Роль рецепторів, які активують проліферацію пероксисом-гамма, в регуляції функцій та апоптозу моноцитів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ДОНЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМ. М. ГОРЬКОГО

УДК 616. 12-008.331.1+616.13-004.6]:615.2

14.03.08 - імунологія та алергологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

РОЛЬ РЕЦЕПТОРІВ, ЯКІ АКТИВУЮТЬ ПРОЛІФЕРАЦІЮ ПЕРОКСІСОМ - ГАММА, В РЕГУЛЯЦІЇ ФУНКЦІЙ ТА АПОПТОЗУ МОНОЦИТІВ

РАСІН

ОЛЕКСІЙ МИХАЙЛОВИЧ

Донецьк

2008



ДИСЕРТАЦІЄЮ Є РУКОПИС

Робота виконана в Центральний науково-дослідній лабораторії (завідувач - проф. І.П. Кайдашев) ВДНЗ "Українська, медична стоматологічна академія" МОЗ України, м.Полтава (ректор - проф. В.М. Ждан).

Науковий керівник:

доктор медичних наук, професор Кайдашев Ігор Петрович, завідувач ЦНДЛ, завідувач кафедри внутрішніх хвороб з доглядом за хворими ВДНЗУ "Українська медична стоматологічна академія".

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Білоглазов Володимир Олексійович , завідувач кафедри внутрішньої медицини №2 (Кримський державний медичноий університет ім. С.І. Георгієвського МОЗ України);

- доктор медичних наук, професор, член-кореспондент НАН України Гольцев Анатолій Миколайович, завідувач відділу кріопатології та імунології (Інститут кріобіології та кріомедицини АМН України

Захист дисертації відбудеться "24" грудня 2008 р. о 11 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д11.600.04 при Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького МОЗ України (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (83003, м.Донецьк, вул. Артема, 106)

Автореферат розісланий "17 " листопада 2008 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат медичних наук, доцент А.М. Колесніков



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гострою проблемою сучасної імунології є регуляція активності клітин імунної системи. Їй присвячені праці провідних імунологів нашої країни. Значні успіхи наявні в з'ясуванні структури та функції рецепторів клітин імунної системи , функції мембран, секреції цитокінів (Г.М. Бутенко, 2007; Н.М. Бережна, 2007; В.О. Білоглазов, 2007; А.М. Гольцев, 2007; Г.М. Драник, 2007, І.П. Кайдашев, 2005; В.А. Малижев, 2007; А.С. Прилуцький, 2007; Б.М. Пухлик, 2007; В.В. Чоп'як, 2007; А.А. Чумак, 2007; К.Ф. Чернушенко, 2007 та інші).

Внутрішньоклітинні молекулярні механізми, які регулюють цю активність, досліджені значно менше. Останнім часом посилена увага приділяється ролі ядерних транскрипційних факторів, особливо так званих "рецепторів, які активують проліферацію пероксисом, PPAR" (Г.М. Драник, І.П. Кайдашев). Виявлено, що клітини імунної системи експресують ці рецептори і вони відіграють значну роль у регуляції їхньої активності, але наявних даних недостатньо.

Особлива увага до PPAR викликана тим, що сучасні дослідження виявили тісний зв'язок між цими рецепторами та найпоширенішими захворюваннями людства (атеросклерозом, артеріальною гіпертензією, цукровим діабетом 2 типу (ЦД2)) та їхньою "передхворобою" - метаболічним синдромом. Обґрунтована гіпотеза пов'язує всі ці процеси з наявністю в організмі людини хронічного запалення із в'ялим перебігом. Ці дані дозволяють вважати зміни в імунній системі провідною ланкою патогенезу згаданих хвороб. Є дані, які вказують на макрофаги жирової тканини як на головні винуватці розвитку цих хвороб (Лутай М.И., 2006). Отже, виникла необхідність дослідження ролі PPAR у регуляції функціонального стану та апоптозу моноцитів/макрофагів.

Макрофаги людини експресують переважно один з трьох ізомерів PPAR - PPAR-гамма [K., Asada, S.Sasaki , T. Suda et al., 2004]. Синтетичні ліганди цих рецепторів - тіазолідінодіони, використовують у лікуванні ЦД2 [Lehmann, J.M., 1995]. Є дані, що статини, які знижують рівень холестерину в крові людини, також впливають на активність PPAR-гамма [Rosen E.D., Fitzgerald M.L., Randow F. et al., 2001]. Тому за допомогою цих фармакологічних агентів можна дослідити роль PPAR-гамма в регуляції функцій та апоптозу моноцитів/макрофагів, а отже, отримати нові дані про участь імунної системи в патогенезі метаболічного синдрому та похідних від нього хвороб.

Відомо, що білки людини мають багато ізомерів внаслідок мутацій генів, що їх кодують. Значення явища генетичного поліморфізму для імунології, імунорегуляції, патофізіології та фармакотерапії потребує досліджень (І.П. Кайдашев, 2006, 2007). PPAR-гамма має досить розповсюджений у європейській популяції поліморфізм, який веде до заміни проліну на аланіни в 12 положенні бокового ланцюжка цього рецептора: так званий поліморфізм "Про12Ала" [Deeb S.S., Fajas L., Nemoto M., 1998]. У науковій літературі практично відсутні дані про розповсюдження в Україні та вплив цього поліморфізму на функціональний стан і апоптоз моноцитів/макрофагів, але є дані про меншу частоту хвороб на ЦД2 в осіб з наявністю алеля 12Ала [Altshuler et al., 2004].

