Фосфоліпідні везикули (ліпосоми) як модулятори функціонального стану адренергічних систем у гладеньких м’язах судин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ДЕРЖАВНА УСТАНОВА «ІНСТИТУТ ФАРМАКОЛОГІЇ ТА ТОКСИКОЛОГІЇ»

ФОСФОЛІПІДНІ ВЕЗИКУЛИ (ЛІПОСОМИ) ЯК МОДУЛЯТОРИ ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ АДРЕНЕРГІЧНИХ СИСТЕМ У ГЛАДЕНЬКИХ М'ЯЗАХ СУДИН

14.03.05 - фармакологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ШЕПЕТЬКО МАКСИМ ВОЛОДИМИРОВИЧ

Київ - 2009

Анотація

Шепетько М.В. Фосфоліпідні везикули (ліпосоми) як модулятори функціонального стану адренергічних систем у гладеньких м'язах судин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Державна установа «Інститут фармакології та токсикології АМН України», Київ, 2009.

Дисертація присвячена дослідженню мінливості адренергічних систем гладеньком'язових клітин судин під впливом фосфоліпідів. На підставі досліджень in vitro встановлено, що перехід міцелярної структури фосфоліпідів у глобулярну форму (ліпосоми) призводить до якісних змін реакційної здатності фосфоліпідів, зокрема, зі зменшенням розмірів до 80-100 нм у них з'являється здатність модулювати адренергічні реакції.

У дослідах на ізольованій ворітній вені щура продемонстровано, що фосфоліпіди підвищують виразність ефекту адреналіноподібних речовин. Показано, що малі одношарові ліпосоми здатні швидко та зворотньо підсилювати реакції, опосередковані альфа-адренорецепторами, що виражається збільшенням величини максимальної відповіді на агоністи альфа-адренорецепторів та зниженням величини EC₅₀.

Малі одношарові ліпосоми здатні швидко та зворотньо знижувати реакції, опосередковані бета-адренорецепторами, що виражається зниженням величини максимальної відповіді на агоністи бета-адренорецепторів. Великі одношарові ліпосоми та фосфоліпіди в міцелярній формі такою здатністю не володіють. Модулюючий ефект малих одношарових ліпосом відносно агоністів адренорецепторов, вочевидь, реалізується через бета-адренорецептори, тому що усувається бета-адреноблокаторами, але не альфа-адренолітиками.

Тобто нами ідентифікована нова фармакологічна мішень для фосфатидилхолінових ліпосом у судинній стінці - її адренорецепторна система.

Ключові слова: ліпосоми, фосфоліпіди, адренорецептори, адреноміметики, адреноблокатори, модуляція ефекту.

Аннотация

Шепетько М. В. Фосфолипидные везикулы (липосомы) как модуляторы функционального состояния адренергических систем в гладких мышцах сосудов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Государственное учреждение «Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины», Киев, 2009.

Диссертация посвящена исследованию изменчивости адренергических систем гладкомышечных клеток сосудов. На основании исследований in vitro установлено, что переход мицеллярной структуры фосфолипидов в глобулярную форму (липосомы) приводит к качественным изменениям реакционной способности фосфолипидов, в частности, с уменьшением размеров до 80-100 нм у них появляется способность модулировать адренергические реакции. Исходный уровень адренореактивности, а, следовательно, и тонуса сосудов зависит от фосфолипидного соствав мембран и может быть усилен или ослаблен введением экзогенных фосфолипидов.

В опытах на изолированных сосудах при помощи метода миографической регистрации показано, что мелкие однослойные липосомы способны быстро и обратимо усиливать реакции, опосредованные альфа-адренорецепторами, что выражается усилением величины максимального ответа на агонисты альфа-адренорецепторов (для фенилэфрина на 71,3%, для клонидина на 44,8% и для адреналина на 70,9%) и снижением величины их EC₅₀.

Мелкие однослойные липосомы способны быстро и обратимо снижать бета-адренореактивность воротной вены, что выражается снижением величины максимального ответа вены на агонисты бета-адренорецепторов (для добутамина на 55,5%). Большие однослойные липосомы и фосфолипиды в мицеллярной форме такой способностью не обладают.

Модулирующий эффект малых однослойных липосом в отношении агонистов-адренорецепторов, по-видимому, реализуется через бета-адренорецепторы, так как его проявления устраняются бета-адреноблокаторами, но не альфа-адренолитиками. Это доказывает способность фосфолипидов, организованных в липосомы, изменять бета- и альфа-адренореактивность сосудистых гладкомышечных клеток и свидетельствует о селективности их модуляции.

Фосфатидилхолин является аллостерическим модулятором адренореактивных систем, селективность которого по отношению к подтипам адренорецепторов снижается в ряду альфа-1>бета-1>альфа-2>бета-2.

Судя по расчетным величинам энергии связывания при взаимодействии фосфатидилхолина с симпатоактивными соединениями, ни один из комплексов не является энергетически выгодной структурой, то есть экзогенный фосфатидилхолин, повидимому, не образует комплексов с перечисленными соединениями и взаимодействует именно с адренорецепторами.

