Стандартизація методик якості та розробка технології ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків

Размещено на http://www.allbest.ru/

ДЕРЖАВНЕ ПІДПРИЄМСТВО “ДЕРЖАВНИЙ НАУКОВИЙ ЦЕНТР ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ І МЕДИЧНОЇ ПРОДУКЦІЇ”

15.00.03. - стандартизація та організація виробництва лікарських засобів

УДК 615.33:615.277].07 + 577.352.4

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук

СТАНДАРТИЗАЦІЯ МЕТОДИК ЯКОСТІ ТА РОЗРОБКА ТЕХНОЛОГІЇ ЛІПОСОМАЛЬНИХ ФОРМ АНТРАЦИКЛІНОВИХ АНТИБІОТИКІВ

СТАДНІЧЕНКО

ОЛЕКСАНДР

ВІКТОРОВИЧ

Харків - 2009

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Державній науково-дослідницькій лабораторії з контролю якості лікарських засобів Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України (м. Харків).

Науковий керівник: доктор фармацевтичних наук Краснопольський Юрій Михайлович, Національний політехнічний університет «Харківський політехнічний інститут», професор кафедри біотехнології та аналітичної хімії

Офіційні опоненти: доктор хімічних наук, професор Гризодуб Олександр Іванович,

Державне підприємство «Український науковий фармакопейний центр якості лікарських засобів», завідувач відділом державної фармакопеї

доктор фармацевтичних наук, професор Стрельников Леонід Семенович, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри біотехнології

Захист відбудеться «_28_» __грудня__2009 року о _1000_ год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.817.01 при Державному підприємстві «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції» (61085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Державного підприємства «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції» (61085, м. Харків-85, вул. Астрономічна, 33).

Автореферат розісланий «_26_» __листопада__2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор біологічних наук, професор Н.Ф. Маслова

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Незважаючи на успіх фармацевтичної індустрії в розробці багатьох нових протипухлинних препаратів, онкологічні захворювання є причиною щорічної смерті в світі 6 млн. людей, і ця цифра зростає. Застосування більшості традиційних хіміотерапевтичних агентів - цитостатиків є обмеженим через неефективну доставку лікарського засобу до пухлини-мішені та важкі токсичні ефекти для здоров'я людини. Тому важливою є розробка технологій нових мікроносіїв, які можна використовувати для прицільної доставки препарату в пухлину, і, таким чином, покращити його ефективність. Ліпосомальні форми протипухлинних антибіотиків є одним із шляхів вирішення цієї проблеми.

Як відомо, в більшості нормальних тканин проникнення частинок обмежується безперервною ендотеліальною вистілкою судин. Великі частинки та ліпосоми практично не проникають до капілярів навіть у випадках, коли міжклітинні контакти та пори в ендотелії досить великі. Щільні контакти (2-6 нм) між ендотеліальними клітинами перешкоджають проникненню дуже дрібних ліпосом (до 30 нм у діаметрі). Більшість пухлин мають систему судин із низькою щільністю, що є достатньою для проходження дрібних часток, зокрема ліпосом. Таким чином, фізіологія пухлинних судин обумовлює підвищений рівень міжклітинних пор. Це може бути причиною вибіркового накопичення в пухлині цитостатиків, що введені в ліпосоми, і, тим самим, зменшення накопичення цитостатиків в здорових тканинах, зменшуючи токсичний ефект.

Винахід ліпосом, що стабілізовані полімерами, дає можливість впливати на новоутворення завдяки можливості запобігання проникненню ліпосом через ретикуло-ендотеліальну систему, що покращить їх стабільність у кров'яному руслі впродовж значного часу. Таким чином, ліпосоми зі стеричним стабілізатором можуть краще проникати в пухлини, що призведе до зростання показників ефективності лікування.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Національного фармацевтичного університету за темою: «Створення транспортних систем для доставки активних субстанцій до онкологічно змінених органів» (№ державної реєстрації 0108U010942).

Мета та задачі дослідження. Метою дослідження є розробка та наукове обґрунтування технології ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків; розробка та валідація методів контролю ліпосомальних препаратів із водорозчинним діючим засобом.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

- здійснити аналіз літератури щодо сучасних технологій отримання та методів контролю ліпосомальних форм протипухлинних препаратів;

- розробити та валідувати хроматографічну методику визначення ступеня інкапсуляції антрациклінових антибіотиків у ліпосомах;

- вивчити стабільність антрациклінових антибіотиків протягом часу при різних значеннях рН та концентрації (на прикладі доксорубіцину гідрохлориду, як найменш стабільного з досліджуваних антрациклінових антибіотиків), визначити оптимальні фізико-хімічні параметри для зберігання та виробництва лікарських засобів із антрацикліновими антибіотиками;

- розробити ліофільну ліпосомальну форму антрациклінового антибіотика ідарубіцину гідрохлориду (як найменш токсичного та найбільш перспективного з досліджуваних антрациклінових антибіотиків) з використанням класичної технології інкапсуляції;

- розробити та оптимізувати методику активної інкапсуляції антрациклінових антибіотиків (епірубіцину гідрохлориду, ідарубіцину гідрохлориду, мітоксантрону гідрохлориду та доксорубіцину гідрохлориду) у ліпосоми за допомогою градієнту рН та градієнту концентрації сульфату амонію;

- стандартизувати технологічний процес активної інкапсуляції для отримання ліпосом у промисловості.

Об'єкти дослідження. Діючі речовини - доксорубіцину гідрохлорид, епірубіцину гідрохлорид, ідарубіцину гідрохлорид, мітоксантрону гідрохлорид; допоміжні речовини (компоненти буферних розчинів, кріопротектори, стабілізатори), лікарські форми антрациклінових антибіотиків.

