Генная терапия

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАРАГАНДИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА БИОХИМИИ

Реферат

Тема: «ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ»

Караганда 2009 г.

Содержание

ВВЕДЕНИЕ

ТЕРАПИЯ ОПУХОЛЕЙ

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ МОНОГЕННЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

ПРОБЛЕМА ВЕКТОРОВ - ОСНОВНАЯ ПРОБЛЕМА ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

ПЕРВЫЕ ПОПЫТКИ ГЕНОТЕРАПИИ МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Заключение

Список литературы

Введение

(gene therapy) - лечение, направленное на избавление человека от какого-либо генетического заболевания путем введения в его организм с помощью методов генетической инженерии нормальных генов, так чтобы они могли преодолеть эффекты влияния дефектных генов. Наиболее радикальным подходом в этом случае является введение нормальных генов на очень ранней стадии эмбрионального развития человека, так чтобы новый ген мог соединиться с половыми клетками (яйцеклеткой и сперматозоидом) и человек унаследовал бы те признаки, которые данный ген несет в себе. Однако такой подход не является абсолютно безопасным и этически оправданным, так как последствия такого введения гена в дальнейшем отразятся на всех потомках того человека, которому была осуществлена такая операция; поэтому данный метод в медицине практически не используется. В случае генной терапии соматических клеток (somatic cell gene therapy) здоровый ген вводится в соматические клетки (например, в стволовые клетки костного мозга), из которых развиваются другие клетки. Все появившиеся на основании этих модифицированных клеток новые клетки будут совершенно нормальными, и если они будут присутствовать в организме в достаточном количестве, то заболевание человека будет устранено (дефектные гены, однако, останутся в зародышевых клетках, но их влияние будет подавлено). В настоящее время генная терапия чаще всего выполняется для лечения заболеваний, вызванных наличием дефекта в одном рецессивном гене, так чтобы имеющийся дефект можно было устранить введением нормального аллеля (лечение заболеваний, связанных с наличием дефектов в доминантных генах (например, болезни Хантингтона), требует модификации или замены дефектного аллеля, когда его влияние выражается в наличии нормального аллеля). В качестве примеров таких рецессивных заболеваний можно привести дефицит аденозин дезаминазы (АДА-дефицит) и фиброзно-кистозную дегенерацию. Уже проведено достаточно модельных экспериментов, связанных с генной терапией: из организма больного с помощью моноклональных антител забираются стволовые клетки лимфоцитов, которые затем выращиваются вместе с ретровирусами, генетически запрограммированными таким образом, чтобы они содержали нормальный АДА-ген.

Таким образом данный ген соединяется со стволовыми клетками, которые по возвращении в костный мозг пациента начинают вырабатывать там нормальные лимфоциты. Клинические эксперименты, связанные с генной терапией в случае фиброзно-кистозной дегенерации, предполагают использование липосом для введения нормального гена в легкие больных людей с помощью ингалятора. Также проводятся исследования, связанные с генной терапией некоторых видов рака (например, меланомы и рака груди). В данном случае в ткань, пораженную раковыми клетками, вводятся гены, которые ускоряют образование веществ, разрушающих опухолевые клетки.

Терапия опухолей

Не секрет, что, несмотря на существенное улучшение методов борьбы с опухолями, онкологические заболевания продолжают оставаться одной из основных причин смертности. По данным Национального ракового института США, за последнее десятилетие смертность от рака снизилась на 15-17%, но одновременно с этим встречаемость заболевания увеличилась на 50%. Похоже, что эффективность традиционных методов лечения рака достигла своего максимума. Необходимо искать принципиально новые подходы к терапии опухолей. Достижения современной молекулярной биологии и генетики позволяют надеяться, что такие средства будут найдены.

В настоящее время молекулярно-генетические принципы возникновения опухолей в основном понятны. Открыта и охарактеризована большая группа онкогенов, мутации в которых приводят к их повышенной экспрессии и, как следствие, к злокачественной трансформации клеток. Другая группа генов, обозначаемых как гены-супрессоры опухолей, кодируют белки, подавляющие клеточный рост. Инактивация таких генов также способствует превращению нормальной клетки в опухолевую. Наконец, выявлено большое число генов, изменения в которых всегда ведут к перерождению первичной, относительно доброкачественной опухоли. Ее клетки становятся злокачественными, способными к инвазивному, деструктивному росту и метастазированию, т.е. переносу и росту в новых местах. Более того, трансформированные клетки могут атаковать и уничтожать нормальные клетки организма.

Хотя мы узнали очень много о механизмах возникновения рака, это не привело к немедленному решению проблемы рака, т.е. к разработке методов его лечения. Одна из причин - разнообразие генетических изменений, вызывающих рак. Более того, в одной опухоли могут присутствовать клетки с разными генетическими портретами, которые выражаются в виде опухолевых антигенов. Другая причина - невозможность вызвать генетические изменения абсолютно во всех опухолевых клетках так, чтобы подавить их рост. Наконец, третья причина - это высокая пластичность опухолевых клеток, их способность накапливать мутации, сохраняя жизнеспособность. В результате некоторым клеткам удается избежать гибели, и они снова дают рост опухоли.

