Робота виконана на кафедрі біофізики біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник: доктор фізико-математичних наук, професор Прилуцький Юрій Іванович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор кафедри фізики функціональних матеріалів

Офіційні опоненти:Доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу фізики біологічних систем.

Захист відбудеться “10” жовтня 2008 року о 15 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті імені В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, площа Свободи, 4, ауд. 7-4.

З дисертацією можна ознайомитися у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, площа Свободи, 4.

Автореферат розіслано “8” вересня 2008 року.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.

скелетний м'язовий іон міозин

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на Міжнародній конференції “Сучасні проблеми теоретичної фізики” (інститут теоретичної фізики АН України, Київ, 2002 р.), на Міжнародному симпозіумі “Biological Motility” (Пущино, Росія, 2004 р.), на I науковій конференції „Проблеми біологічної і медичної фізики” (Харків, 2004 р.), на IV Всеукраїнській науковій конференції студентів, аспірантів та молодих вчених “Біологічні дослідження молодих вчених в Україні” (КНУ ім. Тараса Шевчека, Київ, 2004 р.) та V International Congress on Mathematical Modeling (Дубна, Росія, 2002 р.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 8 статей у наукових журналах та 4 тези доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 122 сторінках, містить 40 рисунків і складається зі вступу, 5-ти розділів та висновків. Список використаних літературних джерел має 150 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовано актуальність теми дослідження, сформульовано його мету та задачі, які необхідно було розв'язати для її досягнення, визначено наукову новизну та практичну цінність отриманих результатів.

У розділі 1 проведено огляд літератури за темою дослідження. Викладено сучасні уявлення про структуру скелетного м'язу та функціонування його скоротливого апарату, будову саркомеру, молекулярну структуру актинового і міозинового філаментів. Наведені властивості скелетного м'язу та особливості його скорочення за різних умов. Проаналізовані наявні моделі генерації сили м'язового скорочення, їх переваги і недоліки. Розглянуто сучасні уявлення про Са²⁺-залежну регуляцію скорочення скелетного м'язу, зокрема, щодо зв'язку між концентрацією іонів Са²⁺ та силою м'язового скорочення. Описані відомі факти про АТФ-азну активність міозину скелетних м'язів і вплив на неї рівня рН середовища.

У розділі 2 описані експериментальна установка, методика експеримен-тальних вимірювань та об'єкт досліджень. Для реєстрації динамічних параметрів скорочення волокон скелетного м'язу використовували тензометричну установку, що складалася з камери, в якій розміщується досліджуваний препарат, датчиків сили і довжини, двигуна, генератора синхронних імпульсів, охолоджуючого пристрою, терморезистора, осцилографів, комплексу АЦП-ЦАП, комп'ютера, систем оптичних пристроїв для візуального спостереження за експериментом. Cтимуляцію м'язових волокон здійснювали електричними імпульсами прямокутної форми тривалістю 2 мс частотою від 16 до 30 Гц напругою 5-7 В. Дослідження проводили на ізольованих волокнах (поодиноких та пучках) м'язу m.tibialis anterior, виділених із задньої кінцівки жаби трав'яної Rana temporaria.

У розділі 3 запропонована нова модель скорочення скелетного м'язу і на її основі розглянуті динаміка і термодинаміка скорочення, яка базується на таких положеннях:

Молекула міозину в б-спіралізованій стрижньовій ділянці має квазіперіодичну структуру і розглядається як квазіодновимірний кристал з складною елементарною коміркою і періодом, що дорівнює кроку б-спіралі. Збудження б-спіралі генерується за рахунок енергії гідролізу молекули АТФ, має квантовий характер і розглядатєтьсяся як квазічастинка екситон-солітонного типу в наближенні ефективної маси.

Збудження викликає деформаційний відгук б-спіралі, а саме, зміну всіх її характеристик: кроку, радіусу та ефективного числа пептидних груп на виток спіралі. Врахувуючи суттєву суперспіралізованість пептидних ланцюгів, скоро-чення б-спіралі підсилюватиметься її додатковим самозакручуванням. За наявнос-ті зв'язку між головками міозинової молекули і актиновими філаментами, процеси зменшення довжини і деформації б-спіралізованих ділянок молекул міозину приводить до взаємного руху актинових і міозинових філаментів, можливо з їх взаємним накручуванням одне на одне, і, очевидно, до скорочення саркомера.

Робота окремих міозинових молекул товстого філаменту є незалежною, і загальна сила, генерована усім саркомером, є сумою дій усіх наявних одномолекулярних моторів.