Предмет дослідження. Розробка науково обґрунтованих складів і стандартизація промислових технологій ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків доксорубіцину гідрохлориду, епірубіцину гідрохлориду, ідарубіцину гідрохлориду, мітоксантрону гідрохлориду. Розробка та валідація методики визначення ступеня інкапсуляції антрациклінових антибіотиків у ліпосоми.

Методи дослідження. Фізичні, фізико-хімічні та мікробіологічні методи. Обробка експериментальних даних проводили методами математичної статистики.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше розроблено методику визначення ступеню інкапсуляції за допомогою ВЕРХ; розроблено методику визначення частинок методом динамічного розсіювання світла. Вперше в результаті фізичних, фізико-хімічних та мікробіологічних досліджень створено та науково обґрунтовано склад ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків (епірубіцину гідрохлориду, ідарубіцину гідрохлориду, мітоксантрону гідрохлориду, доксорубіцину гідрохлориду) за допомогою технології хімічного градієнта. Вперше проведено порівняння ефективності інкапсуляції для ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків, виготовлених за методом хімічного градієнта. Наукова новизна розробки ліпосомальних форм за допомогою технології хімічного градієнта підтверджено патентом України на корисну модель № 40072, А61К 9/50, 31/685.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено методику ВЕРХ, яка дозволяє визначати ступінь інкапсуляції водорозчинної діючої речовини у ліпосоми. Розроблено методику визначення розміру частинок за методом динамічного розсіювання світла. Розроблено технологію отримання ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків. Отримані дані використані для розробки складу зареєстрованих в Україні препаратів «Доксолік», «Епілік», «Ідалік» та «Міталік» виробництва ЗАТ «Біолік» (реєстраційні посвідчення МОЗ України UA/4210/01/01, UA/4416/01/0, UA/4957/01/01, UA/4431/01/01 відповідно). Внесено зміни у проект АНД та технологічний регламент препарату «Ліподокс» виробництва ЗАТ «Біолік» (реєстраційне посвідчення UA/1508/01/01).

Особистий внесок здобувача. Особисто здобувачем здійснено пошук і аналіз даних наукової літератури щодо сучасних технологій отримання ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків та методів контролю у процесі розробки та виробництва.

Автором особисто проведено експериментальні дослідження з метою розробки методики визначення ступеня інкапсуляції, вивчено фізичні та фізико - хімічні властивості ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків та отримано зразки досліджуваних препаратів. Результати досліджень наведено у дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались на ЙЙ науково-практичній конференції «Управління якістю в фармації» (Харків, 2007), на Всеросійський науковій конференції з міжнародною участю «Нанотехнології в онкології 2008» (Москва, 2008).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 6 наукових робіт, у тому числі 3 статті у наукових фахових виданнях, 1 патент та 2 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 156 сторінках машинопису, складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), об'єктів і методів досліджень (розділ 2), експериментальної частини (розділ 3-6), загальних висновків, списку використаних джерел літератури та 1 додатку. Робота містить 33 таблицю та 42 рисунки. Бібліографічний покажчик містить 150 джерел, 135 з яких - зарубіжні.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі викладено актуальність теми, мету та основні задачі досліджень, наукову новизну та практичне значення отриманих результатів.

У першому розділі наведено аналіз даних літератури щодо властивостей ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків, який показав, що вони менш токсичні, та більш ефективні в порівнянні з водними розчинами антибіотиків. Встановлено, що екструзійний метод отримання ліпосом є сучасним та перспективним у промислових масштабах. Розглянуто методики отримання ліпосом за технологією «хімічного градієнта». З'ясовано, що метод ультрафільтрації є найбільш прийнятним при використанні даного способу накопичування активної речовини у ліпосомах. Проведено огляд аналітичних методів, які використовуються для технологічного контролю та контролю якості ліпосомальних препаратів. Проведено аналіз сучасного ринку ліпосомальних лікарських засобів з активною речовиною онкологічної спрямованості.

У другому розділі описано об'єкти та методи досліджень, що були використані в даній роботі.

У третьому розділі дисертації проведено розробку та валідацію методу визначення ступеня інкапсуляції антрациклінових антибіотиків у ліпосоми методом ВЕРХ.

Розробка методики визначення ступеня інкапсуляції водорозчинної активної діючої речовини. Попередні випробування показали, що існуючі методики визначення ступеня інкапсуляції мають певні недоліки - довгий час аналізу, неможливість автоматизації, високу похибку та низьку відтворюваність. Це не відповідає вимогам, що висуваються до виробництва ліпосом.

Дана методика заснована на гель-проникній хроматографії з використанням обладнання для ВЕРХ. Ліпосоми, як надмолекулярні структури виходять в “мертвому” об'ємі, а активна діюча речовина затримується в порах гелю, за рахунок чого досягається розділення.

Як рухома фаза був обраний фосфатний буфер з рН 5,2 ± 0,2. Значення рН буферу запобігає деструкції ліпосом та антрациклінових антибіотиків упродовж аналізу. Детектування здійснювалось на діодно-матричному та флюорометричному детекторах одночасно. Швидкість рухомої фази складала 1 мл/хв. Для хроматографії використовувалися препарати без розведення.

На наведена вид хроматограма ліпосомального зразка з неінкапсульованим ідарубіцину гідрохлоридом, отримана на спектрофотометричному детекторі.

З розподілення між піком ліпосом, які виходять у об'ємі, який не утримується, та піком неінкапсульованого антрациклінового антибіотика. Для порівняння наведена хроматограма «пустих», незавантажених ліпосом.

З'ясовано, що більш низьке значення стандартного відхилення калібрувальної залежності за діодно-матричним (спектрофотометричним) детектором в порівнянні з флюорометричним детектором робить його більш прийнятним для використання у визначеному діапазоні.