Вивчення ролі ядерних транскрипційних факторів та їх поліморфізму в регуляції активності клітин імунної системи, впливу поліморфізму генів транскрипційних факторів на дію фармакотерапевтичних препаратів має велике значення для розвитку клінічної імунології, імунокорекції та імунореабілітації, а також низки клінічних дисциплін, що обумовило мету нашого дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є самостійним фрагментом планової наукової теми ВДНЗУ "Українська медичнїа стоматологічна академія": "Оптимізація лікування хворих на артеріальну гіпертензію в поєднанні з патологією кардіореспіраторної та ендокринної систем шляхом фармакогенетичних досліджень рецепторів, які активують проліферацію пероксисом, та рецепторів ангіотензину ІІ першого типу", яка виконується за планом МОЗ України. Номер державної регістрації: 0106U003239. Строк виконання - 2004-2007 роки.

Мета дисертації: вивчити в експерименті in vitro вплив агоністів PPARг аторвастатину і розиглітазону на апоптоз і функціональний стан моноцитів/макрофагів крові чоловіків з явищами метаболічного синдрому залежно від поліморфізму гена PPARг Про12 Ала.

Завдання дослідження:

1. Одержати дані про частоту поліморфізму гена PPARг у здорових людей і осіб з явищами метаболічного синдрому в українській популяції і сформувати групи з різними поліморфними варіантами гена PPARг.

2. Вивчити в експерименті in vitro вплив агоністів PPARг розиглітазону і аторвастатину на інтенсивність апоптозу моноцитів/макрофагів крові з різними генетичними варіантами гена PPARг Про12Ала.

3. Вивчити здатність до продукції моноцитами/макрофагами активних форм кисню в осіб з різними генетичними варіантами PPARг і вплив агоністів цих рецепторів: розиглітазону і аторвастатину.

4. Дослідити фагоцитарну активність моноцитів/макрофагів in vitro під впливом агоністів PPARг розиглітазону і аторвастатину.

5. Вивчити вплив in vitro агоністів PPARг розиглітазону і аторвастатину на продукцію моноцитами/макрофагами чинника некрозу пухлин - альфа.

Об'єкт дослідження. Моноцити/макрофаги крові людини з явищами метаболічного синдрому.

Предмет дослідження. Апоптоз і функціональний стан моноцитів/макрофагів крові чоловіків з явищами метаболічного синдрому при дії агоністів PPARг залежно від поліморфізму гена PPARг Про12Ала.

Методи дослідження. Метод полімеразної ланцюгової реакції; морфологічні, НСТ-тест, хемілюмінесцентні, імуноферментні.

Наукова новизна. Уперше одержані дані про розповсюдження поліморфізму гена PPARг Про12Ала в українській популяції. Уперше в Україні знайдені особливості розповсюдження поліморфізму гена PPARг Про12Ала в осіб з метаболічним синдромом. Уперше одержані дані про особливості впливу in vitro агоністів PPARг розиглітазону і аторвастатину на апоптоз моноцитів/макрофагів крові чоловіків із метаболічним синдромом. Уперше досліджено фагоцитарну активність моноцитів/макрофагів крові людей та вплив на неї агоністів PPARг в групах із різними генотипами цього рецептора. Уперше вивчено двома незалежними методами продукцію моноцитами/макрофагами крові активних форм кисню під впливом агоністів PPARг аторвастатину та розиглітазону в осіб із різними генетичними варіантами гена цього рецептора. Уперше досліджено продукцію моноцитами/макрофагами фактора некрозу пухлин - альфа в осіб із різними поліморфними варіантами гена PPARг.

Практичне значення дослідження. Нові дані про вплив поліморфізму і агоністів PPARг на функції моноцитів/макрофагів у осіб із явищами метаболічного синдрому служать розумінню ролі імунної системи в розвитку хронічного запалення, інсулінорезистентності й асоційованих із ними хвороб, що є теоретичним обґрунтуванням застосування глітазонів і статинів при метаболічному синдромі з профілактичною і лікувальною метою з урахуванням генотипних особливостей організму хворого.

Вивчення впливу поліморфізму гена PPARг на активність і апоптоз моноцитів і їхні реакції на агоністи PPARг може бути використано для індивідуалізованого прогнозування можливості розвитку метаболічного синдрому і його ускладнень. Фармакогенетичний підхід до вибору методів регуляції активності МФС може служити основою для профілактичних і лікувальних заходів, що індивідуалізуються, в осіб із чинниками ризику найпоширеніших серцево-судинних, легеневих хвороб і цукрового діабету 2 типу.

Упровадження результатів дослідження. Результати досліджень упроваджені в навчальний процес і наукові дослідження на кафедрах нормальної фізіології та загальної та клінічної фармакології з курсом клінічної імунології ВДНЗУ "Українська медична стоматологічна академія" (акти впровадження від 10.09.2008р.), на кафедрі терапії Вінницького національного медичного університету (акт впровадження від 06.11.08 р.); на кафедрі внутрішніх хвороб Івано-франківського державного медичноого університету (Акт впровадження від 10.11.08р.) 1 міській лікарні м. Полтави (акт впровадження від 11.11.2008 р.).

