Удосконалення методів лабораторної діагностики туберкульозу на основі сучасних уявлень про біологію його збудника

Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія медичних наук України

Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

03.00.07 - мікробіологія

Удосконалення методів лабораторної діагностики туберкульозу на основі сучасних уявлень про біологію його збудника

Трофімова Поліна Станіславівна

Харків 2007

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Київському інституті фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук Журило Олександр Анатолійович, завідувач лабораторії мікробіології туберкульозу Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології Національного фармацевтичного університету МОЗ України;

доктор біологічних наук, професор Варбанець Людмила Дмитрівна, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат медичних наук С.В. Бруснік.

Анотація

Трофімова П.С. Удосконалення лабораторних методів діагностики туберкульозу на основі сучасних уявлень про біологію його збудника. - Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України, Харків, 2007.

Дисертацію присвячено питанням розробки нових прискорених методів індикації та ідентифікації мікобактерій туберкульозу, вивчення розповсюдження та біологічних особливостей штамів збудника туберкульозу, стійких до антимікобактеріальних препаратів. Виявлено збільшення частоти виділення мультирезистентних M. tuberculosis по м. Києву та деяких регіонах України, вивчені їх біологічні особливості.

Впроваджено в практику модифікований метод пропорцій для постановки тесту медикаментозної стійкості M. tuberculosis як більш точного та економічного в порівнянні з методами, що існують в Україні. На основі результатів культуральних досліджень з використанням нового агарового середовища зі стимулятором росту та ПЛР-аналізу розроблені прискорені методи індикації та ідентифікації M. tuberculosis.

Ключові слова: туберкульоз, M. tuberculosis, мультирезистентність, лабораторна діагностика, прискорені методи діагностики.

Аннотация

Трофимова П.С. Совершенствование лабораторных методов диагностики туберкулёза на основе современных представлений о биологии его возбудителя. - Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины. Харьков, 2007.

Диссертация посвящена усовершенствованию лабораторных методов диагностики туберкулёзной инфекции, вопросам изучения распространения мультирезистентных штаммов M. tuberculosis по г. Киеву и некоторым регионам Украины, а также исследованию их биологических свойств. Выявлено увеличение уровня распространения химиорезистентных штаммов микобактерий туберкулёза за последние годы. Подтверждено изменение их биологических свойств. Предложено и внедрено в практику модифицированный метод пропорций для постановки теста медикаментозной устойчивости, как более точного и экономичного в сравнении с существующими методами в Украине.

Изучено частоту выделения L-трансформированных форм M. tuberculosis и их биологические свойства у больных туберкулёзом лёгких. Выявлено, что нестабильные L-формы микобактерий туберкулёза имеют выраженную склонность к реверсии in vitro в бактериальную форму возбудителя в 71,3 % случаев, что свидетельствует о высоком потенциальном риске их перехода в бактериальную форму в организме больного при благоприятных условиях. В исследованиях с новой питательной средой со стимулятором роста было показано, что микобактерии имеют свой, характерный только для них цикл развития. На основании полученных экспериментальных данных роста M. tuberculosis на новой агаровой среде после их предварительной обработки стимулятором роста было разработано методику ускоренного метода индикации и идентификации M. tuberculosis. Доказана целесообразность использования в лабораторной практике диагностики туберкулёза молекулярно-генетического метода индикации комплекса M. tuberculosis/bovis с использованием тест-набора MS-СКРИН, который позволяет сократить сроки определения наличия микобактерий в клиническом материале от больного.

Ключевые слова: туберкулёз, M. tuberculosis, мультирезистентность, лабораторная диагностика, ускоренные методы диагностики.

Annotation

Trofimova P.S. Perfection of methods of laboratory diagnostics of the tuberculosis on the basis of modern views about biology of its agent. - Manuscript. Thesis for a scientific degree of candidate of medical sciences on a speciality 03.00.07 - microbiology. - Institute of microbiology and immunology by I.I. Metchnikov AMS of Ukraine, Kharkov, 2007.

The dissertation is devoted to the questions of the developing of new accelerated methods for indication and identification of the M. tuberculosis and to exploration of spreading and biological properties of M. tuberculosis strains, which are resistant to drugs against tuberculosis.

Increasing of frequency of detecting multidrug-resistant strains of M. tuberculosis in Kiev and some regions of Ukraine was revealed. The biological properties of those strains of M. tuberculosis were studied. The modified method of proportions for realization of test to drug resistance in M. tuberculosis was introduced in medical practice as more accurate and economically convenient compare to the analogue methods, which are widely used in Ukraine now. The new accelerated methods of indication and identification of M tuberculosis were created on the base of results of cultural investigations with using new agar-medium to growth stimulation and PCR-analysis.

Key words: tuberculosis, M. tuberculosis, multidrugresistance, laboratory diagnostics, accelerated methods of diagnostics.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Нині туберкульоз є однією з найпоширеніших в світі інфекційних хвороб, яка посідає перше місце за смертністю людей від інфекційної патології. Вельми актуальна сьогодні проблема туберкульозу й в Україні (Фещенко Ю.І., Мельник В.М., Кобилянська А.В., 2003; Фещенко Ю.І., 2005). Інтенсивне поширення туберкульозної інфекції супроводжується наростанням агресивних властивостей збудника - високої його життєздатності та медикаментозної стійкості (МС) (Бастиан И., Порталс Ф., 2003; Сазыкин В.Л., 2005).

Неабиякий вплив на зростання захворюваності на туберкульоз має збільшення питомої ваги хіміорезистентних варіантів збудника, що з одного боку погіршує перебіг хвороби, а з іншого - призводить до поширення випадків туберкульозу з множинною МС. Встановлено, що на різних географічних територіях близько 15 - 30% вперше виявлених хворих на туберкульоз заражаються мікобактеріями туберкульозу (МБТ), стійкими до антимікобактеріальних препаратів (АМБП) (Марьяндышев А.О. и соавт., 2005; Балабанова Я.М. и соавт., 2006).

