Фармакологічне вивчення протизапальної активності антагоніста рецепторів інтерлейкіна-1 (АРІЛ-1)

Матеріали та методи дослідження. Об`єктом досліджень обраний антагоніст рецепторів інтерлейкіна-1 (АРІЛ-1) виробництва ВАТ «РЭСБИО» (м. Санкт-Петербург, Росія). Субстанція АРІЛ-1 отримана в Державному науково-дослідному інституті особливо чистих біопрепаратів Федерального медико-біологічного агентства Росії, м. Санкт-Петербург «ДНДІ ОЧБ».

Субстанція АРІЛ-1 складається з 153 амінокислот. АРІЛ-1 отриманий за допомогою генно-інженерних технологій та є ліофільно висушеним білком ІЛ-1ра, який продукується рекомбінантним штамом E. coli BL21.

Як препарати порівняння використовували диклофенак натрію - «Наклофен» виробництва KRKA (Чехія) розчин для ін`єкцій 25 мг/мл; індометацин - «Метиндол» виробництва «Pliva Cracow» (Польша) розчин для ін`єкцій 30 мг/мл; кверцетин - гранули кверцетина Борщагівського ХФЗ (Україна) 2,0; генно-інженерний (рекомбінантний) препарат супероксиддисмутази «Рексод», отриманий на ВАТ «РЕСБИО» (м. Санкт-Петербург, Росія); метамізол натрію - «анальгін» ФК «Здоров`я» (Україна), розчин для ін`єкцій 50%, та силімарин - «Силібор» ФК «Здоров`я» (Україна) таблетки, вкриті оболонкою, по 35 мг.

Експериментальне вивчення протизапальної активності АРІЛ-1 включало дослідження його антиексудативної, мембранозахисної, антиальтеративної, антипроліферативної дії; визначення аналгезивної та жарознижувальної активності АРІЛ-1 та поглиблене вивчення його ефективності на моделях запалення з перевагою ексудації, альтерації та проліферації (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

Досліди проводили з використанням лабораторних тварин, які були вирощені у розпліднику ЦНДЛ НФаУ. Утримання тварин відповідало діючим правилам по пристроях, обладнанню та утриманню віваріїв. Тварини отримували стандартне харчування відповідно до діючих норм (Кожем'якін Ю.М. і співав., 2002). З тваринами поводились згідно з вимогами комісії з біоетики НФаУ та «Загальними етичними принципами експериментів на тваринах» (Київ, 2001), що узгоджуються з положеннями “Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують для експериментальних та наукових цілей” (Страсбург, 1986 р. зі змінами, внесеними в 1998 р.). ексудативний запалення гемоліз жарознижувальний

АРІЛ-1 розчиняли в воді для ін'єкцій та вводили внутрішньом'язово, при вивченні антиексудативної активності - в дозах 1; 3 та 6 мг/кг маси тіла експериментальних тварин, для подальших досліджень була обрана доза 3 мг/кг. Референс-препарати вводили: диклофенак натрію та індометацин внутрішньом`язово в дозах EД<sub>50</sub> за антиексудативною активністю - 8 мг/кг та 10 мг/кг відповідно, при ад`ювантному артриті EД₅₀ диклофенака натрію була 15,4 мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001); рексод - внутрішньоочеревинно, розчинивши в воді для ин`єкцій, в умовно-ефективній дозі 0,02 мг/кг (Деримедвідь Л.В., 2004); кверцетин та силібор - внутрішньошлунково у вигляді тонко диспергованих суспензій у очищеній воді, стабілізованих емульгатором твіном-80, кверцетин в умовно-ефективній дозі, яка складає 5 мг/кг (Сахарова Т.С., 2006) та силібор в дозі EД<sub>30</sub> - 25 мг/кг (Місюрьова С.В., 2002); анальгін - внутрішньом`язово в дозі 50 мг/кг (Доклінічні дослідження лікарських засобів, 2001).

Експериментальне вивчення антиексудативної дії АРІЛ-1 проводили на моделях карагенінового, зимозанового та гістамінового набряків, визначення мембранопротекторної дії - на моделі спонтанного гемолізу еритроцитів у щурів за методом F.C. Jager (1996).

Оцінку антиальтеративної активності АРІЛ-1 проводили на моделі некротичних виразок у щурів, а антипроліферативної дії - на моделі “ватної” гранульоми.

Вираженість аналгетичної дії АРІЛ-1 вивчали на моделі вісцерального болю - за методом “оцтовокислих корчів” у мишей, оцінку жарознижувальної активності препарату проводили на моделі молочної лихоманки у щурів.

Наступним етапом поглибленого дослідження АРІЛ-1 було визначення його протизапальної активності на моделях системного запалення, в розвитку яких спостерігали фази ексудації, альтерації та проліферації.

Однією з моделей для поглибленого вивчення ефективності протизапальних засобів, яка вважається адекватною ревматоїдному артриту у людини, є модель ад'ювантного артриту (АА). Вплив АРІЛ-1 на розвиток і перебіг АА оцінювали за зменшенням набряку кінцівок, нормалізацією часу зсідання крові, загальної кількості лейкоцитів, ШОЕ, рівнем С-реактивного білка, а також визначали вплив препаратів, які досліджуються, на процеси ПОЛ. Інтенсивність процесів ПОЛ визначали за рівнем ТБК-активних продуктів. Час згортання крові визначали за Мас і Магро, лейкоцити підраховували в камері Горяєва, ШОЕ визначали за мікрометодом Т.П. Панченкова, рівень С-РБ - імунотурбідиметричним методом за допомогою тест-наборів фірми «Lachema» (Чехія). Об`єм лап вимірювали за допомогою механічного онкометра за А.С. Захаревським.