Таким образом, современные подходы к генной терапии опухолей основаны, во-первых, на нормализации работы мутировавшего гена (онкогена или гена-супрессора) и, во-вторых, на обучении иммунной системы организма распознавать опухолевые антигены и активировать противоопухолевый иммунный ответ.

К первому относятся попытки подавить работу наиболее часто активируемых онкогенов, например, онкогена ras, или, наоборот, вызвать образование нормального продукта гена-супрессора опухолей, например, белка р53. В частности, заражение опухолей вирусами, синтезирующими нормальный белок р53, останавливает развитие опухоли, хотя и не приводит к полному излечению.

Здесь мы подходим к основополагающей проблеме любой неинвазивной терапии. Ведь если мы инфицируем вирусным вектором целый организм, то и нормальные клетки заражаются вирусом, который будет всегда либо синтезировать нормальный белок р53, либо инактивировать экспрессию гена ras. И то и другое может иметь негативные последствия для нормальной клетки. Значит, повысить эффективность воздействия и снизить негативные эффекты может только направленная или адресная доставка терапевтического средства. Работы в данном направлении интенсивно ведутся, но каких-либо существенных достижений пока не опубликовано.

Второй подход основан на мобилизации иммунной системы организма против опухоли. В рамках теории иммунного надзора, трансформированные клетки должны удаляться с помощью клеток иммунной системы. Однако наличие опухолей указывает на низкую эффективность этого надзора, а может быть, и на его полное отсутствие. Одновременно с этим имеется целый ряд документированных фактов, подтверждающих принципиальную возможность существования противоопухолевого иммунитета. Это и случаи спонтанной регрессии опухоли; и обнаружение в организме пациентов клеток иммунной системы, распознающих опухолевые клетки; и многочисленные эксперименты на животных, в которых достигался терапевтический эффект. Эти факты не могли не привести к идее противоопухолевой вакцинации, тем более что противопатогенные вакцины уже доказали свою эффективность. Но в данном случае речь идет не о профилактической вакцинации, а о вакцинации уже инфицированного организма, т.е. о терапевтической вакцинации, что весьма непросто, если нужно вызвать специфический иммунный ответ. “Иммунизировать против рака будет так же сложно, как организму отторгнуть правое ухо, оставив незатронутым левое”, - писал В.Вуглум в журнале “Раковые исследования” (США) в начале XX в.

За последнее десятилетие за рубежом проведено большое количество клинических испытаний по противоопухолевой вакцинации. Так, в США за один только год (2003) прошло более 100 клинических исследований по вакцинотерапии опухолей. В основном их можно разделить на три группы. К первой относят клинические исследования, в которых в качестве иммуногенов используются известные опухолевые антигены в виде синтетических пептидов. Для этого определяется наличие этих антигенов в опухоли пациента и проводится иммунизация соответствующими пептидами. При подобном подходе частичный регресс опухоли достигался только в 2-3% случаев. С точки зрения клинической медицины применение стандартизованных химических пептидов имеет неоспоримое преимущество. Однако, во-первых, эффективность такой вакцинации незначительна, во-вторых, количество известных опухолевых антигенов еще очень ограничено. Кроме того, в организме пациентов уже сформировалась толерантность к опухолевым антигенам, используемым для вакцинации. Значит, необходимо каким-то образом либо преодолеть эту толерантность, либо применять те опухолевые антигены, на которые она еще не сформировалась.

Эти задачи пытаются решить в исследованиях, относящихся ко второй группе. Здесь источником опухолевых антигенов служат сами инактивированные опухолевые клетки, которые для преодоления толерантности генетически модифицируются, чтобы секретировать различные цитокины, такие как интерлейкин-2, -4, -7, интерферон, фактор, стимулирующий рост колоний, и целый ряд других. Все перечисленные цитокины принимают участие в формировании приобретенного иммунного ответа. Большинство опухолевых клеток, модифицированных для продукции определенных цитокинов, in vitro не замедляют свой рост. Однако in vivo рост опухоли значительно замедляется, что говорит об активации иммунного ответа организма благодаря цитокинам. Механизмы данного процесса до конца не ясны и могут отличаться для различных цитокинов. Тем не менее использование инактивированных цитокин-продуцирующих опухолевых клеток для иммунизации пациентов применяется в клинике, однако его эффективность составляет 3-4%.

К третьей группе относятся вакцины на основе дендритных клеток пациента, которые нагружаются вне организма (ex vivo) опухолевыми антигенами в виде пептидов или клеточных лизатов. Эффективность такой вакцинации, а именно случаи частичного регресса опухоли, составляет 7-7.5%.

Как видно из приведенных клинических данных, эффективность терапевтических вакцин достаточно низкая. Как это объяснить и как повысить их эффективность?