З мікробіологічної точки зору, основними причинами, що призводять до розвитку хіміорезистентності МБТ, є неоднорідність мікобактеріальної популяції, варіабельність її складу і ступеня вірулентності, мінливість біологічних властивостей збудника з одночасною селекцією резистентних особин у результаті неадекватної хіміотерапії (И.Р. Дорожкова и соавт., 2005; О.К. Асмолов і спіавт., 2005; В.В. Николаевский и соавт., 2005). Відомо, що з придбанням M. tuberculosis резистентності хоча б до одного з медикаментозних препаратів, змінюються його біологічні властивості: біохімічні (ферментативні), культуральні, вірулентність та патогенність (Бастиан И., Порталс Ф., 2003; Исакова М.Т. и соавт., 2005). На сучасному етапі є дуже важливим індикація та ідентифікація саме тих варіантів M. tuberculosis, які з різних причин вже зазнали змін, означення їх фенотипічних і генотипічних особливостей, впровадження в практику охорони здоров'я молекулярних методв в поєднанн з рутинними, що дозволить оптимзувати дагностику збудника в бактеріологічних лабораторіях вдкри шлях до фундаментальних дослджень в галуз болог M. tuberculosis. Науково-дослідна робота дозволить оцінити місце молекулярно-біологічних методів діагностики МБТ в порівнянні з традиційними мікробіологічними та визначити показання до їх застосування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках планових науково-дослідних робіт лабораторії мікробіології Інституту фтизіатрії і пульмонології ім. Ф.Г. Яновського АМН України і є частиною наукових тем: “Вивчити частоту виділення та біологічні особливості L-форм мікобактерій туберкульозу у хворих на хронічний деструктивний туберкульоз легень”, № держреєстрації 0198U000756; “Вивчення частоти виділення та механізмів виникнення полірезистентності штамів M.tuberculosis, розповсюджених в даний час в м. Києві та деяких регіонах України”, № держреєстрації 0100U000806; “Вивчити мікробіологічні властивості, частоту і профіль медикаментозної стійкості M. tuberculosis у хворих з вперше виявленим туберкульозом легень в сучасних умовах” № держреєстрації 0100U000806.

Мета дослідження: удосконалення лабораторних методв дагностики туберкульозу шляхом вивчення бологчних властивостей збудника та особливостей формування його резистентност до антимкобактеральних препаратв.

Задачі дослідження:

1. Оцнити рвень мікробіологічного підтвердження туберкульозу у хворих, що знаходилися на лкуванн в нституті фтизіатрії і пульмонології за останн роки, визначити бологчні властивості збудників.

2. Модифікувати метод пропорцій для визначення стійкості штамів M. tuberculosis, щодо протитуберкульозних засобів різних рядів.

3. Провести аналіз частоти медикаментозної стійкості штамів M. tuberculosis, виділених від хворих з вперше діагностованим туберкульозом легень.

4. Вивчити частоту видлення L-трансформованих форм M. tuberculosis на різних етапах антибактеріальної терапії і х бологчні властивості у хворих на туберкульоз легень.

5. Означити особливост бологчного розвитку мікобактерй на сконструйованому поживному середовищ з стимулятором росту і розробити прискорений метод індикації M. tuberculosis.

6. Обґрунтувати доцільність використання тест-набору MS-СКРИН для ндикації комплексу M. tuberculosis/bovis в полмеразнй ланцюговй реакц.

Об'єкт дослiдження: штами M. tuberculosis від хворих на туберкульоз легень.

Предмет дослідження: біологічні властивості різних варіантів M. tuberculosis.

Методи дослідження: мікробіологічні, в тому числі прискорен: система BBL MGIT AST SIRE, середовище з стимулятором росту - для виявлення мікобактерій туберкульозу та їх змінених варіантів і вивчення медикаментозної чутливості до рифампіцину; генетичні - для діагностики туберкульозу за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для прискореної індикації та ідентифікації збудника туберкульозу; статистичні - для оцінки вірогідності результатів. Дані щодо резистентності штамів M. tuberculosis, отриманих від хворих з вперше діагностованим туберкульозом легень (ВДТЛ), накопичувались і статистично оброблялись створеною нами сумісно з міжнародною організацією PATH “Електронною системою обліку стійкості до антимікобактеріальних препаратів у туберкульозі”.

Наукова новизна отриманих результатів. Вивчена розповсюдженість медикаментозностійких варіантів M. tuberculosis, видлених вд хворих, що знаходилися на лкуванн в нституті фтизіатрії і пульмонології (ІФП) за останн роки, означено х бологчні властивості. Розроблена модифікація методу пропорцій для визначення медикаментозної стійкості штамів M. tuberculosis. Вперше досліджена частота виділення та біологічні особливості L-форм МБТ у хворих на туберкульоз легень. Доведено співпадання морфологічних, культуральних, тинкторіальних та ферментативних властивостей ревертантних культур і типових М. tuberculosis, виділених у одних і тих самих хворих. Підтверджено, що ревертантні штами нестабільних L-форм МБТ зберігають притаманну туберкульозу вірулентність для морських свинок. Вивчено особливості розвитку M. tuberculosis на сконструйованому поживному середовищі зі стимулятором росту та розроблено метод прискореної індикації і ідентифікації M. tuberculosis на його основі. Вперше обґрунтована і доведена ефективність застосування тест-набору MS - СКРИН для ндикац комплексу M. tuberculosis/bovis в ПЛР з клінічного матеріалу хворих на туберкульоз.

Практичне значення результатів дослідження. Виділені й охарактеризовані медикаментозностійкі штами M. tuberculosis, які циркулюють в даний час на території України. В останні роки збільшилась кількість штамів з резистентністю до 4-х, 5-ти, 6-ти і навіть 7-ми препаратів, що, безсумнівно, є відображенням несприятливої ситуації в Україні стосовно туберкульозу у пацієнтів з вперше діагностованим захворюванням. Означено біологічні властивості таких штамів, що дає практичну можливість прогнозування епідеміологічної ситуації з туберкульозу в окремих регіонах.