Як відомо, у патогенезі РА провідним компонентом ушкодження є імунний фактор. Вивчення впливу АРІЛ-1 на стан імунітету тварин з АА проводили за загальноприйнятими методами імунологічних досліджень. У тварин визначали рівень ЦІК за методом преципітації у розчині поліетиленгліколю (Haskova V., 1978), вміст загального комплементу за 50% гемолізом (Зейфарт М., 1979), активність фагоцитозу (за методом Stuart A.E., 1978).

Поглиблене вивчення антиальтеративної активності АРІЛ-1 проведено на моделі адреналінового міокардиту (АМ) у щурів. Функціональний стан серцевого м`язу та, відповідно, антиальтеративну активність порівнюваних препаратів оцінювали за МКС та показниками ЕКГ, які реєстрували у II стандартному відведенні на електрокардіографі ЕКIТ-ОЗ М2.

Для оцінки антиоксидантних властивостей АРІЛ-1 визначали вміст ТБК-активних продуктів (Арутюнян А.В. і співав., 2000). Іінтенсивність цитолітичних процесів оцінювали за рівнем аспартатамінотрансферази (АсАТ) у сироватці крові дослідних тварин (Камишніков В.С., 2002).

Поглиблене вивчення протизапальної дії АРІЛ-1 проводили також на моделі хронічного тетрахлорметанового гепатиту у щурів. Стан печінки оцінювали за масовим коефіцієнтом печінки (МКП), показником виживання тварин та біохімічними показниками. У сироватці крові визначали: ферментосинтетичну функцію печінки - за рівнем АлАт; наявність холестазу в печінці - за вмістом лужної фосфатази; стан білоксинтетичної функції печінки - за вмістом загального білка; антитоксичну функцію печінки - за рівнем сечовини; стан обміну ліпідів - за рівнем холестерину (Камишніков В.С., 2002). У гомогенаті печінки визначали інтенсивність процесів ПОЛ за рівнем ТБК-активних продуктів, ДК та стан АОС організму тварин - за вмістом ВГ та каталази (Арутюнян А.В. і співав., 2000); ступінь енергозабезпечення печінки - за рівнем глікогену в тканині (Камишніков В.С., 2002).

Жовчоутворюючу функцію печінки оцінювали за швидкістю секреції жовчі, кількістю жовчних кислот та холестерину в жовчі.

Всі дослідження були виконані згідно з Методичними рекомендаціями з доклінічного вивчення лікарських засобів, 2001.

Отримані експериментальні дані обробляли методами параметричної та непараметричної статистики (Лапач С.М. і співавт., 2001) за допомогою стандартного пакету статистичних програм «Statistica 6.0».

Результати досліджень та їх обговорення

Дослідження антиексудативної та мембранопротекторної дії АРІЛ-1 (розділ 3). Враховуючи відомості про доведену важливу роль цитокінів, зокрема інтерлейкіну-1 (ІЛ-1), у розвитку гострого запалення, та з метою визначення середньої ефективної дози було доцільним провести вивчення фармакологічних властивостей АРІЛ-1 з визначення його антиексудативної та мембраностабілізуючої активності.

Встановлено, що за антиексудативною активністю на моделях карагенінового та зимозанового набряків АРІЛ-1 не поступався референс-препаратам - диклофенаку натрію та кверцетину. На моделі гістамінового набряку диклофенак переважав активність АРІЛ-1 майже в 2 рази (таблиця 1).

За ступенем виразності мембранозахисної дії на моделі спонтанного гемолізу у щурів АРІЛ-1 та кверцетин можна розташувати наступним чином: АРІЛ-1 у дозі 3 мг/кг (45,7%) ? кверцетин (40,2%) (таблиця 1).

Таблиця 1

Антиексудативна та мембранозахисна дія (в %) АРІЛ-1, диклофенаку натрію та кверцетину

Результати проведених досліджень дозволяють зробити висновок, що на моделі зимозанового набряку АРІЛ-1 на відміну від класичних НПЗЗ, переважно діє на 1-2 годинах дослідження, коли у розвитку запалення переважна роль належить лейкотрієнам (ЛТ). Цей факт можна вважати підтвердженням антилейкотрієнового механізму дії АРІЛ-1 (Іщенко О.М., 2001). Крім того, на підставі отриманих експериментальних даних на моделях карагенінового та гістамінового набряків можливо припустити, що АРІЛ-1 впливає і на синтез простагландинів та на активність біогенних амінів (зокрема, гістаміну), тобто є більш універсальним препаратом у порівнянні з класичними НПЗЗ, які пригнічують ЦОГ та знижують синтез ПГ (карагеніновий набряк), та кверцетином, протизапальна дія якого забезпечується вибірковим пригніченням ліпооксигенази (ЛОГ) та зниженням синтезу ЛТ (зимозановий набряк).

Для проведення подальших досліджень ми визначили умовно-ефективну дозу АРІЛ-1, яка складає 3 мг/кг.

Дослідження антиальтеративної, антипроліферативної, анальгезивної та жарознижувальної активності АРІЛ-1 (розділ 4). Відомо, що ІЛ-1 є індуцибельним білком, синтез якого починається у відповідь на ушкодження тканин, тобто він є стартовим моментом запуску будь-якого запального процесу. Антиальтеративну дію АРІЛ-1 ми досліджували на моделі некротичних виразок.