Работа подчеркивает наличие самостоятельных фармакологических эффектов у фосфатидилхолиновых липосом. Идентифицирована новая фармакологическая мишень для фосфатидилхолиновых липосом в сосудистой стенке - её адренорецепторная система. Указанные эффекты предоставляют возможность коррекции тонуса сосудов за счет изменения чувствительности рецепторного аппарата сосуда, что обеспечит более продолжительный и стабильный эффект чем введение экзогенных катехоламинов. При такой коррекции, адреналинсенсибилизирующее действие фосфолипидов создаст относительный избыток катехоламинов при их неизменном уровне в кровотоке, что в свою очередь отразиться на показателях артериального давления. Обнаруженные особенности комбинированного действия адреномиметиков и липосом доказывают возможность модификации биологического эффекта лекарственных препаратов фосфолипидами липосом. Результаты исследования позволят прогнозировать усиление или ослабление целевого эффекта веществ, включеных в липосомы, что необходимо учитывать при использовании липосомальных форм фармакологических препаратов в медицинской практике.

Ключевые слова: липосомы, фосфолипиды, адренорецепторы, адреномиметики, адреноблокаторы, модуляция эффекта.

фосфоліпід адренергічний клітина

Summary

Shepetko M.V. Phospholipid Vesicles (Liposomes) as Functional Modulators for Adrenergic Systems in Vascular Smooth Muscles. - Manuscript.

Thesis for PhD degree by specialty 14.03.05 - pharmacology, State Institution «Institute of Pharmacology and Toxicology AMS of Ukraine», Kiev, 2009.

This thesis focuses on the investigation of the effects of phospholipid vesicles (liposomes) on adrenergic responses in vascular smooth muscle cells (SMC). It has been shown that liposomes possess the ability to modulate adrenergic reactions in SMC particular when its size was up to 80-100 nm.

The experiments on isolated rat portal vein preparations demonstrated that small-size monolammellar liposomes can rapidly and reversibly increase the responses mediated by alpha-adrenoreceptors in SMC. This manifested in enhancement of alpha-adrenoreceptors maximal response to agonists and corresponding decrease of EC₅₀. Small-size monolammellar liposomes can also rapidly and reversibly decrease beta-adrenoreception sensitivity in portal vein that manifested in decrease of SMC maximal response to beta-adrenoreceptors agonists. Large-size monolammellar liposomes and micellar phospholipids do not possess such ability.

The modulating effect of small-size monolammellar liposomes on contractile responses induced by agonist of adrenoreceptors is appeared to be realized via beta-adrenoreceptors because it is abolished by beta-adrenoblockers but not by alpha-adrenolytics. Thus, the new pharmacological target for phosphatidylcholine liposomes action in vascular SMC has been identified.

These adrenomodulating effects of liposomes should be taken into account in liposomal drugs development as well as under at the therapeutic usage of liposomes.

Key words: liposomes, phospholipids, adrenoreceptors, adrenomimetics, adrenoblockers, effect modulation.

Перелік умовних скорочень

МОЛ - малі одношарові ліпосоми

ВОЛ - великі одношарові ліпосоми

МФ - міцелярна форма фосфатидилхоліну

АМ - адреноміметик

АБ - адреноблокатор

АР - адренорецептор

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. До числа глобальних проблем рецепторної фармакології належить мінливість адренореактивних систем. Дане явище проявляється в підвищенні або ослабленні активності адренорецепторів певного типу. Функціонально це виражається посиленням або ослабленням функції відповідних ефекторних структур. Прикладом може служити гіперскоротливість гладеньком'язових елементів при артеріальній гіпертензії [Veglio F., 2001], бронхіальній астмі [Tan K.S., 2001], а також виникнення надлишкових або парадоксальних ефектів у відповідь на введення адренотропних препаратів [Ahles A., 2009]. Проявом даної проблеми є і виникнення феномена толерантності до блокаторів бета-адренорецепторів [Broadley K.J., 2002].

Мінливість адренореактивних систем можна також розглянути як додатковий механізм впливу на адренорецептори.

Вплив факторів, що змінюють кількісні та якісні характеристики адренорецепторів досліджено недостатньо. Відомо, що адренореактивні системи здатні динамічно змінюватися під впливом таких факторів, як гіпоксія, зміна температури, метаболічної активності, гормонального статусу, при вікових змінах, впливі канцерогенів та при малігнізаційній трансформації. Помічено також, що вплив кожного з цих факторів опосередкований змінами фосфоліпідного складу мембран.

На даний час фосфоліпіди широко використовуються як носії лікарських речовин. Наші дані дозволяють продемонструвати, що фосфоліпіди ліпосом самі по собі не є біологічно інертним носієм лікарських речовин, а здатні спричиняти самостійні ефекти. Зокрема, володіють виразною, але зовсім невраховуваною дією, результатом якої буде зміна функції судинних структур. Відносно ефектів фосфоліпідів ліпосом складається дещо парадоксальна ситуація. В більшості джерел вказується на біологічну інтактність фосфоліпідів ліпосом. Певні літературні джерела вказують на антигіпертензивний ефект ліпосом [Соловьев А.И., 2002], зокрема препарату ліпін [Хромов О.С., 2008]. З іншого боку, ряд дослідників у своїх роботах демонструють, що ліпосоми посилюють дію катехоламінів [Стефанов А.В., 1980, 1983], основним ефектом яких є вазоконстрикція, що суперечить антигіпертензивній дії. Наша робота дозволяє певною мірою прояснити ці суперечності.