Розроблено мікробіологічні основи організації і проведення моніторингу за медикаментозностійкими штамами M. tuberculosis та сформовано концепцію створення реєстру хіміорезистентного туберкульозу в Україні. Встановлена зворотньо-пропорційна залежність між виділенням типових форм збудника та його L-трансформованими варіантами. Виявлено, що чутливість до антибактеріальних препаратів у культур-ревертантів співпадає з такою у типових М. tuberculosis, виділених від одного і того ж хворого. На основі нового поживного середовища зі стимулятором росту розроблено метод індикації та ідентифікації M. tuberculosis, який дозволяє в значно коротші строки виявити збудника з клінічного матеріалу хворого. Обґрунтовано застосування тест-набору MS - СКРИН для генетичної діагностики туберкульозної інфекції. Показана його вища ефективність в порівнянні з рутинними методами мікробіологічної діагностики туберкульозу. Результати дослідження створюють передумови для покращення мікробіологічної діагностики туберкульозу. Крім того, виявлення нетипових форм мікобактерій туберкульозу, які під дією тих чи інших факторів змінили свої біологічні властивості, має клінічне та епідеміологічне значення для виявлення збудника туберкульозу у тих випадках, коли виявити збудник при звичайних мікробіологічних дослідженнях не вдається.

Отримані в процесі роботи дані увійшли до наказу МОЗ України від 06.06.02 р. за № 45 та впроваджені в практику закладів протитуберкульозної мережі України.

Особистий внесок здобувача. Автором проаналізовано наукову літературу з даної проблеми, проведено ретроспективний аналіз розповсюдження штамів M. tuberculosis, самостійно виконано всі мікробіологічні і біологічні експерименти. Визначено методичні підходи при проведенні експериментальних досліджень, статистичній обробці даних, аналізі і порівнянні отриманих результатів та співставлення їх з даними літератури.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації оприлюднено на конкурсі науково-технічних проектів “Інтелектуальний потенціал молодих вчених - місту Києву” (3 премія, Київ, 2001); Республіканському науково-практичному семінарі для лікарів-бактеріологів протитуберкульозних закладів України “Прискорена мікробіологічна діагностика туберкульозу з використанням нового середовища” (Київ, 2002); ІІІ з'їзді фтизіатрів і пульмонологів (Київ, 2003); науково-практичному семінарі для лікарів-бактеріологів протитуберкульозних закладів України “Культуральні методи діагностики туберкульозу та впровадження методу пропорцій для визначення медикаментозної стійкості M. tuberculosis” (Київ, 2004); XIV з'їзді мікробіологів, епідеміологів та паразитологів (Полтава, 2004); науково-практичному семінарі “Мікробіологічні методи дослідження на туберкульоз та організація системи контролю якості при їх виконанні” (Київ, 2005); науково-практичному семінарі “Контроль якості культуральних методів діагностики туберкульозу” (Київ, 2005); ІІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції з міжнародною участю “Біотехнологія. Освіта. Наука. Практика” (Харьков, 2006).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 20 наукових праць, з них 10 у профільних журналах, визначених ВАК України, 4 методичних рекомендацій, 3 інформаційних листи, 3 тез, 2 патенти України, “Інструкція з мікробіологічної діагностики туберкульозної інфекції”, затверджена Наказом МОЗ України № 45 від 06.02.2002 р.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 164 сторінках друкованого тексту, ілюстрована 23 таблицями, 19 рисунками, складається із вступу, 6 розділів (огляд літератури, 5 розділів власних досліджень), аналізу і узагальнення результатів досліджень, висновків, практичних рекомендацій та списку 143 використаних джерел.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. В роботі використано характеристики 11890 штамів M. tuberculosis, вилучені із зразків клінічного матеріалу хворих на туберкульоз легень, що знаходилися на стаціонарному лікуванні в ІФП з 1990 по 2005 роки. Отримано і досліджено 129 культур L-трансформованих форм збудника туберкульозу, із них 92 культури реверсували в бактеріальну форму МБТ і віднесені до нестабільних L-форм, а 37 культур не дали реверсії після 3-х пасажів in vitro і віднесені до умовно-стабільних L-форм МБТ. Вивчено біологічні властивості (морфологічні, культуральні, тинкторіальні, ферментативні, чутливість до антимікобактеріальних препаратів) у 87 штамв МБТ, отриманих після реверсії нестабільних L-форм. Дослджено врулентнсть для морських свинок 12 ревертантних культур МБТ, які отримані із нестабльних L-форм збудника туберкульозу. Для ідентифікації виділених штамів використано культурально-біохімічні тести: нациновий тест (наявність здатності продукувати нікотинову кислоту), нітратредуктазний тест, визначення окисно-відновних ферментів, визначення термостабльност каталази, реакцію гідролізу твіну-80 визначали за допомогою тест-наборів фірми “TULIP” (Індія), спроможність росту клнчних ізолятів мкобактерй оцінювали на середовищ з салциловокислим натрєм та паранітробензойною кислотою.

Гістологічні препарати готували з різних ділянок уражених органів тварин (селезінка, нирка, печінка, легені). Усього приготовлено, досліджено та задокументовано в оптичному світловому мікроскопі Olympus BX 51 з цифровою камерою С 5050 ZOOM 432 препарати з 144 блоків (лабораторія патоморфології ІФП). Для ПЛР-дагностики використано тест-набір MS-СКРИН для ндикац комплексу M. tuberculosis/bovis з клінічного матеріалу. Для відтворення специфічного патологічного процесу туберкульозної інфекції і отримання від тварин не змінених морфологічно штамів M. tuberculosis використано 37 морських свинок.

Посів на нове поживне середовище здійснювали наступним чином: тритижневі культури M. tuberculosis, вирощені на середовищі Левенштейна-Єнсена, знімали тампоном і змішували зі стимулятором росту до одержання гомогенної суспензії із розрахунку 1-2 млн. мікробних тіл у 1,0 мл суспензії. Склад стимулятора росту: рідин - 0,04 г, сахароза - 0,3 г, натрій двовуглекислий - 0,01 г, вода дистильована - до 100 мл, в основі якого міститься поверхнево-активна речовина, яка сприяє зниженню рівня восків в клітині бактерій, що призводило до різкої зміни швидкості росту. Суспензію в об'ємі 1,5 мл витримували при 37 ⁰С протягом 24-48 годин, після чого пересівали на чашки Петрі із свіжоприготованим агаровим поживним середовищем, рівномірно розподіляли по всій поверхні середовища, потім чашки Петрі не перевертаючи герметично закривали клейкою стрічкою (скотчем). Посіви переглядали щодня та інкубували 10 діб. З появою візуального росту культури відзначали початок росту, готували два мазки, один з яких забарвлювали за Цилем-Нільсеном, другий водно-спиртовим розчином метиленового синього. З метою виділення L-форм МБТ досліджувалося свіжо зібране харкотиння від хворих. В роботі керувалися методичними рекомендаціями під редакцією І.Р. Дорожкової і співавт., 1984.