Протягом перших 7 діб після ін'єкції щурам розчинів оцтової кислоти та декстрану спостерігалось відчудження некротичної тканини, у деяких випадках - виділення гнійного ексудату. На 8 добу площа ранового процесу була максимальною (340-360 мм²), після чого розпочалось загоєння ран.

Використання АРІЛ-1, рексоду та диклофенаку натрію привело до достовірного поліпшення показників загоювання ран порівняно з групою контрольної патології. Найбільшу антиальтеративну активність на моделі некротичних виразок у щурів виявив рексод (62,2%). АРІЛ-1 (52,4%) та диклофенак натрію (48,3%) достовірно поступалися рексод за антиальтеративною дією. Треба зазначити, що при застосуванні рексод і АРІЛ-1 спостерігали тенденцію до затримки утворення виразок і зменшення їх площі.

При цьому наприкінці дослідження повне рубцювання виразок відбулось у 75% тварин, що отримували АРІЛ-1 і рексод. В групі тварин, яких ліковали диклофенаком натрію, цей показник склав 50%. У тварин групи контрольної патології не зафіксовано жодного випадку повного рубцювання.

Таким чином, можна зробити висновок, що АРІЛ-1 дещо поступається за антиальтеративною дією рексод. Отримані результати дослідження відповідають механізмам дії обраних препаратів: СОД діє на початковій, “нульовій” стадії ВРО і перешкоджає ушкодженню клітин і тканин АФК при запальних процесах, тобто є мембранопротектором (Деримедвідь Л.В., 2004).

Механізм антиальтеративної дії АРІЛ-1 пов`язаний з блокуванням специфічних рецепторів до ІЛ-1 шляхом їх конкурентного зв'язування, що зменшує ушкоджуючу дію ІЛ-1 на клітинні мембрани, сприяє гальмуванню ВРО та знижує накопичення вільних радикалів, а також блокує ліпооксигеназний шлях метаболізму арахідонової кислоти та гальмує синтез ЛТ.

На останніх етапах запального процесу провідна роль належить процесу проліферації. Ця стадія запалення характеризується розвитком грануляційної тканини в осередку ураження. Враховуючи також, що в процесі розвитку проліферативної фази запального процесу важливу роль відіграють інтерлейкіни, зокрема ІЛ-1, наступним етапом досліджень було визначення антипроліферативної дії АРІЛ-1.

Антипроліферативну активність досліджених препаратів визначали за їх здатністю пригнічувати утворення грануляційної тканини навколо імплантованої ватяної кульки. При введенні АРІЛ-1 маса гранульоми зменшилась з 44,82,6 мг в групі контрольної патології до 29,21,9 мг, під дією індометацину - до 25,72,8 мг, а диклофенак сприяв зменшенню розвитку грануляційної тканини до 35,62,1 мг (рис. 1).

Таким чином, АРІЛ-1 за антипроліферативною дією не поступався індометацину та перевищував активність диклофенака натрію.

Відомо, що між антиальтеративною та антипроліферативною активностями стандартних НПЗЗ (індометацин, диклофенак) існує зворотня симбатна залежність - чим більше виражені антиальтеративні властивості, тим менше - антипроліферативні. Таку кореляцію між антиальтеративною та антипроліферативною дією НПЗЗ можна пояснити їх різною здатністю пригнічувати синтез колагену, що позитивно впливає на проліферативні процеси та негативно - на альтеративні (Зупанець І.А., 1988). На відміну від традиційних НПЗЗ АРІЛ-1 виявляє водночас як антиальтеративну, так і антипроліферативну активність.

Отримані результати підтверджують відомості про те, що ІЛ-1 посилює проліферацію синовіальних фібробластів, підвищує їх диференціацію в остеоцити та стимулює синтез сполучної тканини (Насонов Є.Л., 2001). АРІЛ-1 пригнічує продукцію протеаз хондроцитами та знижує проліферацію фібробластів (Батян Г.М., 2003).

Наступним етапом проведених досліджень було вивчення аналгетичної та жарознижувальної дії АРІЛ-1. Як показали результати досліду, аналгетична активність АРІЛ-1 на моделі оцтовокислих «корчів» дорівнювала 23,5%, що приблизно у 2 рази менше, ніж дія референс-препарату. Проте, необхідно наголосити, що знеболювальну дію АРІЛ-1 проявляє у дозі, в 17 разів меншій, ніж метамізол натрію.

Відомо, що механізм аналгетичної дії метамізолу натрію пов`язаний з блокуванням синтезу ПГ та брадикініну, зміною взаємодії тканинних рецепторів з медіаторами запалення та гальмуванням вивільнення останніх з тканинних базофілів, що пригнічує проведення больових імпульсів по аферентних шляхах спинного мозку (Стефанов О.В., 2001). Вочевидь, аналгетичні властивості АРІЛ-1 зумовлені його антиоксидантною дією, оскільки він зменшує пошкоджуючу дію АФК на тканини і цим зменшує подальші реакції з боку ноцицептивної системи.

Таблиця 2

Порівняння аналгетичної та жарознижувальної дії АРІЛ-1 в %

В результаті проведених дослідів на моделі молочної лихоманки у щурів встановлено, що при різних режимах введення жарознижувальна дія АРІЛ-1 була неоднаковою. При профілактичному режимі введення АРІЛ-1 переважав за дією референс-препарат, його активність складала 63,6%, тоді як активність диклофенаку натрію дорівнювала 37,5%. При лікувальному режимі, навпаки, АРІЛ-1 поступався за виразністю дії препарату порівняння майже в 2,7 разу (29,2% та 78,3% відповідно).