Про важливість ролі адренорецепторів в функціонуванні організму свідчить той факт, що всі структури, які містять гладенькі м'язи, містять адренорецептори і є катехоламінозалежними. Тому дилатація або скорочення судини розглядається, окрім інших чинників, як наслідок активації відповідних адренорецепторів під дією катехоламінів. Приваблює сама можливість впливу на вегетативну регуляцію судин, при якій корекція судинного тонусу відбувається за рахунок зміни чутливості рецепторного апарата, а не завдяки короткочасному ефекту екзогенних катехоламінів.

На даний момент необхідний пошук лікарських засобів, що взаємодіють не з лігандзв'язуючими ділянками адренорецепторних систем, а з іншими структурами, що впливають на функціонування адренореактивних систем. Потреба в таких засобах, без сумніву, існує [Сергеев П.В., 1999]. Як приклад, можна привести дані літератури про зниження ефективності бета-адренергічних впливів на серце при серцевій недостатності [Красникова Т.Л., 2000] і гіпертонічній хворобі [Castellano M., 2003]. При серцевій недостатності відбувається зменшення числа бета(1)-адренорецепторів на 60-70%, що обумовлено десенситизацією бета-рецепторів міокарда [Violin J.D., 2006]. При артеріальній гіпертензії також виникає зменшення числа бета-адренорецепторів, підвищення експресії інгібуючого білка Gi, роз'єднання зв'язку бета-адренорецепторів з Gs-білком внаслідок підвищення активності кінази бета- адренорецепторів [Violin J.D., 2006].

Представлені дані переконливо показують важливість і необхідність своєчасного відновлення ефективності адренергічних впливів. Із цих позицій розробка питань фізіології й фармакології та клінічного використання речовин-модуляторів адренорецепторів, безсумнівно, представляється актуальною.

Мета дослідження: вивчити властивість фосфоліпідів модулювати адренергічні реакції в гладеньких м'язах судин в умовах in vitro.

Завдання дослідження:

1.Експериментально продемонструвати зміни, що викликаються фосфоліпідними везикулами у виразності та динаміці скоротливої активності гладеньких м'язів судин, у порівнянні з фосфоліпідними міцелами.

2.Виявити зміни, що викликаються фосфоліпідними везікулами в агоніст-індукованих реакціях гладеньких м'язів судин залежно від типу активованого адренорецептора.

3. Оцінити зміни, що викликаються фосфоліпідними везикулами, в агоніст-індукованих реакціях гладеньких м'язів судин, фізико-хімічних і структурних властивостей фосфоліпіду.

Об'єкт дослідження - мінливість адренорецепторних систем.

Предмет дослідження - здатність фосфоліпідних везикул модулювати адренорецепторні системи.

Методи дослідження - фармакологічні, фізіологічні, морфологічні та статистичні.

Наукова новизна роботи. Вперше теоретично обґрунтовано та експериментально доведено, що перехід міцелярної структури фосфоліпідів (міцели) у глобулярну форму (ліпосоми) призводить до якісних змін реакційної здатності фосфоліпідів, а саме, зі зменшенням розмірів часток у них з'являється здатність модулювати адренергічні реакції. Уперше в дослідах на ізольованій ворітній вені щура продемонстровано, що фосфоліпіди підвищують виразність ефекту адреналіноподібних речовин та блокаторів бета-адренорецепторів, що доводить здатність фосфоліпідів, організованих у ліпосоми, змінювати бета- і альфа-адренореактивність судинних гладеньком'язових клітин та свідчить про селективність їх модуляції. Іншими словами, ідентифікована нова фармакологічна мішень для фосфатидилхолінових ліпосом у судинній стінці. Встановлено, що зміна ефектів адреноміметиків різної селективності при їх послідовному введенні з ліпосомами зберігається в умовах блокади альфа-адренорецепторів і не проявляється в умовах блокади бета-адренорецепторів, що також доводить селективність модулюючого ефекту ліпосом.

Робота підкреслює наявність самостійних фармакологічних ефектів у фосфатидилхолінових ліпосом. Виявлені особливості комбінованої дії адреноміметиків і ліпосом доводять можливість модифікації біологічного ефекту лікарських препаратів фосфоліпідами ліпосом, що необхідно враховувати при використанні ліпосомальних форм фармакологічних препаратів у медичній практиці.

Науково-практична значимість роботи. Результати проведеного дослідження розширюють сучасні уявлення про фармакологічні властивості різних форм фосфоліпідів, у тому числі залежно від способу їхньої структурної організації.

Результати даного дослідження дозволяють прогнозувати посилення або ослаблення цільового ефекту речовин, що включені у ліпосоми, за рахунок впливу на адренорецепторні системи матеріалу носія, тобто фосфоліпідів самих ліпосом. Дані, отримані в дослідженні, необхідно враховувати при розробці ліпосомальних форм адренергічно активних препаратів, тому що ефекти носія можуть істотно відбитися на активності речовини, що доставляється.