Методи статистичної обробки отриманих результатів. Отримані результати статистично оброблено за загальноприйнятими методами варіаційної і кореляційної статистики з використанням значень середньої арифметичної (М), помилки середньої арифметичної (m), критерію Ст'юдента, рівня значущості (р). Результати власних досліджень та їх обговорення. Проведено ретроспективний аналіз 11890 штамів M. tuberculosis, виділених від хворих протягом 13 років. Виявлено динаміку виділення чутливих і резистентних штамів МБТ до АМБП по роках (рис. 1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Динаміка чутливості до АМБП штамів МБТ, виділених за період 1990-2002 рр.

Ретроспективний аналіз даних показав, що в 1990 р. M. tuberculosis, чутливі до АМБП, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, в 2002 р. їх кількість не перевищувала 24,3 %, тобто за даний період часу цей показник знизився в 2,2 рази, а питома вага хіміорезистентних штамів МБТ зросла в 1,6 разів - з 46,5 % до 75,5 %.Аналіз структури МС МБТ у стаціонарі ІФП за 1990 - 2002 рр. відображають дані табл. 1.

Таблиця 1. Структура медикаментозної стійкості до АМБП штамів МБТ, виділених за період 1990 - 2002 рр.

Наведені дані свідчать, що в структурі медикаментозної стійкості M. tuberculosis за останні 13 років переважали мульти- і полірезистентні варіанти. При цьому прослідковується чітка тенденція росту рівня виділення мультирезистентних штамів M. tuberculosis. Показники вилучення мультирезистентних штамів M.tuberculosis зросли на 27,6 % (з 40,5 % до 68,1 %), тобто в 1,7 рази. Важливо відзначити, що якщо в 1990 р. питома вага мультирезистентних штамів МБТ від загального числа виділених штамів збудника туберкульозу складала 18,9 %, то в 2002 р. цей показник виріс у 2,7 рази і досяг рівня 51,6 %.Результати проведених досліджень є відображенням епідеміологічної ситуації, що загострилася в Україні за останні роки. Слід відзначити особливо різке збільшення рівня мультирезистентності збудників (у 1,9 разів) за період 1995 - 2002 рр., що слід рахувати закономірним процесом в обстановці розвитку епідемії. Виявлено статистично достовірне різке зниження частоти виділення монорезистентних штамів МБТ за відповідний період з 37,9 % у 1990 р. до 15,7 % у 2002 р., тобто на 22,2 % або в 2,4 рази. Значний спад рівня монорезистентності підтверджується ще й тим, що в загальній структурі стійкості збудників питома вага виділених штамів МБТ, резистентних до 1 препарату, за період 1990 - 2002 pp. зменшилася в 1,5 рази (з 17,6 % до 11,9 %).

В 1990-2002 рр. визначення МС M. tuberculosis проводилось за методом абсолютних концентрацій, який на той час був загальноприйнятим та використовувався всіма бактеріологічними лабораторіями протитуберкульозної мережі України. Використання ж методу пропорцій обґрунтовує мікробіологічні підходи проведення моніторингових досліджень за МС в країні і створює перспективи інтеграції у світову моніторингову мережу спостереження за резистентністю збудників туберкульозу. Моніторинг за МС M. tuberculosis особливо важливий для контингенту з вперше виявленим туберкульозом легень, а дані про первинну резистентність і спостереження за нею служать показником ефективності лікування хворих на туберкульоз.

Нами запропоновано модифікований метод пропорцій з використанням 2-х контролів, як більш економічний, необхідною також є уніфікація постановки досліджень визначення МС МБТ для препаратів 1-го і 2-го ряду з використанням єдиного критерію резистентності - 1,0 %, що істотно полегшує процедуру постановки даного тесту.

Результати проведених досліджень дозволяють запропонувати та узгодити з ВООЗ внесення змін у величини критичних концентрацій АМБП в середовищі з препаратами 1-го і 2-го ряду відповідно до 1,0 % критичної пропорції. Головною перевагою модифікованого нами методу пропорцій є те, що він дозволяє оцінити бактеріальну популяцію M. tuberculosis не тільки як чутливу або стійку, але й розподілити її за ступенем резистентності.

Таким чином, на другому етапі нами вивчено рівень і профіль первинної МС штамів МБТ, виділених від хворих з вперше діагностованим туберкульозом легень в 2003 - 2005 рр, за методом пропорцій, оскільки саме первинна МС є основою для проведення моніторингу за хіміорезистентним туберкульозом (табл. 2).

Таблиця 2. Структура МС МБТ до АМБП по роках

Отже, в структурі МС варіантів МБТ, які циркулювали серед хворих на ВДТЛ, прослідковується висока розповсюдженість мультирезистентних штамів МБТ та тенденція щодо збільшення рівня їх виділення від хворих. Виходячи з того, що за період 1990 - 2005 рр збільшилася частота виділення МС штамів МБТ та з'явилися варіанти M. tuberculosis, стійкі до 6-ти і більше АМБП, можна зробити висновок щодо погіршення епідемічної ситуації з туберкульозу в країні, відображенням якої є епідемія хіміорезистентного туберкульозу в Україні. З метою з'ясування причин виникнення такої ситуації проведена робота по вивченню біологічних властивостей МС штамів M. tuberculosis.

Встановлено, що наявність у збудника резистентності до АМБП супроводжується затримкою росту особин мікобактеріальної популяції, що найбільш виражено при множинній МС. Масивність бактеріовиділення зростає по мірі збільшення числа хіміопрепаратів, до яких реєструється стійкість. Зменшення швидкості росту та масивність бактеріовиділення можуть служити непрямою ознакою наявності у хворого стійких до АМБП варіантів МБТ. Зниження активності каталази і пероксидази у окисно-відновних процесах мікробної клітини МБТ, втрата корд-фактору також опосередковано можна враховувати за показник стійкості збудника до АМБП, в першу чергу до ізоніазиду. Таким чином, доведено необхідність терміново налагоджувати в Україні епідеміологічний контроль за резистентністю до АМБП та створювати реєстр бактеріовиділювачів і Національний реєстр хіміорезистентного туберкульозу, а також проводити централізований моніторинг за хіміорезистентним туберкульозом і рахувати його за основний показник роботи бактеріологічних лабораторій, які проводять діагностику туберкульозу. Передумови для вирішення цієї проблеми нами створено мікробіологічні основи проведення моніторингу за МС M. tuberculosis.

