, потім піддавали стандартній парафіновій проводці. З виготовлених таким чином блоків робили серійні зрізи завтовшки 4-5Ч10^-6м.

Морфологічна обробка включала комплекс гістологічних, гістохімічних, ІГХ і морфометричних методів. Препарати забарвлювали гематоксиліном та еозином, а також пікрофуксином за методом ван Гізон та за методом Малорі для виявлення колагенових волокон.

У препаратах, забарвлених азотнокислим сріблом вивчали активність аргірофільних білків, що асоціюються з ділянкою ядерцевих організаторів (БДЯОр). PAS-реакцію використовували для виявлення глікогену і з'єднання білка з вуглеводами. Методом Браше оцінювали вміст РНП в цитоплазмі епітеліоцитів з контролем кристалічної рибонуклеази. Методом Фьольгена-Россенбека визначали вміст ДНП в ядрах з контролем реакцією гідролізу з HCl. Цитофотометричним методом визначали оптичну щільність вмісту РНП і ДНП в зеленій частині спектру на зрізах, оброблених даними гістохімічними методами. На препаратах, забарвлених методом Фьольгена-Россенбека, у всіх досліджуваних випадках також проводилася плоїдометрія.

У препаратах, забарвлених гематоксиліном і еозином, проводили комплекс морфометричних досліджень з вимірюванням товщини епітеліального пласта, товщину шару базальноклітинної гіперплазії, а також проводили цито- і каріометрію.

Імуноморфологічне дослідження проводили на парафінових зрізах, завтовшки 5-6мкм непрямим методом Кунса за методикою Brosman (1979). Апоптоз визначали з МКАТ до CD₉₅, а клітини, що продукують ендотелін-1, виявлялися МКАТ до ендотеліну-1 (Novocastra Laboratories Ltd, UK). Колаген типірували МКАТ до колагену I, III, IV типів. У якості люмінесцентної мітки використовували F(ab)-2-мічені фрагменти кролячих антитіл проти імуноглобулінів миші (FITS). Препарати вивчали в люмінесцентному мікроскопі МЛ-2 з використанням світлофільтрів: ФС-1-2, СЗС-24, БС-8-2, УФС-6-3. Інтенсивність світіння визначали на мікрофлюориметрі з ФЕУ-35 і виражали в умовних одиницях, рівних струму, що протікає через вимірювальний прилад, виражених у мікроамперах (АЧ10^-6).

Також проводили ІГХ реакції з МКАТ до білка проліферації Ki-67 (клон MIB-1, DakoCytomation) і до онкопротеїну p16^INK4a (kit для гістологічних препаратів (hystological) №К5334, DakoCytomation). Клітини, позитивні відносно експресії маркерів, вивчали в 4-6 випадково вибраних полях зору. Після підрахунку 300 гістологічно ідентифікованих об'єктів (ядер або клітин), обчислювали показники експресії за результатами всіх вивчених ділянок. Як позитивну вважали реакцію в нормальних клітинах епітеліального шару, а також диспластично і неопластично змінених (О.В. Дорохова, 2007; С.В. Петров, Н.Т. Райхлин, 2004; T. Sano et al., 1998).

Комплекс гістологічних, морфометричних, стереометричних і цитофотометричних досліджень проводився на мікроскопі Olympus BX-41 з використанням програм Olympus DP-Soft (Version 3:1) і Microsoft Excel (С.Н. Лапач с соавт., 2001).

Весь цифровий масив даних оброблявся методами математичної статистики з використанням варіаційного, альтернативного і кореляційного аналізів. При використанні методів альтернативної і варіаційної статистики обчислювали середню арифметичну, середнє квадратичне відхилення, середню помилку різниці, імовірність різниці. Імовірність різниці між двома середніми при малих вибірках визначали за таблицею Ст'юдента з дотриманням умови (n1+n2-2). При визначенні ступеня ймовірності припускали точність р?0,05. Оцінку взаємозв'язків окремих параметрів у досліджуваних групах проводили методом кореляційного аналізу (Г.Ф. Лакин, 1990; В.И. Сергиенко, И.Б. Бондарева, 2000).