Для того чтобы разобраться со сложным процессом возможного противоопухолевого ответа, совершим небольшой экскурс в теорию иммунного ответа. В упрощенном виде иммунная система атакует то, что имеет признак “чужого” или/и не имеет признака “своего”. Эволюционируя, иммунная система должна была противостоять, в первую очередь, наружной инфекции, которая не имеет признаков “своего”, но несет признак “чужого”. Но трансформация собственных клеток организма и, как следствие, отсутствие признака “чужой”, а в то же время присутствие признака “свой”, приводит к возникновению толерантности в отношении переродившихся клеток. В данном случае мы даже не рассматриваем те опухоли, которые сами “научились” распознавать и атаковать клетки иммунной системы, например, через Fas лигандзависимый лизис. Таким образом, чтобы обеспечить эффективное распознавание опухолевых клеток, мы должны пометить их маркером “чужой”, а чтобы удалить их - активировать цитотоксический ответ.

Антиген-презентирующие клетки (АПК), к которым относятся дендритные клетки, макрофаги и некоторые другие, взаимодействуют с патогеном. Поглощенный патоген индуцирует синтез антигенных пептидов, которые представляются в комплексе с антигенами главного комплекса гистосовместимости (major histocomplatibility complex - MHC), формируя первый сигнальный каскад. Одновременно с этим АПК распознает “чужого”, запускает цитокиновый каскад и синтезирует костимуляторную (кооперативно действующую) молекулу В7, обеспечивая второй сигнальный каскад. Таким образом наивная Т-клетка превращается в обученную клетку-помощника. Через сложный каскад цитокинов и взаимодействий такая клетка инициирует антительный и/или цитотоксический Т-лимфоцитарный ответ (рис.2). Для надежности природой придуманы два сигнала, помогающие избежать ответа на “свои” антигены, который может привести к аутоиммунным заболеваниям. В случае злокачественной трансформации клеток организма именно отсутствие второго сигнала блокирует противоопухолевый ответ иммунной системы. Распознавание “чужого” происходит с помощью врожденной системы защиты организма.

Еще не так давно врожденная система защиты рассматривалась как некая примитивная система, обеспечивающая первичную защиту организма от инфекций. Теперь стало ясно, что она не столь примитивна, а должна сложным образом отличить “свое” от “чужого” и, более того, без ее правильного функционирования нет адекватного адаптивного ответа организма. В систему врожденного распознавания “чужого” и адекватного реагирования вовлечен целый ряд распознающих и сигнальных молекул. Наиболее хорошо изучено семейство TLR (Toll like receptors) млекопитающих.

Совсем недавно в нашей лаборатории, а позднее и зарубежными исследователями обнаружено новое семейство сигнальных и распознающих молекул. Мы назвали новое семейство Tag7 - по первому обнаруженному члену семейства, а зарубежные авторы - PGRP; они работали на стандартном объекте генетиков - плодовой мушке дрозофиле, а мы изучали функции представителей этого семейства у млекопитающих. Перечислять все выявленные функции этих молекул в рамках одной статьи не имеет смысла. Остановимся на найденных и оказавшихся существенными для дальнейшей работы по созданию противоопухолевой вакцины. Первое замечательное свойство секретируемого белка Tag7/PGRP состоит в том, что он привлекает к месту секреции (т.е. к клеткам, выделяющим белок в окружающую среду) клетки иммунной системы, в том числе и профессиональные антиген-презентирующие клетки. Второе его свойство, которое решили использовать при создании вакцины, - способность активировать созревание дендритных клеток, т.е. стимулировать экспрессию сигнальной молекулы В7, которая и обеспечивает последующее созревание наивного Т-лимфоцита.

Насколько эффективен тот или иной подход, какой механизм вовлечен в формирование противоопухолевого ответа, изучается на экспериментальных моделях, на животных. Мы использовали линии клеток мышиной меланомы, которые могут расти как в культуре (вне организма), так и после их введения животным. В культуре клетки наращивались до определенного количества, затем их генетически модифицировали вектором, содержащим ген tag7/PGRP. После этого опухолевые клетки начинали секретировать белок Tag7/PGRP, количество которого измерялось. Далее клетки облучали для подавления их деления, т.е. инактивировали, и вводили животным в качестве вакцины. Через 10 дней, после формирования иммунного ответа, в противоположную ногу животным вводили исходные (неинактивированные и немодифицированные) опухолевые клетки и в дальнейшем наблюдали за ними. Оказалось, что на иммунизированных таким образом животных опухоли практически не формировались или, появившись, вскоре исчезали, все животные при этом выживали. В контрольных группах животных опухоли развивались, и мыши погибали.

В других экспериментах мы использовали так называемых “голых” мышей - у них отсутствуют Т-лимфоциты. Считается, что именно эти клетки играют одну из основных ролей в элиминации опухолей. Животным, полностью лишенным Т-клеток, вакцинация не помогала, что говорило о том, что и в нашем случае Т-клетки чрезвычайно важны для противоопухолевого ответа. Последующие опыты показали, что в наблюдаемом нами противоопухолевом ответе организма определенное участие принимают и натуральные киллеры, и В-лимфоциты. Никаких побочных негативных явлений, вызванных вакцинацией, не отмечалось. Более трех лет в нашей лаборатории шли опыты на животных, а результаты публиковались в престижных международных журналах. В терапевтической схеме, т.е. когда сначала вводили опухолевые клетки и лишь потом вакцину, эффективность была меньше, но тем не менее большое количество животных выживало.