Більшість дослідників за часів Роберта Коха вважали, що M. tuberculosis є формою, здатною еволюціонувати, хоча сам Кох дотримувався думки щодо мономорфізму цього збудника. Ми керувалися тим положенням, що у всьому різноманітті морфологічних форм можна передбачити наявність особливого циклу розвитку бактерій, окремі стадії якого можуть мати різне значення при інфекції. В теперішній час вважається, що клітини збудника туберкульозу являють собою тонкі, прямі або злегка зігнуті палички. Морфологія суттєво варіює в залежності від віку культури та умов культивування - в молодих культурах палички більш довгі, а в старих схильні до простого галуження. Іноді утворюють коковидні структури та L-форми, які зберігають інфекційність, а також форми, що фільтруються. В наших дослідженнях ми зробили спробу з'ясувати роль змінених форм МБТ в патології людини.

Розділ 4. досліджень присвячено вивченню частоти виділення та біологічних особливостей L-форм мікобактерій у хворих на туберкульоз легень. За результатами мікробіологічного дослідження мокротиння хворих на туберкульоз легень всіх пацієнтів поділено на 4 групи: хворі, які виділяли одночасно МБТ і L-форми; хворі, які виділяли тільки МБТ; хворі, в мокротинні яких знайдено лише L-форми та хворі, які не виділяли збудника туберкульозу. Всього L-форми висіяні у 43,6 % обстежених хворих. У 37,2 % пацієнтів вилучені тільки типові МБТ. У решти - 19,2 % хворих жодної форми збудника не знайдено. Всі виділені штами L-форм МБТ розподілено на 2 групи: нестабільні та умовно-стабільні. До категорії нестабільних L-форм віднесено 92 (71,3 %) штами, які через 1-3 пасажі in vitro реверсували в бактеріальну форму збудника. Ці нестабільні L-форми збудника, на нашу думку, найбільш небезпечні, оскільки вони можуть реверсувати в бактеріальну форму МБТ і спричиняти рецидив захворювання. До категорії умовно-стабільних L-форм було віднесено 37 (28,7 %) штамів, які після 3-х пасажів in vitro нереверсували. Нестабльн L-форми з біологічної точки зору вельми цікаві, оскльки саме вони найбльш небезпечні, реверсуючи при сприятливих умовах в бактеральну форму МБТ в органзм хворого. Існу реальна можливсть вивчити х властивост, дослджуючи бологчн особливост ревертантних культур: х тинкторальн, культуральн та морфологчн властивост, чутливсть до АМБП, каталазну активнсть, рст на середовищ з салциловокислим натрм, врулентнсть для лабораторних тварин.

Нами вивчено біологічні особливості 87 ревертантних штамів, отриманих з нестабільних L-форм МБТ, які були одержані від хворих на туберкульоз легень. Ці властивості в порівнянні з такими у типових МБТ, виділених у тих же хворих за морфологічними, культуральними, тинкторіальними та ферментативними ознаками ревертантних культур і типових М. tuberculosis, виділених у одних і тих самих хворих, повністю співпадають. Також було з'ясовано, що в більшості випадків чутливість (або стійкість) культур-ревертантів до АМБП повністю співпадає, якщо L-форми і типові МБТ були виділені одночасно або в близькі строки (до 2-х міс.). Якщо ж L-форми були виділені через значний час після виділення типових МБТ (2-5 міс.), то у ревертантних штамів в ряді випадків спостерігалася поява стійкості до нових препаратів, якими лікувався хворий, і до яких типові МБТ були раніше чутливими, або ж підсилюється ступінь уже раніше встановленої стійкості.

Можна припустити, що процес формування стйкост МБТ до АМБП знаходиться у прямому зв'язку з тривалстю антибактерально терап, що в рвнй мр можна вднести як до типових форм збудника, так до його L-трансформованих варантв. Тобто L-трансформаця являться закономрним етапом розмноження МБТ в процес х онтогенетичного розвитку, а видлення типових МБТ псля тривалого часу х вдсутност результат реверс L-форм в органзм хворого. Персистенція збудника туберкульозу в організмі людини, очевидно, відбувається саме в його L-трансформованому варіанті (в умовно-стабільній L-формі). Досліджено вірулентність для морських свинок 12 культур-ревертантів, отриманих з нестабільних L-форм МБТ. Доведено, що ревертантні штами нестабільних L-форм МБТ зберігають властиву туберкульозу вірулентність для морських свинок. Подальша робота була спрямована на пошук закономірностей системи розвитку M. tuberculosis (5 розділ). До того ж слід додати, що до цього нас підштовхнула сама родова назва збудника туберкульозу - Mycobacterium (яка нагадує форму міцелію гриба). Отже, існують інші, які відрізняються від класичного уявлення про мікобактерії і їх неможливо віднести до L-форм.

У всьому розмаїтті морфологічних форм логічно передбачити наявність особливого циклу розвитку бактерій, окремі стадії якого можуть мати різне значення при інфекції. При цьому ми враховували особливості хімічного складу клітини M. tuberculosis - в клітині міститься 10,0-40,0 % ліпідів. Вони складаються з трьох фракцій: фосфатидна (та, що розчиняється в ефірі й не розчиняється в ацетоні), жирова (та, що розчиняється в ефірі та ацетоні) і воскова (та, що розчиняється у хлороформі та ефірі, але не розчиняється в алкоголі, ефірі, ацетоні, метиловому алкоголі). Саме остання фракція, на наш погляд, є основним фактором, який затримує швидкість росту мікобактерій, шляхом утруднення надходження поживних речовин до цитоплазматичної мембрани та в клітину бактерій, являючи собою полісахарид, який пов'язаний з міколовими кислотами та пептидами. Віск відіграє значну роль у стримані процесів обміну в життєдіяльності клітини M. tuberculosis.

