Система протеолізу і глікозилювання імуноглобулінів G в патогенезі злоякісних новоутворень (клініко-лабораторне дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Система протеолізу і глікозилювання імуноглобулінів G в патогенезі злоякісних новоутворень (клініко-лабораторне дослідження)

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Онкологічні захворювання займають в структурі смертності населення України друге місце (Федоренко З.П. і спіавт., 2005). Темпи росту захворюваності на рак займають одне з провідних місць серед європейських країн: щорічно в Україні виявляється близько 15-16 тис. нових випадків раку шлунка (РШ) (Федоренко З.П. та ін., 2005). У зв'язку з цим дослідження патогенетичних ланок онкологічної патології стає все більш актуальним. РШ є одним з найбільш поширених злоякісних новоутворень вісцелярних органів. Серед парапротеїнемічних гемобластозів особливу актуальність представляє множинна мієлома (ММ).

Злоякісний ріст клітин супроводжується активацією системи протеолізу крові і тканин та асоціюється з локальною секрецією пухлиною протеолітичних ферментів, в результаті якої в зоні активної інвазії просування пухлини в міжклітинному матриксі стає безперешкодним (Borgono C.A., Diamandis E.P., 2004; Whitbread A.K. et al., 2006). Важливу роль у прогресії пухлини відіграють ферменти, що володіють трипсиноподібною (ТПА) та еластазоподібною активністю (ЕПА) (Garbett E.A., Reed M.W., Brown N.J., 1999; Yoshikawa T. et al., 2006). Ріст активності протеїназ призводить до посилення інгібіторного потенціалу організму, основу якого складають, на думку багатьох авторів, альфа-1-антитрипсин (ААТ) і альфа-2-макроглобулін (АМГ) (Веремеенко К.Н., Кизим А.И., 1964; Веремеенко К.Н., 1983). У пацієнтів з РШ виявлена висока експресія пухлино-асоційованого інгібітору трипсину, збільшення його активності найбільш характерне для ранніх стадій розвитку захворювання, що може служити, на думку ряду авторів, прогностичним чинником (Wiksten J.P. et al., 2005). З одного боку, протеїнази здатні понизити антигенні властивості пухлинних клітин, викликаючи розщеплювання їхніх імуноспецифічних рецепторів, а з іншого боку, процеси протеолізу можуть також торкнутися сироваткових імуноглобулінів, зміна модифікації яких може призвести до падіння їх антигензв'язуючої здатності, а значить, до зниження протипухлинного гуморального імунітету (Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И., 1988).

При розвитку онкологічних захворювань відбувається посилення процесів глікозилювання (Ip C. et al., 2000). Проте залишається недостатньо вивченим внесок вуглеводних компонентів (ВК) в конформацію імуноглобулінів, також неповністю вивчена функція ВК в процесі біосинтезу Ig, їх роль в стійкості імуноглобулінів до дії протеаз. Тому особливий інтерес викликає вивчення змін глікозилювання молекул IgG у хворих на РШ, пошук кореляції рівня манози (Man) - одного з важливих і найбільш поширених моносахаридів ВК імуноглобулінів (Taguchi T. et al., 2003) - з тяжкістю розвитку РШ і із стійкістю молекул IgG до гідролізу протеолітичними ферментами, тим більше що подібних досліджень у доступній нам літературі ми не виявили.

При розвитку парапротеїнемічних гемобластозів також відбуваються зміни ВК імуноглобулінів. Так, на Fab-фрагментах IgG у хворих на ММ виявлені ділянки підвищеного сіаліювання і фукозилювання (Murata K., et al., 2000), більш того рівень сіаліювання IgG розглядається як маркер малігнізації парапротеїнемій (Fleming S. et al., 1998). Проте до теперішнього часу немає даних про кореляцію ступеня глікозилювання сироваткових парапротеїнів класу G з їх рухливістю в електричному полі та стійкістю до денатурації. Дослідження цих процесів дозволять оцінити внесок вуглеводних структур в характеристику молекул імуноглобулінів - їх заряд, конформаційну стабільність і дозволить якнайповніше розкрити механізми гуморального імунодефіциту, що розвивається у хворих на ММ.

Таким чином, вивчення змін в системі протеолізу та його роль в глікозилюванні IgG сироватки крові дозволить з'ясувати основні механізми зниження протипухлинної активності імунної системи хворих з онкологічними захворюваннями, а також запропонувати методи, що дозволяють оцінити ступінь їх тяжкості.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана в рамках наукової тематики кафедри патологічної фізіології Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського «Розробка підходів для оцінки патогенетичної ролі тканинних протеїназ і їх інгібіторів при системних і локальних патологічних процесах» (номер державної реєстрації 0107U001255). Шифр теми 02/07. Дисертант є співвиконавцем теми.

Мета дослідження: встановити роль системи протеолізу і глікозилювання імуноглобулінів в патогенезі злоякісних новоутворень, експериментально довести взаємозв'язок цих патогенетичних ланок з конформаційними змінами імуноглобулінів, що супроводжуються зменшенням їх стійкості до дії протеолітичних ферментів.