Жарознижувальну активність АРІЛ-1 можна пояснити здатністю пригнічувати взаємодію ІЛ-1 з рецепторами нейронів центру терморегуляції в гіпоталамусі, що знижує внутрішньоклітинний рівень циклічного аденозинмонофосфату, зменшує утворення теплової енергії та підсилює тепловіддачу (Іщенко О.М., 2002).

Розбіжність в жарознижувальній активності АРІЛ-1 при різних режимах введення ймовірно пояснюється тим, що при лікувальному режимі ми маємо справу вже з наслідками запуску цитокінового каскаду та пірогенного впливу ІЛ-1, тож блокування рецепторів ІЛ-1 у даному випадку ніяк не впливає на виразність процесу. Профілактичне введення АРІЛ-1 дозволяє загальмувати початок запуску цитокінового каскаду.

Таким чином, за результатами проведених досліджень встановлено, що АРІЛ-1 виявляє виражену антиексудативну, антиальтеративну, антипроліферативну, жарознижувальну (при профілактичному режимі введення) та помірну анальгезивну активність. Наявність у АРІЛ-1 водночас антиальтеративної, антиексудативної та антипроліферативної активності вигідно відрізняє його від класичних НПЗЗ, які більшою мірою пригнічують ексудативну фазу запалення.

Поглиблене вивчення ефективності АРІЛ-1 на моделях запалення (розділ 5). Найбільш розповсюдженим ревматологічним захворюванням є ревматоїдний артрит, який є хронічним запаленням сполучної тканини та суглобів зі складним аутоімунним патогенезом. При цьому захворюванні в суглобах спостерігаються всі стадії запалення (альтерація, ексудація та проліферація). На наступному етапі дослідження був вивчений вплив АРІЛ-1 на перебіг ад`ювантного артриту (АА) у щурів.

Після субплантарного введення ад'юванта Фрейнда у щурів спостерігали запальну реакцію, яка супроводжувалася розвитком гіперемії та набряку ураженої кінцівки. З 15-го дня досліду у щурів почали з'являтися ознаки ураження парної лапи та хвоста, виявлялось посилення ексудації (об`єм лап збільшився в 1,3 разу), гіперемія, порушення рухомості, що супроводжувалось змінами наступних показників: кількість лейкоцитів збільшилась в 2,6 разу, рівень ШОЕ - 2,7 разу, вміст СР-Б - в 2,2 разу, час згортання крові зменшився у 1,6 разу, рівень низькомолекулярних ЦІК збільшився - у 4,4 разу; високомолекулярних - у 4,3 разу, активність фагоцитозу в середньому - в 1,7 разу, рівень загального комплементу - у 2,2 разу. Все це свідчить про початок розвитку генералізованого артриту.

Введення АРІЛ-1 та диклофенаку натрію сприяло достовірному поліпшенню всіх показників, за якими оцінювали перебіг АА.

За антиексудативною активністю, впливом на рівень лейкоцитів та час згортання крові АРІЛ-1 наближається до дії диклофенаку натрію. Референс-препарат достовірно переважає АРІЛ-1 за впливом на ШОЕ, але поступається йому за антиоксидантною дією та впливом на імунологічні показники, а саме, загальний комплімент та рівень ЦІК (рис. 2, 3).

Отримані результати підтверджують дані літератури щодо ключової ролі цитокінів, зокрема ІЛ-1, в патогенезі ревматичних захворювань. ІЛ-1 викликає гіперпродукцію гострофазових білків (С-реактивного, фібриногена тощо), бере участь у деструкції навколосуглобових тканин, сприяє диференціації В-лімфоцитів до плазматичних клітин та стимулює синтез ревматоїдного фактора (Симбірцев А.С., 2001).

За рахунок блокади специфічних рецепторів ІЛ-1 АРІЛ-1 послаблює перебіг гострої фази захворювання, знижує синтез медіаторів запалення, обмежує пошкодження клітинних мембран, пригнічує активність ферментів-металоіназ (коллагеназ, стромелізинів, желатиназ), які беруть участь в пошкодженні хряща та кісток при артриті. Також АРІЛ-1 знижує ПОЛ за рахунок пригнічення гранулоцитарно-макрофагального колонієстимулюючого фактора, що гальмує міграцію в порожнину суглоба лейкоцитів та зменшує фагоцитоз (Симбірцев А.С., Кетлінський С.С., 2003).

Відомо, що взаємодія між лейкоцитами та ендотелієм є однією з наважливіших ланок у розвитку запального процесу. ІЛ-1 регулює адгезію активованих нейтрофілів до клітин ендотелія, що викликає конверсію ксантиндегідрогенази до її активної форми - ксантиноксидази, внаслідок чого посилюється продукція супероксиду та інших активних метаболітів кисню (Кетлінський С.С., 2003). АРІЛ-1 достовірно зменшує лейкоцитоз та знижує рівень ТБК-АП, що призводить до гальмування запального процесу (Симбірцев А.С., Кетлінський С.С., 2006).

Можливо припустити, що виражена терапевтична дія АРІЛ-1 при АА пояснюється тим, що даний препарат здатен блокувати водночас запальні та імунні реакції, тобто впливає на імунну та ендокринну системи (Карцева О.А., 2002).

Результати дослідження свідчать про здатність АРІЛ-1 гальмувати запуск реакцій імунітету в умовах АА у щурів.

Оскільки доведено, що захворювання міокарда зазвичай супроводжуються запальним процесом, але НПЗЗ в терапії кардіологічних захворювань не використовуються внаслідок пригнічння синтезу простагландину Е₂, який впливає на кровопостачання міокарда, було цікавим дослідити вплив АРІЛ-1 на стан серцевого м'язу на тлі адреналінового міокардиту (АМ) у щурів.