Результати дослідження та їх обговорення. При аналізі розподілу пацієнток з плоскоклітинними інтраепітеліальними ураженнями ШМ за віком виявлено, що пік захворюваності припадає на вік 50-59 років, за яким за частотою зустрічальності плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ іде група 40-49 років. Вікові групи 40-49 і 50-59 років - це групи, де найчастіше зустрічаються поліпи ШМ і ще достатньо велика кількість ендоцервікозів, а також найчастіше зустрічаються проліферативні процеси міометрію та ендометрію, що, можливо, пов'язано з гормональними змінами в організмі жінок, які обумовлені періодами клімаксу і менопаузи.

Середній вік пацієнток з передраковими процесами та CIS складає 45,5±3,6 років, а саме: CIN I - 44,1±5,7 роки, CIN II - 47,5±6,4 років, CIN III - 43,4±6,8 роки, CIN III з осередками CIS та ізольованою CIS - 47,1±7,6 років. InvCa найчастіше спостерігається в групі 40-49 років, але середній вік пацієнток складає 52,8±6,6 роки, що досягається за рахунок також достатньо високої частоти зустрічальності в наступних вікових категоріях.

З фонових процесів перше місце за ризиком виникнення плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ посідає ендоцервікоз з епідермізацією, що найчастіше зустрічається у віці 20-29 років і майже рівномірно зменшується у міру збільшення віку, друге місце - поліпи ШМ з явищами епідермізації, які найчастіше зустрічаються в групах 40-49 і 50-59 років.

У міру розвитку диспластичних станів методом морфометрії установлено збільшення середніх значень товщини епітеліального пласта, товщини шару анапластичних змін і, відповідно, співвідношення товщини епітеліального пласта і його нижніх шарів, а також діаметру й об'єму ядер і клітин вищеназваних шарів у міру збільшення тяжкості стадій канцерогенезу ШМ (табл. 1).

Значно помітним виявилося збільшення середніх значень діаметру й об'єму ядер у групах з помірним і важким ступенями плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ. Разом з тим відзначено, що ці показники при CIS по відношенню до важкої дисплазії і при invCa по відношенню до CIS збільшилися незначно. Відповідно змінам розмірів ядер і клітин у міру збільшення тяжкості ступеня плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ змінюється і об'єм цитоплазми - зменшується, унаслідок чого з тією ж закономірністю збільшується ЯЦІ.

Описане збільшення морфометричних параметрів епітеліоцитів супроводжується збільшенням рівня їх морфо-функціональної активності, що підтверджують дані цитофотометричного дослідження з вимірюванням оптичної щільності ДНП в ядрах і РНП в цитоплазмі клітин (табл. 2).

Проведене порівняльне вивчення активності БДЯОр також виявило активацію ДНП та РНП у міру збільшення ступеня дисплазії, коли середня кількість вмісту гранул срібла в одному ядрі і питома вага клітин, що мають в одному ядрі 5 і більше гранул, зростають, досягаючи максимальних значень при invCa (табл. 3).

Особливо важливо підкреслити той факт, що оптична щільність РНП зростає саме при CIN III, а при invCa є найбільшою. Та ж сама динаміка спостерігається при визначенні середнього вмісту срібла в ядрах, що означає високу функціональну активність ядер та синтез РНП. Важливий не тільки вміст гранул срібла в ядрах клітин, а й питома вага клітин з активними ядерцевими організаторами в ядрах.

Ступінь виразності мітотичної активності в клітинах незміненого багатошарового плоского епітелію, при плоскоклітинних інтраепітеліальних ураженнях ШМ і раку різна, але підлягає тій же закономірності, яка виявлена в описаних вище дослідженнях: найбільш високий мітотичний індекс при invCa, велика кількість мітозів виявляється також в CIS і при CIN III, найменшу мітотичну активність мають клітини незміненого багатошарового плоского епітелію (табл. 4). При цьому співвідношення між кількістю нормальних мітозів і патологічних неоднорідне. Так у незміненому епітелії зустрічаються тільки нормальні мітози. При CIN I разом з нормальними мітозами з'являються патологічні, кількість яких зростає в міру збільшення ступеня плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ, досягаючи високих значень при CIS і максимуму при invCa.

Плоїдометричне дослідження показало, що середній вміст хроматину в ядрі епітеліоцита незміненого багатошарового плоского епітелію ШМ незначний, але вище за норму вже при CIN I, у подальші стадії канцерогенезу вміст генетичного матеріалу збільшується і найбільша його кількість виявляється в ядрах при invCa. Також виявлено, що до цієї закономірності схильні і середня плодоїдність ядер, і показники питомої ваги клітин з поліплоїдними і анеуплоїдними ядрами з відповідним зменшенням кількості клітин з нормальним вмістом хроматину (табл. 5).