Результати вносять ряд істотних коректив і в розуміння фізіологічної природи зміни судинного тонусу. Так, зокрема, показана важлива роль фосфоліпідів у регуляції судинного тонусу і роль фосфоліпідів як компонентів системи модуляції адренореактивності. Значення даного спостереження є важливим для клініки, адже не виключено, що адреналінсенсибілізуюча дія фосфоліпідів викликає посилення скорочення гладеньких м'язів судин при базовому рівні катехоламінів крові, що у свою чергу може відбиватися на показниках артеріального тиску.

Явище модуляції фосфоліпідами адренергічних систем можна використовувати в клінічній фармакології для розробки методів подолання толерантності до бета-блокаторів. Дані про вплив фосфоліпідів на адренореактивність судин можуть розглядатися також як теоретична база для розробки методів боротьби з патологічними станами, що супроводжуються посиленням або ослабленням нервових впливів на ефекторні структури.

Результати дослідження впроваджені в навчальний процес на кафедрах фармакології та клінічної фармакології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця, Тернопільського державного медичного університету імені І.Я. Горбачевського, Дніпропетровської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. З допомогою наукового керівника була визначена тема, вибір об'єкта та методики дослідження. Внесок здобувача полягає у визначенні мети та завдань роботи. Весь обсяг роботи з першоджерелами літератури, проведення патентно-інформаційного пошуку, експериментів, статистична обробка і аналіз отриманих результатів виконані здобувачем самостійно. Наукова оцінка, розробка основних положень і висновків роботи також виконані здобувачем. Підготовка наукових матеріалів дисертаційної роботи до публікації здійснювалася разом з науковим керівником.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалось у відділі експериментальної терапії ДУ «Інститут фармакології та токсикології АМН України» протягом 2005- 2008 рр. в межах науково-дослідної держбюджетної теми «Фармакологічний аналіз змін калієвої провідності і внутрішньоклітинної концентрації іонізованого Са²⁺ в ефекторних елементах судинної стінки при оксидативному стресі»; номер державної реєстрації - 0106U000869.

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи були представлені на конференції «Роль мессенджерних систем у патогенезі патологічних процесів різної етіології» (Тернопіль, листопад 2007), всеукраїнському конгресі «Сьогодення та майбутнє фармації» (Харків, квітень 2008), всеросійській конференції «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, квітень 2008), міжнародних науково-практичних конференціях «Довкілля та здоров'я людини» (Ужгород, квітень 2008) і «Досягнення та перспективи клінічної фармакології» (Вінниця, травень 2008), міжнародному науковому симпозіумі «Сучасні профілактичні й реабілітаційні технології в кардіології» (Бориспіль, жовтень 2008). Основні положення дисертації доповідалися й обговорювалися на міжнародній конференції «Биология - наука ХХІ века» (Пущино, листопад 2008).

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи досліджень. У дослідженні використана методика міографічної реєстрації скоротливої активності гладеньких м'язів. Досліди виконані на спеціально сконструйованій установці на базі А.с. №1028315. Реєстрація скорочувальної активності здійснювалася в ізометричному режимі за допомогою датчиків напруги, у якості яких застосовувалися механо-електричні перетворювачі ємнісного типу FTS 0.1 (Grass Technologies, США). Сигнал з перетворювача передавався на двоканальний підсилювач, потім після обробки на аналого-цифровому перетворювачі фіксувався комп'ютерною програмою для запису та аналізу даних Data Trax 2.048 (World Precision Instruments inc., 2008). В якості тест-об'єкта використовували ізольовані сегменти ворітної вени печінки 230 білих щурів-самців лінії Вистар вагою 250-300 г. Всі експериментальні процедури здійснювали відповідно до Методичних рекомендацій ДФЦ МОЗ України [О.В. Стефанов, 2001], вимог Європейської конвенції із захисту лабораторних тварин (Страсбург, 1986) та Статуту Української асоціації з біоетики та норм GLP (1992).

Ворітна вена печінки щура є адекватною моделлю резистивних судин і підходить у якості тест-об'єкта для вивчення адренорецепторів. Перфузія препаратів проводилася термостатованим (36-37° С) стандартним розчином Кребса.

Реєстрували реакції ворітної вени на фенілефрин, клонідин та адреналін (агоністи альфа(1)-, альфа(2)-, альфа(1,2)-адренорецепторів відповідно), празозин, йохимбін та фентоламін (антагоністи альфа(1)-, альфа(2)- та альфа(1,2)- адренорецепторів), а також на добутамін, кленбутерол та ізопреналін (агоністи бета(1)-, бета(2)-, бета(1,2)-адренорецепторів), атенолол, бутоксамін та пропранолол (антагоністи бета(1)-, бета(2)- та бета-(1,2)адренорецепторів) у присутності ліпосом (100 мкг/мл) та їх відсутності у буферному розчині.

Для побудови кривих доза-ефект використовувався ряд послідовних концентрацій (10^-8-10^-4 моль/л) для кожного з агоністів та антагоністів. Індивідуальні відповіді ізольованих ворітних вен на фармакологічні впливи при різних концентраціях оцінювали шляхом порівняння «інтегральної інтенсивності скоротливої активності» (ІІА) за методикою, що описана в роботі [Phillip M., 1994, 1996]. Даний показник був використаний у зв'язку з варіабельністю частоти та амплітуди спонтанних скорочень ворітної вени. ІІА являється зведеним показником, що включає частоту, амплітуду та величину базального тонусу, чисельно дорівнює площі під кривою «сила скорочення (F) - час (t)» і відображає роботу, що виконана м'язом. Для одержання ІІА з оцифрованих даних запису спонтанних скорочень брали ділянки графіка функції F(t) тривалістю 4 хв. і піддавали інтегруванню (AUC_0-4).