При використанні попередньої обробки M. tuberculosis спеціальним складом - “стимулятором росту”, який сприяє зниженню рівня восків в клітині бактерій, а також нового агаризованого середовища, було виявлено, що поряд зі зміною швидкості росту мікобактерій, спостерігається виражений їх поліморфізм. На агаровому середовищі після добової експозиції в “стимуляторі росту” штами мікобактерій давали візуальний ріст, починаючи з 3-ї доби, рясний газонний ріст культур фіксували на 45 добу. При збільшенні експозиції в стимуляторі на 1 добу (до 48 годин) було виявлено підсилення інтенсивності росту M. tuberculosis незначний ріст визначали візуально, починаючи з 2-ої доби інкубації, газонний ріст культур на 3-ю добу спостереження. M. tuberculosis на агаровому середовищі мали характерні культуральні властивості: колонії соковиті, трохи матові з жовтуватим відтінком, по консистенції восково-маслянисті, легко відокремлюються від агару. За допомогою мікроскопії було виявлено наступні морфологічні варіанти мікобактерій туберкульозу коковидні і овоїдні клітини, що переходили з часом у диплококові і паличковидні форми, які в свою чергу поступово переходять у колбовидні клітини.

Ми намагалися одержати ревертантні культури, які або частково, або цілком відновили б властивість кислотостійкості, а морфологію цілком. Це вдалося за допомогою пересіву культур з агарового середовища на традиційне поживне середовище Левенштейна-Єнсена, але без додавання малахітового зеленого. Приготовлені мазки культур у початковий період росту на такому середовищі дозволяли знайти велику кількість дрібних і великих коковидних форм, іноді таких, що галузяться. Подальший розвиток призводив до утворення ниткоподібних форм, які деструктуризувалися і розпадалися з утворенням паличковидних форм характерних для M. tuberculosis (палички Коха) тонких, паличковидних клітин з характерною кислотостійкістю.

Відбирано культури M. tuberculosis, що виростали на агаровому середовищі після попередньої обробки стимулятором росту та на поживному середовищі Левенштейна-Єнсена без малахітового зеленого, що виростали в результаті пересіву з агарового середовища, які потім змивали ізотонічним розчином хлориду натрію. Отримані суспензії ділили на частини. З першої порції суспензії готували мікроскопічні препарати і досліджували під мікроскопом, другу порцію засівали на рідке поживне середовище Школьнікової, третю порцію використовували для біологічної проби - зараження лабораторних тварин, а саме морських свинок, з метою відтворення специфічного патологічного процесу туберкульозу в макроорганізмі. Для підтвердження належності культур до виду M. tuberculosis використовували експрес-тести для ідентифікації Microxpress (виробництва фірми Tulip Diagnostics (p) LTD, Індія). Використання ніацинового, нітратредуктазного, каталазного тестів дозволило віднести культури, що виросли, до виду M. tuberculosis. Таким чином, нами виявлено, що розмноження M. tuberculosis після попередньої обробки стимулятором росту на агаровому поживному середовищі має свої особливості. І це явище характерно для всіх культур M. tuberculosis.

При посіві другої порції суспензії, отриманої з культури, що виростала на агаровому середовищі та яєчному середовищі Левенштейна-Єнсена без малахітового зеленого, на рідке поживне середовище Школьнікової, через 5-8 діб спостерігалося формування на поверхні вказаного середовища тонкої плівки, що характерно для L-форм M. tuberculosis. При мікроскопії мазків з цієї плівки виявлялися ниткоподібні утворення. Вони мали різну будову: розгалужену, нерозгалужену або у вигляді порожніх трубочок, схожих на тендітну сітку або каркас. На їх поверхні в більшості випадків відмічено потовщення.

Третя частина суспензії використовувалася для зараження морських свинок з метою відтворення специфічного патологічного процесу туберкульозу в макроорганізмі. Введення різних за морфологією клітин M.tuberculosis в організм морських свинок призводило до розвитку у тварин патологічного процесу, специфічного для туберкульозу. Зроблені нами висновки про те, що видозмінені клітини, які відрізнялися морфологічно від клітин виду M.tuberculosis, належать саме до цього виду, підтвердилися даними гістологічного дослідження органів і тканин морських свинок. Після підшкірного зараження морських свинок загибель від генералізованого туберкульозного процесу наставала у середньому через 45-50 діб в усіх експериментальних групах. Слід відмітити, що ми не акцентували увагу коли наступала загибель в дослідних групах. Важливо було дослідити експериментальний туберкульоз, довести це симптоматикою, специфічною зміною органів тварин, морфологічними дослідженнями і, безумовно, верифікувати діагноз, виділив типову туберкульозну паличку, яка б володіла усім комплексом морфологічних, тінкториальних, культуральних і біохімічних властивостей. Це основні постулати-критерії Р. Коха, які викладені 24 березня 1882 р. на засіданні Берлінської фізіологічної спілки, які є обов'язковими для оцінки патогенності будь-якого мікроорганізму.

На розтині загиблих морських свинок спостерігалася картина генералізованого туберкульозу. Експериментальні дані щодо симптоматики, специфічних змін органів тварин та результатів морфологічних досліджень викладено в главі 5. Головний висновок - видозмінені клітини, які відрізнялися морфологічно від клітин виду M.tuberculosis, належать саме до цього виду, що підтвердилося даними морфологічного дослідження органів і тканин морських свинок. З патоморфологічного матеріалу всіх загиблих тварин, що знаходилися в експерименті, вилучено типову туберкульозну паличку.

Проведена робота з морфологічно зміненими клітинами M. tuberculosis переконала нас, що мікобактерії мають свій, характерний лише для них цикл розвитку, який до теперішнього часу ще остаточно не означено. Отримані експериментальні дані росту M. tuberculosis на агаровому середовищі після їх попередньої обробки стимулятором росту підштовхнули нас провести додаткові дослідження й відпрацювати методику прискореного методу індикації та ідентифікації M. tuberculosis. На основі проведених досліджень отримано патент на “Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих” та розроблено корисну модель “Спосіб визначення стійких до рифампіцину M. tuberculosis”.