Із хроматограм видно розподілення між піком ліпосом, які виходять у “мертвому” об'ємі, та пік неінкапсульованого антрациклінового антибіотика. Для порівняння наведена хроматограма «пустих», незавантажених ліпосом.

Діодно-матричний детектор був обраний як найбільш поширений у фармацевтичній галузі; флюорометричний детектор - як високочутливий до ароматичних сполук, і, зокрема, до антибіотиків антрациклінового ряду. Детектування на діодній матриці здійснювалося при довжині хвилі 254 нм, що відповідає максимальній чутливості для антрациклінових антибіотиків. Для флюорометричного детектора був обраний фільтр збудження - 430-470 нм, та фільтр випускання - 560-650 нм.

Для побудови калібрувальних графіків були використані висоти піків. Методику було розроблена для доксорубіцину гідрохлориду, та апробовано на епірубіцину, ідарубіцину та мітоксантрону гідрохлоридах. Цикл аналізу одного зразка не перевищує 15 хвилин, що відповідає вимогам експресності. Відсутність пробопідготовки зменшує загальну похибку аналізу.

Валідація методики визначення ступеня інкапсуляції активної діючої речовини. Методика була валідована за наступними параметрами: лінійність, специфічність, межа кількісного визначення, межа якісного визначення, точність, діапазон застосування, правильність.

Виходячи з того, що при отриманні ліпосом розбіг у показниках інкапсуляції становить не менш, ніж 15 %, для достовірного визначення ступеня інкапсуляції потрібна загальна похибка не вище, ніж 5 %. При перевірці методики за допомогою метода „введено - знайдено” було визначено, що похибка при використанні спектрофотометричного детектора не перевищує 5 %, що є достатнім для проведення вимірів. Специфічність аналізу була підтверджена за допомогою спектральної 3D станції.

Четвертий розділ дисертації присвячений вивченню стабільності антрациклінових антибіотиків при різних значеннях рН та концентрації. Також була здійснена ідентифікація основної домішки - аглікону доксорубіцину, яка утворюється в умовах максимальної стабільності.

Визначення оптимальних умов стабільності антрациклінових антибіотиків. Було проведене вивчення стабільності антрациклінових антибіотиків на прикладі доксорубіцину гідрохлориду при різних концентраціях і різних значеннях рН (протягом 12 місяців для рН 2 та рН 3, та 6 місяців для рН 4 та рН 6). Після 6 місяців зберігання при високому рівні рН домішки накопичуються у кількості, який недопустимий у препараті .

Були побудовані залежності у координатах: відсотки домішок - рН для визначення оптимального, з точки зору стабільності, значення рН. Передбачалося, що найбільша стабільність зразків буде знаходитися на нижньому плато (мінімумі), утвореному при накладенні кривої на отримані крапки.

Графік загальної кількості домішок від рН розчину доксорубіцину гідрохлориду при терміні зберігання зразків 3 місяці має апроксимовану параболічну форму. При цьому нижня частина - «база» параболи, відповідає такому значенню рН, при якому загальний відсоток домішок мінімальний. Приклад хроматограми, що була отримана при контролі стабільності наведено на рис. 4.

Вид графіку залежності загальної кількості домішок від рН розчину доксорубіцину гідрохлориду при терміні зберігання зразків 6 місяців на рис.2 співпадає з графіком на рис. 3. При терміні зберігання 6 місяців парабола розташована вище в порівнянні з терміном 3 місяці, що свідчить про накопичення загального числа домішок в процесі зберігання. Видно, що мінімуму домішок відповідає діапазон рН 2,5 - 3,5 (рис. 2 і 3). Аналогічні дані отримані при вимірюванні стабільності епірубіцину, ідарубіцину та мітоксантрону гідрохлоридів.

Також була відмічена тенденція доксорубіцину гідрохлориду до підвищення стабільності при зростанні його концентрації в розчині від 1 мг/мл до 3 мг/мл.

Виявили, що при рН 2,5 - 3,5 максимальна кількість домішок обумовлена наявністю домішки з часом утримування 3,076 хв (рис. 4). Був проведений експеримент із хроматографічного препаративного виділення цієї домішки, подальшій ії ідентифікації методами ядерного магнітного резонансу на ядрах водню (1Н ЯМР) та спектрофотометрії.

Препаративне хроматографічне розділення речовини було здійснене в два етапи. Фракції, що містять цільовий компонент, збирали та висушували при зниженому тиску. Чистота продукту методом ВЕРХ склала - 99,5 % яка була достатня для проведення спектральних вимірів.

Спектрофотометричний метод виявив ідентичність спектрів у діапазоні 210 - 400 нм для домішки, що вивчалася та доксорубіцину гідрохлориду, що свідчить про ідентичність антрациклінових хромофорних груп. Також була прийнята до уваги хроматографічна поведінка домішки при використання ВЕРХ у режимі іон-парного модифікування - час утримання домішки не змінювався при змінах концентрації модифікатора, а залежав лише від концентрації ацетонітрилу. Це свідчить про відсутність іоногенних груп у структурі молекули.

При аналізі методом 1Н ЯМР були отримані наступні значення хімічних зсувів: (д, м. д.): 0,77 0,70 (2Н, -ОН -ОН); 7,8 7,6 (3Н, -СН-СН-СН- ароматич.); 6,0 (1Н, -ОН); 5,4 (1Н, -ОН); 5,1 (1H, -H); 4,6 (2H, -CH2-); 3,9 (3Н, -ОСН3); 2,9 (2H, -CH2-); 2,1 (2H, -CH2-). Хім. зсуву в м. д. (кількість протонів, тип сигналу (скорочено)).