Порівняння проводили шляхом побудови кривих залежності ІІА (%) від концентрації перерахованих симпатоактивних речовин (log С) в присутності фосфоліпідів (100 мкг/мл) та їх відсутності в буферному розчині, котрі апроксимували S-подібними кривими за рівнянням Хілла, що були побудовані за методом найменших квадратів. Із апроксимації експериментальних даних чотирьохпараметричної логістичної кривої (крива Хілла, або крива доза-ефект) були отримані величина ЕД₅₀ та величина максимального ефекту для залежностей доза-ефект. Залежності доза-ефект та значення величин максимальних реакцій при різних впливах порівнювалися з застосуванням методу Т'юкі [Гланц С., 1999].

В експериментах використовувався фосфатидилхолін у вигляді малих одношарових ліпосом (МОЛ), великих одношарових ліпосом (ВОЛ) і фосфатидилхолін у міцелярній формі.

Малі одношарові везикули готували ex tempore за наступною методикою: 10% спиртової розчин лецитину об'ємом 0,3 мл висушували в грушоподібній колбі на вакуумному роторному випаровувачі до одержання тонкої плівки. До отриманої плівки додавали ізотонічний розчин NaCl в об'ємі 1,5 мл і струшували на механічному шейкері до повного суспендування фосфоліпіду. Суспензію, що утворилася (25 мг/мл), піддавали ультразвуковій обробці на дезінтеграторі УЗДН-2Т протягом 3 хв. із частотою 22 кГц. Отриманий розчин додавали до кожного з розведень адренергічно активної речовини в розчині Кребса для одержання концентрації 100 мкг/мл (за фосфоліпідом). Розчин, що містить ліпосоми, використовувався в експерименті протягом 1-1Ѕ годин.

Великі одношарові ліпосоми одержували ex tempore методом «обернених фаз». Для цього до 2,0 мл розчину ліпіду в диетиловому ефірі додавали 1,0 мл буферного розчину, що містить 140 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl (pH 7,4). Далі суміш обробляли ультразвуком 5-10 хв. у трубчастому випромінювачі УЗДН 2-Т при температурі 10°С с частотою 22 кГц до одержання стійкої емульсії. Емульсію, що утворилася, переносили в грушоподібну колбу і видаляли розчинник на вакуумному випаровувачі.

Електронно-мікроскопічні дослідження часток фосфоліпіду виконано на мікроскопі JEM-100СХ (Японія) методом негативного контрастування. Мікрофотографії з електронного мікроскопа обробляли за допомогою комп'ютерної системи аналізу зображень UTHSCSA ImageTool 3 (США).

Визначення розмірів ліпосом проводилося на лазерному дифракційному аналізаторі (наносайзері) Shimadzu SALD-7101 (Японія). Розрахунок розподілу часток фосфоліпіду по розмірах зроблено за допомогою програми Wing-1 (Shimadzu, Японія).

Значення коефіцієнта ліпофільності для симпатоактивних речовин визначалося методом ACD/log P за допомогою програми ACD/Lab5.

Квантово-фармакологічні дослідження молекулярних комбінацій фосфатидилхоліну з адренергічно активними сполуками виконані за допомогою програми HyperChem 7.0. Зокрема електронна та просторова структура досліджена за допомогою методу молекулярної механіки ММ+ і напівемпіричних розрахунків (метод РМ3).

Вірогідність отриманих результатів оцінювали за t-критерієм Стьюдента. Зміни вважали достовірними при р<0,05. Всі розрахунки проводили з використанням EXCEL 2007, OriginPro 8.0 (OriginLab Corporation, США).

Результати дослідження та їх обговорення.

Дослідження типу та розмірів фосфоліпідних часток. Як показало електронно-мікроскопічне дослідження, фосфоліпідні частинки являли собою одношарові сферичні структури з діапазоном діаметрів від 80-100 нм, замкнуті одношарові сферичні частинки розміром близько 200-300 нм і структури неправильної форми розміром близько 600-800 нм, ідентифіковані нами як МОЛ, ВОЛ і міцелярна форма фосфатидилхоліну відповідно.

Дані, отримані на наносайзері, підтверджують інформацію, отриману на електронному мікроскопі. Так, при дослідженні суспензії МОЛ широта діапазону розподілу часток за розміром становила від 179 нм до 23 нм, найбільш часто зустрічалися везикули діаметром 97-52 нм, при цьому середній розмір часток становив 78,45 нм.

