Фітохімічне вивчення представників роду Sambucus і розробка на їх основі лікарських засобів

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я

НАЦІОНАЛЬНИЙ ФАРМАЦЕВТИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

ФІТОХІМІЧНЕ ВИВЧЕННЯ ПРЕДСТАВНИКІВ РОДУ SAMBUCUS І РОЗРОБКА НА ЇХ ОСНОВІ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ

15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія

ВЕЛЬМА ВІКТОРІЯ ВОЛОДИМИРІВНА

Харків - 2008

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі хімії природних сполук Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук, професор КИСЛИЧЕНКО ВІКТОРІЯ СЕРГІЇВНА, Національний фармацевтичний університет, завідуюча кафедрою хімії природних сполук

Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, професор СЕРБІН АНАТОЛІЙ ГАВРИЛОВИЧ, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри ботаніки

кандидат фармацевтичних наук, доцент ТЕРНИНКО ІННА ІВАНІВНА, Луганський Державний медичний університет, доцент кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії

Захист відбудеться 21.03.2008 р. о _10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01 при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002, м. Харків, вул. Пушкінська, 53

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4)

Автореферат розісланий 20.02.2008 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан

АНОТАЦІЇ

Вельма В.В. «Фітохімічне вивчення представників роду Sambucus і розробка на їх основі лікарських засобів». - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.02 - фармацевтична хімія та фармакогнозія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2008.

Дисертація присвячена вивченню біологічно активних речовин бузини чорної та бузини трав'янистої. Проведено системне фітохімічне дослідження вегетативних та генеративних органів бузини чорної та бузини трав'янистої. Досліджено якісний склад та кількісний вміст різних груп біологічно активних речовин у квітках, листі, плодах, корі бузини чорної та у квітках і листі бузини трав'янистої. З квіток та листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої виділено в індивідуальному стані та встановлено структуру 31 речовини. Умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін, ескулін, мірицетин та алантоїн виділено вперше.

Одержано настойку квіток і настойку листя бузини чорної, для яких визначено гостру токсичність, протизапальну, антиоксидантну та гепатопротекторну активності.

Розроблено проекти АНД на «Листя бузини чорної», «Настойка квіток бузини чорної», « Настойка листя бузини чорної». Розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий - дієтичну добавку «Еліксири та бальзами на основі рослинних екстрактів» торгівельної марки «Вітагрен»: „Бальзам „Вітагрен” і „Еліксир „Тим'янівка”, до складу яких входять квітки бузини чорної.

Ключові слова: бузина чорна (Sambucus nigra), бузина трав'яниста (Sambucus ebulus), біологічно активні речовини, настойка, біологічна активність.

Вельма В.В. «Фитохимическое изучение представителей рода Sambucus и разработка на их основе лекарственных средств». - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2008.

Диссертация посвящена доказательству того, что листья бузины черной и бузины травянистой не поступаются по химическому составу и фармакологической активности цветкам бузины черной и могут быть новыми дополнительными источниками биологически активных веществ для создания лекарственных средств.

Впервые проведено комплексное фармакогностическое изучение бузины черной и бузины травянистой. Качественными реакциями, хроматографическими методами исследований, трехмерной флуоресцентной спектроскопией были обнаружены свободные и связанные сахара, полисахариды, пектиновые вещества, аминокислоты, органические кислоты, дубильные вещества, гидроксикоричные кислоты, флавоноиды, антоцианы, кумарины, сапонины, хлорофиллы, каротиноиды, стероиды и фосфолипиды.

Из цветков и листьев бузины черной и листьев бузины травянистой выделено в индивидуальном состоянии и установлено структуру 31 вещества: 4 производных гидроксикоричных кислот, 9 производных кумарина, 2 терпеноида, 5 флавоноидов, 6 антоцианов, 2 хлорофилла, 1 стерин, 1 фосфолипид и 1 вещество - производное мочевины. Умбелиферон, скополетин, эскулетин, скополин, скимин, эскулин, мирицетин и алантоин выделены впервые.

В цветках, листьях, плодах и коре бузины черной был определен фракционный состав полисахаридов: спирторастворимые полисахариды, водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлоза.

Количественное определение общего содержания полисахаридов проводили гравиметрическим методом. Количественное содержание пектиновых веществ было определено спектрофотометрическим методом.

Количественное содержание соединений фенольного комплекса определяли: окисляемые полифенолы (титриметрическим методом в пересчете на танин), гидроксикоричные кислоты (спектрофотометрическим методом в пересчете на хлорогеновую кислоту), флавоноиды (спектрофотометрическим методом в пересчете на рутин), антоцианы (спектрофотометрическим методом в пересчете на цианидина хлорид).

Количественное определение свободных органических кислот проводили титриметрическим методом в пересчете на яблочную кислоту. Было определено содержание аскорбиновой кислоты во всех исследуемых образцах сырья.

В результате исследования аминокислотного состава установлено наличие 16 аминокислот в цветках, листьях, плодах бузины черной, листьях бузины травянистой и 15 аминокислот (отсутствует аминокислота - аланин) в коре бузины черной.

Были получены липофильные фракции и определен их качественный состав и количественное содержание. Методом газожидкостной хроматографии было определено от 9 до 21 жирной кислоты в цветках, листьях, плодах, коре бузины черной и в листьях бузины травянистой.

Методом атомно-абсорбционной спектроскопии установлено количественное содержание 26 макро- и микроэлементов. В значительном количестве накапливаются калий, кальций, магний, кремний, фосфор, натрий, железо и алюминий.

Получены настойка цветков и настойка листьев бузины черной, для которых определена острая токсичность, противовоспалительная, гепатопротекторная и антиоксидантная активности.

При исследовании острой токсичности настойки цветков и настойки листьев бузины черной установлено, что они являются относительно нетоксичными препаратами (LD₅₀ > 15000 мг/кг).