Було доведено, що досліджувана домішка є агліконом доксорубіцину, який утворюється у ході кислотного гідролізу молекули доксорубіцину шляхом відщеплення аміноцукру. Відносний час утримування домішки склав 0,407 по відношенню до основної речовини. Згідно з ДФУ вміст домішки доксорубіцину аглікону не повинен перевищувати 0,5 % від вмісту доксорубіцину гідрохлориду, однак у ДФУ не наведені дані з ідентифікації домішки, такі як відносний час утримування.

П'ятий розділ дисертації присвячений розробці технології ліпосомальної форми ідарубіцину гідрохлориду та вивченню її фізико-хімічних та мікробіологічних властивостей.

Вивчення та вибір фосфоліпідів для виробництва ліпосом. При досліджені використовували сировину трьох виробників: ЗАТ «Біолік», Україна, фірма «Lipoid», США та фірма «Avanti Polarlipids», США. Проведено експеримент з вивчення і порівняння фосфоліпідного і жирнокислотного складу використовуваних фосфатидилхолінів з використанням стандартних зразків (СЗ) фірми Avanti Polarlipids , США (табл. 1, табл. 2).

Таблиця 1 Фосфоліпідний склад досліджуваних фосфатидилхолінів

№	Фосфоліпід (Rf)	Фосфоліпідний склад, % (Rf)
		Виробник
		Біолік (Україна)	Lipoid (США)	Avanti Polarlipids (США)
1	Фосфатидилхолін (0.34) СЗ AvantiPolarlipids	91,1 (0,35)	97,7 (0,34)	97,4 (0,36)
2	Фосфатидилетаноламін (0.79) СЗ AvantiPolarlipids	4,3 (0,80)	-	0,4 (0,77)
3	Лізофосфатидилхолін (0.22) СЗ AvantiPolarlipids	3,8 (0,21)	1,4 (0,21)	1,3 (0,21)
4	Неідентифіковані домішки	0,8	0,9	0,9

Був використаний метод тонкошарової хроматографії. Відмінності в значенні Rf між речовинами-стандартами та ідентифікованими компонентами, які наведені в табл. 2, можна пояснити відмінністю жирнокислотного складу використовуваних речовин.

Таблиця 2 Порівняльна характеристика жирнокислотного складу досліджуваних фосфатидилхолінів

№	Жирна кислота	Вміст жирних кислот, %
		Виробник
		Біолік	Lipoid	Avanti Polarlipids
1	16:0 - пальмітинова кислота	31,6	33,5	35,8
2	16:1 - пальмітоолеїнова кислота	1,8	1,2	1,1
3	18:0 - стеаринова кислота	11,8	11,5	10,5
4	18:1 - олеїнова кислота	32,2	31,5	30,4
5	18:2 - лінолієва кислота	17,7	16,1	18,7
6	20:4 - арахідонова кислота	2,5	3,1	2,4
7	Неідентифіковані	2,4	3,1	1,1

Ці показники мають високе значення при розробці технології отримання ліпосом, оскільки гомогенізація повинна проводитися при температурі не вище за температуру фазового переходу фосфатидилхоліну - (38±2) 0С, який за своєю природою є рідким кристалом.

Метою аналізу було визначення жирнокислотного складу методом газорідинної хроматографії (ГРХ). У ході експерименту було встановлено, що компоненти, які досліджуються, мають схожий вміст жирних кислот. Температура фазового переходу для фосфатидилхолінів з таким складом складає (38±2) 0С.

Так само можна зробити висновок про значну схожість фосфоліпідного та жирнокислотного складів всіх трьох фосфатидилхолінів. Для подальшого експерименту було обрано фосфатидилхолін фірми «Lipoid», США, як найбільш якісний та найменш дорогий з досліджуваних.

Розробка технології та характеристики ліофілізованої ліпосомальної форми ідарубіцину гідрохлориду. Для розробки технології було необхідно визначити та оптимізувати наступні параметри: вміст фосфоліпідів у препараті, метод додавання активної речовини та концентрацію кріопротектора.

Було проведено експеримент з оптимізації вмісту фосфатидилхоліну для зразків з концентрацією 0,5 %,1 %, 3 %, 5 %, 7 % та 9 %. Результати виміру ступеня інкапсуляції в залежності від вмісту фосфатидилхоліну наведені на рис. 5.

Для отримання ліпосом було обрано емульсію з концентрацією фосфатидилхоліну 5 %.

Були проведені експерименти з вибору кріопротектора. Мальтозу, лактозу та сахарозу брали у чотирьох концентраціях - 3%, 5%, 7% та 9%. Для кожного зразка була виміряна втрата ступеня інкапсуляції після ліофілізації. Отримані дані наведені в табл. 3.

Ступень інкапсуляції ідарубіцину гідрохлориду при використанні ліпосом із різним вмістом фосфатидилхоліну

Отримані дані дозволили встановити, що максимальна інкапсуляція спостерігається при концентрації фосфатидилхоліну 5%. Подальше збільшення концентрації не веде до покращення інкапсуляції.

За результатами табл. 3 найбільшу кріопротекторну дію має лактоза у концентрації 9 %, але при концентрації більше 5% втрата інкапсуляції є майже незмінною. Для доцільності використання допоміжних речовин у препараті було вирішено прийняти концентрацію кріопротектора 5 %.