После успешных экспериментов на животных в 2000 г. решили начать клинические испытания. В этом нам очень помогли руководство и сотрудники РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН в Москве и НИИ онкологии им.Н.Н.Петрова в Санкт-Петербурге. Составили Протокол проведения клинических испытаний. По действующим жестким правилам первые испытания новых способов лечения проводятся на пациентах, которым уже никакая другая терапия помочь не в состоянии; в данном случае на больных меланомой (одним из самых страшных видов рака), для которых методы лечения были исчерпаны. Схема индивидуального приготовления вакцины выглядит следующим образом: из удаленной во время хирургической операции опухоли отбирается первичный опухолевый материал, и из него в лабораторных условиях получают первичную опухолевую клеточную линию. Далее эти клетки размножают и подбирают условия для их генетической модификации. После проведения самой генетической модификации, инактивации опухолевых клеток радиацией и определения уровня экспрессии гена вакцина готова. В 2001 г. вакцинировали первого пациента. К настоящему времени начальную фазу испытаний можно считать успешно завершенной. По результатам проведенных исследований написана и опубликована статья в международном журнале.

Каков краткий итог проведенных исследований? Нашим коллегам-клиницистам удалось добиться стабилизации заболевания в 25% случаев, а частичного регресса опухоли - в 7% случаев. Конечно, эти цифры не впечатляют, но если сравнить с выше приведенными данными, где эффективность похожего подхода составляла всего 3%, то использование активаторов врожденного компонента иммунной защиты (белка Tag7/PGRP) повысило положительную динамику в два раза. В то же время надо понимать, что с помощью вакцины практически нельзя удалить большую опухоль, тем более если пациент уже прошел курс химиотерапии и его иммунная система подавлена не только прогрессирующей опухолью, но и проводимой терапией. Какова же область применения аутологичной вакцины? Несомненно, она нужна после хирургического вмешательства, чтобы избежать рецидивов заболевания. Когда удален крупный опухолевый узел, возможный источник метастазов, эта вакцина способна уничтожить невидимые глазу врача единичные опухолевые клетки.

Зарубежные лаборатории и клиники уже накопили большой опыт подобных работ. В России же - это первое и пока единственное клиническое испытание вакцинотерапии опухолей с помощью аутологичных генетически модифицированных клеток. За это время нам пришлось преодолеть массу трудностей. Эффективность получения клеточной линии из опухолевого материала весьма низкая, порядка 10-15%. Реально приготовление вакцины занимает 3-5 мес и требует участия квалифицированных специалистов, которых в нашей стране практически не осталось. Кроме этого, для работы необходимы высококачественные импортные клеточные реагенты, специальное оборудование, абсолютная стерильность, а это существенно влияет на стоимость исследований. Клиническое исследование, проведенное нами, оказалось возможным только благодаря поддержке, получаемой от мэра г.Москвы Ю.М.Лужкова.

Несомненно, предложенный нами подход показал свою эффективность, но его можно и нужно улучшать. Во-первых, необходимо в будущей вакцине совместить активацию врожденного компонента и приобретенного иммунитета. В настоящее время в нашей лаборатории такие исследования проводятся. Во-вторых, сделать клиническое применение вакцины более удобным и менее дорогостоящим. Для этого имеются все предпосылки, поскольку в ходе клинических исследований сформировался банк опухолевых клеточных линий, охарактеризованных по многим параметрам. В настоящее время мы подбираем наиболее эффективные с точки зрения представленности опухолевых антигенов клеточные линии для приготовления аллогенной (не персональной) генетически модифицированной вакцины. Такой стандартный препарат, готовый к использованию, сократит и время от момента операции до начала его применения.

В заключение хочется подчеркнуть два важных момента. Для лечения онкологических заболеваний нельзя найти одно универсальное лекарство - слишком многообразны трансформированные (злокачественные) клетки. Именно поэтому мы разработали целый ряд генно-терапевтических подходов по блокированию кровеснабжения опухоли.

Лишенная питания и кислорода опухолевая ткань должна погибнуть. Но даже и комбинация двух методов не станет панацеей. Необходимы дальнейшие исследования и испытания методов. При этом всегда надо помнить, что чудес не бывает.

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ МОНОГЕННЫХ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ

генный терапия опухоль наследственный

Отмечено, что основные затраты на генную терапию приходятся на США, где уже созданы десятки крупных фирм для разработки научных подходов к генной терапии, израсходованы сотни миллионов долларов на разработку новых генных конструкций и способов их доставки. Именно в США сосредоточено уже более 80% генно-инженерных проектов, принятых к клиническим испытаниям, основная часть которых касается разработок методов лечения онкологических заболеваний. Кратко рассмотрены преимущества и недостатки основных способы доставки нуклеиновых кислот в клетки. Перечислены заболевания, для которых уже реализуются проекты по генной терапии. Специальный раздел обзора посвящен состоянию исследований по клеточной и генной терапии миодистрофии Дюшенна, в т.ч. обзору последних работ на эту тему в лаборатории авторов.