Визначення ліофільності. З метою теоретичного обґрунтування модулюючого ефекту фосфоліпідів відносно симпатоактивних сполук для останніх був обчислений коефіцієнт ліпофільності. Ліпофільність досліджуваних речовин збільшувалася в наступному порядку: адреналін < фенілефрин < празозин < атенолол < ізопротеренол < добутамін < клонідин < бутоксамін < йохимбін < кленбутерол < пропранолол < фентоламін. Було знайдено взаємозв'язок між ліпофільністю симпатоактивних речовин та їх підлеглістю модулюючій дії фосфатидилхоліну. Аналіз показав, що порядок зниження ліпофільності адренергічно активних сполук частково збігається з порядком, у якому фосфатидилхолін підсилює їх дію. Особливо ця тенденція стосується речовин, що стоять на початку послідовності.

Природа зв'язку ліпофільності та модулюючого ефекту вимагає подальшого уточнення, але, виходячи з отриманих результатів, уже можна заключити, що малі фосфатидилхолінові ліпосоми підсилюють виразність ефектів адренергічно активних речовин із низькою ліпофільністю і майже не впливають на ефекти речовин з високою ліпофільністю.

Квантово-хімічні розрахунки. Для з'ясування взаємодії молекули фосфатидилхоліну з адренергічно активними сполуками був обчислений виграш енергії зв'язування при їх взаємодії за допомогою квантово-хімічних розрахунків. Установлено, що енергія комбінації фосфатидилхоліну із симпатоактивними речовинами в жодному з випадків не була менша суми енергій кожного з компонентів (Таб. 1). Це вказує на низьку реакційну здатність молекули фосфатидилхоліну з перерахованими вище сполуками, і свідчить на користь того, що фосфатидилхолін взаємодіє саме з адренорецепторами.

Таблиця 1 Енергія звязування при взаємодії фосфатидилхоліну з сипатоактивними сполуками.

Вплив фосфатидилхоліну на спонтанну скорочувальну активність ворітної вени. У ході дослідів установлено, що сам по собі фосфатидилхолін адренергічною активністю не володіє, але в його присутності змінюються реакції гладеньких м'язів на катехоламіноподібні речовини. При спробі побудувати криву доза-ефект для зростаючих концентрацій МОЛ (від 20 до 1280 мкг/мл) було виявлено, що ліпосоми на скорочувальну активність ворітної вени впливають не дозозалежним, а пороговим чином. Після досягнення граничної концентрації в 100 мкг/мл подальшої зміни ефекту не відбувалося. Тому як робоча концентрація для всіх наступних експериментів була обрана саме ця концентрація ліпосом.

Дія МОЛ на ефекти симпатоактивних сполук. Порівнюючи дію МОЛ при комбінованому введенні з агоністами та антагоністами адренорецепторів за величиною максимальної відповіді (Е_мах), найбільша їх активність відзначена відносно ефектів альфа(1)-АМ фенілефрину (збільшення на 71,34±10,7%) та неселективного альфа(1,2)-АМ адреналіну (збільшення на 70,85±12,2%). Дещо менша активність для альфа-(2)-АМ клонідину (збільшення на 44,80±4,7%).

Що стосується дії МОЛ на ефекти альфа-адреноблокаторів, то ліпосоми посилювали величину максимальної відповіді альфа(1)-АБ празозину та альфа(1,2)-АБ фентоламіну (на 42,17±7,8% і 70,83±20,5% відповідно) та пригнічували її для альфа(2)-АБ йохимбіну на 37,32±7,9%.

Значні зміни відзначені також для величини максимальної реакції при комбінованій дії МОЛ та бета(1)-АМ добутаміну і бета(1)-АБ атенолола (2-кратне зниження Е_мах в обох випадках). Дещо менше зниження зафіксовано для ізопротеренола (16,33±9,45%). За даним критерієм МОЛ не виявили активності по відношенню до бета(2)-АМ і бета(2)-АБ і достовірно підвищили значення Е_мах для пропранолола (збільшення вдвічі).

Порівнюючи різницю ЕС₅₀ та напрямок зсуву кривих доза-ефект, необхідно відзначити, що дія МОЛ на ефекти агоністів усіх типів альфа-АР проявлялася зміщенням кривої доза-ефект ліворуч, що відбувається при збільшенні числа ліганд-зв'язуючих ділянок, крім антагоніста альфа(2)-АР йохимбіну, для якого спостерігався правобічний зсув кривої доза-ефект (який, зазвичай, відбувається в результаті блокади рецепторів або зниження їх кількості). Найбільш значний зсув кривої доза-ефект ліворуч відбувався для ефектів бета(2)-АМ і бета(2)-АБ, причому величина E_max в обох випадках достовірно не змінювалася для кленбутерола та бутоксаміна. Для неселективного бета-АМ ізопротеренола відбувався правобічний зсув кривої доза-ефект, відповідний 6-кратному збільшенню EС₅₀.

Таким чином, при аналізі дії МОЛ відносно адренергічно активних сполук можна помітити певну систему в змінах. Найбільш очевидними змінами, що відбуваються під впливом МОЛ, є: посилення відповідей альфа-АМ (на підставі збільшення їх Е_мах),, пригнічення відповідей бета-АМ (на підставі зниження Е_мах).