Таблиця 3 Втрата ступеня інкапсуляції при використанні різних кріопротекторів

№	Назва кріопротектора	Вміст кріопротектора, %
		3	5	7	9
		Втрата ступеня інкапсуляції, %
1	Мальтоза	15,6	10,1	10	10,4
2	Лактоза	8,2	4,2	4,3	4,1
3	Сахароза	11,8	8,3	8,4	7,9

На підставі проведених досліджень було запропоновано технологію отримання ліпосомальної форми ідарубіцину гідрохлориду яка включає стадії:

- отримання ліпідної плівки та її гідратація буферним розчином з подальшим отриманням крупних мультиламелярних ліпосом;

- гомогенізація отриманої суспензії екструзійним методом та отримання дрібних моноламелярних ліпосом (розмір 60 - 120 нм);

- фільтрація через фільтр з розміром пор 0,22 мкм у стерильних умовах;

- розлив та ліофілізація.

Концентрація фосфатидилхоліну у препараті складає 50 мг/мл, концентрація лактози - 50 мг/мл, концентрація ідарубіцину гідрохлориду - 1 мг/мл. Зразки були герметизовані в атмосфері аргону.

Ступінь інкапсуляції склала 60,3 %. Отриманий показник інкапсуляції є досить високим для препаратів без використання технології «хімічного градієнта». При такому ступені інкапсуляції активна субстанція рівномірно розподілена в об'ємі препарату, а ліпосоми займають весь вільний простір та стикаються між собою.

Визначення антимікробної активності проводили дифузійним одношаровим методом з використанням мікроорганізмів Bacillus cereus NCTC 8431. Визначення проводили у порівнянні з препаратом в неліпосомальній формі - «Ідалік», що є розчином ідарубіцину гідрохлориду з концентрацією 1 мг/мл. Була встановлена висока антимікробна активність ліпосомальної форми ідарубіцину гідрохлориду у порівнянні із вільною формою ідарубіцину гідрохлориду. Значення активності ліпосомальної форми склало 98.7±1.20% у порівнянні із неліпосомальною формою лікарського засобу при однаковій концентрації діючої речовини.

У шостому розділі дисертації проведено дослідження з отримання ліпосомальних форм доксорубіцину, епірубіцину, ідарубіцину та мітоксантрону гідрохлоридів шляхом створення трансмембранного градієнта рН та створення трансмембранного градієнта концентрації сульфату амонію. Було розроблено та стандартизовано метод отримання ліпосом із заданим розміром. Було розроблено технологію отримання рідкої ліпосомальної форми з доксорубіцину гідрохлоридом.

Загальна характеристика методу. При використанні методу “хімічного градієнта” утворюється різниця складу та концентрацій буферних розчинів всередині та ззовні ліпосом. При цьому, враховуючи фізико - хімічні властивості антрациклінових антибіотиків зокрема: рКа, структуру та гідрофобність, можливо зміщувати рівновагу: «Антибіотик (всередині ліпосоми) Антибіотик (ззовні ліпосоми)» ліворуч, тобто у бік ліпосомальної форми, за рахунок проникнення антибіотика крізь бішар ліпідів, та його незворотного зв'язування з компонентами буферного розчину всередині ліпосоми. інкапсуляція антрацикліновий антибіотик ліпосома

Розробка технології отримання ліпосом із заданим розміром. Структура онкологічно змінених тканин з міжклітинними щілинами, які дозволяють проникати у пухлину часткам меншим за 200 нм, обумовлює необхідність отримання ліпосом із середнім розміром 60 нм, та верхньою межею розміру - 120 нм.

Метод екструзії було обрано, як найбільш технологічний для виготовлення значної кількості ліпосом з однаковим ступенем дисперсності. Емульсію фосфатидилхоліну піддавали екструзії на установці «M-110 Microfluidizer Processor» (ф. “Microfluidics”, США) при 400 атм., 6 циклів при температурі (38±2) С. Після кожного циклу та після охолодження проводили визначення розміру частинок. Графік зменшення середнього діаметру ліпосом у залежності від кількості циклів екструзії наведено на рис. 6.

Після кожного наступного циклу розмір частинок зменшувався, а показники дисперсності системи покращувалися.

Розробка технології отримання ліпосом за градієнтом рН. Для розробки методу отримання ліпосом шляхом «хімічного градієнта» оптимізовано: вміст фосфоліпідів, вміст кріопротектора (ліофілізовані ліпосоми) та вміст стабілізатора (рідкі ліпосоми).

Для визначення оптимального вмісту фосфоліпідів було проведено порівняльні дослідження зразків отриманих за технологією градієнта рН, з концентрацією фосфатидилхоліну 0,5%, 1,5%, 2,5%, 4%, 5%, 6%. Зразки. Було встановлено, що для досягнення максимальної інкапсуляції при використанні технології «хімічного градієнта» достатньо концентрації фосфатидилхоліну 2,5%, яку було прийнято для подальшої розробки технології.

Було проведено експеримент з визначення оптимальної концентрації кріопротектора, результати якого наведені на рис. 7. Видно, що вже при концентрації лактози 25 мг/мл втрата ступеня інкапсуляції стає мінімальною. Ця концентрація була обрана для подальших експериментів.

Було проведено експеримент із визначення оптимального вмісту стабілізаторів Twin 80 та Kremophor EL для ліпосом із концентрацією фосфатидилхоліну 2,5%. Стабілізатори додавали у концентрації 2,5%, 5%, 7,5%, 10%, 12,5% та 15% від маси фосфатидилхоліну. Для імітації довготривалих умов зберігання зразки центрифугували протягом 2 годин при 2000 об/хв. Мінімальна концентрація стабілізаторів, при якій не було виявлено ознак розшарування, склала для Twin 80 - 12,5%, для Kremophor EL - 10%. Це обумовило вибір стабілізатора Kremophor EL в концентрації 10 % у виготовлені ліпосом.

Було встановлено, що основна маса активної речовини потрапляє в ліпосоми протягом двох перших діб, що сприятливим чинником, оскільки у разі видалення невключеної речовини можна не побоюватися процесу руйнування ліпосом, та «витоку» речовини з ліпосом.