Изучение противовоспалительной активности на моделе карагенинового отека свидетельствует о наличии умеренной антиэкссудативной активности настойки цветков и настойки листьев, которая уступает традиционному антифлогистику диклофенаку натрия, но превосходит по противовоспалительному действию настой бузины черной.

Исследование антиоксидантной активности проводили на модели экспериментального гепатита, который вызвало введение четыреххлористого углерода. Состояние антиоксидантной системы определяли в тканях печени по уровню ТБК-активных продуктов и восстановленного глутатиона. Данные эксперимента свидетельствуют о наличие в исследуемых настойках антиоксидантной активности.

Изучение гепатопротекторной активности настоек бузины проводили на модели гепатита, который был вызван введением парацетамола. В результате эксперимента установлено, что введение животным исследуемых настоек достоверно нормализует белково-синтетическую и гликогенобразующую функции печени, о чем свидетельствует достоверное повышение содержания общего белка в сыворотке крови и гликогена в ткани органа.

Разработаны проекты АНД на «Листья бузины черной», «Настойка цветков бузины черной», «Настойка листьев бузины черной». Разработано ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт специальный пищевой - диетическую добавку «Эликсиры и бальзамы на основе растительных экстрактов» торговой марки «Витагрен»: „Бальзам „Витагрен” и „Эликсир „Тимьяновка”, в состав которых вошли цветки бузины черной.

Ключевые слова: бузина черная (Sambucus nigra), бузина травянистая (Sambucus ebulus), биологически активные вещества, настойка, биологическая активность.

Velma V.V. «Phytochemical study of species of Sambucus genus plants and development of medicines on their basis». - Manuscript.

The dissertation for scientific degree of the candidate in pharmacy 15.00.02 - pharmaceutical chemistry and pharmacognosy. - National University of Pharmacy, Kharkiv, 2008.

The dissertation is devoted to study of biologically active substances (BAS) in Sambucus nigra and Sambucus ebulus. The system phytochemical study of vegetative and generative organs of Sambucus nigra and Sambucus ebulus was carried out. The qualitative composition and quantitative contents of the basic groups BAS in flowers, leaves, fruits, barks of Sambucus nigra and flowers, leaves of Sambucus ebulus were investigated. 31 substances were isolated from flowers and leaves of Sambucus nigra and from leaves of Sambucus ebulus and their structures were determined. Umbelliferone, skopoletin, eskuletin, skopolin, skimin, eskulin, myricetin and alantoin were isolated for the first time.

The complex method to obtain the infusion from flowers and infusion from leaves of Sambucus nigra was developed; the acute toxicity, anti-inflammatory, hepato-protective and antioxidant activities of these infusions were ascertained.

The drafts of ANDs on plant materials “Sambucus nigra leaves”, “Infusion of Sambucus nigra flowers”, “Infusion of Sambucus nigra leaves” were developed. The draft of specification U 15.8-31757369-001:2006 on special food substance - dietetic additive “Elixirs and Balsams on vegetable extract basis” of trade mark “Vitagren”: “Balsam “Vitagren” and “Elixir “Timyanivka” (which have flowers of Sambucus nigra in the consists) - was worked out.

Keywords: European elder (Sambucus nigra), Herbaceous elder (Sambucus ebulus), biologically active substances, infusion, biological activity.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

фітохімічний біологічний настойка токсичність

Актуальність теми. У теперішній час велике значення приділяється пошуку рослин з достатньою сировинною базою, а також нових джерел біологічно активних речовин (БАР) рослинного походження. Вивчення багатовікового досвіду народної медицини є перспективним шляхом виявлення додаткових видів лікарської рослинної сировини (ЛРС), які після відповідних фармакологічних і клінічних досліджень в подальшому могли б використовуватися у науковій медицині. Після аналізу природних запасів лікарської флори України ми визначили за перспективне вивчення представників роду Sambucus L.

Перспективною рослиною для поглибленого вивчення є бузина чорна (Sambucus nigra L.) родини жимолостевих (Caprifoliaceae), квітки якої застосовують в науковій медицині різних країн світу. Вони входять до складу таких комплексних препаратів, як «Ново-пасит», «Синупрет», «Атма» та інші.

Більш широко представники роду Sambucus L. використовуються в народній медицині. Відвар з листя бузини чорної приймають при цукровому діабеті, ревматизмі, подагрі, асциті, захворюваннях нирок і набряках. Відвар з листя бузини трав'янистої місцево застосовують при ларингітах, у вигляді припарок - при ревматизмі, подагрі, застарілих ранах тощо.

Саме тому, доказ того, що листя обох видів бузини не поступаються за хімічним складом та фармакологічною активністю квіткам бузини чорної і можуть бути новими джерелами БАР для створення лікарських засобів визначають тему даного дослідження як актуальну.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планом проблемної комісії „Фармація” МОЗ України і є фрагментом комплексної науково-дослідної роботи Національного фармацевтичного університету “Фармакогностичне вивчення біологічно активних речовин, створення лікарських засобів рослинного походження” (номер державної реєстрації 0103U000476).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було фармакогностичне вивчення бузини чорної і бузини трав'янистої з дослідженням різних груп БАР і визначення можливості отримання лікарських субстанцій та лікарських засобів на їх основі.

Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

- провести інформаційний пошук, критичний аналіз сучасного стану досліджень за темою дисертаційної роботи;

- провести попередні порівняльні фітохімічні дослідження якісного складу квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої;

- виділити в індивідуальному стані БАР і встановити їх структуру;

- визначити кількісний вміст основних груп БАР в бузині чорній та бузині трав'янистій;

- провести стандартизацію сировини листя бузини чорної;

- одержати і стандартизувати настойку квіток і настойку листя бузини чорної;

- встановити основні анатомо-діагностичні ознаки листя бузини чорної;

- підтвердити можливість створення нових лікарських засобів з сировини, що вивчалася шляхом вивчення фармакологічної активності отриманих субстанцій.

Об'єкти дослідження: квітки, листя, плоди, кора бузини чорної та квітки і листя бузини трав'янистої, виділені БАР з квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої.