Присутність у клітинній популяції пухлин клітин з анеуплоїдними ядрами свідчить про наявність процесів клітинної загибелі в них. Інтенсифікація процесів масової клітинної загибелі підтверджується також даними ІГХ дослідження: при проведенні непрямої реакції Кунса з використанням МКАТ до CD₉₅ виявлено збільшення рівня експресії CD₉₅ і збільшення апоптозного індексу (табл. 6).

Характеризуючи стан базальної мембрани можна відзначити, що в незміненому епітелії і при CIN I-III цілісність її збережена, проте при CIN III вона дещо стоншена. При CIS межа базальної мембрани нечітка, при підозрі на початок інвазії базальна мембрана на місці нечіткості меж епітелію розщеплюється на окремі волокна, які товщають за рахунок набряку і коротшають. Колагенові волокна фрагментуються, стають нерівномірними, розташовуються безладно, кількість їх зменшується. У підозрілій на інвазивний ріст зоні відмічається проліферація фібробластів, які розміщуються під розщепленою базальною мембраною у вигляді валу. На початку інфільтративного росту, коли відзначається проникнення пухлинних клітин у підлягаючу тканину, залишки базальної мембрани зберігаються тим менше, чим глибше розташовуються пухлинні комплекси. Колагенові волокна виявляються все в меншій кількості, вони укорочені, потовщені, безладно розташовані. Кількість фібробластів зменшується, вони вже не утворюють валу навколо пухлинних клітин. Проте лімфоїдно-плазмоцитарна інфільтрація виражена, причому головним чином за рахунок лімфоцитів різного ступеня зрілості. У результаті цього пухлинні клітини знаходяться в безпосередньому зіткненні з лімфоїдно-плазмоцитарним інфільтратом. У той же час навколо ізольованих інвазивних осередків нерідко виявляється нерівномірно сформована базальна мембрана. Однак, коли із цих ізольованих осередків відмічається виникнення нових інвазивних відростків з низько диференційованих клітин, то базальна мембрана в зоні їх проникнення найчастіше не визначається. Зменшення виразності, фрагментація і відсутність базальної мембрани при останніх стадіях канцерогенезу і розвинутому раку пов'язані із зниженням колагенобразуючої функції клітин базального шару плоского епітелію. Проте, як було відмічено раніше, при інвазивному раку іноді виявляється нерівномірно сформована базальна мембрана навколо ізольованих осередків, що говорить про підвищення продукції колагену пухлинними клітинами (О.К. Хмельницкий, 2000).

Зміни, що відбуваються з базальною мембраною і стромою, ми також вивчали за допомогою ІГХ досліджень, визначаючи наявність і співвідношення типів колагену. У базальній мембрані виявлявся колаген IV типу, інтенсивність світіння якого знижується в міру збільшення тяжкості ступеня дисплазії, фрагментоване світіння зустрічається в ділянках, підозрілих на інвазію і відсутнє в зонах інвазивного росту. При ІГХ типіруванні колагену в підлягаючій стромі в групі з незміненим епітелієм і при CIN I-III явно переважав колаген I типу, при CIS його кількість зменшується, а при invCa його вміст украй низький. У стромі, що розвивається, при invCa виявляється й колаген III типу. Даний тип колагену вважається незрілим, тільки що утвореним. Колаген III типу виявлявся також і в стінках судин, особливо у великій кількості в інвазивних пухлинах, що свідчить про новоутврюванність останніх. Одночасно зі сторони ендотеліальної вистілки судин виявлено підвищення інтенсивності світіння в препаратах, оброблених МКАТ до ендотеліну-1 у міру наростання стадії канцерогенезу.

При вивченні показників проліферативного потенціалу за рівнем експресії Ki-67 було встановлено стабільне підвищення середнього значення питомої ваги клітин з позитивною реакцією до даного білка при збільшенні ступеня ураження епітелію ШМ. Особливо істотною і статистично достовірною (p?0,05) була різниця між рівнем експресії Ki-67 в незміненому епітелії ШМ і при CIN I, при CIN I і CIN II і між CIN II і CIN III. У той же час рівень цього показника в групах CIN III, СIS і invCa не мав достовірних відмінностей. Наше дослідження показало, що вищі значення питомої ваги клітин з позитивною реакцією до Ki-67 серед інвазивних плоскоклітинних раків має незроговілий рак, тобто пухлина з нижчим ступенем диференціювання (рис. 1).