Завдання дослідження:

1. Вивчити активність трипсиноподібних і еластазоподібних протеїназ і активність інгібіторів протеїназ (альфа-1-антитрипсину і альфа-2-макроглобуліну) сироватки крові у первинних хворих на ММ і РШ, встановити їх патогенетичне значення в пухлинному процесі.

2. Розробити на основі даних активності протеолітичних ферментів та їх інгібіторів критерій тяжкості розвитку РШ.

3. Обґрунтувати доцільність застосування і визначити діагностичну значимість лектиноферментного аналізу (ЛФА) в онкологічній практиці.

4. Дослідити особливості глікозилювання імуноглобулінів G та встановити їхнє патогенетичне значення у хворих на ММ і РШ.

5. Вивчити взаємозвязок змін активності протеїназ-інгібіторної системи і глікозилювання імуноглобулінів G з конформаційною стійкістю останніх.

Об'єкт дослідження: хворі з онкологічними захворюваннями, механізми розвитку злоякісних новоутворень.

Предмет дослідження: стан протеїназ-інгібіторної системи, глікозилювання сироваткових імуноглобулінів G, аналіз стійкості імуноглобулінів до денатурації та до дії протеолітичних ферментів.

Методи дослідження: клінічні, біохімічні, електрофоретичні і статистичні.

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна полягає в експериментальному доказі значущості змін активності системи протеолізу і ВК імуноглобулінів класу G в патогенезі РШ і ММ.

Вперше виявлено взаємозв'язок термінальної стадії розвитку РШ (віддаленого метастазування) із зрушеннями активності протеїназ та інгібіторного потенціалу сироватки крові, що дозволило запропонувати спосіб оцінки тяжкості захворювання. Виявлено, що у хворих на РШ, що знаходяться в термінальній стадії захворювання, імуноглобуліни G більш податливі трипсиновому гідролізу, ніж у здорових людей та у пацієнтів без віддалених метастазів.

Вперше за допомогою запропонованої нами нової методики ЛФА проведено дослідження взаємодії лектинів з імуноглобулінами G хворих на РШ, доведено роль антигензв'язуючого фрагмента IgG в зв'язуванні з лектинами.

Встановлено, що гіперглікемія і некроз клітин можуть додавати свій внесок до процесу неспецифічного глікозилювання (НГ) імуноглобулінів. При цьому на прикладі хворих на цукровий діабет (ЦД) і інфаркт міокарда (ІМ) показано, що найбільш глибокі зміни ВК імуноглобулінів відбуваються при поєднанні цих двох процесів.

Показано, що у хворих на РШ відбуваються зміни ВК поліклональних IgG: спостерігається їхнє надмірне глікозилювання, розвиток віддалених метастазів супроводжується посиленням манозилювання. Виявлено, що гіперглікозилювання IgG корелює з падінням їх стійкості до дії трипсину. Доведено, що глікозилювання парапротеїнів хворих на ММ в порівнянні з контрольним поліклональним IgG відрізняється як вищим вмістом цукрів, так і низьким. Вперше виявлена кореляція рухливості парапротеїнів в електричному полі, тобто їх заряду з рівнем манозилювання: виявлено, що ріст вмісту манози супроводжується падінням мобільності парапротеїнів. Виявлено, що при ММ аномальне глікозилювання зачіпає не тільки парапротеїни, але і поліклональну фракцію IgG. Встановлено, що високоглікозильовані парапротеїни в порівнянні з контрольним поліклональним IgG і з парапротеїнами з низьким вмістом цукрів володіли меншою стабільністю до денатурації при проведенні диск-електрофорезу в поліакриламідному гелі (ПААГ) у присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE).

Розкрито принципово новий механізм зниження гуморального імунітету у хворих із злоякісними новоутвореннями: надмірне глікозилювання сироваткових імуноглобулінів G супроводжується падінням їхньої конформаційної стійкості та зниженням стійкості до дії протеїназ. На підставі даних про активність компонентів протеїназ-інгібіторної системи нами запропонований новий індекс, що дозволяє оцінити тяжкість і прогноз перебігу РШ, а саме важливий для клініцистів етап розвитку захворювання - початок віддаленого метастазування.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в ході експериментів дані розширюють уявлення про взаємозв'язок протеїназ сироватки крові та їх інгібіторів з глікозилюванням сироваткових імуноглобулінів G та про їх роль в патогенезі злоякісних новоутворень. Результати досліджень пояснюють причини зниження гуморального імунітету у хворих на РШ і ММ та можуть лягти в основу розробки нових методів патогенетичної корекції у них імунодефіциту. В результаті проведених експериментальних досліджень створена наукова основа для клінічного прогнозування віддаленого метастазування і запропоновані критерії оцінки тяжкості перебігу РШ.

Запропонована нами методика ЛФА може бути застосована в клінічних лабораторіях як спосіб вивчення глибини змін структури олігосахаридних ланцюгів імуноглобулінів і як оцінний критерій тяжкості перебігу захворювання. Обгрунтовані наукові висновки і рекомендації для наукового і практичного застосування одержаних результатів. Пріоритетність вказаних способів підтверджена декларативними патентами України на корисну модель.