В розділі 6. власних досліджень з метою реалзац генетичних пдходв до дагностики туберкульозно нфекц обгрунтовано доцільність використання тест-набору для індикації комплексу M. tuberculosis/bovis в ПЛР за допомогою “Набору реактивів для виявлення дезоксирибонуклеїнової кислоти M. tuberculosis, М. bovis (“MYC - ТЕSТ”), що складається з трьох комплектів: № 1 - для виділення ДНК із клінічного матеріалу, № 2 - для ампліфікації ДНК M. tuberculosis, М. bovis, № 3 - для поділу ДНК методом електрофорезу в гелі агарози. Набір MYC - ТЕSТ забезпечує ампліфікацію фрагменту інсерційного елемента IS6110 хромосоми M. tuberculosis, М. bovis і дозволяє знайти мікобактерій при їх мінімальній кількості до 50 клітин.

Нами було порівняно дані посівів на рідке середовище BBL MGIT з наступним виявленням ДНК методом ПЛР і посівів на нове агаризоване середовище зі стимулятором росту також з наступним виявленням ДНК методом ПЛР. Посів мокротиння на рідке живильне середовище BBL MGIT з наступною детекцією ДНК методом ПЛР дозволив виявити мікобактерії в досить короткий термін у хворих, що дали негативний результат у 1-у добу дослідження методом ПЛР. Аналогічні результати отримано при використанні агаризованого поживного середовища зі стимулятором росту з наступною детекцією ДНК методом ПЛР, але в ще більш ранні терміни - на 5-6 добу.

Отже, як показали дослідження, перспективним є впровадження в лабораторну дагностику туберкульозу молекулярно-генетичного методу ндикац комплексу M. tuberculosis/bovis з використанням тест-набору MS-СКРИН, що дозволя скоротити термін визначення наявності мкобактерй у хворого. В порівнянні з традиційними мікробіологічними методами (бактеріоскопія, люмінесцентна мікроскопія, бактеріологічний метод) пропонований метод є більш чутливим.

Висновки

В роботі вирішено актуальну наукову задачу - удосконалено існуючі методи індикації та ідентифікації збудника туберкульозу та розроблено нові прискорені методи для покращення мікробіологічної діагностики туберкульозу. Обґрунтовано мікробіологічні підходи проведення моніторингових досліджень за медикаментозною стійкістю в країні, що створює перспективи інтеграції у світову моніторингову мережу спостереження за резистентністю збудників туберкульозу.

1. За період 1990-2002 рр. виявлено збільшення частоти виділення медикаментозностійких штамів МБТ та появу варіантів M. tuberculosis, стійких до 6-ти і більше антимікобактеріальних препаратів, що свідчить про погіршення епідемічної ситуації з туберкульозу в країні, відображенням якої є епідемія хіміорезистентного туберкульозу в Україні. Так, якщо в 1990 р. M. tuberculosis, чутливі до антимікобактеріальних препаратів, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, то в 2002 р. їх кількість не перевищувала 24,3 % (р < 0,001), тобто за даний період часу цей показник знизився в 2,2 рази, а питома вага хіміорезистентних штамів МБТ зросла майже в 1,6 разів - з 46,5 % до 75,5 % (р < 0,05).

2. В 2003-2005 рр. виявлено високу розповсюдженість мультирезистентних штамів МБТ, які циркулюють серед хворих на вперше діагностований туберкульоз легень. В 2003 р. кількість таких штамів становила 13,6 %, а в 2005 р. - 16,9 %, тоді як експерти ВООЗ встановили, що 3,0 % поріг є дуже небезпечним і може привести до неконтрольованої ситуації з туберкульозу.

3. Запропоновано і впроваджено в практику модифікований метод пропорцій для постановки тесту медикаментозної стійкості з використанням 2-х контролів, як більш точний та економічний у порівняні з методами, що існували в Україні.

4. Вивчені біологічні властивості у резистентних до антимікобактеріальних препаратів штамів МБТ підтверджують, що стійкість супроводжується затримкою росту особин мікобактеріальної популяції, особливо при множинній медикаментозній стійкості. Масивність бактеріовиділення має тенденцію до росту по мірі збільшення числа хіміопрепаратів, до яких реєструється стійкість. Зниження активності каталази і пероксидази у окисно-відновних процесах мікробної клітини МБТ є допоміжним показником стійкості збудника до антимікобактеріальних препаратів, в першу чергу до ізоніазиду.

5. У хворих на туберкульоз легень L-форми МБТ були виділені у 43,6 % пацієнтів, в переважній більшості бактеріовиділювачів типових МБТ через 1-5 міс. після початку лікування. Виділені L-форми характеризувалися нестабільністю, виразною схильністю до реверсії in vitro в бактеріальну форму збудника в 71,3 % випадків, що свідчить про високий потенційний ризик їх переходу в бактеріальну форму в організмі хворого при сприятливих умовах.

6. Встановлено, що морфологічні, тинкторіальні, культуральні та ферментативні властивості ревертантних штамів, отриманих з нестабільних L-форм МБТ, повністю співпадають з властивостями типових МБТ, отриманих у тих же хворих, чутливість культур-ревертантів до антимікобактеріальних препаратів співпадає з такою у типових МБТ, виділених від одного і того ж хворого, а також вони зберігають вірулентність для морських свинок, яка притаманна збуднику туберкульозу.

7. Вивчено особливості розвитку M. tuberculosis на новому агаризованому поживному середовищі зі стимулятором росту та розроблено метод прискореної індикації і ідентифікації M. tuberculosis на його основі. Отримано патент на “Спосіб виділення мікобактерій туберкульозу з патологічного матеріалу хворих” та розроблена корисна модель “Спосіб визначення стійких до рифампіцину M. tuberculosis”. Нове агаризоване середовище дозволяє отримати культуру мікобактерій туберкульозу на 3 добу. Доведено, що отримана культура, яка має нетрадиційну для M. tuberculosis морфологію, є однією із стадій її розвитку.

8. Обґрунтовано необхідність проведення мікробіологічної діагностики туберкульозу за допомогою молекулярно-генетичного методу ндикац комплексу M. tuberculosis/bovis з використанням тест-набору MS-СКРИН, який дозволя скоротити термін визначання наявності мкобактерй у хворого до однієї доби.