Енергія збудження в б-спіральній ділянці молекули міозину визначається як сума енергій E(k) колективних збуджених станів, які відповідають різним значенням хвильового числа k. У довгохвильвому наближенні

,

де імпульс (Е₀ - складова енергії, що не залежить від хвильового числа, h - стала Планка, б - безрозмірний множник, пов'язаний з ефективною масою квазічастинки рівнянням

,

R - відстань між сусідніми взємодіючими пептидними групами, Л - енергія взаємодії між ними. Середні по ансамблю термодинамічні властивості визначаються статистичною сумою по всім можливим станам, які характеризуються значенням хвильового числа k. Статистична сума, віднесена до одного колективного збудження молекули міозину,

( к_Б - постійна Больцмана, Т - абсолютна температура) розрахована в континуальному наближенні в залежності від відносної довжини б-спіралізованих ділянок молекул міозину

,

де l_М - довжина збудженої б-спіралі, l₀ - параметр, який має розмірність довжини. Це дає змогу розрахувати вільну енергію системи і визначити залежність між відносною силою

(),

яку генерує одномолекулярний мотор, і відносною довжиною поліпептида L_М, скориставшись формулою

.

Сила, яка генерується усім саркомером є сумою сил окремих одномолекулярних “моторів”, які є незалежними. Тому загальна сила скорочення всього волокна відрізняється від одномолекулярної лише масштабними множниками. Визначивши масштабні множники для параметрів l₀ і f₀ у відповідності до результатів проведених експериментів з поодинокого скорочення скелетного м'язу, отримаємо рівняння стану всього саркомеру:

(1)

На рис. 1 приведена діаграма стану саркомера, розрахована за формулою (1).

Сила скорочення f, яка визначається виразом (3), є функцією відносної деформації м'язу

:

. (2)

Вважаючи, що зміна об'єму при розтягуванні м'язу за ізобаричних умов є незначною (V0), для зміни внутрішньої енергії (ентальпії) маємо

U() H = - fl + TS, (3)

де ізотермічна зміна ентропії системи може бути оцінена за формулою:

. (4)

На рис. 2 приведена залежність

,

з якої випливає, що значення ентропії зменшується при розтягуванні м'язу і досягає свого мінімального значення у точці _с=0,25. Для зміни внутрішньої енергії ( ентальпії) наближено маємо:

, де . (5)

Розрахована залежність U()/(k_БT) = - приведена на рис. 3. При розтягуванні м'язу зміна ентальпії H<0, тобто система виділяє теплоту. Досліджувана функція має мінімум при ₀=0,9, що відповідає максимально можливому видовженню м'язу 1,9l₀.

Знаючи напруженість м'язу

, (6)

де s - площа поперечного перерізу м'язу, можна оцінити значення його модуля Юнга:

^. (7)

Відомо, що максимальне значення ізометричного напруження для скелетного м'язу жаби (0,1-0,3) МПа , тому E(0,4-1,2) МПа, що відповідає відомим літературним даним.

Для з'ясування залежності сили, згенерованої м'язом, і величини скорочення від температури, аналізу енергетичних параметрів роботи м'язового волокна, а також розрахунку зміни ентропії для скорочення за різних температур, ми експериментально дослідили процеси зміни довжини та сили м'язового волокна m.tibialis anterior жаби трав'яної Rana temporaria за умов фіксованого зовнішнього навантаження та різних температур омиваючого фізіологічного розчину. Препарат стимулювали електричними імпульсами прямокутної форми тривалістю 2 мс з частотою 30 Гц (загальна тривалість 3 с).

На рис. 4 представлена експериментально отримана «f-l-Т» діаграма скорочення м'язового волокна - залежність «сила, генерована м'язом - довжина м'язу» за різних температур.

За цією залежністю чисельно розрахована ізотермічна зміна ентропії системи (рис. 5) дорівнює

. (8)

Запропонована статистична модель була застосована для розгляду динаміки скорочення скелетного м'язу, один кінець якого закріплений, а інший з'єднаний з навантаженням маси М (ізотонічне скорочення). Рівняння руху м'язу має вигляд

, (9)

де f(l) - активна сила скорочення, яка визначається з (1), Q+ q=Q₀ - деяка стала величина пасивної сили, Q - вага навантаження, q - сила власного опору м'язу, яка в нашому наближенні не залежить від довжини саркомеру l. Функцію (1) розкладемо в ряд Тейлора по L до квадратичного члена включно в околі точки експериментального (див. рис.1) максимуму L=1 і отримаємо наближення для активної сили f(l):

. (10)

Підставляючи (10) у (9), отримуємо нелінійне неоднорідне диференціальне рівняння другого порядку відносно функції l(t), яке вдається розв'язати аналітично:

, (11)

де параметр знаходиться з експериментальних вимірювань часу t₀ досягнення м'язом максимальної сили при поодинокому скороченні.