Кратко суммированы результаты экспериментов на биологических моделях миодистрофии Дюшенна - мышах mdx по введению различных экспрессирующихся конструкций с кДНК гена дистрофина при помощи генного ружья, липосом, микросфер, вирусных олигопептидов и лактоферрина. Ключевые слова: генотерапия, векторные системы, клинические испытания, генные болезни, миодистрофия Дюшенна, дистрофин.

Реальным практическим следствием революционных преобразований в биологии, обусловленных стремительным прогрессом Международной программы "Геном Человека" в идентификации всех его генов, явилась молекулярная медицина, рассматривающая проблемы здоровья и болезней человека на молекулярном уровне, прежде всего, на уровне функции нуклеиновых кислот. Основные разделы молекулярной медицины, уже получившие реальное развитие, это молекулярная диагностика, привентивная (профилактическая) медицина и генная терапия. Подробно с современным состоянием первого и второго направления молекулярной медицины в мире и в нашей стране можно ознакомиться в соответствующих монографиях и обзорах [1-5]. Различные аспекты генной терапии неоднократно освещались и в отечественной научной и научно-популярной литературе [6-8]. Вместе с тем, стремительный рост исследований в области генной терапии в мире, наряду с катастрофической нехваткой подобных исследований в нашей стране делают оправданным регулярный критический обзор данного направления молекулярной медицины в отечественной научной литературе.

Цель настоящего обзора - дать представление о состоянии научных разработок и клинических испытаний по генной терапии наследственных и ненаследственных (мультифакториальных) болезней человека в 1998-1999 гг, отметить основные достижения в этой стремительно развивающейся области, суммировать мировые и собственные данные по разработке научных основ генной терапии тяжелого моногенного наследственного заболевания - миодистрофии Дюшенна.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ И ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Согласно современным представлениям генную терапию (ГТ) понимают как введение нуклеиновых кислот в клетку с целью воздействия на медицинский статус организма и/или лечения болезни [9]. Существенно, что при этом сам ген уже воспринимается как новый фармацевтический препарат для лечения не одного, а многих заболеваний, не только моногенных (мутации в одном гене), но и полигенных, мультифакториальных (мутантные гены + неблагоприятные внешние факторы), инфекционных заболеваний и любых других патологических состояний. Если к этому добавить безусловную перспективность генов и их ДНК-фрагментов в создании нового поколения вакцин против многих инфекционных болезней и даже опухолей, то потенциальные возможности ГТ представляются воистину безграничными! Уместно отметить, что к 2003 году, когда будет полностью расшифрован геном человека и станут известными последовательности всех его генов, фармакология может пополнится 60-70 тысячами новых генно-инженерных препаратов! [В июне 2000г. объявлено, что коллективы ученых США ("The Human Genome Project" и фирма "Celena Genomics") и Великобритании (UK Sanger Center) завершают работу по расшифровке первичной структуры генома человека (3,2 млрд. пар оснований), начатую международным сообществом как в государственных, так и в частных институтах (Nature, 405, 983-984 (2000). Эти результаты, составившие "черновую" карту генома человека будут опубликованы в журнале "Nature Genetics" в ноябре 2000г. (http://www.nature.com/genomics/new).Ученые Израиля заявили, что обладают компьюторной программой, которая позволит обработать полученные данные по первичной структуре и составить функциональную карту генома человека)]

Естественно, что подобную перспективу вполне оценивают многие ведущие фармацевтические фирмы, затраты которых на ГТ только в 1997г. составили около 181 млн долларов США, а в 1998г. - почти 250млн долларов [10]. При этом финансирование исследований, равно как и многие другие показатели, касающиеся состояния ГТ в мире, безусловно, смещены в сторону США. Так, согласно информации на сентябрь 1999 г. английского издательства Уайли и Ко., 310 из 396 одобренных для клинических испытаний проектов ГТ выполняются в США и 68 - в Западной Европе (Франция, Великобритания, Италия, Германия и др.). К сожалению, ни одного сколько-нибудь продвинутого и официально утвержденного генно-терапевтического проекта клинических испытаний в России или в странах СНГ не существует. Следует так же отметить, что из 396 проектов 261 (65,9%) еще находятся на фазе I клинических испытаний (оценка токсичности генной конструкции), 133 - между фазами I/II (ограниченные испытания на небольшом контингенте больных) и только 2 проекта, касающиеся лечения смертельной опухоли мозга - глиобластомы - на фазе III (широкомасштабные клинические испытания в нескольких центрах).

Естественно, что среди выполняемых проектов ГТ более 60% приходится на лечение опухолей, примерно по 15% на лечение инфекционных болезней (СПИД, гепатит В, туберкулез и др.), столько же на лечение моногенных заболеваний (муковисцидоз, болезни накопления (мукополисахаридозы), семейная гиперхолестеринемия, гемофилия В и др.). Остальные эксперименты касаются, главным образом, изучения возможностей использования генных конструкций с целью клеточного маркирования в опытах in vivo. Такие эксперименты были начаты еще в 1989г. и позволили получить важную информацию об иммунологических свойствах опухолевых клеток и их чувствительности к Т-лимфоцитам.