Матеріали роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрах патофізіології Кримського державного медичного університету ім. С. І. Георгієвського, Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, Харківського національного медичного університету, Тернопільського державного медичного університету ім. І. Я. Горбачевського, Івано-Франківського державного медичного університету і в Кримському республіканському клінічному онкологічному диспансері.

Особистий внесок здобувача. Описані в роботі дані - результат самостійного виконання дисертантом експериментальних досліджень. Автором самостійно проведений патентно-інформаційний пошук, аналіз актуальності і ступеня вивчення проблеми, визначені напрями досліджень, мета і завдання дисертаційної роботи, проведені огляд і аналіз літератури за темою дисертаційної роботи, визначені методологічні підходи, відпрацьовані моделі проведення експериментальних досліджень, всі методики і дослідження проведені автором особисто. Крім того, автором проведені аналіз, систематизація і статистична обробка результатів дослідження, сформульовані основні положення дисертації. Обгрунтовані наукові висновки і рекомендації для наукового і практичного використання одержаних результатів. Розроблені новий метод ЛФА (патент України на корисну модель №26221 (А61В 5/145) від 10.09.2007 р.) та індекс тяжкості хворих на РШ (патент України на корисну модель №28915 (А61N 5/10) від 25.12.2007 р.).

Апробація результатів дослідження. Дисертаційна робота апробована на спільному засідання кафедр патологічної фізіології, гістології, цитології та ембріології, нормальної фізіології, патологічної анатомії, медицини невідкладних станів з курсом анестезіології та реанімації Кримського державного медичного університету ім. С.І. Георгієвського МОЗ України. Результати дослідження доповідалися на: 2-му з'їзді онкологів країн СНД (Київ, 2000); 6-х читаннях ім. В.В. Підвисоцького, присвячених 150-річчю з дня народження (Одеса, 2007); науково-практичній конференції «Актуальні питання патофізіології» (Ялта, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових праць, з них: 7 - статті в ліцензованих ВАК України журналах і збірках, 3 з яких - моноавторські, 4 - в співавторстві; 3 - тези в матеріалах з'їздів і наукових конференцій. Отримано 2 деклараційні патенти України на корисну модель.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота виконана за загальноприйнятим для наукових робіт планом і складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, розділу власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів, висновків, практичних рекомендацій і списку використаної літератури. Бібліографічний список вміщує 235 найменувань робіт, з них - 73 кирилицею і 162 латиницею. Текст роздрукований на 151 сторінці машинописного тексту, ілюстрований 20 таблицями і 44 рисунками.

Основний зміст роботи

лектиноферментний онкологічний інгібіторний імуноглобулін

Матеріал і методи дослідження. Контрольну групу здорових людей склали 50 осіб - донорів-добровольців з Кримської республіканської станції переливання крові. Для дослідження сироваткової активності протеїназ-інгібіторної системи і стійкості сироваткового IgG до трипсинового гідролізу об'єктом досліджень були вибрані хворі з онкопатологією шлунка, які проходили обстеження і лікування в Кримському республіканському клінічному онкологічному диспансері. В основну групу досліджень були включені 94 первинних хворих на РШ. Після постановки кінцевого діагнозу хворі були розподілені на дві групи. До першої (45 осіб) увійшли пацієнти з РШ, які не мають ознак віддаленого метастазування. Друга група складалася з 49 осіб, до неї ввійшли пацієнти з 4-ою стадією розвитку захворювання з ознаками віддаленого метастазування. У сферу наших досліджень були включені також два пацієнти з рідкісною формою доброякісної пухлини - лейоміомою шлунку, а також п'ять хворих з рецидивами РШ. Наступна серія досліджень включала 60 хворих на ММ, які проходять лікування у відділенні гематології Кримського республіканського клінічного онкологічного диспансеру. Дослідження активності протеїназ-інгібіторної системи проводилося у 20 хворих на ММ; у 40 пацієнтів з ММ (29 хворих з парапротеїном класу IgG і 11 - класу IgA) визначали глікозилювання парапротеїнів і їх поведінку в електричному полі. Для аналізу впливу гіперглікемії і некрозу тканин на глікозилювання IgG були досліджені 10 хворих на ЦД 2-го типу без ознак гострої коронарної патології, п'ять хворих на ІМ з характерним «інфарктним» зубцем Q у поєднанні з ЦД 2 типу (ІМ+ ЦД) і 5 хворих на ІМ без порушень вуглеводного обміну.

Загальну ТПА сироватки крові визначали за швидкістю розщеплювання N-альфа-бензоіл-L-аргініну ефіру (БАЕЕ) (Пасхина Т.С., Доценко В.Л., Блинникова Е.И., 1973). Оцінка ЕПА проводилася за гідролізом субстрату N-бутилоксикарбоніл-L-аланін-n-нітрофенілового ефіру (Оглоблина О.Р. та співав., 1980). Антитриптичну активність сироватки крові вивчали за методом, який грунтується на пригніченні інгібіторами, що містяться в сироватці крові (перш за все, ААТ), активності трипсину, залишкові значення якої вимірювали за розщеплюванням БАЕЕ; активність АМГ знаходили за рівнем розщепленого БАЕЕ трипсином, що зв'язався з АМГ, і подальшою інактивацією трипсину, що не зв'язався з АМГ, соєвим інгібітором трипсину (Нартикова В.Ф., Пасхина Т.С., 1979).