Предмет дослідження: виявлення, виділення, ідентифікація БАР з квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої, створення на їх основі нових лікарських засобів, вивчення їх фармакологічної активності.

Методи дослідження: якісний склад і кількісний вміст БАР визначали фармакопейними методами, а також використовували тонкошарову (ТШХ), паперову (ПХ) та газорідинну хроматографію (ГРХ), специфічні якісні реакції. Ліпофільні комплекси досліджували за допомогою тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в УФ та видимому діапазонах спектру. Для розділення БАР використовували колонкову хроматографію на поліаміді, целюлозі, силікагелі і препаративну хроматографію на папері і в тонкому шарі сорбенту. Хімічну будову виділених сполук встановлювали на основі їх хімічних перетворень, даних УФ- та ІЧ-спектрів, температури плавлення. Анатомічну будову листя встановлювали на препаратах з поверхні та поперечних зрізах. Фармакологічні дослідження проводили in vitro та in vivo.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичне фітохімічне вивчення БАР квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої.

Встановлено в них наявність та кількісний вміст вуглеводів, амінокислот, жирних кислот, гідроксикоричних та органічних кислот, дубильних речовин, флавоноїдів, антоціанів, хлорофілів, каротиноїдів, макро- та мікроелементів.

З квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої в індивідуальному стані виділено 31 речовину: 4 похідних гідроксикоричних кислот, 9 похідних кумарину, 2 терпеноїди, 5 флавоноїдних сполук, 6 антоціанів, 2 хлорофіли, 1 стерин, 1 фосфоліпід і 1 речовину - похідну сечовини. З них умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін, ескулін, мірицетин та алантоїн виділені вперше. Визначено наявність і кількісний вміст 16 амінокислот, 26 макро- і мікроелементів, від 9 до 21 жирної кислоти у квітках, листі, плодах та корі бузини чорної та у листі бузини трав'янистої.

Одержано настойку квіток і настойку листя бузини чорної, для яких визначено гостру токсичність, протизапальну, антиоксидантну та гепатопротекторну активності.

Новизна досліджень підтверджена заявкою на патент а 2007 04412 від 20 квітня 2007 року.

Вперше вивчено анатомічні ознаки листя бузини чорної, які були використані для діагностики ЛРС та створення проекту аналітичної нормативної документації (АНД) на сировину.

Практичне значення отриманих результатів. Одержано настойку квіток і настойку листя бузини чорної, які виявляють протизапальну, антиоксидантну та гепатопротекторну дію. Розроблено проекти АНД на «Листя бузини чорної», «Настойка квіток бузини чорної», «Настойка листя бузини чорної». На замовлення ТОВ „Панацея” розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий - дієтичну добавку «Еліксири та бальзами на основі рослинних екстрактів» торгівельної марки «Вітагрен»: „Бальзам „Вітагрен” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1085 від 11.07.2006) і „Еліксир „Тим'янівка” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1088 від 11.07.2006), до складу яких входять квітки бузини чорної.

Результати досліджень впроваджено у навчальний процес кафедри якості, стандартизації та сертифікації ліків інституту підвищення кваліфікації спеціалістів фармації Національного фармацевтичного університету, кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії Медичного інституту Української асоціації народної медицини, кафедри фармакогнозії Запорізького державного медичного університету і кафедри фармакогнозії і ботаніки Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я.Горбачевського.

Особистий внесок здобувача. Безпосередньо автором здійснено:

- інформаційний пошук за темою дисертаційної роботи, аналіз отриманих даних з питань сучасних досліджень за проблематикою, результати яких стали підґрунтям до вибору об'єктів дослідження;

- встановлено наявність і визначено кількісний вміст полісахаридів (та їх фракційний склад), амінокислот, жирних кислот, гідроксикоричних кислот, дубильних речовин, флавоноїдів, антоціанів, органічних кислот, хлорофілів, каротиноїдів, макро- і мікроелементів;

- виділено та ідентифіковано 31 сполуку;

- одержано настойку квіток і настойку листя бузини чорної;

- вивчено анатомічну будову листя бузини чорної;

- розроблено проекти АНД на «Листя бузини чорної», «Настойка квіток бузини чорної», «Настойка листя бузини чорної»;

- розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий - дієтичну добавку «Еліксири та бальзами на основі рослинних екстрактів» торгівельної марки «Вітагрен»: „Бальзам „Вітагрен” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1085 від 11.07.2006) і „Еліксир „Тим'янівка” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1088 від 11.07.2006), до складу яких входять квітки бузини чорної.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладено та обговорено на науково-практичних конференціях різного рівня: науково-практичному семінарі “Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (Харків, 2004), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції “Дні науки `2005” (Дніпропетровськ, 2005), VI Національному з'їзді фармацевтів України «Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України» (Харків, 2005), 1-ї Міжнародній науково-практичній конференції «Науково-технічний прогрес і оптимізація технологічних процесів створення лікарських препаратів» (Тернопіль, 2006), Міжнародній науковій конференції «Лікарські рослини: традиції та перспективи досліджень» (Київ, 2006), ІІ Міжнародній науково-практичній конференції «Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних добавок» (Харків, 2006), 7^th International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds (Ташкент, Узбекистан, 2007).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць, в тому числі 6 статей, 5 з яких у фахових наукових виданнях, 8 тез доповідей та 1 заявку на патент України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, чотирьох розділів, загальних висновків, списку літературних джерел та 10 додатків. Дисертаційна робота викладена на 243 сторінках. Обсяг основного тексту дисертації складає 153 сторінок машинописного тексту. Дисертація ілюстрована 26 рисунками та 37 таблицями. Список літератури включає 176 джерела, з них 109 кирилицею та 67 латиною.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Ботанічна характеристика, розповсюдження, хімічний склад, використання в офіційній та народній медицині основних представників роду Sambucus L.