Введення АРІЛ-1 та рексоду призвело до достовірного поліпшення всіх показників стану міокарда експериментальних тварин, особливо рівня ВГ (56-71%) та ТБК-АП (36,9-55,1%), що сприяло збільшенню виживання тварин на 16,7-33,3% відповідно. Також при застосуванні АРІЛ-1 та рексоду визначена тенденція до нормалізації електрофізіологічних процесів у серцевому м`язі, про що свідчать збільшення потенціалу збудження передсердь та шлуночків (підвищення амплітуди зубця Р на 15%), збільшення скоротливої активності передсердь (відновлення PQ в середньому на 70%, QRS - на 47%, QT - на 25%), зниження ішемії міокарда (сегмент ST менше зміщений від ізолінії на 75,5-85%). У групі тварин, що отримували диклофенак натрію, визначена лише тенденція до нормалізації стану серцевого м`яза.

В групі тварин з контрольною патологією під дією адреналіну спостерігали тахікардію (підвищення ЧСС на 37%) та збільшення потреби міокарда у кисні, що призвело до гіпоксії та ішемії серцевого м`язу й спричинило подальший розвиток запальної реакції, яка супроводжувалась аутолізом кардіоміоцитів (рівень АсАТ виріс в 1,3 разу), а також набряком м`язових волокон (МКС збільшився в 1,5 разу). Розвиток патології підтверджувався змінами показників ЕКГ (PQ - 37%, QRS - 45%, QT - 21%, амплітуди зубців R і P - 30%, зміщення сегмента ST від ізолінії - 70%), стану АОС та ВРО та став причиною загибелі двох тварин з групи контрольної патології.

Аналіз результатів дослідження на моделі АМ свідчить, що виражена антиоксидантна (36,9%) та антицитолітична (25%) дія АРІЛ-1 забезпечує його кардіопротекторну активність (35,9%), за якою він не поступається ефективності рексоду (38,1%).

Відомо, що одним з механізмів пошкодження клітинних мембран є вільнорадикальне окиснення. Надлишок продуктів перекисної деструкції порушує фізико-хімічну структуру клітинних мембран, пригнічує їх ферментні системи, інактивує цитоплазматичні ферменти, розщеплює АТФ та амінокислоти, деполяризує нитки ДНК, а також знижує активність тіолових ферментів, що призводить до розвитку альтеративних і ексудативних процесів. Виражена антиальтеративна активність рексоду при АМ пояснюється антиоксидантними та мембранопротекторними властивостями (Деримедвідь Л.В., 2004).

Механізм антиальтеративної дії АРІЛ-1 при АМ, як і на скринінговій моделі (некротичні виразки), пов`язаний з блокуванням специфічних рецепторів до ІЛ-1 шляхом їх конкурентного зв'язування та зниженням ушкоджуючої дії ІЛ-1 на мембрани кардіоміоцитів, а також з гальмуванням процесів ПОЛ.

Основний механізм дії диклофенаку натрію пов`язаний з пригніченням ЦОГ та зниженням синтезу ПГ, тобто диклофенак більшою мірою контролює вираженість ексудативної фази запалення та мало впливає на розвиток альтеративних процесів.

Наступним етапом поглибленого вивчення фармакодинаміки АРІЛ-1 було дослідження його впливу на перебіг хронічного тетрахлорметанового гепатиту у щурів. Введення розчину тетрахлорметану викликало у щурів в групі контрольної патології тяжку інтоксикацію, яка супроводжувалась запаленням гепатоцитів (МКП збільшився в 2 рази), розвитком жирової дистрофії печінки (вміст холестерину в сироватці крові збільшився в 2 рази) та порушенням її білоксинтетичної (рівень білка в сироватці крові знизився в 1,4 разу), глікогенсинтетичної (вміст глікогену в печінці зменшився в 2,4 раза), жовчоутворюючої (швидкість секреції жовчі й вміст жовчних кислот зменшилися, відповідно, в 2,5 й 1,5 разу) та ліпотропної функцій (рівень холестерину в жовчі зменшився в 1,6 разу), що спричинило загибель 25% тварин з гепатитом у групі контрольної патології.

Введення АРІЛ-1 призвело до збільшення виживання тварин до 100%. Застосування силібору сприяло збільшенню виживання щурів до 87,5%.

Застосування АРІЛ-1 та силібору позитивно впливало на стан печінки тварин на тлі експериментального гепатиту (рис.7-10). Особливо це стосується нормалізації показників АлАТ, ЛФ (51,6%; 44,4%) та показників ВГ, каталази та глікогену під впливом АРІЛ-1 та силібору.

На підставі аналізу отриманих даних дослідження можна зробити висновок, що за гепатозахисною активністю на моделі тетрахлорметанового гепатиту АРІЛ-1 не поступався силібору. Треба відзначити, що за впливом на виживання тварин, інтенсивність процесів ВРО та нормалізацію стану антиокисної системи гепатоцитів ефективність АРІЛ-1 була виразнішою у порівнянні з референс-препаратом.

Гепатозахисна дія АРІЛ-1, на наш погляд, зумовлена тим, що АРІЛ-1 за рахунок блокування рецепторів до ІЛ-1 зменшує його прооксидантний вплив, тобто контролює швидкість процесів ВРО та сприяє відновленню активності компонентів АОС, що, в свою чергу, пригнічує розвиток запальних процесів в гепатоцитах. На нашу думку, АРІЛ-1 внаслідок зниження запалення та мембаностабілізувальної дії стимулює пригнічену тетрахлорметаном монооксигеназну систему печінки.