9. Ретроспективний аналіз даних показав, що в 1990 р. M. tuberculosis, чутливі до АМБП, складали 53,5 % від усіх виділених штамів МБТ, в 2002 р. їх кількість не перевищувала 24,3 %, тобто за даний період часу цей показник знизився в 2,2 рази, а питома вага хіміорезистентних штамів МБТ зросла в 1,6 разів - з 46,5 % до 75,5 %.

Практичні рекомендації.

1. Впровадження стандартизованих мікробіологічних методик дозволить покращити виявлення МБТ та визначення їх медикаментозної стійкості. Організація моніторингу за медикаментозною стійкістю МБТ можлива тільки завдяки використанню методу пропорцій, яка є пріоритетним завданням у контролі над епідемією хіміорезистентного туберкульозу в Україні.

2. Моніторинг за медикаментозною стійкістю МБТ особливо важливий для контингенту з вперше виявленим туберкульозом легень, тому що дані про первинну резистентність і спостереження за нею служать показником ефективності заходів щодо боротьби з туберкульозом. Впровадження “Електронної системи обліку стійкості до антимікобактеріальних препаратів у туберкульозі”, мікробіологічних основ організації і проведення моніторингу за медикаментозностійкими штамами M. tuberculosis та сформована концепція створення реєстру хіміорезистентного туберкульозу в Україні дозволить в короткий час налагодити централізований моніторинг за хіміорезистентним туберкульозом.

3. Інтенсивна хіміотерапія складає передумови формуванню варіантів МБТ зі суттєво зміненими біологічними властивостями. Виявлення нетипових форм мікобактерій туберкульозу може мати значення при підтвердженні діагнозу туберкульозу у осіб, які потребують особливого бактеріологічного контролю, коли виявити збудник рутинними мікробіологічними дослідженнями не вдається.

4. Обґрунтованим є застосування молекулярно-генетичних методів діагностики туберкульозу. Але, враховуючи високу вартість необхідного обладнання, раціональним є комплексне використання фено- та генотипічних методів дослідження в лабораторіях 4-рівня, з поступовим розширенням виконання цих методик в лабораторіях 3-го рівня, тобто на рівні обласних протитуберкульозних закладів України.

Список праць за темою дисертації

туберкульоз резистентність хворий

1. Динамика изменений спектра лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёза, выделенных от больных, находившихся на стационарном лечении в 1990-1999 гг. / Фещенко Ю.И., Журило А.А., Барбова А.И., Клименко М.Т., Самойленко С.И., Трохимова П.С., Вялых Ж.Э. // Укр. хіміотерапевт. журн. - 2000. - № 3. - С. 12-16.

2. Біологічні особливості L-форм мікобактерій туберкульозу, що виділені у хворих на туберкульоз легень / Чернушенко К.Ф., Журило О.А., Клименко М.Т., Барбова А.І., Ясир С.Г., В'ялих Ж.Е., Трофімова П.С. // Укр. пульмонол. журн. - 2002. - № 2. - С. 48-50.

3. Резистентність мікобактерій туберкульозу до фторхінолонів / Журило О.А., Барбова А.І., Клименко М.Т., Черенько С.О., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Іванкова О.В. // Укр. хіміотерапевт. журн. - 2002. - № 3-4. - С. 45-48.

4. Ситуація з мультирезистентного та полірезистентного туберкульозу в м. Києві / Журило О.А., Турченко Л.В., Клименко М.Т., Барбова А.І., Трофімова П.С., В'ялих Ж.Е., Миронченко С.В., Бочко Н.В., Карнаухова М.М. // Укр. пульмонол. журн. - 2002. - № 3. - С. 36-39.

5. Распространённость и структура лекарственной устойчивости M. tuberculosis у больных, находившихся на стационарном лечении в Институте фтизиатрии и пульмонологии в 2000-2002 гг. / Фещенко Ю.И., Журило А.А., Барбова А.И., Веселовский Л.В., Трохимова П.С., Миронченко С.В., Спасенко Е.В. // Укр. хіміотерапевт. журн. - 2003. - № 3 - 4(18). - С. 3-6.

6. Ретроспективне дослідження первинної медикаментозної резистентності M. tuberculosis у вперше виявлених хворих на туберкульоз легень по м. Києву за 2002-2003 рр. / Журило О.А., Барбова А.., Клименко М.Т., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Карнаухова М.М., Бочко Н.В., Веселовський Л.В., Гаєва Л.В. // Укр. пульмонол. журн. - 2004. - № 3. - С. 8.

7. Визначення оптимального співвідношення дози ізоніазиду та вітаміну В₆ для лікування експериментального туберкульозу у морських свинок / Гайова Л.В., Барбова А.І., Трофімова П.С., Бобкова Л.С., Чубенко А.В. // Укр. хіміотерапевт. журн. - 2005. - № 1- 2(20). - С. 61-64.

8. Біологічні властивості M. tuberculosis, виділених від хворих з первинною медикаментозною стійкістю / Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Клименко М.Т., Ясир С.Г., Гайова Л.В. // Укр. пульмонол. журн. - 2005. - № 3. - С. 51-53.

9. Клинико-бактериологическая диагностика туберкулёзных плевритов / Фещенко Ю.И., Опанасенко Н.С., Журило А.А., Барбова А.И., Трохимова П.С., Миронченко С.В. // Укр. пульмонол. журн. - 2004. - № 4. - С. 34-37.

10. нструкція з бактерологчно діагностики туберкульозної інфекції / Фещенко Ю.І., Журило О.А., Барбова А.., Клименко М.Т., Трофімова П.С., Власенко В.В. // Наказ МОЗ України № 45 від 06.02.2002. - 118 с.

11. Мікробіологічні методи обстеження хворих на туберкульоз (на підставі нових даних про особливості біологічного розвитку M.tuberсulosis) / Журило О.А., Власенко В.В., Барбова А.І., Конопко І.Г., Мирко Є.О., Черниш І.М., Василенко С.П., Трофімова П.С., В'ялих Ж.Е. // Метод. рекомендації. - 2001. - 24 с.

12. Мікробіологічні основи проведення моніторингу за медикаментозною стійкістю штамів M. tuberculosis в України / Фещенко Ю.І., Журило О.А., Барбова А.І., Трофімова П.С., Миронченко С.В., Веселовський Л.В., Спасенко О.В. // Метод. рекомендації. - 2004. - 24 с.