Особистий внесок здобувача. Автор особисто провів патентно-інформаційний пошук, проаналізував джерела літератури з даної теми, розробив разом з науковим керывником план експерименту, освоїв методи дослідження, провів математичну обробку й аналіз результатів дослідження, сформульовав основні положення, висновки і практичні рекомендації. Авторські права дисертанта захищені патентом України на корисну модель. Частина експериментального матеріалу та деякі теоретичні узагальнення отримані у співпраці з науковим керівником, професором І.П. Кайдашевим та ст. наук. співр. ЦНДЛ ВДНЗУ "УМСА" М.В Микитенко, Л.А. Куценко та М.С. Расіним. Усі співавтори дали згоду на використання спільно отриманих даних у дисертації. Конкретний особистий внесок здобувача в публікацію наукових праць разом із співавторами складає рівномірну частку науково-практичної участі кожного співавтора.

Апробація результатів досліджень. Результати роботи були представлені на таких наукових форумах: "3rd International Symposium "PPARS Efficacy and Safety, From Basic Science to Clinical Applications", Monte Carlo (Monaco), March 19-23, 2005"; Х1 конгресі світової федерації українських лікарських товариств, 28-30 серпня 2006 р.(Полтава); на IX з'їзді Всеукраїнського лікарського товариства, м. Вінниця, 10-12 травня 2007 р.; на IV з'їзді медичних генетиків України, 9-11 жовтня 2008 року, м. Львів; на 2 Республіканському з'їзді ендокринологів України, м. Київ. 15-17 листопада 2008 року, на клінічних конференціях клініки внутрішніх хвороб ВДНЗУ "УМСА", Полтава, 2005, 2006, 2007, 2008 рр.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 праць у рекомендованих ВАК України виданнях. Одержаний патент України на корисну модель.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з переліку умовних скорочень, вступу, огляду літератури, характеристики матеріалу і методів дослідження, чотирьох розділів результатів власних досліджень, аналізу й узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій і списку джерел літератури, який містить 256 найменувань наукових праць. Дисертація надрукована на 139 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 44 таблицями, 7 діаграмами, 3 малюнками.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріал і методи. Матеріалом дослідження служила кров 2 груп чоловіків віком 40-65 років, середній вік - 51±4 року. З них 49 - хворі терапевтичного і пульмонологічного відділень 1 міської клінічної лікарні м. Полтави з явищами метаболічного синдрому. Контрольну групу для вивчення розповсюдження поліморфізму гена PPARг в українській популяції склали 46 чоловіків тієї ж вікової групи (49±3,4 року)

Кров у пацієнтів брали з 8 до 9 години ранку натщесерце з ліктьової вени в сухі пробірки. Суспензію мононуклеарів із цільної крові виділяли за методом І.П. Кайдашева і співавт. (1998). Відповідно до завдань роботи в кожній порції крові досліджували рівень апоптозу моноцитів/макрофагів морфологічним методом із забарвленням барвником Май-Грюнвальда з дофарбуванням за Романовським-Гімзою, а також флуоресцентним барвником "Hoechts 33342". Активність фагоцитозу визначали за поглинанням частинок латексу. Продукцію активного кисню - за НСТ-тестом (утворення гранул формазану при додаванні нітросинього тетразолію) та шляхом визначення люмінолзалежної хемілюмінесценції моноцитів/ макрофагів, активованої зимозаном. Продукцію фактора некрозу пухлин - альфа імуноферментним методом із використанням ліцензованого набору реактивів фірми "Укрмедсервіс", м. Донецьк.

Для цього після стандартизації суспензії з неї відбирали по 100 мкл для кожного дослідження згідно з наведеною нижче схемою (табл. 2.1).



Таблиця 2.1

Схема постановки експерименту in vitro

Назва проби	До інкубації	Після інкубації
		Контроль	Додавання аторвастатину мкмоль/л	Додавання розіглітазону мкмоль/л
		Фіз..р-н	Метанол	ДМСО	0,1	1,0	10	10	30	100
№ проби	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Апоптоз	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Фагоцитоз	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
НСТ-тест	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
Хемілюмінесценція	+	+	+	+	+	+	+	+	+	+
ФНП-а	-	-	+	+	-	+	-	-	+	-

Всього в експерименті in vitro було проведено 1276 досліджень.

Результати дослідження та їх обговорення

Методом ПЦР та подальшим рестрикційним аналізом, ми вивчили розподіл частот генотипів і алелів гена PPARг Про12Ала в групі з 95 осіб чоловічої статі: 49 хворих із явищами метаболічного синдрому і 46 - без ознак МС. В українській популяції ми вперше знайшли значне розповсюдження алеля 12Ала гена PPARг (20,7%) дещо більше, ніж середні показники серед європеоїдів (12-20%) та близьке до показників у чеській популяції. У групі хворих із явищами МС частота 12Ала алеля має тенденцію до нижчих показників, ніж у здорових осіб, що відповідає даним, одержаним у хворих на цукровий діабет 2 типу (ЦД2) в різних популяціях.

Раніше встановлено протективний вплив 12Ала алеля на виникнення ЦД2. Відомо, що розвиток МС і ЦД2 тісно пов'язаний із явищами хронічного запалення і в цих процесах важлива роль належить імунній системі. Проте молекулярний механізм цього явища не з'ясований. Посилено зацікавлює вивчення функціонального стану моноцитів як основних клітин природженого та набутого імунітету в осіб із 12Ала алелем гена PPARг і особливостей їхньої реакції на агоністи цього рецептора. Отримані дані дозволили нам сформувати три групи пацієнтів із генотипами Про12Про, Про12Ала та Ала12Ала для подальших досліджень.