Поліклональні імуноглобуліни G і парапротеїни для аналізу їх глікозилювання отримували методом висолювання та іонообмінної хроматографії на ДЕАЕ-Трісакрілі М (LKB, Швеція) і ДЕАЕ А-50 (Pharmacia, Швеція); клас парапротеїнів і тип їх легких ланцюгів, а також тип білків Бенс-Джонса (Б-Дж) - легких ланцюгів парапротеїнів, що виявляються в сечі хворих на ММ, - визначали методами імуноелектрофорезу і подвійною радіальною імунодифузією за Оухтерлоні (Фримель Р., 1987). Як контроль використовували поліклональний IgG, виділений з суміші сироваток крові п'ятдесятьох здорових людей.

Порівняльна оцінка рухливості парапротеїнів в електричному полі, яка грунтується на аналізі їх молекулярної маси і заряду, проводилася методом диск-електрофорезу в 7,5% ПААГ (PAGE) і в градієнті концентрації ПААГ (3,5-30%) в SDS-PAGE (Гааль Э., Медьеши Р., Верецкеи Л., 1982).

ЛФА, що реєструє ступінь глікозилювання IgG, проводився за допомогою розробленої нами методики (Петросян А.М., Британ А.В., 2006). У дослідженнях переважно застосовувався лектин гороху (Pisum sativum, PSA), що володіє високою спорідненістю до -D-Man і менш вираженою (у 2 рази) - до -D-глюкози (Лобсанов Ю.Д., Плетнев В.З., Мокульский М.А., 1990). Також використовували лектин картоплі (Solanum tuberosum, STA, специфічність до -GlcNAc), лектин арахісу (Arachis hypogaea, PNA, специфічність до -Gal), лектин пшениці (Triticum vulgaris, WGA, специфічність до NeuAc (glcNAc) ₂), і лектин виноградного равлика (Helix pomatia, HPA, специфічність до -GalNAc). Трипсиновий гідроліз проб IgG проводили при співвідношенні фермент: субстрат рівному 1:50 (w/w); тривалість гідролізу при +37С склала 16 годин, після чого реакцію розщеплювання імуноглобулінів припиняли соєвим інгібітором трипсину в співвідношенні трипсин/інгібітор 1:2 (w/w) (Фримель Р., 1987).

Статистична обробка даних проводилася за допомогою пакету програм Microsoft Excel (Windows XP). Дані представлені у вигляді M ± m. Відмінності оцінювалися за критерієм Стьюдента t і вважалися достовірними при р<0,05. Аналіз кореляції між абсолютними параметрами оцінювався за коефіцієнтом лінійної кореляції Пірсона r, кореляція вважалася достовірною при р<0,05 (Лапач З.Н., Чубенко А.В., Бабич П.Н., 2001). Аналіз відносних величин проводився з урахуванням критичних значень коефіцієнтів кореляції рангів Спірмена . Пошук пов'язаності двох різних показників проводився за допомогою критерію узгодженості Пірсона ², а також коефіцієнта пов'язаності Чупрова К і коефіцієнта асоціації Юла Q (Зайцев В.М., Лифляндский В.Р., Маринки В.В., 2003).

Результати власних досліджень та їх обговорення. Наші дослідження щодо активності компонентів системи протеолізу дозволили зробити висновок, що при розвитку РШ відбуваються значні зрушення як з боку системи протеїназ, так і їх інгібіторів. Так, ТПА була понижена у хворих без віддаленого метастазування на 33,3% (p<0,001), у пацієнтів з термінальною стадією - на 32,1% (p<0,001). Істотне падіння (19,6%, p<0,001) сироваткової ЕПА зареєстроване в групі пацієнтів з віддаленими метастазами, в той же час у хворих без віддаленого метастазування даний параметр залишався без істотних змін, рівень його знизився лише на 3,5% (p>0,05).

Аналіз активності інгібіторів протеїназ дозволив виявити достовірне підвищення активності ААТ і у хворих без віддаленого метастазування, і у пацієнтів з термінальною стадією розвитку раку: зростання ААТ склало 82,5% (p<0,001) і 79,3% (p<0,001) відповідно.

Дещо інші результати одержані при дослідженні активності інгібітору протеїназ АМГ. Так, у хворих без віддалених метастазів в порівнянні з групою здорових людей відбулося лише незначне зниження активності сироваткового АМГ (9%, p>0,05), тоді як у хворих з крайньою стадією розвитку захворювання цей показник достовірно знизився - на 29,3% (p<0,001) (мал. 2).

Пошук взаємозв'язку між показниками активності протеїназ та їх інгібіторів дозволив виявити у хворих на РШ негативний кореляційний зв'язок між активністю ААТ і ТПА. Так, загальний коефіцієнт лінійної кореляції r для всіх хворих склав -0,34 (р<0,05), при цьому для першої групи цей показник дорівнював -0,33, для другої - -0,37. У хворих з віддаленими метастазами виявлений негативний кореляційний зв'язок між активністю інгібіторів - ААТ і АМГ: r склав -0,49 (р<0,01).