Позитивний вплив АРІЛ-1 на процеси жовчоутворення обумовлений тим, що АРІЛ-1 зменшує негативний вплив ІЛ-1 на ферментативні системи, які забезпечують процес жовчоутворення. Це підтверджується й даними літератури про те, що ряд цитокінів негативно впливають на систему АТФ-аз, яка відіграє ключову роль в процесі жовчоутворення (Івашкін В.Т., 1994).

Силібор, подібно до інших біофлавоноїдів, сприяє стабілізації мембранних структур гепатоцитів та лімітує в них швидкість перебігу процесів ВРО. Крім того, згідно з даними літератури, силімарин здатний пригнічувати продукцію ІЛ-1 (Дроговоз С.М., Скакун Н.П., 1986).

Результати проведеного експериментального вивчення протизапальної дії АРІЛ-1 свідчать про наявність у АРІЛ-1 вираженої (в межах 34-50%) антиексудативної, антиальтеративної, антипроліферативної, жарознижувальної, антиоксидантної та помірної аналгетичної (23,5%) активності. За усіма видами активності, окрім аналгетичної, АРІЛ-1 не поступається обраним референс-препаратам і значно переважає їх за спектром фармакодинаміки. Широкий спектр фармакологічної активності АРІЛ-1 визначається його здатністю впливати на всі фази запальної реакції та регулювати імунну відповідь.

Різнобічними експериментальними дослідженнями доведено, що АРІЛ-1 гальмує дію ІЛ-1, лейкотрієнів, ПГ, знижує інтенсивність процесів ПОЛ, цитолізу, гальмує синтез ревматоїдного фактору та проліферацію тканин. На нашу думку, АРІЛ-1 є протизапальним препаратом, який поряд з фармакологічними ефектами НПЗЗ проявляє антиоксидантні та імуносупресивні властивості.

Таким чином, проведені дослідження підтверджують перспективність впровадження препарату АРІЛ-1 в клінічну практику для терапії запальних захворювань сполучної тканини, суглобів, печінки та міокарда.

ВИСНОВКИ

У дисертації теоретично та експериментально обґрунтовано доцільність використання антагоніста рецепторів інтерлейкіна-1 (АРІЛ-1) для лікування запальних захворювань сполучної тканини, суглобів, печінки та міокарда. У результаті вивчення фармакологічної ефективності АРІЛ-1 встановлено виражені антиексудативні, антиальтеративні, антипроліферативні, жарознижувальні, антиоксидантні та помірні аналгетичні властивості. Аналіз результатів проведених досліджень дозволяє зробити висновок, що спектр фармакологічної дії АРІЛ-1 обумовлений інгібуванням рецепторів інтерлейкіну-1, який є одним з головних промоторів запальної та імунної відповіді організму.

· Встановлено, що на моделях гострого асептичного запалення АРІЛ-1 у дозах 3 та 6 мг/кг проявляє антиексудативні та мембраностабілізуючі властивості, які не поступаються дії диклофенаку натрію та кверцетину. Визначена умовно-ефективна доза АРІЛ-1 за протизапальною дією складає 3 мг/кг.

· АРІЛ-1 проявляє антиальтеративну активність, яка знаходиться на рівні диклофенаку натрію. За виразністю антипроліферативної дії АРІЛ-1 не поступається індометацину.

· АРІЛ проявляє помірні аналгетичні властивості, за вираженістю яких у 2 рази поступається метамізолу натрію. Ступінь жарознижувальної активності АРІЛ-1 залежить від режиму введення: виразна жарознижувальна дія при профілактичному режимі введення, та помірна - при лікувальному режимі.

· За антиоксидантною, антицитолітичною та мембраностабілізуючою активністю на моделі адреналінового міокардиту АРІЛ-1 не поступається ефективності рексоду та перевищує дію диклофенаку натрію. За гепатозахисною дією на моделі хронічного ураження печінки у щурів (тетрахлорметановому гепатиті) АРІЛ-1 переважає препарат порівняння силібор. За ефективністю на моделі ад`ювантного артриту у щурів АРІЛ-1 не поступається диклофенаку натрію, а за антиоксидантною активністю на цієї моделі значно його переважає.

· Підтверджено, що АРІЛ-1 пригнічує дію ПГ, ІЛ-1, лейкотрієнів, знижує інтенсивність процесів ПОЛ, гальмує цитоліз та проліферацію тканин.

· Доведена доцільність подальшого вивчення АРІЛ-1 з метою використання даного препарату в терапії запальних та аутоімунних захворювань.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Щокіна К.Г. Порівняння антипроліферативної активності сучасних та перспективних протизапальних препаратів / К.Г. Щокіна, О.П. Вікторов, Е.В. Супрун, О.М. Іщенко, Є.М. Коваленко // Фармаком. - 2005. - №4. - С.104-106. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту).

Вікторов О.П. Обгрунтування раціонального вибору сучасних і перспективних препаратів з протизапальною дією: метод. рек. / О.П. Вікторов, К.Г. Щокіна, С.М. Дроговоз, Є.М. Коваленко - Х., 2006. - 16 с. (Особистий внесок здобувача: участь у підборі теоретичного матеріалу, проведення частини експериментів, участь у аналізі зібраних та одержаних даних, участь у оформленні та підготовці видання).

Вікторов О.П. Особливості антиексудативної дії сучасних та перспективних препаратів з протизапальною дією/ О.П. Вікторов, К.Г. Щокіна, Е.В. Супрун, Є.М. Коваленко // Ліки. - 2005. - №5-6. - С.15-20 (Особистий внесок здобувача: теоретичне обгрунтування дослідження; проведення експерименту; участь у аналізі одержаних результатів, участь у підготовці статті).