В огляді літератури наведено ботанічну характеристику, дані про хімічний склад, застосування у науковій та народній медицині бузини чорної, бузини трав'янистої та бузини червоної. Дані літератури свідчать, що бузина чорна і бузина трав'яниста мають багатий хімічний склад і широко використовуються у народній медицині, що дало можливість передбачити перспективність даних рослин для фітохімічного та фармакологічного дослідження.

Дослідження хімічного складу квіток, листя, плодів і кори бузини чорної та квіток і листя бузини трав'янистої з виділенням і встановленням структури біологічно активних сполук

Об'єктами досліджень були квітки, листя, плоди і кора бузини чорної та квітки і листя бузини трав'янистої. Сировина була заготовлена в 2004-2005 роках у Харківському, Дергачівському, Зміївському, Вовчанському, Балакліївському районах Харківської області України.

За допомогою якісних реакцій, ПХ та ТШХ у квітках і листі бузини чорної та листі бузини трав'янистої було виявлено вільні та зв'язані цукри, полісахариди, пектинові речовини, амінокислоти, органічні кислоти, дубильні речовини, гідроксикоричні кислоти, флавоноїди, антоціани, кумарини, сапоніни, хлорофіли, каротиноїди, стероїди, фосфоліпіди.

Для вивчення якісного складу ліпофільних фракцій методом тривимірної скануючої спектрофлуориметрії в ультрафіолетовому та видимому діапазонах спектру отримано тривимірні спектри флуоресценції.

Аналіз отриманих спектрів ліпофільних фракцій бузини чорної дозволив зробити висновок щодо наявності суміші хлорофілу a і b у квітках, листі, плодах та корі; флавоноїдів у квітках, листі та корі; кумаринів у квітках та листі; ненасичених ліпідів (фосфоліпідів та простих фенолів) у листі; простих фенолів у плодах та корі; поліфенолів у плодах бузини чорної.

Методом колонкової адсорбційної хроматографії, рехроматографії на силікагелі і поліаміді, препаративної хроматографії на папері та в тонкому шарі з квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої в індивідуальному стані виділено 31 речовину: 4 похідні коричної кислоти, 9 похідних кумарину, 5 флавоноїдів, 6 антоціанів, 2 тритерпеноїди, 1 стерин, 2 хлорофіли, 1 речовину фосфоліпідної природи і 1 речовину - похідну сечовини. Структуру виділених сполук встановлювали за допомогою фізико-хімічних властивостей, даних УФ-, ІЧ-спектроскопії у порівнянні з достовірними зразками. Умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін, ескулін, мірицетин та алантоїн виділені вперше з усіх видів сировини, що вивчалася. Основні фізико-хімічні властивості виділених речовин наведені в табл. 1.

Похідні коричної кислоти. Речовини 2.1-2.4 давали позитивні якісні реакції з заліза (ІІІ) хлоридом, кислотою сульфаніловою діазотованою, що визначало їх фенольну природу. Кислотні властивості цих сполук виявляли за допомогою розчину бромтимолового синього. Блакитне забарвлення речовини 2.2 після обробки хроматограм реактивом кислоти барбітурової вказувало на наявність у їх складі кислоти хінної. За результатами хімічних перетворень, даних УФ-спектрів, температур плавлення і порівняння з достовірними зразками гідроксикоричних кислот речовини 2.1-2.4 були ідентифіковані відповідно як ферулова, хлорогенова, п-кумарова та кавова кислоти.

Похідні кумарину. Дана група представлена 9 речовинами, які були виділені з досліджуваної сировини. Речовини 2.5-2.13 розщеплюються йодистоводневою кислотою в середовищі рідкого фенолу та оцтового ангідриду до кумарину, що дозволяє віднести їх до похідних бензо--пірону. На підставі молекулярної маси, елементного складу, а також фізико-хімічних властивостей, УФ- та ІЧ-спектрів, а також порівняння з достовірними зразками речовини 2.5-2.13 ідентифіковані відповідно як кумарин, герніарин, дафноретин, умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін та ескулін. З них умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін, ескулін виділені вперше.

Тритерпеноїди. Речовини 2.14-2.15 за результатами якісних реакцій і хроматографічного аналізу було віднесено до тритерпеноїдів. В ІЧ-спектрі сполуки 2.14 спостерігалися смуги поглинання при 3300, 2750, 2200 см^-1, що свідчило про наявність гідроксильних груп, 1700 см^-1 відповідала валентним коливанням -С=О, 1600-1620 см^-1 характерні для С=С зв'язків. При ацетилюванні та метилюванні речовини 2.14 отримували ацетати та метилати, які не давали депресії температури плавлення з відповідними ацетатами і метилатами урсолової кислоти. ІЧ-спектр речовини 2.15 мав смуги поглинання, характерні для олеанолової кислоти при 3300, 2720, 2200, 1700, 1620, 1600, 1390, 1340, 1320, 1290, 1260, 1230 см^-1. При ацетилюванні речовини 2.15 отримували ацетати, які не давали депресії температури плавлення з відповідними ацетатами олеанолової кислоти. За результатами визначення фізико-хімічних властивостей, молекулярної маси, елементного складу, даних ІЧ-спектроскопії, а також порівняння з достовірними зразками речовини 2.14-2.15 було ідентифіковано відповідно як урсолову та олеанолову кислоти.

Стерини. Речовина 2.16 була віднесена до стероїдів на підставі якісних реакцій та хроматографічного аналізу. Речовина 2.16 має температуру плавлення 138-140⁰С, [] = +37,5 (хлороформ), не дає депресії температури проби змішання з референтним зразком в-ситостерину. В результаті вивчення фізико-хімічних властивостей і хроматографічного дослідження речовину 2.16 було ідентифіковано як в-ситостерин.

Хлорофіли. Рослинні пігменти, виділені з хлороформних фракцій, визначали хроматографічно на підставі природного зеленого забарвлення плям у видимому світлі і змін його на червоний колір під дією УФ-світла. В усіх досліджуваних зразках хроматографічно ідентифікували речовину 2.17 і речовину 2.18 як хлорофіл a та хлорофіл b відповідно.