Для оцінки тяжкості розвитку РШ нами була запропонована величина, що об'єднує три параметри активності протеїназ-інгібіторної системи сироватки крові, - ТПА, АМГ і ААТ. Запропонований нами індекс тяжкості захворювання хворих на рак шлунку (ІТ) вимірюється в абсолютних одиницях (Од) і виражається наступною формулою:

У групі хворих без віддалених метастазів ІТ склав 76,9 ± 1,8 Од, у пацієнтів з віддаленим метастазуванням 82,5 ± 0,9 Од. Виявлена достовірна різниця між групами хворих (p<0,01) дозволяє його використовувати як критерій тяжкості захворювання. Пошук зв'язаності двох показників - віддаленого метастазування і рівня ІТ - підтвердив наявність сильного зв'язку між фактом віддаленого метастазування і умовно прийнятим рівнем ІТ - 77 Од (критерій узгодженості Пірсона ² склав 12,6 при його критичному значенні 10,2 (р<0,001), а коефіцієнт зв'язаності Чупрова К при цьому дорівнював 0,46).

У хворих з рецидивом РШ рівень ЕПА в порівнянні з контролем був понижений на 45% (p<0,01), ТПА - на 33% (p<0,01), ААТ був вищий за контроль на 80% (p<0,001), а АМГ знизився на 59% (p<0,01). При цьому середній ІТ склав 84,6 Од, що наближає цю категорію пацієнтів до групи хворих з віддаленим метастазуванням. Таким чином, запропонований нами ІТ може служити не тільки критерієм прогресії пухлини, але і своєрідним контрольним параметром, що відображає рецидив онкопатології у хворих, котрі перенесли оперативне лікування РШ.

У двох хворих з доброякісною онкопатологією - лейоміомою - рівень ТПА був нижчий за контроль (0,48 мкМ/мл*хвил) і склав 0,17 мкМ/мл*хвил і 0,4 мкМ/мл*хвил відповідно, ЕПА - була підвищена на 12 і 80%, активність ААТ була нижча за контрольні показники (34,8 ІО/мл) і склала 29 ІО/мл і 20,5 ІО/мл, а АМГ при рівні контролю 4,1 ІО/мл була понижена і склала 2,7 ІО/мл і 2,9 ІО/мл відповідно.

У пацієнтів з ММ виявлено в порівнянні з контролем істотне падіння ТПА на 43,7% (p<0,001), ЕПА - на 27% (p<0,001). У цій групі хворих зростання інгібіторів протеїназ сироватки крові відбулося за рахунок ААТ (64,4%, p<0,001), активність АМГ була понижена на 22% (p<0,001).

Для аналізу олігосахаридного складу імуноглобулінів нами була запропонована методика ЛФА, що дозволяє за короткий проміжок часу (3,5 години) визначити ступінь глікозилювання молекул IgG. Ця методика ЛФА скорочує час експерименту в порівнянні з методами інших авторів. У нашій роботі експериментально підтверджено, що ступінь афінності лектинів рослин до Fab-фрагмента IgG більший, ніж до його Fc-фрагмента (p<0,01).

Таким чином, результати ЛФА можуть бути інтерпретовані як результат високоспецифічного зв'язування лектинів з вуглеводними детермінантами імуноглобулінів в області їх антигензв'язуючого фрагмента. Одержані нами дані взаємодії лектинів рослин з білками Б-Дж підтверджують низький рівень їх глікозилювання. Так, наприклад, в одній з серій ЛФА оптична щільність взаємодії лектину гороху з контрольним IgG склала (E₄₀₅) 0,763 ± 0,04, з цілісними парапротеїнами - 0,390 ± 0,03 (p<0,001), з білками Б-Дж - 0,09± 0,03 (p<0,001). Одержані дані дозволяють припустити, що процеси надмірного манозилювання відбуваються в області ділянок важких ланцюгів Fab-фрагментів.

Одним з чинників ризику розвитку РШ є гіперглікемія (Jun J.K., et al., 2006). З одного боку, зростання сироваткового рівня глюкози супроводжується адекватним збільшенням концентрації Man (Pitkanen E., Pitkanen O., Uotila L., 1997; Akazawa S., Metzger B.E., Freinkel N., 1986; Taguchi T. et al., 2003). З іншого боку, розвиток пухлини супроводжується некрозом частини її клітин. Оскільки імуноглобуліни також здатні до неферментативного зв'язування з моносахаридами, ми припустили, що НГ може вносити свій внесок до профілю олігосахаридного ланцюга молекул IgG, зокрема, у вміст Man.

Проте у хворих із злоякісними захворюваннями прослідкувати в динаміці внесок чинників гіперглікемії і некрозу в глікозилювання імуноглобулінів не є можливим: хворих на РШ, як правило, оперують після постановки попереднього діагнозу, а пацієнти з ММ починають курс специфічної і патогенетичної терапії. Саме тому ми використовували ЦД 2-го типу як модель гіперглікемії і ІМ як модель некрозу клітин.