Аналіз інтенсивності реакції з Ki-67, яку оцінювали методом цитофотометрії шляхом визначення оптичної щільності (рис. 2), показав: середня оптична щільність у CIN I виявилася нижчою, ніж у багатошаровому плоскому епітелії ШМ, що обумовлено, імовірно, тим, що в розрахунок приймалися клітини із слабше забарвленими ядрами в середньому і поверхневому шарах епітелію, разом з інтенсивніше забарвленими ядрами клітин базального і парабазального шарів. У міру збільшення тяжкості ступеня дисплазії показник середньої оптичної щільності збільшується, досягаючи максимуму при CIN III, проте, відмінність у значеннях між CIN II і CIN III статистично недостовірна. При CIS і invCa в порівнянні з попередніми групами відмічено зниження середнього значення даного показника, що пояснюється швидше за все не зниженням експресії білка Ki-67, а його розподілом у збільшеному в об'ємі ядрі. При цьому різниця значень середньої оптичної щільності між CIS і invCa статистично недостовірна, хоча, якщо враховувати окремі показники незроговілих і зроговілих раків, то в цих випадках різниця достовірна.

При аналізі розподілу Ki-67-позитивних клітин нами виявлено стійке збільшення кількості клітин у середньому і поверхневому відділах епітелію ШМ при прогресії дисплазії від легкого до важкого ступеня, що, імовірно, є відображенням ступеня порушення процесів як проліферації епітеліальних клітин, так і диференціювання, що обумовлено порушенням регуляції клітинного циклу.

Одним з індикаторів злоякісної трансформації клітин плоского епітелію ШМ, уражених вірусом папіломи людини високого ступеня ризику, є накопичення онкопротеїну p16^INK4a. За нашими даними рівень експресії білка p16^INK4a підвищується разом із збільшенням клітинної і тканинної атипії епітелію ШМ (рис. 3). У незміненому багатошаровому плоскому епітелії ШМ ми визначали відсутність реакції з p16^INK4a, тоді як при CIN I виявлялися два варіанти ІГХ реакції - негативний і фокальний. Група CIN II найбільш різноманітна відносно кількості p16^INK4a-позитивних клітин, у якій відмічались усі три можливі варіанти фарбування - негативне, фокальне і дифузне. При CIN III в нашому дослідженні зустрілися фокальний і дифузний тип реакції, при CIS і в незроговілих раках - тільки дифузний, у зроговілих раках - фокальний і дифузний.

Інтенсивність ІГХ реакції з p16^INK4a визначалася шляхом вимірювання оптичної щільності в ядрах і в цитоплазмі (рис. 4). Відмічається зниження показників у групах CIN II і CIN III в порівнянні з попередніми групами, пов'язане, напевне, із збільшення об'єму ядер і цитоплазми, з подальшим достовірним збільшенням у групі CIS, що, можливо, указує на посилення прогресії онкотрансформації. У плоскоклітинних раках відзначалося зниження середніх значень оптичної щільності як в ядрі, так і в цитоплазмі, проте значення даних показників вищі в незроговілих раках, що, разом із зниженням експресії даного маркера в зроговілих плоскоклітинних раках, підтверджує припущення щодо ослаблення інтенсивності ІГХ реакції в клітинах з ознаками посилення ороговіння, що і спостерігається в ракових «перлинах».

Враховуючи певну різнорідність експресії p16^INK4a в досліджуваних групах надається можливість зробити висновок про існування найбільш характерного варіанту ІГХ фарбування для кожного ступеня диспластичних і неопластичних уражень епітелію ШМ, таких як, наприклад, негативне фарбування при CIN I і дифузне для CIN III, CIS і invCa. Останнє, вочевидь, відображає завершеність процесу онкотрансформації, який безпосередньо відбувається на більш ранніх стадіях, ймовірно на етапі CIN II, ураховуючи найбільшу різноманітність експресії маркера онкотрансформації p16^INK4a при дисплазіях помірного ступеня. Іншими словами, CIN II, імовірно, і є тією перехідною зоною, яка відображає оборотність або безповоротність змін, що відбуваються в диспластично зміненому епітелії.

Таким чином, нашим дослідженням установлено, що надмірна експресія Ki-67 і p16^INK4a можуть служити специфічним індикатором гіперпроліферативних і диспластичних станів, пов'язаних з неопластичною трансформацією.