Фосфоліпіди. На підставі фізико-хімічних властивостей і хроматографічного аналізу з достовірним зразком - лецитином-стандартом встановлено, що речовина 2.19 відноситься до фосфатидилхоліну (лецитину).

Флавоноїди. З флавоноїдних сполук було виділено 5 речовин, які представлені агліконами та глікозидами. Аглікони, виділені нами у вільному стані, відносяться до флавонів. Результати якісних реакцій, хімічних перетворень, хроматографічна поведінка в різних системах розчинників, дані УФ- та ІЧ-спектроскопії дозволили ідентифікувати речовину 2.20 як кемпферол (3,5,7,4'-тетрагідроксифлавон), речовину 2.21 як кверцетин (3,5,7,3',4'- пентагідроксифлавон), речовину 2.22 як мірицетин (3,5,7,3',4',5'-гексагідроксифлавон). Серед виділених глікозидів встановлено структуру речовини 2.23 - астрагалін (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид) та речовини 2.24 - рутин (кверцетин-3-О-в-D-рутинозид). Вперше виділено мірицетин з усіх видів досліджуваної сировини.

Антоціани. За якісними реакціями, хроматографічною поведінкою, визначеним елементним складом, температурою плавлення та даних УФ-спектрів речовина 2.25 ідентифікована з ціанідином, речовина 2.26 з хризантеміном, речовина 2.27 з петунідином, речовина 2.28 з пеонідином, речовина 2.29 з дельфінідином, речовина 2.30 з пеларгонідином.

Похідні сечовини. Речовина 2.31 з 1% спиртовим розчином пара-диметиламінобензальдегідом забарвлювала в жовтий колір, що характерно для похідних сечовини. На основі даних молекулярної маси і елементного складу встановлена загальна формула виділеної речовини - С₄Н₆N₄O₃. ІЧ-спектр має смуги поглинання, які характеризують первинну аміногрупу (3441, 3348, 1606 см^-1) та іміногрупу (3230, 3070,1537 см^-1). На основі проведених досліджень можна констатувати, що сполука 2.31 представляє собою алантоїн. Алантоїн виділений вперше з квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої.

Таблиця 1. Основні фізико-хімічні властивості виділених речовин

Речовина, її структурна характеристика	Джерело отримання сполуки	Т пл. 0С	[], град	УФ-спектр, л нм	Rf у системах розчинників
					Система	Rf
1	2	3	4	5	6	7
Похідні коричної кислоти
2.1. Ферулова кислота (4-гідрокси-5-метокси-корична кислота)	КБЧ ЛБЧ	168-170	-	320 290 234	1 2	0,88 0,55
2.2. Хлорогенова кислота (5-О-кофеїл-D-хінна кислота)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	203-205	-32 (метанол)	325 300 245	1 2	0,62 0,7
2.3. п-Кумарова кислота (4-гідроксикорична кислота)	КБЧ ЛБЧ	212-214	-	310 228 217	1 2	0,9 0,6
2.4. Кавова кислота (3,4-дигідроксикорична кислота)	КБЧ ЛБЧ	194-195	-	325 300 235	1 2	0,8 0,5
Похідні кумарину
2.5. Кумарин (бензо--пірон)	КБЧ	67-69	-	-	3	0,1
2.6. Герніарин (7-метоксикумарин)	КБЧ	117-119	-	218 256 298 344	3 4	0,41 0,15
2.7. Дафноретин (2-метокси-6-окси-3,7'-дикумариновий ефір)	КБЧ	254-256	-	-	5	0,85
2.8. Умбеліферон (7-гідроксикумарин)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	228-230	-	231 258 327	2 5	0,64 0,36
2.9. Скополетин (6-метоки-7-гідроксикумарин)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	202-204	-	230 255 296 346	2 5	0,50 0,58
2.10. Ескулетин (6,7-дигідроксикумарин)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	344-350	-	230 258 270 316	2 5	0,51 0,06
2.11. Скополін (6-метокси-7-0-в-D-глюкопіранозил-кумарин)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	218-220	-8,5 ДМФА	231 330	6	0,24
2.12. Скимін (7-0-в-D-глюкопіранозил-кумарин)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	218-220	-80 (мета-нол)	220 252 325	5	0,38
2.13. Ескулін (6-0-в-D-глюкопіранозил-7-гідроксикумарин)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	204-206	-146 (мета-нол)	-	2 4	0,73 0,49
Тритерпеноїди
2.14. Урсолова кислота	КБЧ ЛБЧ	280-283	+62,5 (хло-роф.)	-	1	0,89
2.15. Олеонолова кислота	КБЧ ЛБЧ	300-303	+79,0 (хло-роф.)	-	1 7	0,9 0,44
Стерини
2.16. в-сітостерин	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	134-136	+37,5 (хло-роф.)	-	1 7	0,95 0,54
Хлорофіли
2.17 Хлорофіл а	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	117-120	-	-	5	0,90
2.18. Хлорофіл b	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	120-130	-	-	5	0,93
Фосфоліпіди
2.19. Лецитин	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	Воскопод.	-	-	8	0,28
Флавоноли
2.20. Кемпферол (3,5,7,4'-тетрагідрокси-флавон)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	273-274	-	366 266	1 2	0,83 0,10
2.21. Кверцетин (3,5,7,3',4'-пентагідроксифлавон)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	310-312	-	375 268 256	1 2	0,69 0,70
2.22. Мірицетин (3,5,7,3',4',5'-гексагідроксифлавон)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	350-354	-	374 272 254	9	0,24
Глікозид кемпферолу
2.23. Астрагалін (кемпферол-3-О-в-D-глюкопіранозид)	КБЧ	196-198	-6,8 (етанол)	375 270	1 2	0,69 0,37
Глікозид кверцетину
2.24. Рутин (кверцетин-3-О-в-D-рутинозид)	КБЧ	189-192	-32,3 (етанол)	362 268 258	1 2	0,46 0,54
Антоціани
2.25. Ціанідин (2-(3',4'-дигідроксифеніл)-3,5,7-тригідрокси-бензо[b]пірилію хлорид)	КБЧ	-	-	535	10	0,36
2.26. Хризантемін (3-глюко-2-(3',4'-дигідроксифеніл)-3,5,7-тригідрокси-бензо[b]пірилію хлорид)	КБЧ	205	-	525	10	0,42
2.27. Петунідин (2-(3',4'-дигідрокси-5'-метоксифеніл)-3,5,7-тригідрокси-бензо[b]пірилію хлорид)	КБЧ	-	-	-	10	0,54
1	2	3	4	5	6	7
2.28. Пеонідин (2-(4'-гідрокси-3'-метоксифеніл)-3,5,7-тригідрокси-бензо[b]пірилію хлорид)	КБЧ	-	-	-	10	0,33
2.29. Дельфінідин (2-(3',4',5'-тригідроксифеніл)-3,5,7-тригідрокси-бензо[b]пірилію хлорид)	КБЧ	-	-	544	10	0,48
2.30. Пеларгонідин (2-(4'-гідроксифеніл)-3,5,7-тригідрокси-бензо[b]пірилію хлорид)	КБЧ	-	-	530	10	0,39
Похідні сечовини
2.31. Алантоїн (5-уреїд гідантоїну)	КБЧ ЛБЧ ЛБТ	234-235	-	-	1	0,35