На підставі проведених експериментальних досліджень та з урахуванням фізико-хімічних властивостей компонентів розроблена технологічна схема процесу виробництва рідкої ліпосомальної форми із доксорубіцину гідрохлориду за технологією градієнта рН (рис. 8).

Технологічна схема процесу виробництва рідкої ліпосомальної форми доксорубіцину гідрохлориду

Концентрацію буферних розчинів було зменшено у порівнянні з існуючими технологіями, що не призвело до погіршення показників інкапсуляції. Також було розроблено схему додавання стабілізатора, використання якого підвищило його ефективність та зменшило кількість допоміжних речовин.

Отримання ліпосом за технологією градієнта рН. Будова ліпідного бішару дозволяє проникати крізь фосфоліпідну мембрану об'єктам тільки у молекулярній формі, які не є іонізованими та не мають поверхневого заряду.

При попаданні солянокислої солі антрациклінового антибіотика у фосфатний буфер із рН 6,5 - 7,5 встановлюється рівновага, в результаті якої частина антибіотика переходить у молекулярну форму. Незаряджена молекула антибіотика проходить крізь мембрану і потрапляє у внутрішню порожнину ліпосоми. У процесі встановлення рівноваги частина молекулярної форми проходить крізь мембрану і залишає зону реакції, що зміщує рівновагу у бік незарядженої форми антибіотика.

Потрапляючи у внутрішній об'єм ліпосоми, заповнений цитратним буферним розчином з рН 2,5 - 3,5, незаряджена молекула антибіотика приєднує протон до первинної (доксорубіцин, епірубіцин, ідарубіцин) або вторинної (мітоксантрон) аміногрупи і, таким чином, набуває позитивного заряду.

Заряджені молекули втрачають можливість зворотно проникати крізь мембрану та накопичуються таким чином усередині ліпосоми.

Інкапсуляція антрациклінових антибіотиків за технологією градієнта рН (А) та за технологією градієнта сульфату амонію (В)

Для зразків ліпосом, отриманих методом «градієнта рН», було проведено вимірювання ступеня інкапсуляції, результати яких наведені у табл. 3. Різницю у показниках інкапсуляції можливо пояснити відмінностями у структурі антибіотиків, та, як наслідок, різним об'ємом сольватних оболонок, що призводить до розходжень у кінетиці інкапсуляції.

Отримання ліпосом за технологією градієнта концентрації сульфату амонію. Ліпосоми отримували за допомогою гідратації ліпідної плівки буферним розчином сульфату амонію та подальшої екструзії. Далі, за допомогою ультрафільтрації, проводили видалення оточуючого ліпосоми буферного розчину. На цій стадії на поверхні ліпосоми створюється «хімічний градієнт» - усередині ліпосоми буферний розчин сульфату амонію, а зовні - розведений буферний ізотонічний розчин. При потраплянні антрациклінового антибіотика у розчин, відбувається його адсорбція на поверхні ліпосоми та проникнення у внутришньоліпосомальний простір. Завдяки реакції обміну утворюється комплекс із сульфат-іоном (рис.9).

Концентрація активної речовини - доксорубіцину гідрохлориду, епірубіцину гідрохлориду та мітоксантрону гідрохлориду складала 2 мг/мл. Концентрація ідарубіцину гідрохлориду - 1 мг/мл. Для отриманих ліпосомальних зразків був виміряний ступінь інкапсуляції. Отримані дані наведені у табл. 4.

У порівнянні з ліпосомами, отриманими за методом градієнта рН, ліпосоми отримані за методом градієнта концентрації сульфату амонію, мають нижчий ступінь інкапсуляції, за винятком зразків із ідарубіцину гідрохлоридом, що може бути обумовлено його гідрофобністю.

На основі ліпосом з стабілізатором, виготовлених за технологією градієнта рН, було отримано рідку ліпосомальну форму епірубіцину гідрохлориду та доксорубіцину гідрохлориду зі 100 % інкапсуляцією.

Таблиця 4 Ступінь інкапсуляції активних речовин для рідких ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків, отриманих за допомогою методів градієнта рН, та градієнта концентрації сульфату амонію через 14 діб

Назва	Ступінь інкапсуляції при використанні градієнта сульфату амонію, (%)	Ступінь інкапсуляції при використанні градієнта рН, (%)
Доксорубіцину ГХ	57,8	78,9
Епірубіцину ГХ	68,5	84,4
Ідарубіцину ГХ	54,8	-
Мітоксантрону ГХ	31,7	65,7

Дослідження стабільності. Було проведено дослідження стабільності рідкої ліпосомальної форми епірубіцину гідрохлориду зі 100 % включенням, доксорубіцину гідрохлориду зі 100 % включенням та чотирьох ліофільно висушених зразків - доксорубіцину гідрохлориду, епірубіцину гідрохлориду, ідарубіцину гідрохлориду та мітоксантрону гідрохлориду. Контроль проводили протягом 12 місяців за наступними показниками: ступінь інкапсуляції, чистота активної речовини, концентрація фосфоліпідів, вміст води (у випадку ліофільно висушених зразків), розмір часток після регідратації.

Препарати були стабільні в період спостереження. Було відмічено зниження чистоти активної субстанції на 0,2% та на 0,5% для рідкого епірубіцину та доксорубіцину гідрохлоридів відповідно. Для ліофільно висушених зразків цей показник склав 0,1% для кожного зразка. Втрата ступеня інкапсуляції після регідратації для ліофільно висушених зразків становила від 5% до 8%. Для рідких ліпосомальних препаратів ступінь інкапсуляції залишався постійним - 100%. Після 12 місяців зберігання було проведено тести на стерильність, токсичність та пірогенність для всіх досліджуваних зразків, які показали, що зразки нетоксичні та апірогенні. Було досліджено динаміку включення антибіотиків в процесі зберігання.