Коваленко Е.Н. Патофизиологическое значение интерлейкина-1 / Е.Н. Коваленко, Т.А. Бухтиарова, В.В. Страшный Патофизиологическое значение интерлейкина-1 // Фізіологічно активні речовини. - 2002. - №2 (34). - С. 91-94. (Особистий внесок здобувача: участь у підборі теоретичного матеріалу, участь у підготовці статті).

Іщенко О.М. Особливості антиальтеративної дії антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1 / О.М. Іщенко, Є.М. Коваленко, Е.В. Супрун, Л.В. Деримедвідь, Г.В. Бєлік // Вісник фармації. - 2005. - №2 (42). - С. 52-55. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту; участь у аналізі одержаних результатів, участь у підготовці статті).

Коваленко Є.М. Вивчення гепатозахисної дії антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1 / Є.М. Коваленко, О.М. Іщенко, Е.В. Супрун, С.М. Дроговоз //Ліки. - 2006. - №1-2. - С. 52-57. (Особистий внесок здобувача: теоретичне обгрунтування дослідження; проведення експерименту; участь у аналізі одержаних результатів).

Супрун Е.В. Вивчення антиальтеративної активності антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1 (АРІЛ-1) в експерименті / Е.В. Супрун, Є.М. Коваленко // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: тез. VI Нац. з`їзду фармацевтів України, 28-30 вересня 2005 р. - Х.: Вид-во НФаУ, 2005. - С. 604-605.

Супрун Е.В. Експериментальне дослідження гепатозахисної дії антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1 (АРІЛ-1) / Е.В. Супрун, Є.М. Коваленко, Л.М. Грищенко // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтичної галузі України: тез. VI Нац. з`їзду фармацевтів України, 28-30 вересня 2005 р. - Х.: Вид-во НФаУ, 2005. - С. 605-606.

Дроговоз С.М. Перспектива применения антагонистов рецепторов интерлейкина-1 в комплексном лечении больных с ревматоидным артритом / С.М. Дроговоз, Е.М. Коваленко // Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономічні дослідження лікарських засобів та біологічно активних домішок: тез. II Міжнар. наук.-практ. конф.,12-13 жовтня 2006 р. - Х.: Вид-во НФаУ, 2006. - С. 184.

Вікторов О.П. Порівняння ефективності перспективних та сучасних протизапальних засобів на моделі ад`ювантного артриту / О.П. Вікторов, К.Г. Щокіна, Є.М. Коваленко // Фармакологія 2006 - крок у майбутнє: тез. III Нац. з`їзду фармацевтів України, 17-20 жовтня 2006 р. - Одеса: Одес. Держ. Мед. ун-т, 2006. - С.32.

Брунь Л.В. Вивчення протизапальної та анальгетичної активності глюкозиламонійних солей галоген заміщених анілідів карбоксисукцинанілової кислоти в експерименті / Л.В. Брунь, І.А. Зупанець, С.Г. Ісаєв, Є.М. Коваленко // Фармакологія 2006 - крок у майбутнє: тез. III Нац. з`їзду фармацевтів України, 17-20 жовтня 2006 р. - Одеса: Одес. Держ. Мед. ун-т, 2006. - С.22.

Супрун Е.В. Експериментальне вивчення протизапальної активності антагоніста рецепторів інтерлейкіну-1 (АРІЛ-1) / Е.В. Супрун, Є.М. Коваленко // Фармакологія 2006 - крок у майбутнє: тез. III Нац. з`їзду фармацевтів України, 17-20 жовтня 2006 р. - Одеса: Одес. Держ. Мед. ун-т, 2006. - С.169-170.

Супрун Е.В. Експериментальне вивчення особливостей антиальтеративної активності АРІЛ-1 / Е.В. Супрун, С.М. Дроговоз, Є.М. Коваленко // Ліки. - 2005. - №3-4. - С. 43-47. (Особистий внесок здобувача: проведення експерименту; участь у аналізі одержаних результатів, участь у підготовці статті).

Щекина Е.Г. Роль цитокинов в развитии воспалительных заболеваний / Е.Г. Щекина, Е.Н. Коваленко // Український біофармацевтичний журнал. - 2008. - Т.1, №1. - С. 25-27. (Особистий внесок здобувача: участь у підборі теоретичного матеріалу, участь у підготовці статті).

АНОТАЦІЇ

Коваленко Є.М. Фармакологічне вивчення протизапальної активності антагоніста рецепторів інтерлейкіна-1 (АРІЛ-1). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фармацевтичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Національний фармацевтичний університет, Харків, 2009.

Дисертація присвячена експериментальному вивченню протизапальної активності антагоніста рецепторів інтерлейкіна-1 (АРІЛ-1).

Результати проведених досліджень дозволяють зробити висновок, що на моделях гострого ексудативного запалення АРІЛ-1, на відміну від класичних НПЗЗ, переважно діє на 1-2 годинах дослідження, тобто на етапі утворення лейкотрієнів (ЛТ). Цей факт також можна вважати підтвердженням антилейкотрієнового механізму дії АРІЛ-1. Однак, на підставі отриманих експериментальних даних можливо припустити, що АРІЛ-1 виявляє певний вплив і на синтез простагландинів та біогенних амінів (зокрема, гістаміну), тобто є більш універсальним препаратом у порівнянні з класичними НПЗЗ, які пригнічують ЦОГ та знижують синтез ПГ, та кверцетином, протизапальна дія якого забезпечується вибірковим пригніченням ЛОГ та зниженням синтезу ЛТ (зимозановий набряк).