Примітка:

1. Системи розчинників: 1 - н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2); 2-15%-оцтова кислота; 3 - петролейний ефір/формамід (25%); 4 - гексан/формамід (25%); 5 - хлороформ/формамід (25%); 6 - толуол-н-бутанол (3:1)/вода (35%); 7 - толуол-етилацетат-оцтова кислота (12:4:0,5); 8 - метилетилкетон-м-ксилол (1:1)/формамід; 9 - хлороформ-оцтова кислота-вода (13:6:2); 10 - етилацетат-оцтова кислота-мурашина кислота-вода (100:11:11:25).

2. Квітки бузини чорної - КБЧ, листя бузини чорної - ЛБЧ, листя бузини трав'янистої - ЛБТ.

Визначення кількісного вмісту біологічно активних речовин в бузині чорній та бузині трав'янистій

Дана частина роботи була проведена з метою порівняння двох основних представників одного роду, подальшої розробки проектів АНД для стандартизації перспективного виду сировини, а також отримання даних, які відсутні у літературі про вміст значної кількості ряду груп БАР.

Кількісне визначення загального вмісту полісахаридів проводили гравіметричним методом. Кількісний вміст пектинових речовин було визначено спектрофотометричним методом.

Кількісний вміст сполук фенольного комплексу визначали: окиснювальні поліфеноли (титриметричним методом в перерахунку на танін), гідроксикоричні кислоти (спектрофотометричним методом в перерахунку на хлорогенову кислоту), флавоноїди (спектрофотометричним методом в перерахунку на рутин), антоціани (спектрофотометричним методом у перерахунку на ціанідину хлорид).

Кількісний вміст вільних органічних кислот проводили титриметричним методом в перерахунку на яблучну кислоту. Було визначено вміст аскорбінової кислоти у всіх досліджуваних зразках сировини. Результати досліджень представлені в табл. 2.

Таблиця 2. Кількісний вміст біологічно активних речовин

БАР	Вміст, % (m=5)
	Бузина чорна	Бузина трав'яниста
	Квітки	Листя	Плоди	Кора	Листя	Квітки
Полісахариди	4,140,05	4,440,02	9,430,02	2,130,01	7,220,03	7,030,02
Пектин	7,640,02	5,330,02	4,460,03	8,72 0,03	6,380,03	7,820,02
Сума окисню-вальних фенолів	6,730,03	3,250,01	3,340,04	2,560,02	2,630,03	5,580,01
Гідроксикоричні кислоти	2,770,03	2,530,02	3,650,04	0,350,01	2,550,02	2,610,02
Флавоноїди	11,120,08	2,310,02	3,010,04	1,930,01	4,830,07	10,610,09
Антоцiани	0,030,01	-	2,920,04	-	-	0,070,01
Органічні кислоти	8,670,05	7,420,02	7,270,04	5,820,04	5,040,05	6,840,04
Аскорбінова кислота	0,020,01	0,050,01	0,080,01	0,030,01	0,060,01	0,030,01

Визначення полісахаридів за фракціями проводили у шроті, який залишився після отримання ліпофільних екстрактів. Було визначено спирторозчинні полісахариди (СРПС), водорозчинні полісахариди (ВРПС), пектинові речовини (ПР) та геміцелюлоза (ГЦ). Результати представлені в табл. 3.

Таблиця 3. Кількісний вміст полісахаридів за фракціями в досліджуваних органах бузини чорної

БАР	Вміст, % (m=5)
	Бузина чорна
	Квітки	Листя	Плоди	Кора
СРПС	13,310,03	5,580,02	12,630,04	6,210,02
ВРПС	3,580,01	2,790,01	12,700,03	3,710,02
ПР	0,920,01	9,290,06	1,370,02	6,470,03
ГЦ	11,890,06	52,890,05	8,420,04	29,030,05

В результаті дослідження амінокислотного складу встановлено наявність 16 амінокислот у квітках, листі, плодах бузини чорної, листі бузини трав'янистої та 15 амінокислот (відсутня амінокислота - аланін) у корі бузини чорної.

Було отримано ліпофільні фракції та визначено їх якісний склад та кількісний вміст. Методом газорідинної хроматографії було визначено кількісний вміст вільних жирних кислот. Результати представлені в табл. 4.