В этой связи уместно заметить, что в целом история ГТ как нового направления медицины может быть разделена на три этапа. Этап I - (1970-1990) характеризуется попытками лечения дефицита фермента аргиназы заражением клеток вирусом папилломы Шоупа. В это же время предпринята неудачная попытка лечения бета - таллассемии пересадкой клеток костного мозга, трансформированных ex vivo бета глобиновым геном; генетическое маркирование Т-лимфоцитов. Начало этапа II знаменуется единственной до настоящего времени успешной попыткой лечения врожденного иммунодефицита, осуществленной в США в сентябре 1990 г. В 1992 г. предприняты попытки лечения методом ex vivo семейной гиперхолестеринемии (мутация в гене рецептора липопротеинов низкой плотности) и гемофилии В, в 1993 г. - муковисцидоза и в 1995 г. - первые попытки лечения глиобластомы. Эти исследования по ГТ и попытки клинических испытаний до 1996 г. все еще оставались единичными. С 1997 г. и по настоящее время (этап III) (когда наметился качественный прорыв в технике доставки чужеродных генов и, как казалось многим, появились реальные шансы быстрого терапевтического эффекта при самых разных заболеваниях,) число проектов, одобренных в США Комитетом RAC (Recombinant Advisory Committee) увеличилось до 200 и продолжает стремительно возрастать, достигнув к концу 1999г уже 400 [11].

Вместе с тем, по справедливому замечанию одного из пионеров ГТ американского исследователя Фрэнча Андерсона " За исключением нескольких непроверенных случаев ни один из протоколов ГТ пока не оказался успешным в лечении болезней человека "[12]. Краткий анализ результатов ГТ на сегодняшний день позволяет прийти к следующим основным выводам: 1. ГТ пригодна для лечения широкого спектра заболеваний; 2. ГТ- в применяемом объеме имеет низкий риск осложнений; 3. Эффективность ГТ пока весьма разочаровывает [12].

В чем же основная причина таких неудач? Главное - до сих пор практически ни в одном проекте ГТ не удалось получить успешной трансформации (трансдукции) достаточно большого числа клеток-мишеней и добиться терапевтически значимой длительности экспрессии чужеродного гена.

ПРОБЛЕМА ВЕКТОРОВ - ОСНОВНАЯ ПРОБЛЕМА ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Проблема доставки нужного гена в нужную клетку с целью получения правильной дозы необходимого белкового продукта, обладающего терапевтическим эффектом, до настоящего времени не решена и по сути, продолжает оставаться центральной проблемой ГТ проектов. Трудность достижения этой цели по образному выражению Фрэнча Андерсона определяется тем, что "организм человека затратил много тысяч лет, чтоб защитить себя от нападения факторов вненешней среды, в т.ч. от чужеродной ДНК, пытавшейся проникнуть в его геном" [12]. Естественно, что преодолеть эти барьеры оказывается очень сложно. Не случайно технология доставки генов является главным препятствием на пути успеха ГТ. Для решения этой проблемы в настоящее время существуют самые разные методы (физические, химические, биологические), достаточно подробная характеристика которых дана в уже ранее цитированных монографиях и обзорах. [1, 6-8] Рассмотрим, однако, более подробно те из них, которые активно совершенствуются и представляются наиболее перспективными на сегодняшний день.

Хорошо известно, что наиболее популярными в проектах ГТ до настоящего времени являются векторы на основе вирусов и липидов (липосом). При этом из 396 ГТ проектов на сентябрь 1999г. в более 40% используют различные варианты ретровирусов (РВ), в 20% - модифицированные аденовирусы (АВ), в 20% липосомы (Л). В остальных 20% проектов применяют, адено-ассоциированный вирус (ААВ), вирус оспы, генное ружье (ГР) и даже "голую" ДНК. Основные преимущества и недостатки всех этих векторов уже были ранее рассмотрены [1, 6-8].

Учитывая, что основным недостатком АВ был выраженный иммунный ответ организма на введение АВ конструкций, прогресс в этой области коснулся создание АВ векторов, лишенных практически всех собственных генов АВ (gutted AdV vectors) и АВ, с резко ослабленным антигенным паттерном, провоцирующим иммунный ответ. Последние по аналогии с военным самолетом-невидимкой получили название Стелс ( Stealths AdV). Естественно, что удаление собственных генов АВ позволило резко увеличить размеры переносимых генных конструкций, однако, и создало дополнительные сложности с наработкой и очисткой таких векторов.

В связи с тем, что ретровирусы успешно инфицируют только митотически делящиеся клетки, заметно повысился интерес к другим вирусам, таким как ленти-вирусы и особенно адено-ассоциированные вирусы, которые хорошо проникают и в неделящиеся клетки .