Морфологічним методом ми вивчили апоптоз у вказаних трьох групах моноцитів/макрофагів, одержаних із крові чоловіків із явищами метаболічного синдрому і різними генотипами гена PPARг Про12Ала та вплив аторвастатину та розиглітазону. Аторвастатин, який є агоністом PPARг, в діапазоні застосованих доз стимулює апоптоз моноцитів/макрофагів (в середньому на 37-75%), має дозазалежний ефект, і значніше посилює апоптоз моноцитів у осіб з 12Ала алелем (на 25-100%).

Розиглітазон, який є могутнім специфічним агоністом PPARг, посилює апоптоз моноцитів/макрофагів крові людей на 65-130%. Ступінь цього посилення залежить від концентрації розиглітазону і генотипу М/М. Найпотужнішу дію створює концентрація в 30 мкмоль/л у групі з генотипом Ала12Ала (130%).

Найважливіші зі встановлених в цьому дослідженні фактів - це підвищення інтенсивності апоптозу моноцитів/макрофагів під впливом двох різних за структурою і механізмом дії агоністів PPARг, а також істотні відмінності в інтенсивності цієї дії в осіб із різними генотипами цих рецепторів.

Вищий ефект спостерігався в моноцитів/макрофагів, отриманих від осіб із алелем 12 Ала (на 12-100%).

Функцію утворення моноцитами/макрофагами активного кисню ми вивчали за допомогою двох методик: дослідження тесту з нітросинім тетразолієм (НСТ-тесту) і інтенсивності хемілюмінесценції. .

На діаграмах 4 та 5 представлені отримані нами результати вивчення НСТ-тесту (середнього цитохімічного коефіцієнту, СЦК) при дії розиглітазону та аторвастатину.

Діаграма 1. Вплив розиглітазону на кисень-утворювальну функцію моноцитів/макрофагів.

Примітка: на діаграмах 1 поданий відсоток зниження середнього цитохімічного коефіцієнта при дії розиглітазону в порівнянні з контролем. Групи стовпчиків відображають вплив різних доз препаратів: 1- 10 мкмоль/л., 2 - 30 мкмоль/л, 3 - 100 мкмоль/л., У кожній групі 1 стовпчик - генотип Про12Про, 2 - генотип Про12Ала, 3 - Ала12ала. Зірочками позначені значущі відмінності від групи Про12Про.

Із даних діаграми 1, видно, що розиглітазон знижує цю функцію моноцитів/макрофагів всіх генотипів (на 6-18%). Найбільш виражена дія розиглітазону відносно моноцитів макрофагів, одержаних від осіб з генотипом Ала12Ала за дозою в 30 мкмоль/л (на 18%). Аторвастатин викликає зниження СЦК тільки в малій та середній дозах на 5-14%. У групі з генотипом Про12Ала спостерігалося більше зниження СЦК - на 7- 13% при дії середньої дози аторвастатину. Доза в 10 мкмоль/л не викликала змін (деяке підвищення продукції активного кисню - 6,9%, статистично не значуще).

Аторвастатин знижує хемілюмінесценцію М/М. Це зниження значніше у осіб з генотипом Ала12Ала при дії максимальної дози аторвастатину (на 87%).

Розиглітазон (діагр.2) знижує хемілюмінесценцію у всіх осіб, значніше у таких із наявним алелем 12Ала в середній та великій дозах.

Діаграма 2. Вплив додавання розиглітазону в живильне середовище на інтенсивність хемілюмінесценції М/М.

Примітка: рівень хемілюмінесценції при додаванні розчинника прийнятий за одиницю. Інші позначки ті ж, що і на діаграмі 1.

Загалом, за всіма даними аторвастатин викликає зниження ХЛ моноцитів на 38-87 %. У осіб з 12Ала алелем зниження більше на 15-25%, ніж у осіб із генотипом Про12Про. Розиглітазон викликає зниження ХЛ моноцитів на 38-79%. У осіб із 12Ала алелем це зниження більше, ніж у осіб із генотипом Про12Про, на 10-15%.

Отже, обидва агоністи PPARг знижують продукцію моноцитами/ макрофагами активних форм кисню на 13-20% і 6-14% відповідно, про що свідчать дані НСТ-тесту, і на 38-87% - за даними вивчення хемілюмінесценції. Найбільше зниження продукції активних форм кисню (на 10-25%) спостерігалося в групах М/М із 12Ала алелем.

Ми вивчили активність фагоцитозу за поглинанням моноцитами частинок латексу (індекс фагоцитозу).Отримані дані показані на діаграмі 3.

Дані на діаграмі 3, свідчать про те, що аторвастатин пригнічує активність фагоцитозу. Найбільші зміни наявні в групі Ала12Ала, вони сягають 13-15%.

Отримані нами дані. переконливо демонструють залежність впливу розиглітазону на фагоцитоз М\М від застосованої дози препарату. Малі та середні дози викликають зниження на 7-17%. а великі - або не впливають (у групах з наявністю 12Про алеля), або викликають підвищення індексу фагоцитозу М/М в групі з 12Ала алелем.

Отже, агоністи PPARг можуть мати різноспрямований вплив на фагоцитарну (поглинальну) функцію моноцитів/макрофагів. Аторвастатин знижував цю здатність М/М на 8-15% переважно в осіб з 12Ала алелем (діагр. 3).