Таблиця 4. Кількісний вміст жирних кислот у ліпофільних екстрактах

Назва кислоти	Загальна формула	Вміст жирної кислоти, % від суми
		Бузина чорна	Бузина трав'яниста
		квітки	листя	плоди	кора	листя
1	2	3	4	5	6	7
Лауринова	С12:0	1,3885	-	-	-	2,5157
Міристинова	С14:0	2,5488	-	-	-	4,0366
Пентадеканова	С15:0	0,5033	1,5977	-	-	-
Пальмітинова	С16:0	22,1861	24,6904	22,6242	18,4925	37,6302
Пальміто-олеїнова	С16:1n9	3,4877	2,0776	-	-	2,9594
Стеаринова	С18:0	2,0317	2,0702	2,0538	2,6398	4,7542
Олеїнова	С18:1n9	17,2164	0,9762	2,7391	3,487	2,1574
Лінолева	С18:2n9,12	16,1099	8,437	21,1481	37,9357	9,4047
Ліноленова	С18:3n9,12,15	2,3074	1,0009	43,22	19,2151	34,5176
Арахінова	С20:0	15,8212	48,1914	3,3188	3,3959	-
Гондолієва	С20:1n11	2,4068	4,3102	-	-	-
Бегенова	С22:0	0,9554	1,4601	-	2,915	-
Лігноцеринова	С24:0	-	-	-	6,4453	-
Нервонова	С24:1	-	-	1,5751	3,6273	-
Церотинова	С26:0	-	-	-	1,8464	-
Сума насичених жирних кислот	45,4350	78,0098	27,9968	35,7349	48,9367
Сума ненасичених жирних кислот	54,5650	21,9902	72,0032	64,2651	51,0633
Сума неідентифікованих кислот	13,0368	5,1883	3,3209	-	2,0242

Методом атомно-абсорбційної спектроскопії визначено елементний склад об'єктів, що досліджувалися. Встановлено наявність та визначено кількісний вміст 26 макро- та мікроелементів. У значній кількості накопичуються калій, кальцій, магній, кремній, фосфор, натрій, залізо та алюміній.

Одержання настойок з квіток та листя бузини чорної, стандартизація досліджуваної сировини та отриманих настойок, вивчення їх гострої токсичності та фармакологічної активності

З метою створення нових лікарських засобів з достатньою сировинною базою було розроблено спосіб одержання настойок з квіток та листя бузини чорної.

В якості екстрагенту було використано 40% спирт етиловий, який дав змогу вилучити максимальну кількість флавоноїдів та гідроксикоричних кислот, що обумовлюють гепатопротекторну і антиоксидантну активності отриманих настойок. Оптимальне співвідношення між сировиною та екстрагентом 1:10 для квіток бузини чорної і 1:15 для листя бузини чорної. В результаті обидві настойки - це рідини коричневого кольору з характерним запахом бузини та гіркуваті на смак.

Вивчення гострої токсичності та фармакологічних властивостей настойки квіток і настойки листя бузини чорної проводили в Національному фармацевтичному університеті на кафедрі фармакотерапії під керівництвом д.мед.н. Деримедвідь Л.В.

При дослідженні гострої токсичності настойки квіток і настойки листя бузини чорної встановлено, що вони є відносно нешкідливими препаратами (LD₅₀ > 15000 мг/кг).

Вивчення протизапальної активності на моделі карагенінового набряку свідчать про наявність помірної антиексудативної дії настойки квіток та настойки листя, яка поступається традиційному антифлогистику диклофенаку натрію, але перевершує за протизапальною дією настій бузини чорної.

Дослідження антиоксидантної активності проводили на моделі експериментального гепатиту, який було спричинено внутрішньошлунковим введенням чотирьоххлористого вуглецю (ССl₄). Стан антиоксидантної системи визначали у сироватці крові та в тканинах печінки за рівнем ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) та відновленого глутатіону (ВГ). Дані експерименту свідчать про наявність у досліджуваних настойок квіток і листя бузини чорної антиоксидантної активності. Це підтверджується нормалізацією рівня ТБК-АП до рівня інтактних тварин і збільшенням, у порівнянні з нелікованою патологією, кількості ВГ. Таким чином, БАР (переважно поліфенольні сполуки), що входять до складу настойок, мають властивість нормалізувати процеси вільнорадикального окиснення, а також стабілізувати антиокиснювальну систему гепатоцитів.

Вивчення гепатопротекторної активності настойок бузини проводили на моделі гепатиту, що був викликаний введенням парацетамолу. Вплив досліджуваних настойок на функціональний стан печінки контролювали за активністю маркерних ферментів цитолізу - аланінамінотрансферази (АлАТ), аспартатамінотрансферази (АсАТ); холестазу - лужної фосфотази (ЛФ); вмісту загального білку в сироватці крові; рівню ТБК-АП, вмісту глікогену та ВГ в тканинах печінки. Зовнішньосекреторну функцію печінки оцінювали за зміною інтенсивності жовчовідділення, рівню жовчних кислот та холестерину в жовчі. В результаті експериментальних досліджень встановлено, що введення тваринам настойок бузини чорної достовірно нормалізує білково-синтетичну і глікогенутворюючу функції печінки, про що свідчить достовірне підвищення вмісту загального білку в сироватці крові і глікогену в тканині органу. При застосуванні настойок бузини також нормалізується функція жовчоутворення, оскільки відмічено позитивну тенденцію до відновлення процесів холато- і холестериногенезу, швидкості секреції жовчі, зниження активності ЛФ до рівня інтактних тварин. Фармакологічні дії настойки квіток та настойки листя бузини чорної, що досліджувалися, за виразністю були на рівні референс-препарату силібору. Покращення функцій печінки під дією настойок бузини та силібору пов'язано, напевне, з наявністю у рослинних поліфенолів мембраностабілізуючої, антиоксидантної, протизапальної, жовчогінної активності, що забезпечують їх гепатопротекторну дію.