На підставі результатів дослідження ми виділили найбільш істотні показники, які можуть служити критеріями диференціальної діагностики дисплазій різного ступеня тяжкості, CIS і invCa і можуть бути використані в практичній охороні здоров'я з метою підвищення якості патоморфологічного дослідження.

епітеліальний дисплазія матка карцинома

ВИСНОВКИ

У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення і нове рішення науково-практичної задачі, що дозволило виявити взаємозв'язок між характером і ступенем виразності диспластичних і неопластичних процесів епітелію ШМ і морфо-функціональною і проліферативною активністю, рівнем експресії ІГХ маркерів біологічних властивостей тканин і станом базальної мембрани і підлягаючої строми.

1. У результаті ретроспективного аналізу частоти зустрічальності і факторів ризику розвитку плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ та аналізу клінічних даних досліджуваних груп установлено, що перше місце за ризиком виникнення CIN та CIS займає ендоцервікоз з епідермізацією, що найчастіше зустрічається у віковій групі 20-29 років і що майже рівномірно убуває у міру збільшення віку, друге місце - поліпи ШМ з явищами епідермізації, що найчастіше зустрічаються в групі 40-49 і 50-59 років. Пік захворюваності плоскоклітинними інтраепітеліальними ураженнями ШМ і інвазивним плоскоклітинним раком доводиться на вік 50-59 і 40-49 років відповідно, тобто групи, де найчастіше зустрічаються поліпи ШМ і ще достатньо велика кількість ендоцервікозів, а також найчастіше зустрічаються проліферативні процеси міометрію і ендометрію, що побічно вказує на гормональний дисбаланс в організмі жінок, обумовлений періодами клімаксу і менопаузи.

2. У міру збільшення тяжкості стадії канцерогенезу відбувається збільшення морфометричних параметрів багатошарового плоского епітелію, що свідчить про збільшення рівня морфо-функціональної активності епітеліоцитів.

3. Ступінь посилення морфо-функціональної і проліферативної активності епітеліоцитів та інтенсифікація процесів масової клітинної загибелі шляхом апоптозу прямо пропорційний ступеню збільшення тяжкості стадії канцерогенезу.

4. У міру збільшення тяжкості стадії канцерогенезу відбуваються зміни в стромально-судинному компоненті і в базальній мембрані. При початку інфільтративного росту, кількість колагенових волокон зменшується, відмічається їх розпад, виражена лімфоїдно-плазмоцитарна інфільтрація, спостерігається новоутворення судин в інвазивній пухлині. ІГХ типірування колагену показало, що при CIN I-III в стромі переважає колаген I типу, при CIS його кількість зменшується, а при invCa його вміст украй низький. У стромі, що розвивається, при invCa виявляється і колаген III типу, який також виявляється і в стінках судин, особливо у великій кількості в інвазивних пухлинах, що свідчить про новоутворення останніх. Базальна мембрана - додатковий критерій у диференціальній діагностиці стадій канцерогенезу: із збільшенням ступеня дисплазії вона стоншується, її розщеплювання і фрагментація свідчать про початок інвазії. Інтенсивність світіння колагену IV типу, що виявляється в базальній мембрані, знижується в міру збільшення тяжкості ступеня дисплазії, фрагментоване світіння зустрічається в ділянках, підозрілих на інвазію і відсутнє в зонах інвазивного росту.

5. Експресія білка Ki-67 збільшується з наростанням ступеня диспластичних уражень епітелію ШМ і досягає максимуму при інвазивному плоскоклітинному РШМ, одночасно з цим змінюється і локалізація Ki-67-позитивних клітин у товщі епітелію: збільшення кількості клітин у середньому і поверхневому відділах епітелію ШМ при прогресії дисплазії. Показник середньої оптичної щільності в міру збільшення тяжкості ступеня дисплазії збільшується, досягаючи максимуму при CIN III, з подальшим зниженням у CIS і invCa.

6. У міру збільшення тяжкості стадії канцерогенезу зростає експресія білка p16^INK4a, що виявляється в збільшенні поширеності фарбування, питомої ваги клітин з позитивною реакцією ІГХ з даним білком і високою інтенсивністю реакції. Позитивна експресія p16^INK4a є специфічним тестом для визначення CIN, CIS, invCa і вірусу папіломи людини високого канцерогенного ризику.