Діаграма 3. Вплив аторвастатину на фагоцитоз моноцитів/макрофагів

Примітка: на діаграмі 3 подано відношення показника індексу фагоцитозу (в %) при додаванні аторвастатину до такого в контролі (при додаванні метанолу або ДМСО). Групи стовпчиків: 1- при дії дози аторвастатину 0,1 мкмоль/л, розиглітазону 10 мкмоль/л, 2 - 1 мкмоль/л та 30 мкмоль/л, відповідно, 3 - 10 мкмоль/л та 100 мкмоль/л. У кожній групі перший стовпчик - у групі Про12Про, другий - Про12Ала, третій -Ала12Ала.

Розиглітазон дозою 10 і 30 мкмоль/л знижував цю функцію на 7-12%, а в дозою 100 мкмоль/л підвищував її. Останнє було більш виражено у М/М, одержаних від осіб з алелем 12Ала (на 10-12%).

Ми вивчили секрецію ФНП-а моноцитами/макрофагами, одержаними з крові 20 хворих із явищами метаболічного синдрому. Результати наведені в таблицях 2 - 4.



Таблиця 2

Вплив поліморфізму гена PPARг на секрецію моноцитами/макрофагами ФНП-а, пг/мл

Показник/ група	n	Додавання
		метанолу (контроль)	аторвастатину 1 мкмоль/л	ДМСО (контроль)	розиглітазону 30 мкмоль/л
Про12Про	8	61,8±4,1	56 ± 2,5	62,8± 4,2	36 ± 5,1*
Про12Ала	6	80,1± 4,0	58 ± 3,2*	45 ± 2,5	33 ± 3,1*
Ала12Ала	5	101 ± 15	64 ±10,2*	57 ± 4,2	35 ±5.2*

З даних таблиці 2 виходить, що аторвастатин не знижує секрецію ФНП-а в групі Про12Про (на 9,4 % - статистично не значущо). Розиглітазон набагато значніше знижував секрецію ФНП-а в цієї групи - на 43% ( р<0,05).

У групі Про12Ала спостерігається зниження продукції ФНП-а на 27,5% при дії і аторвастатину, і розиглітазону. У групі Ала12Ала (табл.2 наявне зниження продукції цього цитокіну на 36,7% при дії аторвастатину і на 39 % при дії розиглітазону. В середньому аторвастатин знижує цю функцію на 30%, розиглітазон - на 48%. Наявні дані свідчать про те, що інтенсивність інгибіторної дії різних агоністів PPARг, на секрецію моноцитами/макрофагами ФНП-а суттєво відрізняється. Отже, аторвастатин і розиглітазон знижують продукцію моноцитами/ макрофагами фактора некрозу пухлин - альфа в середньому на 24,5 і 40,5% відповідно. Це зниження більше в М/М, одержаних від осіб із 12Ала алелем, на 12%. Обидва агоністи PPARг однаковою мірою знижують продукцію

ФНП-а в групах М\М із генотипами Про12Ала і Ала12Ала, тобто за наявності 12Ала алеля. Суттєво віждрізняється дія розиглітазону в групі з генотипом Про12Про. При цьому, розиглітазон однаково діє в групах з різними генотипами. Розбіжність складає 14%. Аторвастатин у цій групі не мав дії. Оскільки аторвастатин можна вважати "м'якшим" агоністом PPARг, ці дані можуть свідчити про нижчу чутливість генотипу Про12Про до протизапальної дії PPARг.

Як вказано вище, в якості методичного підхіду до вирішення поставлених у дисертаціїї завдань було вибране дослідження впливу на апоптоз і функції М/М двох різних за структурою і механізмом дії агоністів PPARг розиглітазону і аторвастатину.

Розиглітазон - це синтетичний ліганд-активатор PPARг з класу тіазолідінодіонів. Препарати цієї групи зв'язуються з відповідним доменом рецептора, що викликає зміну третинної структури (конформації) рецептора, відщеплення корепресору і приєднання коактиватору. Активований рецептор з'єднується з іншим ядерним білком - RXR-рецептором, цей димер приєднується до ДНК і управляє транскрипцією багатьох генів. Отже, вивчався вплив агоніста, безпосередньо діючого на PPAR.

Основним результатом досліджень із застосуванням розиглітазону є одержані нами дані про значне підвищення інтенсивності апоптозу моноцитів/макрофагів під його впливом у осіб зі всіма генотипами але більшу у осіб з наявним 12Ала алелем. У доступній літературі ми не знайшли даних про вплив поліморфізму PPARг Про12Ала на проапоптотичну дію тіазолідінодіонів відносно макрофагів, отже, ці дані є новими.

Аторвастатин - це представником групи статинів - інгібіторів 3-гідроксиметилглютарил-КоА-редуктази (3-ГМГ-КоА-редуктази). Основним його ефектом є зниження біосинтезу холестерину. Вивчаючи його вплив на апоптоз М\М, ми встановили, що аторвастатин, як і розиглітазон, посилює їхній апоптоз.

Механізм цього впливу, за деякими даними, може бути пов'язаний із накопиченням проміжних продуктів біосинтезу холестерину внаслідок блокади 3-ГМГ-КоА редуктази.

У діапазоні застосованих доз аторвастатин у середньому збільшував апоптоз М/М на 43-75%, розиглітазон - на 47-87%. Більш виражений ефект цих агоністів спостерігався у М/М, одержаних від осіб із алелем 12Ала (на 12-42% у порівнянні з групою з генотипом Про12Про). Ці дані також є новими.

Враховуючи сучасні уявлення про роль апоптозу у фізіології та патології клітин, можна вважати, що спостережувана нами значна активація апоптозу моноцитів/макрофагів крові при дії агоністів PPARг відображає один з механізмів протизапального ефекту цього ядерного транскрипційного чинника.