Для проведення подальших досліджень ми визначили умовно ефективну дозу АРІЛ-1, яка дорівнює 3 мг/кг

Дані, отримані під час проведеного різнобічного експериментального вивчення дії АРІЛ-1, дозволили зробити порівняльний аналіз його ефективності на різних моделях запалення, а за результатами аналізу було проведено інтегральне порівняння активності АРІЛ-1 з дією референс-препаратів.

Встановлено, що АРІЛ-1 проявляє виражену (в межах 34-50%) антиексудативну, антиальтеративну, антипроліферативну, жарознижувальну, імуномодулювальну, антиоксидантну та помірну анальгезивну (23,5%) активності. За усіма видами активності, окрім анальгезивної, АРІЛ-1 не поступається обраним референс-препаратам і значно переважає їх за широтою фармакодинаміки. Широкий спектр фармакологічної активності АРІЛ-1 визначається його здатністю впливати на всі фази запальної реакції та регулювати імунну відповідь.

Різнобічними експериментальними дослідженнями доведено, що АРІЛ-1 гальмує дію ПГ, ІЛ-1, лейкотрієнів, знижує інтенсивність процесів ПОЛ, цитолізу, фагоцитозу, гальмує синтез ревматоїдного фактору та проліферацію тканин. Можно стверджувати, що АРІЛ-1 є протизапальним препаратом, який поєднує фармакологічні властивості НПЗЗ, антиоксидантів та імуномодуляторів.

Таким чином, проведені дослідження підтверджують перспективність впровадження препарату АРІЛ-1 до терапії запальних захворювань сполучної тканини та суглобів, печінки та міокарда.

Ключові слова: фармакологічне дослідження, АРІЛ-1, інтерлейкін-1, диклофенак натрію, рексод, кверцетин, запалення, ексудація, альтерація, проліферація, протизапальна дія, антиоксидантна активність.

Коваленко Е.Н. Фармакологическое изучение противовоспалительной активности антагониста рецепторов интерлейкина-1 (АРИЛ-1). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Национальный фармацевтический университет, Харьков, 2009.

Диссертация посвящена экспериментальному изучению противовоспалительной активности антагониста рецепторов интерлейкина-1 (АРИЛ-1).

Установлено, що экссудативная и мембранопротекторная активность АРИЛ-1 на моделях острого асептического воспаления не уступала активности референс-препаратов - диклофенака натрия и кверцетина. Скрининговые исследования позволили определить условно-эффективную дозу АРИЛ-1 - 3 мг/кг.

Согласно результатам проведенных исследований АРИЛ-1 обладает выраженной антиэкссудативной, антиальтеративной, антипролиферативной, жаропонижающей (при профилактическом режиме введения) и умеренной анальгетической активностью. Наличие у АРИЛ-1 одновременно антиальтеративной, антиэкссудативной и антипролиферативной активности выгодно отличает его от традиционных НПВС, которые большей частью угнетают экссудативную фазу воспаления.

Анализ результатов исследования на модели адреналинового миокардита свидетельствует, что выраженная антиоксидантная и антицитолитическая активность АРИЛ-1 обеспечивает его кардиопротекторную активность, которая не уступает рексод и значительно превышает действие диклофенака натрия. По гепатопротекторному действию на модели тетрахлорметанового гепатита АРИЛ-1 не уступает классическому отечественному гепатопротектору силибору. Причем, по влиянию на интенсивность процессов СРО и нормализации антиоксидантной системы гепатоцитов эффективность АРИЛ-1 была в среднем на 20%, чем у референс-препарата.

На модели адъювантного артрита по антиэкссудативной активности, влиянием на уровень лейкоцитоза и время свертывания крови АРИЛ-1 приближается к активности диклофенака натрия. Референс-препарат достоверно превосходит АРИЛ-1 по влиянию на СОЭ, но значительно уступает ему по вдлиянию на иммунологические показатели, а именно общий комплепент и уровень ЦИК. Таким образом, по противоартритному действию АРИЛ-1 находится на уровне диклофенака натрия и по некоторым показателям превосходит его.

Результаты, полученные в ходе разностороннего экспериментального изучения действия АРИЛ-1, позволили провести сравнительный анализ его фармакодинамики на различных моделях воспаления, который позволил провести интегральное сравнение активности АРИЛ-1 с действием референс-препаратов.

Установлено, что АРИЛ-1 обладает выраженным (в пределах 34-50%) антиэкссудативным, антиальтеративным, антипролиферативным, жаропонижающим, иммуномодулирующим, антиоксидантным и умеренным аналгезирующим (23,5%) действием. По всем видам активности, кроме аналгезивной, АРИЛ-1 не уступает выбранным препаратам сравнения и значительно превосходит любой из них по широте фармакодинамики. Широкий спектр фармакологической активности АРИЛ-1 объясняется его способностью оказывать влияние на все фазы воспалительного процесса и регулировать иммунный ответ организма на повреждение.

Экспериментальными исследованиями доказано, что АРИЛ-1 тормозит активность ПГ, ИЛ-1, лейкотриенов, снижает интенсивность процессов ПОЛ, цитолиза, фагоцитоза, тормозит синтез ревматоидного фактора и пролиферацию тканей. Можно утверждать, что АРИЛ-1 представляет собой препарат, объединяющий фармакологические свойства НПВС, антиоксидантов и иммуномодуляторов. Таким образом, проведенные исследования подтверждают перспективность включения АРИЛ-1 в терапию воспалительных зболеваний соединительной ткани и суставов, печени и миокарда.