Большое внимание в последние годы уделяется разработке комбинированных векторов с адресной доставкой, совмещающих преимущества вирусных и невирусных носителей. В частности, особенно активно изучаются комбинации АВ + полилизин + белок (асиалогликопротеин для рецепторов клеток печени, трансферрин (мышечные фибриллы), Fab-полилизин (эпителий бронхов, кишечника). Весьма перспективным представляется использование не самих вирусов, а только отдельных пептидов их оболочки, контролирующих процесс проникновения в клетку и интернализацию в ядро. Некоторые вирусные олигопептиды использованы нами в экспериментах по ГТ миодистрофии Дюшенна.

В качестве перспективных векторов на сегодняшний день рассматриваются синтетические полимеры типа полиэтиленоксид - полиэтилэтилен, а так же биологические полимеры типа декстрана, желатина, образующие при определенных условиях упаковки микросферы, называемые так же полимеросомы [13]. Размеры таких микросфер можно регулировать в зависимости от условий упаковки. Кроме того, их неограниченные возможности в отношении размеров плазмидной ДНК, растворимость в живых тканях (биодеградируемость) и выраженная способность к проникновению внутрь клеток и даже в ядра (см. ниже) привлекают к полимеросомам все больше специалистов по ГТ. Один из вариантов таких полимеросом оказался особенно перспективным для ГТ миодистрофии Дюшенна (см. ниже). Другой биологический полимер ателоколлаген с успехом применен в создании депо для экспрессирующихся генных конструкций в скелетных мышах [14].

ПЕРВЫЕ ПОПЫТКИ ГЕНОТЕРАПИИ МУЛЬТИФАКТОРИАЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Наряду с моногенными заболеваниями, где в основе терапевтического эффекта лежит доставка в клетки-мишени неповрежденной экспрессирующейся генной конструкции, все более широкое внимание привлекают ГТ подходы к лечнию мультифакториальных заболеваний, патогенетическую основу которых составляют не один, а много разных генов, повреждения которых реализуются в определенных неблагоприятных внешних условиях. Именно при таком варианте ГТ гены выступают как лекарственные препараты, обеспечивающие симптоматическое лечение.

Естественно, что в значительной мере сказанное относится к опухолям, подавляющее большинство которых относится к мультифакториальным заболеваниям. ГТ опухолей посвящена обширная литература и многочисленные исследования, ранее рассмотренные и в отечественной литературе [1, 6-8]. Отметим только, что при лечении многих опухолей мультифакториальной природы все чаще используют целый набор различных экспрессирующихся генно-инженерных конструкций, продукты которых воздействуют на разные факторы и механизмы прогрессии опухоли. Так, для лечения рака простаты широко применяют стратегию замены генов -супрессоров опухолей p53, H-ras, Rb, p21, антисмысловые олигонуклеотиды к гену Bcl2 (для блока антиапоптозных генов), традиционные гены-самоубийцы (вирусная тимидинкиназа или цитозин- дезаминаза), а так-же ген мембранного белка е-кадхерина, который обычно утрачивается при прогрессии опухоли, а так-же гены, корректирующие чувствительность опухолевых клеток к андрогенам. [По генной терапии злокачественных новообразований см. обзоры в книгах: M. Strauss, J.Barrenger, eds. (1998) Concepts in Gene Therapy, DeGruyter, Berlin и K. Xanthopoulos, ed. (1998) Gene Therapy, NATO ASI Series H: Cell Biology, 105, Springer. Хорошие перспективы в этой области имеют, по-видимому, исследования в области апоптоза трансформированных клеток и тканей с использованием пептидов, содержащих RGD-мотив, индуцирующий апоптоз.

Значительный прогресс в последнее время достигнут в лечении нейродегенеративных заболеваний таких как боковой амиотрофический склероз, болезнь Паркинсона, хорея Гентингтона и др. Смысл ГТ вмешательства, проходящего клинические испытание заключается во вживлении в определенные подкорковые отделы мозга при помощи стереотаксического аппарата полупроницаемых пластмассовых капсул содержащих культуры клеток, продуцирующих целый набор белков, препятствующих дегенерации нервных клеток таких как ген цилиарного нервно-трофического фактора (hCNTF), нейротрофические гены MNTF-BDNF, NT-3, mNT 4/5; антиоксидантные гены - SOD-2, CP-2; антиапоптозные гены - Bcl2, BclK. При необходимости в эти же экспрессирующиеся конструкции включается и ген тимидин-киназы вируса герпеса, позволяющий ликвидировать инкапсулированные клетки -продуценты с помощью ганциклавира.

Весьма обнадеживающие результаты получены на лабораторных кроликах по лечению ревматоидного артрита. Известно, что более 30 млн американцев страдают ежегодно от этого тяжелого заболевания. Известно, что решающая роль в воспалении суставов и их последующей деформации принадлежит различным цитокинам и другим воспалительным клеточным факторам. Для ГТ ревматоидного артрита предполагается использовать TGF, IGF, BMP-2. Самым перспективным, как показали эксперименты на кроликах, является ген IL-1Ra, отвечающий за синтез белка-антагониста рецептора интерлейкина IL-1 [16]. Существенный прогресс достигнут в экспериментах по профилактике тромбообразования путем введения в клетки эндотелия сосудов гена тканевого активатора плазминогена (фактора V свертывания крови), и профилактики рестеноза артерий после трансплантации (шунтирования) коронарных сосудов, введение гена МuLv, препятствующего пролиферации гладкомышечных клеток интимы сосудов.