ЗАГАЛЬНІ ВИСНОВКИ

1. Здійснено аналіз даних стосовно сучасних технологій отримання та методів контролю якості ліпосомальних форм протипухлинних препаратів.

2. Вперше розроблено та валідовано хроматографичну методику для визначення ступеню інкапсуляції антрациклінових антибіотиков у ліпосоми.

Запропонована методика включена до звіту про науково-дослідну діяльність Національного фармацевтичного університету за 2008 р.

3. Розроблено методику визначення розміру ліпосом у розчині методом динамічного розсіювання світла.

4. Вивчено стабільність антрациклінових антибіотиків протягом зберігання. Доведено, що антибіотики антрациклінового ряду мають найкращі показники стабільності при рН 2,5-3,5. При цьому доведено, що стабільність зростає із підвищенням концентрації антибіотика у розчині. На підставі отриманих даних запропоновано та впроваджено оптимальні значення рН для готових лікарських форм «Ідалік», «Мітолік», «Доксолік», «Епілік» виробництва ЗАТ «Біолік» (Україна).

Розроблені показники стандандартизовано в аналітичній нормативній документації на препарати: «Ідалік» (реєстраційне посвідчення № UA/4957/01/01), «Мітолік» (реєстраційне посвідчення № UA/4431/01/01), «Доксолік» (реєстраційне посвідчення № UA/4210/01/01), «Епілік» (реєстраційне посвідчення № UA/4416/01/01).

5. Із використанням запропонованої технології інкапсуляції розроблено ліофільну ліпосомальну форму антрациклінового антибіотика ідарубіцину гідрохлориду.

6. Вперше розроблено та оптимізовано методику активної інкапсуляції антрациклінових антибіотиків, у тому числі: епірубіцину гідрохлориду, ідарубіцину гідрохлориду, мітоксантрону гідрохлориду та доксорубіцину гідрохлориду, у ліпосоми за допомогою градієнта рН та градієнта сульфату амонію. Вивчено показники стабільності.

7. Запропоновано технологію активної інкапсуляції для отримання ліпосом у промисловому масштабі. Розроблену технологію захищено патентом України на корисну модель № 40072.

8. З метою покращення ефективності препарату розроблено проект змін до нормативно-технічної документації на препарат «Ліподокс» виробництва ЗАТ «Біолік» (реєстраційне посвідчення № UA/1508/01/01).

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Стадніченко О.В. Розробка методики визначення невключеної речовини в ліпосомальні форми доксорубіцину методом ВЕРХ / О.В. Стадніченко, Ю.М. Краснопольський // Фармаком. - 2007. - № 1. - C. 64-69. (Особистий внесок - планування, проведення та опрацювання даних експерименту).

2. Стадніченко О.В. Одержання та характеристики ліпосомальної форми ідарубіцину / О.В. Стадніченко, Ю.М. Краснопольський // Фармаком. - 2007. - № 3. - С. 72-77. (Особистий внесок - здійснення експериментальних досліджень щодо фізико-хімічних властивостей зразків, опрацювання одержаних даних).

3. Стадніченко О.В. Визначеня ступеня інкапсуляції у ліпосомах з антрацикліновими антибіотиками, отриманими за допомогою методу «хімічного градієнта» / О.В. Стадніченко, Ю.М. Краснопольський, С.М. Коваленко // Фармац. журн. - 2008. - № 5. - С. 98-103. (Особистий внесок - здійснення експериментальних досліджень щодо отримання та вивчення зразків, опрацювання одержаних даних та підготовка статті).

4. Пат. № 40072 Україна, МПК А61К 9/50, 31/685. Спосіб здобуття ліпосомального препарату / О.В. Стадніченко, Ю.М. Краснопольський - № u200812064; заявл. 13.10.2008; опубл. 25.03.2009. Бюл. № 6. (Особистий внесок - пошук та порівняння літературних даних, проведення експерименту та опрацювання отриманих результатів).

5. Краснопольский Ю.М. Валидация технологического процесса производства лекарственных препаратов в липосомальной форме с помощью оборудования для ВЭЖХ / Ю.М. Краснопольский, А.В. Стадниченко // Управління якістю в фармації: Мат. 2 научно-практичної конференції. 25 травня 2007 р. - Харків, 2007. - С. 87.

6. Стадниченко А.В. Стандартизация производства и методов контроля липосомальных форм антрациклиновых антибиотиков / А.В. Стадниченко, Ю.М. Краснопольский, С.Н. Коваленко // Нанотехнологии в онкологи 2008: Тез. докл. Всероссийской научной конференции с международным участием. 6 декабря 2008 г. - Москва, 2008. - С. 53-54.

АНОТАЦІЯ

Стадніченко О.В. Стандартизація методик якості та розробка технології ліпосомальних форм антрациклінових антибіотиків - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 15.00.03 - стандартизація та організація виробництва лікарських засобів. - Державне підприємство «Державний науковий центр лікарських засобів і медичної продукції», Харків, 2009.

У результаті аналізу даних літератури була показана необхідність розробки досконалих методів отримання та контролю ліпосомальних препаратів з антрацикліновими антибіотиками.

Розроблена та валідована методика визначення ступеня інкапсуляції антрациклінових антибіотиків у ліпосоми за допомогою обладнання з ВЕРХ.

На підставі вивчення умов стабільності розчинів антрациклінових антибіотиків при різних значеннях рН та концентрацій були обрані оптимальні умови зберігання. Був проведений експеримент з виділення та ідентифікації основної домішки, яка утворюється в цих умовах.