Результати наших досліджень показали, що рівень глікозилювання сироваткових IgG хворих на ЦД не відрізняється від контрольної групи (p>0,05), що означає, що гіперглікемія сама по собі не додає істотного внеску до процесу НГ імуноглобулінів. В той же час у хворих з ІМ в першу добу після інфаркту виявлено надмірне манозилювання IgG (p<0,001), проте через 7 днів даний показник наближається до норми. Аналіз глікозилювання IgG у хворих з поєднаною патологією, ІМ+ЦД, показав, що рівень глікозилювання в порівнянні з контролем був вищий як в перший день після інфаркту (p<0,001), так і через 7 днів після нього (p<0,01). Таким чином, показано, що гіперглікемія може відбитися на рівні НГ тільки в комплексі з некрозом клітин.

Нами вивчений рідкий клінічний випадок ММ з наявністю парапротеїну в плевральному ексудаті. Проведений нами аналіз структури даного білка показав його ідентичність сироватковому моноклональному IgG; схожими виявилися і ВК цих парапротеїнів, зокрема, за вмістом доступних лектину гороху залишків Man. Таким чином, НГ імуноглобулінів є процесом, характерним для сироватки крові.

Виявлено, що у хворих на РШ віддалене метастазування супроводжується падінням стійкості сироваткових IgG до трипсинового гідролізу: коефіцієнт асоціації Юла склав 0,7, що підтверджує у хворих на РШ наявність сильного зв'язку між цими параметрами. В той же час одержані нами результати дозволяють стверджувати, що при РШ відбувається активізація глікозилювання імуноглобулінів G, зокрема, по залишках Man. Прогресія пухлини, її віддалене метастазування, призводять до посилення процесу манозилювання IgG.

Так, в групі хворих без віддалених метастазів рівень манозилювання був вищий за контроль на 42,5% (p<0,001), тоді як у хворих з розвитком віддаленого метастазування цей показник досягав 59,2% (p<0,001) (рівень значущості достовірності відмінностей між групами хворих РШ - (р<0,05). Проведений аналіз стійкості імуноглобулінів до трипсинового гідролізу показав, що найбільш податливі дії трипсину більш манозильовані IgG, у яких ступінь взаємодії з лектином гороху вищий (рис. 4). Так, в середньому в групі високоманозильованих (понад 50% від контролю) імуноглобулінів спостерігалося зниження стійкості до дії трипсину на 45% (p<0,001), в групі середньоманозильованих (понад 25% від контролю) - на 22% (p<0,01).

Результати наших досліджень показали, що у хворих на ММ виявлене різне глікозилювання парапротеїнів класу G: у одній групі кількість вуглеводних детермінант, доступних лектину гороху в ЛФА, більше, ніж в контрольній групі на 54% (p<0,001), в іншій, навпаки, цей показник був понижений на 34% (p<0,001). Доведено, що при ММ відбувається як підвищення глікозилювання парапротеїнів IgG по залишках Man, а також GlcNAc, -Gal, так і зниження по цих моносахаридах (p<0,01).

Нами виявлена взаємозалежність відносної довжини пробігу парапротеїнів l з відносною екстинкцією їх взаємодії з лектином гороху _?E. Коефіцієнт рангової кореляції Спірмена с між l і _?E склав -0,59 (р<0,001). Таким чином, повільними в PAGE виявляються багаті манозою імуноглобуліни, навпаки, слабо манозильовані демонструють велику швидкість руху в електричному полі. Виходячи з того, що в наших дослідженнях саме заряд молекул парапротеїнів був головним чинником, який регулює їх електрофоретичну рухливість, можна вважати, що до анода швидше мігруватимуть більш електронегативні парапротеїни, ізоелектрична точка яких лежить у області «кислих» значень pH. Саме ця група «мобільних» парапротеїнів демонструє слабку взаємодію з лектинами, а група «повільних» молекул, навпаки, володіє великою спорідненістю до лектинів. Отже, можна стверджувати, що падіння заряду (збільшення негативного заряду) молекул патологічних імуноглобулінів супроводжується зниженням їх глікозилювання - зменшенням числа тих вуглеводних детермінант, які доступні молекулам лектинів.

Зіставлення даних по глікозилюванню парапротеїнів і їх деструкції в SDS-PAGE підтверджує гіпотезу про взаємозалежність цих параметрів: коефіцієнт рангової кореляції Спірмена між _?E і Фр (кількість фрагментів деградації) склав -0,57 (p<0,05). Таким чином, зростання вмісту Man в парапротеїнах супроводжується зниженням їх заряду і падінням стійкості до денатурації.