Заключение

Сравнительно недавно предложен ряд принципиально новых вариантов ГТ. При этом основное внимание обращено не на доставку нормального гена в клетки-мишени, а на коррекцию повреждений ДНК в самих клетках. Согласно одному из них, исправление точечных мутаций достигается in vitro путем высокоэффективной генной конверсии. Известно, что при добавлении в культуру делящихся клеток фрагментов геномной ДНК с частотой 1 на 1 000 возможна гомологичная рекомбинация между нативной геномной ДНК и гомологичным ей фрагментом. Согласно новой технологии, получившей название химерапластика [15], в культуру клеток добавляют небольшие по размерам синтетические ДНК/РНК гибридные молекулы (химеропласты), состоящие из короткой (25 нуклеотидов) цепочки ДНК и комплементарной ей цепочки нуклеотидов РНК. При этом в последовательность ДНК/РНК шпилечной структуры включают нужное основание, по которому планируется замена. Обе нуклеотидные последовательности шпилечной структуры комплементарны фрагмену двухцепочечной геномной ДНК, несущей мутацию. Высокая концентрация олигонуклеотидов в ядре, и наличие бактериального RecA белка позволяет на несколько порядков повысить частоту гомологичной рекомбинации. По некоторым данным успешная конверсия (замещение нужного кодона в геномной ДНК) происходит в 25-40% клеток [15]. Примененный ex vivo метод позволяет высокоэффективно осуществлять коррекцию генных дефектов. Клетки-мишени с восстановленной структурой генома могут быть возвращены в организм больного.

Складывается впечатление, что подобный подход может быть очень перспективным. Достаточно заметить, что на основе такого подхода в США в 1998г. была организована коммерческая компания KIMERAGEN, руководителем научного отдела которой стал Мишэль Блазе, ранее возглавлявший группу по ГТ наследственного иммунодефицита, осуществившую первое успешное ГТ вмешательство на человеке в 1990 г. Предполагается, что метод химерапластики может найти применения для ГТ не менее 2 000 различных наследственных заболеваний. [Работы по технологии химеропластики основаны на исследованиях американских ученых Dr. {бип}.Kmiec и Dr. C.J.Steer (Kren B.,Cole-Strauss A., Kmiec {бип}., Steer C.J. (1997) Hepatology, 25, 1462-1468; Kren B.T., Bandyopadhyay P, Steer C.J. (1998) Nature Medicine, 4, 285-290). Dr. Michael Blase (Майкл Блайз)-один из ближайших сотрудников пионера генной терапии Френча Андерсена (Dr. W. French Andersen) во время работы по ГТ тяжелого неспецифического иммунодефицита - долгое время возглавлял Отдел клинической генной терапии Института генома человека Национальных Институтов Здоровья в Бетезе, США. В 1998г. он перешел в KIMERAGEN директором по науке, где возглавил работы по химеропластике]

Концептуально близок к химерапластике и второй ГТ подход, направленный на коррекцию последовательности самого гена. Для многих генов показано, что отсутствие целого экзона функционально менее катастрофично для функции белка, чем сайтовые мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания либо резко нарушающие конформацию белкового продукта, например, нонсенс мутации (возникновение стоп-кодона) при миодистрофии Дюшенна или delF508 в гене СFTR при муковисцидозе. Суть метода, получившего название exon-skipping (перепрыгивание, выбрасывание экзона) сводится к введению в культуру мутантных клеток in vitro коротких антисмысловых последовательностей РНК, комплементарных местам сплайсинга первичного РНК-транскрипта. Их гибридизация в ядре приводит к проскальзыванию петли сплайсинга с захватом и выбрасыванием из мРНК экзона, несущего мутацию. Такой подход был с успехом применен для выбрасывания экзона 23 с мутацией типа стоп-кодон у мышей mdx- биологических моделях миодистрофии Дюшенна Естественно, что оба метода (химерапластика и exon-skipping) могут быть применены только для коррекции генома мутантных клеток вне организма. Последние в случае успешной трансформации могут быть пересажены пациенту обратно. Данный подход получил названия ex vivo и уже нашел применение в клинических проектах по ГТ. Удельный вес проектов ГТ с применением метода ex vivo пока невелик и составляет около 10%. Основная часть проектов по ГТ использует непосредственное введение генноинженерных конструкций в ткань опухоли (25%), внутривенно (15%) и подкожно (15%). Другие способы доставки генов включают внутритрахеальный, внутримышечный, внутриназальный и др. Некоторые из этих подходов были применены в экспериментах по генной терапии миодистрофии Дюшенна .

Список литературы

http://vivovoco.nns.ru

http://humbio.ru/humbio/transgenesis/000387dd.htm

Размещено на Allbest.ru