Проведена розробка технології отримання ліпосомальної форми антибіотика ідарубіцину гідрохлориду за класичним методом. Проведено дослідження та отримання ліпосомальних форм доксорубіцину, епірубіцину, ідарубіцину та мітоксантрону гідрохлоридів шляхом створення трансмембранного градієнта. Запропоновано технологічний процес активної інкапсуляції для отримання рідкого ліпосомального препарату у промисловому масштабі.

Проведено дослідження стабільності отриманих препаратів. На підставі отриманих даних розроблений проект змін до нормативно-технічної документації на препарат «Ліподокс» з метою покращення ефективності.

Ключові слова: стандартизація, розробка технології, антрациклінові антибіотики, ліпосоми, інкапсуляція, хімічний градієнт.

Стадниченко А.В. Стандартизация методик качества и разработка технологии липосомальных форм антрациклиновых антибиотиков - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.03. - стандартизация и организация производства лекарственных средств. - Государственное предприятие «Государственный научный центр лекарственных средств и изделий медицинского назначения», Харьков, 2009.

На основании проведенного анализа данных литературы была показана необходимость разработки современных и совершенных методов контроля липосомальных препаратов с антрациклиновыми антибиотиками.

Разработана и валидирована методика определения степени инкапсуляции антрациклиновых антибиотиков в липосомы. Разработанная методика основана на гель-проникающей хроматографии с использованием оборудования для ВЭЖХ. Время анализа не превышает 15 мин. Было применено два типа детекторов - флюориметрический и диодно-матричный. При валидации методики было показано, что при использовании диодно-матричного детектора методика имеет погрешность не более 5%. Учитывая, что разброс воспроизводимости показателей инкапсуляции в эксперименте составляет около 15 %, полученная погрешность позволяет достоверно определять степень инкапсуляции как при контроле качества готовых лекарственных форм, так и на этапе технологического контроля.

Изучена стабильность растворов антрациклиновых антибиотиков при различных показателях рН и концентрации в течении 12 мес. Определение примесей проводилось методом ВЭЖХ. Доказано, что минимальному содержанию примесей соответствует диапазон рН 2,5 - 3,5. Отмечена тенденция антрациклиновых антибиотиков к повышению стабильности в растворе с ростом концентрации.

Проведен эксперимент по хроматографическому выделению примеси, которая является основной в диапазоне оптимальной стабильности. Примесь идентифицирована методами ядерного магнитного резонанса и спектрофотометрии в ультрафиолетовой и видимой областях.

Исследованы три вида фосфатидилхолина, как сырья для получения липосом. Проведены исследования жирнокислотного и фосфолипидного составов.

Разработана технология получения липосомальной формы идарубицина гидрохлорида с применением «классического» метода инкапсуляции. При разработке были оптимизированы такие параметры, как: содержание фосфатидилхолина, метод добавления активного вещества и концентрация криопротектора. Также проведено исследование степени инкапсуляции в полученном препарате.

Метод трансмембранного химического градиента является перспективным ввиду смещения процесса инкапсуляции в сторону инкапсулированной формы антибиотика в процессе получения липосомальных препаратов. Такая направленность позволяет добиваться показателей инкапсуляции вплоть до 100%.

Разработан и стандартизован метод получения липосом с заданными размерами методом экструзии. Разработаны и исследованы липосомальные формы эпирубицина, идарубицина, митоксантрона и доксорубицина гидрохлоридов путём создания трансмембранного градиента рН и трансмембранного градиента концентрации сульфата аммония. Получены препараты, как в жидком, так и в лиофилизированом виде. Показано, что основная масса антибиотика попадает в липосомы в течении первых двух суток.

Разработана и предложена технология получения жидкого липосомального препарата с антрациклиновыми антибиотиками в промышленном масштабе.

Проведены исследования стабильности полученных препаратов. Контроль проводился в течении 12 месяцев с момента изготовления. Проконтролированы следующие показатели: степень инкапсуляции, чистота активного вещества, концентрация фосфолипидов, размер частиц, вода и размер частиц после регидратации в случае лиофильно высушенных препаратов.

На основании полученных результатов был разработан проект изменений к нормативно-технической документации на препарат «Липодокс» с целью повышения эффективности препарата.

Ключевые слова: стандартизация, разработка технологии, антрациклиновые антибиотики, липосомы, инкапсуляция, химический градиент.

Stadnichenko A.V. Standardization of the quality's methods and development of technology of the antracyclinic antibiotic's liposomal forms - Manuscript.

The dissertation for obtaining of scientific degree of candidate of pharmaceutical sciences on specialty 15.00.03 -- standardization and organization of drug products manufacture. -- State Enterprise «State Scientific Centre of Drugs and medical products», Kharkiv, 2009.

As a result of studying of literature's dates, necessity of development of modern and effective methods for manufacturing and analysis were shown.

HPLC method for determination of an incapsulation degree was developed and validate. Method has been applying for determination of the incapsulation's degree in liposomal preparations, which collect antracyclinic antibiotics as active substances.

Stability test for solutions of the antracyclinic antibiotics was carried out. Solutions had different pH and concentration. On the base of obtained results, the optimal range of pH was proposed. The experiment for purification and identification of main impurity in the proposed pH range was carried out.

Technology for the liposomal form of the idarubicin hydrochloride by "classical" method was developed and proposed. Experimental samples of four antracyclinic antibiotics: epirubicin hydrochloride, idarubicin hydrochloride, mitoxantrone hydrochloride and doxorubicin hydrochloride were made by chemical gradient technology. Liquid and frozen-dried samples were prepared.

Stability of the prepared samples had been researching in 12 month.

Technology for liquid doxorubicin hydrochloride by chemical gradient approach was developed and proposed.

Key words: standardization, development of technology, antracyclinic antibiotics, liposomes, incapsulation, chemical gradient.

Размещено на Allbest.ru

...