7. На підставі отриманих результатів розроблені патоморфологічні критерії диференціальної діагностики дисплазій різного ступеня тяжкості, CIS і invCa ШМ, що дозволить підвищити якість патоморфологічного дослідження.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. Виявлення фонових процесів ШМ, особливо ендоцервікозів і поліпів з явищами епідермізації, вік жінок, що відноситься до групи ризику, наявність проліферативних процесів у міометрії й ендометрії повинні насторожувати відносно виникнення плоскоклітинних інтраепітеліальних уражень ШМ і РШМ. Необхідне ретельне спостереження з обов'язковим проведенням цитологічного, кольпоцитологічного і кольпоскопічного контролю, а також визначення рівня змісту естрогену і прогестерону.

2. При виявленні диспластичних і неопластичних процесів ШМ для поліпшення гістологічної діагностики необхідно проводити додаткове гістохімічне і ІГХ дослідження з використанням комплексу маркерів для уточнення ступеня диспластичного ураження, у випадках інвазивних пухлин - для визначення ступеня диференціювання, дані яких повинні враховуватися в комплексі всіх показників.

3. З метою підвищення якості патоморфологічного дослідження диспластичних і неопластичних процесів ШМ рекомендовано використання розроблених критеріїв диференціальної діагностики епітеліальних дисплазій ШМ, CIS та invCa.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНІХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Плитень О.Н. Морфометрия в дифференциальной диагностике стадий канцерогенеза в шейке матки / А.Ф. Яковцова, В.Д. Марковский, О.Н. Плитень // Вісник морфології. - 2006. - №12 (2). - С. 206-209 (автором проведені набір зразків тканин шийки матки та гістологічне і морфометричне дослідження).

2. Плитень О.Н. Частота возникновения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / А.Ф. Яковцова, В.Д. Марковский, О.Н. Плитень // Запорожский медицинский журнал. - 2006. - №4. - С. 44-46 (автором проведений статистичний аналіз).

3. Плитень О.Н. Факторы риска развития плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / О.Н. Плитень // Український морфологічний альманах. - 2006. - Том 4, №3. - С. 67-70.

4. Плитень О.Н. Значение аргирофильных белков, ассоциированных с областью ядрышковых организаторов, в дифференциальной диагностике плоскоклеточных интраэпителиальных поражений и рака шейки матки / О.Н. Плитень // Патология. - 2007. - Т. 4, №4. - С. 54-57.

5. Плитень О.Н. риск возникновения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / О.Н. Плитень // Актуальні проблеми геронтології та геріатрії: Мат. наук. конф. молодих вчених, присвяченої пам'яті акад. В.В. Фролькіса. - Київ. - 2006. - С. 150-151.

6. Плитень О.Н. Частота плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / О.Н. Плитень // Медицина третього тисячоліття: Мат. міжвузівської конф. молодих вчених. - Харків. - 2006. -С.33-34.

7. Плитень О.Н. Дифференциально-диагностические критерии стадий канцерогенеза в шейке матки / О.Н. Плитень, Н.В. Гольева // Сучасні досягнення молодих вчених на допомогу практичній медицині: Мат. Всеукр. наук.-практ. конф. - Харків. - 2006. - С.81-82 (автором проведені набір зразків тканин шийки, гістологічне та морфометричне дослідження та визначені діагностичні критерії для диференціальної діагностики стадій канцерогенезу).

8. Плитень О.Н. Активность ядрышковых организаторов как дополнительный критерий дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в шейке матки / О.Н. Плитень // Медицина третього тисячоліття: Мат. міжвузівської конф. молодих вчених. - Харків. - 2007. -С.21-22.

9. Плитень О.Н. Возраст как фактор риска возникновения плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки / О.Н. Плитень // Біологічні основи розвитку патології пізнього віку: Мат. VIII наук. конф. молодих вчених з міжнародною участю, присвяченої пам?яті академіка В.В. Фролькіса. - Київ. - 2007. - С. 111-112.

10. Плитень О.Н. Состояние базальной мембраны эпителия шейки матки как показатель стадий канцерогенеза / О.Н. Плитень // Патологоанатомічна діагностика хвороб людини: здобутки, проблеми, перспективи: Мат. Всеукр. наук.-практ. конф., присвяченої 100-річчю від дня народження проф. Н.М. Шінкермана. - Чернівці. - 2007. - С. 145-147.

СПИСОК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

Размещено на Allbest.ru