Як показали наші дослідження, аторвастатин і розиглітазон знижують продукцію М/М активного (вільнорадикального, атомарного, синглетного) кисню, про що свідчать дані тесту з нітросинім тетразолієм і вивчення інтенсивності хемілюмінесценції. Це також може свідчити про протизапальну активність агоністів PPARг. В групі з 12Ала алелем це зниження було значніше. Ці дані також не відображені у науковій літературі.

У доступній літературі ми не знайшли даних про вплив агоністів PPARг на поглинання частинок латексу.

Отже, ці дані також є новими. Ми вважаєм, що вони, як і відомості про зниження під впливом агоністів PPARг продукції М/М активних форм кисню, є свідченням протизапальної активності PPARг.

Ми встановили, що аторвастатин і розиглітазон знижують продукцію ФНП-а моноцитами/макрофагами практично однаково в групах із 12Ала алелем на 27-39%. У групі Про12Про зниження спостерігалося тільки при дії розиглітазону.

Наші дослідження можуть стати обґрунтуванням застосування агоністів PPARг, зокрема тіазолідінодіонів та статинів, як профілактичних і лікувальних засобів при метаболічному синдромі та асоційованих із ним захворюваннях, спрямованими на зменшення хронічного запального процесу.

За свідченням провідних вчених це є новим аспектом профіліктики та лікування так званих "хвороб цивілізації": атеросклерозу, гіпертонічної хвороби, цукрового діабету 2 типу.

Установлення різного за інтенсивністю, а інколи і за напрямком впливу агоністів PPARг на апоптоз і функції моноцитів/макрофагів від осіб із різними генотипами цього рецептора вказує на важливу роль поліморфізму регуляторних білків у процесах імунітету, імунокорекції та імунореабілітації та необхідність більш ширшого дослідження цих явищ для раціональної фармакотерапії порушень імунних процесів.



ВИСНОВКИ

У дисертації одержані експериментальні дані та зроблені теоретичні узагальнення, які свідчать про активацію апоптозу та пригнічення інших досліджених функцій моноцитів/макрофагів крові людини агоністами ядерних транскрипційних факторів - рецепторів, що активують проліферацію пероксисом-гамма (PPARг), аторвастатином і розиглітазоном, а також вищу функціональну активність 12Ала алеля цих рецепторів. Це свідчить про негативний вплив PPARг на функціональну активність моноцитів крові людини.

1. В українській популяції знайдене значне розповсюдження алеля 12Ала гена PPARг (20,7%), що дещо перевищує середні показники серед європеоїдів (12-20%). У групі хворих з явищами метаболічного синдрому частота 12Ала алеля має тенденцію до нижчих показників, ніж у здорових осіб (-11,9%, р=0,092), що відповідає даним, одержаним у хворих на цукровий діабет 2 типу в різних популяціях.

2. Установлено підвищення інтенсивності апоптозу моноцитів/ макрофагів під впливом двох різних за структурою і механізмом дії агоністів РРARг. У діапазоні застосованих доз аторвастатин у середньому збільшував апоптоз М/М на 37-75%, розиглітазон - на 65-130%. Більш виражений ефект цих агоністів спостерігався у М/М, одержаних від осіб із алелем 12Ала (на 12-100% у порівнянні з групою з генотипом Про12Про).

3. Аторвастатин і розиглітазон знижують продукцію моноцитами /макрофагами активних форм кисню на 5-14% і 6-18%, відповідно, про що свідчать дані НСТ-тесту, і на 38-68% за даними вивчення хемілюмінесценції. Найбільше зниження продукції активних форм кисню (на 10-17%) спостерігалося в групах М/М з 12Ала алелем.

4. Агоністи PPARг мають різноспрямований вплив на фагоцитарну (поглинальну) функцію моноцитів/макрофагів. Аторвастатин знижує цю здатність перважно у осіб з 12 Ала алелем на 8-15%. Розиглітазон дозою 10 і 30 мкмоль/л знижував цю функцію на 7-12%, а дозою 100 мкмоль/л підвищував її. Останнє більш виражено у М/М, одержаних від осіб із алелем 12Ала на 10-12%.

5. Аторвастатин і розиглітазон знижують продукцію моноцитами/ макрофагами фактора некрозу пухлин - альфа в середньому на 24,5 і 40,5% відповідно. Це зниження більше в М/М, одержаних від осіб із 12Ала алелем на 12%. Одержані в нашому дослідженні результати свідчать про імуносупресивну активність PPARг, більше виражену в осіб із 12Ала алелем цих рецепторів, Загалом, вони свідчать про важливу роль імунної системи (зокрема, мононуклеарної фагоцитарної системи) в патогенезі хронічного запалення і велике значення досліджень поліморфізму білків регуляторних систем для теоретичної та клінічної імунології, імунокорекції та імунореабілітації.

Практичні рекомендації. Необхідно продовжити дослідження імуносупресивної дії агоністів PPARг як в експериментах, так і в умовах клініки, як чинників запобігання та лікування хронічного запалення, яке є основою розвитку найпоширеніших хвороб людства. Дані про слабший імуномодулюючий ефект агоністів PPARг у осіб з генотипом Про12Про, який переважає в українській популяції, вказують на необхідність диференційованого дозування цих препаратів в залежності від генотипу пацієнта. Наявність генотипу Про12Про маємо вважати одним із додаткових чинників ризику розвитку метаболічного синдрому і асоційованих із ним хвороб. Подальші дослідження, на наш погляд, мають бути спрямовані на з'ясування механізмів взаємодії PPARг з іншими ядерними транскрипційними чинниками, а також з іншими типами PPAR - альфа і бета/дельта, які також виконують певну роль у регуляції функцій мононуклеарної макрофагальної системи.



СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ

1. Расін А.М. Функціональний стан моноцитів/макрофагів крові чоловіків з метаболічним синдромом та різними генетичними варіантами гена PPARг / Расін А.М. // Проблеми екології та медицини.-2007.-Т.11.-№5-6.-С. 9-14.

2. Расин А.М. Значение полиморфизма гена PPARг в противо- воспалительной активности аторвастатина и розиглитазона /Расин А.М., Кайдашев И.П., Расин М.С. // Імунологія і алергологія.-2007. - №2.- С.16-18.

Особистий внесок автора: збір матеріалу, підготовка та проведення експерименту, статистична обробка та аналіз отриманих даних, аналіз наукової літератури за темою.

3. Кайдашев І.П. Аторвастатин та розиглітазон індукують апоптоз моноцитів/макрофагів крові: роль поліморфізму гена PPARг /Кайдашев І.П., Расін О.М., Микитюк М.В., Расін М.С. // Ліки.-2007.-№3-4.- С.55-61.

Особистий внесок автора: збір матеріалу та підготовка експерименту, статистична обробка та аналіз отриманих даних, аналіз наукової літератури за темою.

4. Кайдашев И.П. Влияние полиморфизма гена PPARг на функциональное состояние моноцитов\макрофагов крови людей /Кайдашев И.П., Расин А.М., Микитюк М.В., Куценко Л.А., Расін М.С. // Імунологія та алергологія.-2007.-№1.-С.27-30.

Особистий внесок автора: збір матеріалу та підготовка експерименту, статистична обробка та аналіз отриманих даних, аналіз наукової літератури за темою.

5. Расин А.М. Пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы и их роль в системном воспалении, атерогенезе, артериальной гитпертензии и хроническом обструктивном заболевании легких (обзор литературы) /Расин А.М., Кайдашев И.П., Расин М.С. // Український терапевтичний журнал.-2006.-№2.-С.100-108.

Особистий внесок автора: збір та аналіз наукової літератури за темою.

6. Расин А.М. Пероксисом пролифератор-активирующие рецепторы: их роль в патологии кровообращения /Расин А.М., Кайдашев И.П., Расин М.С. // Кровообіг і гемостаз. -2006.-№ 1.- С.11-18.

Особистий внесок автора: збір та аналіз наукової літератури за темою.

7. Расін О.М. Молекулярні механізми протизапальної дії глітазонів та статинів: роль PPAR-г / О.М. Расін, І.П. Кайдашев, М.С. Расін// Міжнародний ендокринологічний журнал. -2007.-№6 (12).-С. 71-76.

Особистий внесок автора: збір та аналіз наукової літератури за темою, співставлення літературних та власно отриманих даних.

8. Расин М.С. Рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом: их роль в атерогенезе и развитии артериальной гипертензии /Расин М.С., Кайдашев И.П., Расин А.М. // Український кардіологічний журнал.-2006.-№4.-С. 106-112.

Особистий внесок автора: збір та аналіз наукової літератури за темою.

9. Метаболический синдром у мужчин в возрасте 35-59 лет сельского района Полтавской области и возможности профилактической терапии аторвастатином /Кайдашев И.П., В.Н. Васильев, А.М. Расин [и др.] // Врачебное дело.-2006.-№8.-С.48-50.

Особистий внесок автора: статистична обробка та аналіз отриманих у популяційному дослідженні даних, аналіз наукової літератури за темою.

10. Kaydashev I.P. Frequency of the Pro12Ala gene polymorphism PPARг2 in ukrainian population and its possible role in metabolic syndrome development /Kaydashev I.P., Rasin A.M., Shlykova O.A. // Cytology and Genetics.- 2007.- v. 41.- №r 5.- Р. 43-47.

Особистий внесок автора: статистична обробка та аналіз отриманих у популяційному дослідженні даних, аналіз наукової літератури за темою.

11. Деклараційний патент на корисну модель, 16079 Україна. МПК (2006) А61К 31/00. Спосіб лікування хронічного обструктивного захворювання легень у поєднанні з ішемічною хворобою серця / Кайдашев І.П, Расін М.С., Васильєв В.М., Петрушов А.В., Расін О.М., заявники та власники патенту, заявлений 20.02.2006, отриманий 17.07.2006. Бюл. №7.

Особистий внесок автора: формування мети дослідження, статистична обробка та аналіз отриманих даних, аналіз наукової літератури за темою.



АНОТАЦІЯ

Расін О.М. Роль рецепторів, які активують проліферацію пероксисом-гамма, в регуляції функцій та апоптозу моноцитів. Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.08 - імунологія і алергологія. Донецький національний медичний університет ім. М. Горького. М. Донецьк, 2008.