Для розробки АНД на сировину нами було визначено основні мікродіагностичні ознаки листя бузини чорної. Дослідження проводили на базі кафедри ботаніки Національного фармацевтичного університету під керівництвом проф. Сербіна А.Г. Визначені мікродіагностичні ознаки листя бузини чорної використано при розробці відповідного розділу АНД на ЛРС «Листя бузини чорної». Також було розроблено проекти АНД на «Настойка квіток бузини чорної», «Настойка листя бузини чорної». Розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий - дієтичну добавку торгівельної марки „Вітагрен”: „Бальзам „Вітагрен” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1085 від 11.07.2006) і „Еліксир „Тим'янівка” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1088 від 11.07.2006), до складу яких входять квітки бузини чорної.

ВИСНОВКИ

1. Вперше проведено порівняльне фармакогностичне вивчення бузини чорної та бузини трав'янистої з дослідженням груп БАР, отриманням комплексів БАР, стандартизацією сировини та перспективних субстанцій, встановленням їх біологічної активності, що дало можливість отримати лікарські засоби на їх основі.

2. За допомогою якісних реакцій, хроматографічних методів аналізу, тривимірної скануючої спектрофлуориметрії встановлено наявність в квітках і листі бузини чорної та листі бузини трав'янистої вільних та зв'язаних цукрів, полісахаридів, пектинових речовин, амінокислот, органічних кислот, гідроксикоричних кислот, флавоноїдів, антоціанів, дубильних речовин, кумаринів, сапонінів, стероїдів, фосфоліпідів, хлорофілів, каротиноїдів.

3. З квіток і листя бузини чорної та листя бузини трав'янистої в індивідуальному стані виділено 31 сполуку: 4 похідні коричної кислоти, 9 похідних кумарину, 5 флавоноїдів, 6 антоціанів, 2 тритерпеноїди, 1 стерин, 2 хлорофіли, 1 речовину фосфоліпідної природи і 1 речовину - похідну сечовини. На основі фізико-хімічних властивостей виділених речовин та продуктів їх хімічних перетворень, даних УФ-, ІЧ -спектроскопії, порівняння з референт-зразками встановлено їх структуру. З них умбеліферон, скополетин, ескулетин, скополін, скимін, ескулін, мірицетин та алантоїн виділені вперше.

4. Визначено кількісний вміст вуглеводів: гравіметричним методом загальний вміст полісахаридів, спектрофотометричним методом - кількість пектинових речовин у всіх досліджуваних зразках. Вперше з квіток, листя, плодів та кори бузини чорної одержано фракції полісахаридів (СРПС, ВРПС, ПР та ГЦ) та визначено їх кількісний вміст.

5. Вперше визначено якісний склад та кількісний вміст амінокислот. Встановлено наявність 16 амінокислот у квітках, листі, плодах бузини чорної і листі бузини трав'янистої; 15 амінокислот - у корі бузини чорної.

6. Отримано ліпофільні фракції з квіток, листя, плодів, кори бузини чорної і листя бузини трав'янистої. Визначено кількісний вміст хлорофілів та каротиноїдів. Вперше визначено кількісний вміст вільних жирних кислот та визначено числові показники ліпофільних фракцій: число омилення, кислотне, ефірне та йодне числа.

7. Вперше проведено визначення якісного складу та кількісного вмісту макро- та мікроелементів у досліджуваних зразках бузини чорної та бузини трав'янистої та встановлено наявність 26 елементів. Визначено кількісний вміст основних груп БАР: флавоноїдів, антоціанів, гідроксикоричних кислот, суми окиснювальних фенолів, вільних органічних кислот, аскорбінової кислоти.

8. Вперше визначено основні анатомо-діагностичні ознаки листя бузини чорної. Встановлено основні відмінні ознаки сировини, що досліджувалася.

9. Проведено фармакологічні дослідження, які підтвердили наявність протизапальної, антиоксидантної та гепатопротекторної активності настойки квіток і настойки листя бузини чорної.

10. Розроблено проекти АНД на «Листя бузини чорної», «Настойка квіток бузини чорної», «Настойка листя бузини чорної».

11. Розроблено ТУ У 15.8-31757369-001:2006 на продукт спеціальний харчовий - дієтичну добавку торгівельної марки „Вітагрен”: „Бальзам „Вітагрен” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1085 від 11.07.2006) і „Еліксир „Тим'янівка” (свідоцтво про Державну реєстрацію № 1088 від 11.07.2006), до складу яких входять квітки бузини чорної. Склад останнього захищений заявкою на патент України а 2007 04412 від 20 квітня 2007 року.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вельма В.В., Кисличенко В.С. Перспективи фітохімічного вивчення бузини чорної // Запорожский медицинский журнал. - 2004. - Т.2, Вип.1. - С. 95-98. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).

2. Вельма В.В., Кисличенко В.С. Дослідження ліпофільних екстрактів з квіток та листя бузини чорної // Фітотерапія. Часопис.- 2005.- №3.- С. 51-55. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).

3. Кисличенко В.С., Вельма В.В. Изучение аминокислотного состава цветков, листьев и экстракта из цветков Sambucus nigra // Химия природ. соедин.- 2006.- №1.- С.98. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).

4. Липиды и липофильные компоненты некоторых растений / В.С. Кисличенко, Е.Н. Новосел, В.Ю. Кузнецова, В.В. Вельма // Химия природ. соедин.- 2006.- №2.- С.182-183. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).

5. Вельма В.В., Кисличенко В.С. Мінеральний склад водного екстракту з квіток бузини чорної // Медична хімія. - 2006. - Т.8, №1. - С.78-79. (Особистий внесок - участь у проведенні експериментальних досліджень, узагальнення результатів, участь у написанні статті).

6. Заявка а 2007 04412 Україна, МПК А61К 36/35, А61К 36/53, А61К 36/73. Лікувально-профілактичний засіб / В.О. Кабанов, В.В. Вельма, О.Ю. Миткова, В.С. Кисличенко, Л.М. Малоштан. - Заявл. 20.04.2007. (Особистий внесок - участь у патентному пошуку, складу засобу, проведення досліджень, узагальнення результатів, участь в оформлен...