Дія ВОЛ та МФ на ефекти симпатоактивних сполук. Перфузія препаратів ворітної вени великими одношаровими ліпосомами (ВОЛ) та фосфатидилхоліном у міцелярній формі (МФ) в концентрації 100 мкг/мл практично не змінювала початкових ефектів перерахованого ряду симпатоактивних сполук. У діапазоні взятих концентрацій було відзначене збільшення величини максимального ефекту адреналін-індукованої скорочувальної реакції під впливом великих ліпосом на 3% від контрольного значення. При вивченні ефектів комбінації клонідина з міцелярною формою фосфоліпідів було відзначене правобічне зміщення кривої (ЕС₅₀ 6,83Ч10^-7 ± 2,25Ч10^-8 і 3,14Ч10^-7 ±1,64Ч10^-8моль/л, p<0,05; n=6). Більше істотних змін в ефектах адреноміметиків під дією ВОЛ і МФ не спостерігалося.

Аналіз отриманих кривих доза-ефект показав статистично достовірну відсутність змін реакцій ворітної вени індукованих бета-адреноміметиками під дією ВОЛ і МФ в концентрації 100 мкг/мл.

Отже, результати описаної серії експериментів свідчать про те, що низка особливостей, які спостерігалися у серії дослідів з МОЛ, не спостерігалися в дослідах з використанням ВОЛ та МФ. Виходячи із цього, можна зробити висновок, що структура МФ та фосфатидилхоліну, що підлягла змінам у процесі одержання ВОЛ, не дозволяє проявляти модулюючі властивості відносно ефектів симпатоактивних речовин.

Дія МОЛ на ефекти симпатоактивних сполук в умовах блокади бета-адренорецепторів. Для визначення походження зсуву кривих доза-ефект була проведена серія дослідів, у якій адреномодулюючий ефект фосфоліпідів був відтворений в умовах блокади адренорецепторів. Подібне вивчення характеристик агоніста, виміряних у присутності антагоніста, широко застосовується для класифікації (рецепторної спрямованості дії тієї або іншої речовини). Установлено, що агоніст альфа- адренорецепторів фенілефрин стимулює спонтанну скоротливу активність ворітної вени дозозалежним чином з ЕС₅₀1,84Ч10^-6±2,81Ч10^-7 моль/л. У присутності 1,27Ч10^-4 (EС₅₀) антагоніста бета-адренорецепторів атенолола EC₅₀ для фенілефрину збільшилася до 1,25Ч10^-6 ± 2,77Ч10^-7.

Додавання МОЛ не викликало достовірних змін, характерних для ефекту фенілефрину під впливом МОЛ, у відсутності бета-блокатора. Тому можна констатувати відсутність зсуву кривої доза-ефект для альфа-агоніста фенілефрину під впливом МОЛ в умовах блокади бета-адренорецепторів.

Дія МОЛ на ефекти симпатоактивних сполук в умовах блокади альфа-адренорецепторів. На відміну від попередніх дослідів ми спостерігали зміщення кривої доза-ефект для агоніста бета-адренорецепторів в умовах блокади альфа-адренорецепторів. Так, агоніст бета-адренорецепторів добутамін викликав посилення спонтанної скоротливої активності ворітної вени дозозалежним чином з ЕС₅₀ 4,36Ч10^-5±1,85Ч10^-6 моль/л. У присутності 1,41Ч10^-5±1,71Ч10^-6 (ЕС₅₀) блокатора альфа-адренорецепторів празозина ЕС₅₀ фенілефрину зменшувалася до 5,34Ч10^-5±1,65Ч10^-6. Додавання ж МОЛ викликало збільшення ЕС₅₀ фенілефрину до 4,76Ч10^-5 ±1,15Ч10^-6. Тобто, можна зробити висновок, що зсув кривої доза-ефект для добутаміну, що відбувається під впливом ліпосом, не блокується антагоністом альфа-адренорецепторів. Одночасно спостерігалися зміни величини максимальної реакції.

фосфоліпід адренергічний клітина

Висновки

У роботі, присвяченій модуляції адренергічних систем судинних гладеньком'язових клітин за допомогою екзогенних фосфоліпідів, на підставі досліджень in vitro вперше теоретично обґрунтовано та експериментально доведено що:

1. Перехід міцелярної структури фосфоліпідів у глобулярну форму (ліпосоми) призводить до якісних змін реакційної активності фосфоліпідів, зокрема у них з'являється властивість модулювати адренергічні реакції. Найбільшої виразності реакція набуває зі зменшенням розмірів ліпосом до 80-100 нм.

2. Малі одношарові ліпосоми швидко та зворотньо підвищують альфа-адренореактивність ворітної вени, що виражається посиленням величини максимальної відповіді на агоністи альфа-адренорецепторів (для фенілефрину на 71,3%, для клонідину на 44,8% і для адреналіну на 70,9%) і зниженням величини EC₅₀ (на 17,5%, 33,3% і 25,9% для фенілефрину, клонідину та адреналіну відповідно). Великі одношарові ліпосоми та фосфоліпіди в міцелярній формі такою здатністю не володіють.

3. Малі одношарові ліпосоми швидко та зворотньо знижують бета-адренореактивність ворітної вени, що виражається зниженням величини максимальної відповіді на агоністи бета-адренорецепторів (для добутаміну на 55,6%). Великі одношарові ліпосоми та фосфоліпіди в міцелярній формі такою здатністю не володіють.

4. Прояви модулюючого ефекту фосфатидилхолінових ліпосом для симпатоактивних сполук, усуваються антагоністами бета-адренорецепторів і не блокуються антагоністами альфа-адренорецепторів, що вказує на те, що ефект реалізується через бета-адренорецептори.