Залежність сили F, що розвиває навантажений м'яз, від часу отримаємо, враховуючи, що :

. (12)

У випадку q << Q маємо:

. (13)

Графіки функцій (11) і (13) для ізотонічного скорочення та напруження м'язу за різних навантаженнь наведені на рис. 6. На ньому проілюстровано важливий факт: ізотонічне скорочення починається у той момент часу, коли напруження відповідно навантаженого м'язу розвиває силу, яка дорівнює величині цього навантаження: для точки А на рис. 6 маємо F(t)=Q₀=0,7f₀ і, відповідно, для точки В F(t)=Q₀=0,4f₀.

Ізотонічне скорочення не відбувається , якщо Q₀=0,8f₀. Максимально можливе напруження, яке може розвивати м'яз, дорівнює . Незважаючи на кількісні розбіжності між теоретичними і експериментальними результатами, які неминучі при застосуванні певних наближень, необхідно відзначити їх якісне співпадіння.

Запропонована модель дозволяє аналітично отримати залежність між швидкістю ізотонічного скорочення v і силою P, яку розвиває мяз за ізотермічних умов - відоме емпіричне рівняння Хілла

, (14)

де v(Р) - швидкість скорочення при навантаженні Р, Р₀ - максимальне значення ізометричної сили, яку може розвити мяз; b - стала, яка має розмірність швидкості; a - стала, яка має розмірність сили. Розрахувавши

,

де - прискорення, та покладаючи =Mg отримуємо рівняння (16), в якому

, (15)

, ,

a q. (16)

Вирази (15) та (16) надають можливість пояснити зміст параметрів а та b рівняння Хілла. Згідно (16) параметр а є силою внутрішнього опору м'яза q. Максимальна можлива сила м'яза визначається співвідношенням Р₀ = 0.8 f₀ = f₀ - q, і . Оцінене значення а співпадає з експериментальним для скелетного м'яза жаби, одержаного раніше Хіллом. Коефіцієнт b(t) суттєво залежить від сили P. Це дозволяє модифікувати класичне рівняння Хілла, врахувавши експериментально встановлений факт відхилення від гіперболічної залежності “сила-швидкість” за великих навантаженнь, коли має місце сповільнення скоро-чення в певній точці “перегину” Р_inf (рис.7). Модифіковане рівняння Хілла має вигляд:

. (17)

Залежність (17) визначається двома параметрами: максимальним значенням ізотонічної швидкості скорочення v_max та ізометричноою силою Р₀, які можна визначити експериментально. На рис. 7 представлені експериментальна і теоретичні залежності “швидкість - сила” для скорочення м'язового волокна жаби в ізометричних умовах.

У розділі 4 розглядаються дві моделі можливого зв'язку між зміною концентрації іонів Са²⁺ і силовим відгуком на цю зміну, побудовані з використанням методів теорії ймовірності та хімічної кінетики.

Стохастична модель. Розгля-даємо два регуляторні Са²⁺-зв'язуючі центри у ТnС скелетного м'язу. Взаємодія двох основних скоротливих білків - актину і міозину - можлива за умови, коли ці два центри зв'язані з іонами Са²⁺. Ймовірність того, що два центри у ТnС зв'яжуться з іонами Са²⁺ може бути виражена так:

W = p², (18)

де p - ймовірність того, що кожен окремо центр незалежно від іншого зв'язаний з іоном Са²⁺. Динаміка функції p(t), яка по суті визначає кінетику сорбції іонів Са²⁺ на регуляторні центри ТnС, визначається рівнянням:

, (19)

де a>0 і b>0 - швидкості десорбції та адсорбції іонів Са²⁺ на ТnС, відповідно.

Розв'язком рівняння (19) з урахуванням початкової умови p(0)=0 є функція:

, (20)

Припускаючи, що сила скорочення м'язу F(t) пропорційна, з одного боку, ймовірності того, що спільна дія двох іонів Са²⁺ на “спусковий гачок” - ТnС - активує скорочення актоміозинового комплексу (вирази (4.1) і (4.3)), а з іншого - ймовірності

q=1-p=,

пов'язаній з можливим відтоком іонів Са²⁺ хоча б з одного центру, внаслідок чого актоміозиновий комплекс не “працює” (сила скорочення дорівнює нулю), можна записати:

(21)

Невідомі кінетичні параметри (F_max - максимальне значення сили скорочення м'язу), a і b визначаються з умови екстремуму функції F(t). На рис. 8 наведені теоретично розраховані за формулою (21) функціональні залежності F(t)/F_max за різних значень кінетичного параметра ? (часу десорбції іонів Са²⁺ на ТnС). Як бачимо, з ростом величини a збільшується значення часу досягнення максимальної сили t_max і криві зміщуються праворуч. За критичного співвідношення b=2a крива максимуму не має, а виходить на плато.