Комплексний підхід до дослідження патогенезу злоякісних новоутворень з урахуванням літературних даних дозволив нам представити схему змін системи протеолізу і глікозилювання імуноглобулінів та їх внесок в патогенез імунодефіциту, що розвивається у хворих на рак (рис. 5). Поява клону пухлинних клітин супроводжується локальним підвищенням активності протеїназ, що беруть участь в розщеплюванні структурних білків міжклітинного матриксу і призводять до появи вільного простору для подальшого росту пухлини. При цьому розвиток пухлини супроводжується підвищенням активності тканинних глікозидаз, які призводять до глікозилювання мембран, - можливо, таким чином пухлинна клітина оберігає себе від зайвої активності власних протеїназ. Як наслідок активності глікозидаз, відбувається глікозилювання тканинних протеїназ, що робить їх більш невразливими до блокуючої дії інгібіторів протеїназ. Підвищення активності глікозидаз призводить до збільшення глікозилювання імуноглобулінів, зокрема, їх антигензв'язуючих центрів. А оскільки розвиток пухлинного процесу супроводжується гіперглікемією і некрозом пухлинної тканини, то свій внесок в ВК молекул IgG вносить і процес НГ. При цьому зростання манозилювання імуноглобулінів асоціюється зі зниженням їхнього негативного заряду. Можливо, це є ще одним механізмом підвищення гуморального імунітету: зниження негативного заряду імуноглобулінів дозволяє їм блокувати негативно заряджені клітини пухлини. З іншого боку, глікозильовані імуноглобуліни виявляються менш стійкими до дії протеїназ, починається незабаром їхня деградація - на зміну загиблим антитілам синтезуються нові, що мають такі ж зміни ВК антигензв'язуючих центрів. Такі IgG в комплексі з пухлинними антигенами чинять ще більш виражений ефект імуносупресії.

Інгібітори протеолітичних ферментів на ранніх етапах розвитку пухлини здатні блокувати активність протеїназ, але надалі їх надлишок призводить до зв'язування найважливіших протеїназ - компонентів гуморального імунітету. А оскільки частина протеїназ після глікозилювання виявляється екранованою вуглеводними детермінантами, покривається своєрідною «вуглеводною парасолькою», тим самим, захищаючись від інгібіторів, то стає зрозумілим, що роль таких з'єднань, як наприклад, ААТ зводиться лише до блокади невеликої частини активних протеїназ. При цьому АМГ, інгібуючи активність протеїназ, також інактивує сироваткові протеїнази - компоненти гуморального імунітету, а його здатність до активації чинників росту пухлинних клітин призводить у результаті до ще агресивнішого росту пухлини.

При віддаленому метастазуванні процеси манозилювання молекул IgG посилюються, а стійкість імуноглобулінів до розщеплювання трипсином стає ще меншою: це є однією з причин глибшого імунодефіциту у хворих на цій стадії розвитку РШ. Прогресія пухлини призводить до кахексії хворих, а це, у свою чергу, підсилює імунодефіцит: синтез нових імуноглобулінів через дефіцит амінокислот може істотно запізнюватися за їх деградацією.

Висновки

У дисертаційній роботі надано теоретичне узагальнення результатів клініко-експериментальних досліджень і запропоновано нове рішення наукового завдання, яке полягає в установленні ролі компонентів системи протеолізу і процесів глікозилювання сироваткових імуноглобулінів G в патогенезі злоякісних новоутворень. Доведено, що зрушення балансу в системі протеїнази-інгібітори та аномальне глікозилювання призводять до змін конформації імуноглобулінів та їх низької стійкості до дії протеїназ, що є однією з причин зниження гуморального імунітету при розвитку злоякісних новоутворень.

1. У сироватці крові первинних хворих на РШ і ММ відбуваються суттєві зміни активності протеїназ-інгібіторної системи - ріст інгібіторного потенціалу та зниження активності протеїназ. Розвиток злоякісного новоутворення та його прогресія супроводжуються достовірним ростом активності ААТ (p<0,001) та суттєвим зниженням ТПА (p<0,001), між цими параметрами виявлено негативний кореляційний зв'язок (r=-0,34, р<0,05). Падіння активності (p<0,001) АМГ і ЕПА виявлено лише у хворих на РШ з розвитком віддаленого метастазування; у цих пацієнтів виявлена негативна кореляція між рівнем активності ААТ і АМГ (r=-0,49, р<0,01).

2. Запропоновано ІТ, який обєднує в математичній формулі показники ААТ, ТПА і АМГ. По даному індексу виявлена достовірна різниця між пацієнтами з РШ без віддалених метастазів і з ними (p<0,01): його рівень менше 77 Од свідчить про відсутність віддаленого метастазування та є сприятливим прогностичним чинником.

3. Розроблена універсальна методика ЛФА, за допомогою якої зареєстровані суттєві зміни ступеня манозилювання сироваткових імуноглобулінів G у хворих на РШ і ММ. Доведено, що найбільшою афінністю до лектинів володіє Fab-фрагмент антитіл. Методом ЛФА проведено дослідження глікозилювання IgG у пацієнтів з рідкими клінічними випадками онкопатології.

4. Установлено, що розвиток РШ супроводжується підвищенням манозилювання молекул IgG (p<0,001), що може служити критерієм тяжкості захворювання. Так, у хворих без віддалених метастазів зростання становило 42,5%, в той час як у пацієнтів з віддаленим метастазуванням - 59,2% (рівень значимості достовірності відмінностей між групами хворих на РШ - р<0,05). Доведено, що при ММ відбувається як підвищення глікозилювання парапротеїнів IgG по залишкам Man, GlcNAc, Gal, так і зниження по цих моносахаридах. Показано, що глікозилювання парапротеинів корелює з їх конформаційними особливостями: зростання вмісту Man в парапротеїнах супроводжується зниженням їх заряду (коефіцієнт рангової кореляції Спірмена с -0,59, р<0,001) і падінням стійкості до денатурації (коефіцієнт рангової кореляції Спірмена с -0,57, p<0,05).