5. Фосфатидилхолін у вигляді малих одношарових ліпосом є аллостеричним модулятором адренореактивних систем, виразність дії якого стосовно підтипів адренорецепторів знижується в ряду альфа-1 > бета-1 > альфа-2 > бета-2.

6. Судячи з розрахованих величин енергії зв'язування, при взаємодії фосфатидилхоліну із симпатоактивними сполуками (атенолол, бутоксамін, добутамін, ізопреналін, кленбутерол, йохимбін, клонідин, празозин, пропранолол, фенілефрин, фентоламін) жоден з комплексів не є енергетично вигідною структурою. Це вказує на низьку реакційну здатність молекули фосфатидилхоліну з перерахованими вище сполуками, і свідчить на користь того, що фосфатидилхолін взаємодіє саме з адренорецепторами.

7. Вихідний рівень адренореактивності залежить від фосфоліпідного складу мембран і може бути підсилений чи послаблений введенням екзогенних фосфоліпідів.

8. Отримані дані про вплив фосфоліпідів на ефекти симпатоактивних речовин необхідно враховувати при розробці ліпосомальних форм вазотропних препаратів, тому що фосфоліпіди ліпосом можуть істотно змінювати характер реакцій серцево-судинної системи на фізіологічно активні речовини.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Шепетько M.В. Фосфатидилхолінові ліпосоми підсилюють альфа-адренергічні відповіді спонтанноактивної ворітної вени / M.В. Шепетько, A.І. Соловйов // Ліки. - 2007. - №5-6. - С. 110-116. (Внесок здобувача: проведення експериментів, статистична обробка та аналіз результатів, написання статті).

2. Шепетько М.В. Модулююча дія екзогенних фосфоліпідів на ефекти адренотропних сполук / Матеріали ІІ Національного конгресу лікарів внутрішньої медицини «Дискусійні питання діагностики та лікування в клініці внутрішніх хвороб», 16-18 жовтня 2008 р. - К., 2008. - С. 243-250.

3. Шепетько M.В. Посилення ефектів альфа-адреноміметиків фосфатидилхоліновими ліпосомами / M.В. Шепетько, A.І. Соловйов // Науковий вісник Ужгородського університету. Серія «Медицина». - 2008. - Вип. 34. - С. 45-51. (Внесок здобувача: проведення експериментів, статистична обробка та аналіз результатів, написання статті).

4. Шепетько М.В. Вплив екзогенних фосфоліпідів на ефекти адренотропних сполук / M.В. Шепетько, A.І. Соловйов // Фармацевт. журнал. - 2009. - №2. - С. 114-121. (Внесок здобувача: проведення експериментів, статистична обробка та аналіз результатів, написання статті).

5. Шепетько M.В. Парадоксальне поєднання ефектів ліпосом: посилення катехоламінової вазоконстрикції та гіпотензивна дія / M.В. Шепетько, A.І. Соловйов // Медичні перспективи. - 2009. - Т. 14, №2. - С. 29-35. (Внесок здобувача: проведення експериментів, статистична обробка та аналіз результатів, написання статті).

6. Шепетько M.В. Вплив фосфатидилхолінових ліпосом на скоротливу активність ворітної вени, стимульованої альфа-адреноагоністами / M.В. Шепетько, А.В. Стефанов // Медична хімія. - 2007. - Т.9, №4. - С. 78.

7. Шепетько М.В. Вплив фосфатидилхолінових ліпосом на ефекти бета-адренотропних лігандів / M.В. Шепетько, A.І. Соловйов // Мат. міжнар. наук.-практ. конф. «Довкілля і здоров'я людини». - Ужгород: «Говерла», 2008. - С. 86-88.

8. Шепетько М.В. Влияние фосфатидилхолиновых липосом на эффекты бета-адренотропных лигандов / Мат. IX Всерос. мед.-биол. конф. молод. учен. «Фундаментальная наука и клиническая медицина». - Санкт-Петербург: изд. СпбГУ, 2008. - С. 428-430.

9. Шепетько М.В. Mодуляция адренергической активности лекарств липосомами / M.В. Шепетько, A.И. Соловьев / Тез. докл. всеук. конгр. «Настоящее и будущее фармации». - Харьков: «Моноап», 2008. - С. 440.

10. Шепетько М.В. Влияние фосфолипидов на эффекты адренотропных веществ / M.В. Шепетько, A.И. Соловьев // Сборн. тез. ХIІ междунар. Пущинской конфер. Молод. Уч. - Пущино, 2008. - С.161-162.

11. Шепетько M.В. Ліпосомально-адренергічний синергізм / M.В. Шепетько, A.І. Соловйов // Вісн. Вінницького. Нац. мед. ун. - 2008. - №2. - С. 525.

12. Шепетько М.В. Парадоксальное сочетание: усиление катехоламиновой вазоконстрикции и гипотензивный эффект лецитиновых липосом / M.В. Шепетько, A.И. Соловьев / Материалы Международного научного симпозиума «Современные профилактические и реабилитационные технологии в кардиологии», 24 октября 2008 г. - Борисполь. - С. 284-285.

Размещено на Allbest.ru