Кінетична модель. Як відомо, безкальцієва ділянка актину та тропоміозину (АТМ) при приєднанні двох іонів переходить у конформа-цію, здатну розвивати зусилля (ACаТСаМ). Цей перехід відбу-вається двома можливими шляхами (рис. 9) через приєд-нання спочатку одного іону кальцію між актином та тропоміозином (АСаТМ) або між тропоніном та міозином (АТСаМ). Диференційні рівняння для величин концентрацій АТМ - , АСаТМ - , АТСаМ- і ACаТСаМ- і густини іонів в точці на відстані x від точки викиду іонів із саркоплазматичног ретикулуму з врахуванням дифузії іонів вздовж волокна ( - коефіцієнт дифузії іонів кальцію уздовж м'язового волокна) мають вигляд:

(22)

Система (22) розв'язана за допомогою програми, написаній для пакету “Mathematica”, припускаючи періодичність усіх невідомих концентрацій по довжині філаменту . Силу, яку розвиває м'яз розрахована як інтегральне зусилля, тобто сума зусиль, що розвиваються у кожній точці філаменту, припускаючи, що локальне зусилля пропорційне густині AСаТСаМ - . Тоді сумарне зусилля буде пропорційне інтегралу від цієї густини . Результати розрахунку за цією формулою як функції часу , наведені на рис. 10.

Як бачимо, при збільшенні константи зростає максимальне значення сили.

У розділі 5 досліджується вплив на АТФазну активність міозина скелетних м'язів рівня рН середовища. Експериментальна крива залежності АТФазної активності міозину від рН наведена на рис. 11. На ній можна бачити два максимуми активності: при рН~6 і ~9,5, які відрізняються між собою за абсолютними значеннями. В області фізіологічних значень рН від 7 до 8 спостерігається широкий мінімум.

Класична схема, яка описує механізм взаємодії ферментативного білка з двома іонами водню Н⁺, призводить до появи єдиного локального максимуму на кривій залежності максимальної швидкості ферментативної реакції від рівня рН. Тому можна припустити, що участь чотирьох іонів водню у такому ферментативному процесі ініціювати-ме появу двох локальних максимумів. У цьому випадку схема, яка віддзеркалює сукупність відповідних реакцій, має такий вигляд:

(23)

де F - ферментативний білок, S та Р - відповідно субстрат та продукт ферментативної реакції; FS - подвійний „комплекс Міхаеліса” „білок - субстрат” ферментативної реакції, FН - подвійний комплекс „білок-іон водню” і FНS - потрійний „комплекс Міхаеліса” „білок-іон водню-субстрат”; K_s - субстратна константа для стадії утворення потрійного комплексу [FН₄]S (ця константа є кількісною мірою спорідненості субстрату S до подвійного комплексу „білок-іон водню”), K_s, K_s, K_s і K_s - субстратні константи для стадій утворення потрійних комплексів , , і з відповідними коефіцієнтами модифікації , , , ; K_а, K_b, K_c і K_d - константи для стадій утворення подвійних комплексів , , і , відповідно, які характеризують спорідненість іонів водню Н⁺ до ферментативного білка F; K_а, K_b, K_c і K_d - константи для стадій утворення потрійних комплексів , , і з відповідними коефіцієнтами модифікації , , , ; k₂, k₂, k₂, k₂ і k₂ - константи розпаду („число обертів”) комплексів , , , і з відповідними коефіцієнтами модифікації , , , , у напрямку необоротного вивільнення продукту Р ферментативної реакції.

Залучення до схеми (23) закону збереження вільної енергії Гіббса, записаного у формі класичного рівняння Вант-Гоффа, закону діючих мас разом із принципом незалежного протікання реакцій, дає змогу отримати вираз для максимальної швидкості ферментативної реакції як функції h=10^-pH у такому вигляді

,(24)

де f₀ - загальна концентрація речовини в реакції (23).

На рис. 12 представлена залежністьвід величини, з якої ми бачимо, що максимальна швидкість ферментативної реакції як функція h може мати три дійсних додатніх локальних екстремуми, а саме єдиний мінімум та два максимуми.

ВИСНОВКИ