У дисертації отримані експериментальні дані та зроблені теоретичні узагальнення, що свідчать про важливу роль рецепторів, які активують проліферацію пероксисом-гамма (PPARг), і їхніх агоністів - аторвастатину і розиглітазону, а також про значення поліморфізму цих рецепторів у регуляції активності головних клітин природженого та набутого імунітету - моноцитів/ макрофагів, зокрема про активацію апоптозу і негативний вплив PPARг на функціональну активність моноцитів/макрофагів: зниження продукції активного кисню, поглинальної функції та продукції фактора некрозу пухлин-альфа. Одержані в нашому дослідженні результати свідчать про імуносупресивну активність PPARг, більше виражену в осіб із 12Ала алелем цих рецепторів. Загалом, вони свідчать про важливу роль імунної системи (зокрема, мононуклеарної фагоцитарної системи) в патогенезі хронічного запалення і велике значення досліджень поліморфізму білків регуляторних систем для теоретичної та клінічної імунології, імунокорекції та імунореабілітації. аторвастатин розиглітазон поліморфізм імунітет

Ключові слова: PPARг, моноцити/макрофаги, розиглітазон, аторвастатин, апоптоз, чинник некрозу пухлин - альфа.



АННОТАЦИЯ

Расин А.М. Роль рецепторов, которые активируют пролиферацию пероксисом - гамма, в регуляции функций и апоптоза моноцитов. Рукопись. Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.08 - иммунология и аллергология. Донецкий национальній медицинский университет им. М. Горького. Донецк, 2008 г.

Диссертация посвящена роли рецепторов, активирующих пролиферацию пероксисом-гамма (PPARг), и их агонистов: аторвастатина и розиглитазона, а также значению полиморфизма этих рецепторов в регуляции активности главных клеток врожденного и приобретенного иммунитета - моноцитов/ макрофагов крови людей.

В украинской популяции нами впервые найдено значительное распространение аллеля 12Ала гена PPARг (20,7%), несколько превышающее средние показатели среди европеоидов (12-20%). В группе больных с явлениями МС частота 12Ала аллеля имеет тенденцию к более низким показателям, чем у здоровых лиц, что соответствует данным, полученным у большого числа больных сахарным диабетом 2 типа в различных популяциях.

Наиболее важными из установленных в данном исследовании фактов являются повішение интенсивности апоптоза моноцитов/макрофагов под влиянием двух различных по структуре и механизму действия агонистов PPARг, а также существенные различия в интенсивности этого действия у лиц с различными генотипами этих рецепторов, а именно, более высокий уровень апоптоза у лиц с аллелем 12Ала.

Результаты изучения продукции активного кислорода, полученные обоими методами, свидетельствуют о снижении этой функции под влиянием обоих агонистов PPАRг и более значительный эффект при наличии 12ала аллеля.

Полученные в нашем исследовании результаты свидетельствуют о том, что агонисты PPАRг оказывают преимущественно тормозящее влияние на процесс поглощения моноцитами/макрофагами частиц латекса.

Оба агониста PPARг в одинаковой степени снижают продукцию фактора некроза опухоли-альфа, которую мы изучали иммуноферментными методами, более значительно в группах моноцитов/макрофагов с генотипами Про12Ала и Ала12Ала, то есть при наличии 12Ала аллеля.

Полученные нами данные свидетельствуют о противовоспалительной активности PPARг, более выраженной у М/М, полученных от лиц с 12Ала аллелем, реализующейся, по крайней мере, частично, через подавление провоспалительной активности моноцитов/макрофагов. В целом, они свидетельствуют о важной роли иммунной системы (ее отдела - мононуклеарной фагоцитарной системы) в патогенезе хронического воспаления, регуляторных возможностях агонистов PPARг и значении исследований полиморфизма этого рецептора для профилактики и лечения наиболее распространенных "болезней цивилизации".

Ключевые слова: рецепторы, активирующие пролиферацию пероксисом-гамма, PPARг, моноциты/макрофаги, розиглитазон, аторвастатин, апоптоз, фактор некроза опухолей - альфа.



SUMMARY

Rasin A.M. Role of the peroxysome proliferator-activated receptors-gamma in regulation of apoptosis and functions of monocytes. Dissertation for scientific degree of candidate of medical sciences on specialty 14.03.08 - "Immunology and Allergology". Donezk National Medical University in name of M. Gorki. Manuscript.

In this dissertation we have conducted experiments and summarized data which testifies to the important of nuclear receptors, peroxysome proliferator-activating receptors-gamma (PPARг), and their agonists: Atorvastatine and Rosiglitazone, and polymorphism of these receptors with concern to the activity of main cages of innate and acquired immunity (monocytes/macrophages), specifically with regards to intensification of apoptosis and suppression of production of free residuals of oxygen, phagocytes and TNFб production.

Information got in this research testify to anti-inflammatory activity of PPAR, more expressed at M/M got from persons with 12Аla allele, realized, at least, partly, through suppression of proinflammatory activity of M/M. On the whole, they testify to the important role of the immune system (its department - mononuclear phagocyte system) in chronic inflammation, regulator possibilities of agonists of PPAR and value of researches of polymorphism of this receptor for immunocorrection and immunoreabilitation.

Keywords: peroxysome proliferator-activating receptors- gamma, PPARг, monocytes/macrophages, Rosiglitazone, Atorvastatine, apoptosis, TNFб.



ПЕРЕЛІК УМОВНИХ СКОРОЧЕНЬ

PPARг - рецептори, які активують проліферацію пероксисом,

ЦД2 - цукровий діабет 2 типу;

Про12Ала, Ала12Ала, Про12Про -генотипи поліморфного гена PPARг;

12Ала, 12Про - алелі поліморфного гена PPARг;

СЦК -середній цитохімічний коефіцієнт у НСТ-тесті;

ФНП-а - фактор некрозу пухлин-альфа.

Размещено на Allbest.ru

...