5. Виявлено, що надлишковий рівень Man в сироваткових IgG є однією з причин зниження гуморального імунітету, зокрема, при прогресії пухлини - її віддаленому метастазуванні: ступінь манозилювання імуноглобулінів G має зворотну кореляцію з їхньою стійкістю до протеїназ. При цьому найменш стійкими до розщеплення трипсином були імуноглобуліни з високим вмістом Man (коефіцієнт асоціації Юла становив 0,6).

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Ушаков А.В. Гликозилирование иммуноглобулинов G человека при инфаркте миокарда и сахарном диабете / А.В. Ушаков, А.М. Петросян, К.А. Ефетов // Таврический медико-биологический вестник. - 2005. - Т. 8, №4. - С. 150-159. (Особисто здобувачем зроблено: огляд літературних джерел, проведення імуноферментного аналізу, написання статті).

2. Ильясов Р.К. Обнаружение IgG-парапротеина в плевральном экссудате при множественной миеломе / Р.К. Ильясов, Е.В. Паршкова, А.М. Петросян [и др.] // Онкология. - 2006. - Т. 8, №1. - С. 38 - 42. (Особисто здобувачем зроблено: огляд літературних джерел, проведення імуноферментного аналізу, написання статті).

3. Петросян А.М. Лектиноферментный анализ как метод оценки гликозилирования иммуноглобулинов / А.М. Петросян, А.В. Британ // Украинский биохимический журнал. - 2006. - Т. 78, №4. - С. 125-133. (Особисто здобувачем зроблено: формулювання мети та завдань дослідження, обробка і аналіз одержаних результатів дослідження, проведення лектиноферментного аналізу, формулювання висновків).

4. Петросян А.М. Исследование гликозилирования парапротеинов и анализ их электрофоретической подвижности у больных множественной миеломой / А.М. Петросян // Український медичний часопис. - 2006. - Т. 53, №3. - С. 106 - 111.

5. Петросян А.М. Протеиназ-ингибиторная система в патогенезе и определении тяжести заболевания у больных раком желудка / А.М. Петросян, В.З. Харченко // Онкология. - 2007. - Т. 9, №4. - С. 303-306.

6. Петросян А.М. Гликозилирование иммуноглобулинов G сыворотки крови больных раком желудка и их устойчивость к трипсиновому гидролизу на фоне сывороточной активности протеиназ-ингибиторной системы / А.М. Петросян // Український медичний альманах. - 2007. - Т. 10, №5. - С. 138-142.

7. Petrosyan A.M. Serum IgG-paraproteins glycosylation and activity of proteinases and inhibitors of proteinases in patients with multiple myeloma / A.M. Petrosyan // Таврический медико-биологический вестник. - 2007. - Т. 10, №4. - С. 194-201.

8. Пат. 2007 04768, Україна. МПК А61В 5/145. Спосіб визначення глікозування імуноглобулінів / Петросян А.М. Патент на корисну модель; заявник і патентовласник Крымский державний медичний університет. - №26221; заявл. 27.04.07; опубл. 10.09.07. - Бюл. №14.

9. Пат. 2007 09633, Україна. МПК А61N 5/10. Спосіб прогнозування віддалених метастазів при раку шлунку / Петросян А.М., Харченко В.З. Патент на корисну модель; заявник і патентовласник Крымский державний медичний університет. - №28915; заявл. 27.08.07; опубл. 25.12.07. - Бюл. №21. (Особисто здобувачем зроблено: огляд літературних джерел, вивчення системи протеолізу хворих на рак шлунка, розробка математичної формули - індексу тяжкості).

10. Ефетов К.А., Петросян А.М., Паршкова Е.В. Диагностика парапротеинемических гемобластозов с помощью преципитирующих моноклональных антител // 2 съезд онкологов стран СНГ (Киев, май 2000): Тез. докл. - К., 2000. - С. 1271. (Особисто здобувачем зроблено: огляд літературних джерел, проведення імуноферментного аналізу та написання тез).

11. Петросян А.М., Харченко В.З. Определение активности протеаз и ингибиторного потенциала в сыворотке крови больных раком желудка и множественной миеломой // Проблемы, достижения и перспективы развития медико-биологических наук и практического здравоохранения. В: Тр. Крым. гос. мед. ун-та им. С.И. Георгиевского. Симферополь, 2006. - Т. 142, Ч. 3. - С. 241. (Особисто здобувачем зроблено: огляд літературних джерел, вивчення системи протеолізу хворих на рак шлунка та множинну мієлому).

12. Петросян А.М., Британ-Волченко А.В., Сакун Д.Л., Харченко В.З. Метод оценки тяжести развития онкологического процесса на основе анализа протеаз-ингибиторного потенциала сыворотки крови больных раком желудка // Бюллетень VI читань ім. В.В. Підвисоцького, присвячених до 150-річчя з дня народження. - Одесса, 2007. - 132 с. (Особисто здобувачем зроблено: огляд літературних джерел, вивчення системи протеолізу хворих на рак шлунка, розробка математичної формули - індексу тяжкості).

Размещено на Allbest.ru