Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний університет харчових технологій

УДК 57.086.83

Автореферат дисертації на здобуття ступеня

кандидата технічних наук

Розробка промислової технології культивування біологічних агентів для виробництва ротавірусних антигенів

03.00.20 - біотехнологія

Білоткач Катерина Михайлівна

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному університеті харчових технологій МОН України

Науковий керівник

кандидат технічних наук, доцент Салюк Анатолій Іванович, Національний університет харчових технологій МОН України, доцент кафедри біохімії та екології харчових виробництв

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Карпов Олександр Вікторович, Національний університет харчових технологій МОН України, професор кафедри біотехнології мікробного синтезу

кандидат технічних наук, Думанський Валентин Дмитрович, Державне підприємство "Центр імунобіологічних препаратів" МОЗ України, заступник директора

Провідна установа

Національний університет “Львівська політехніка”, кафедра технології імунобіологічних препаратів, фармації та біотехнології, МОН України, м. Львів

Захист відбудеться "31__" __травня__ 2006 р. о _14-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.058.03 при Національному університеті харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68, корпус А, аудиторія 311

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного університету харчових технологій за адресою: 01033, м. Київ, вул. Володимирська, 68.

Автореферат розісланий "28_" ___квітня___ 2006 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої радиВ. М. Поводзинський

культивування вакцинний ротавірус інфікуючий

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Культуральні противірусні вакцини та діагностичні тест-системи - важливі продукти сучасної біотехнології, що є головним засобом боротьби із поширенням вірусних інфекцій. Для виробництва культуральних противірусних вакцин та багатьох діагностичних тест-систем використовують вірусні антигени, отримані за технологією культивування культур клітин тварин та вірусів.

Рентабельність виробництва вірусних антигенів напряму залежить від використання сучасних та ефективних технологій культивування біологічних агентів (БА): культури клітин тварин (КК) та вірусу. Так, на сьогодні в Україні чимало необхідних вірусних антигенів не виробляється через відсутність сучасних високоефективних технологій культивування вірусів. Зокрема, і досі залишається нерозв'язаною проблема діагностики ротавірусної інфекції та імунізації дітей молодшого віку проти ротавірусного гастроентериту. Про важливість розв'язання цього питання свідчать дані ВООЗ, згідно яких, в світі на ротавірусний гастроентерит припадає одна чверть усіх смертельних випадків від гострих кишкових інфекцій, в той час як в Україні більшість випадків ротавірусної інфекції залишається не діагностованою внаслідок недоступності тест-систем на ротавірусну інфекцію. З іншого боку, у сфері агропромислового комплексу, частка вражених ротавірусом сільськогосподарських тварин сягає 30 %, отже, не менш важливою є діагностика ротавірусної інфекції серед сільськогосподарських тварин та їх імунізація проти ротавірусного гастроентериту.

Вирішенням проблеми виробництва діагностичних тест-систем на ротавірусну інфекцію та протиротавірусних імунобіологічних препаратів є розробка промислової технології культивування вакцинного штаму ротавірусу для одержання його поверхневих антигенів. На основі використання антигенів ротавірусу мавп SA-11, специфічних як для людини, так і для тварин, вже розроблено та рекомендовано до виробництва інактивовану протиротавірусну вакцину ветеринарного призначення “РІП-4”. Раніше було також продемонстровано, що для пасивної імунізації дітей проти ротавірусного гастроентериту може бути використане гіперімунне молоко, отримане від корів, імунізованих ротавірусними антигенами. Проте, на сьогодні, через використання класичної технології культивування ротавірусів на культурі клітин у матрасах собівартість виробництва антигенів ротавірусу мавп штаму SA-11 досить висока, що гальмує широке розповсюдження протиротавірусної вакцини серед сільськогосподарських господарств України та подальшу розробку тест-систем та вакцин на основі використання даних антигенів.

Отже, актуальним та необхідним напрямом розвитку вітчизняної біотехнології з виробництва діагностичних тест-систем та противірусних вакцин є розробка промислової технології культивування культур клітин тварин та вірусів, зокрема, ротавірусу мавп штаму SA-11. Впровадження промислової технології виробництва ротавірусів, дозволить підвищити рентабельність одержання ротавірусних антигенів для виробництва інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення "РІП-4".

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у рамках науково-дослідних робіт, проведених згідно угоди про науково-технічне співробітництво між кафедрою біохімії та екології харчових виробництв Національного університету харчових технологій (НУХТ) і кафедрою вірусології Київської медичної академії післядипломної освіти ім._П._Л. Шупика МОЗ України (КМАПО) та в рамках науково-дослідних робіт кафедри вірусології КМАПО “Ротавірусна інфекція: особливості етіології у дітей на сучасному етапі. Розробка експериментально-теоретичних основ створення нових профілактичних і лікувальних препаратів, визначення принципів їх практичного застосування” (державний номер реєстрації 0102U001133), у якій здобувачем особисто виконано частину досліджень “Розробка біотехнології виробництва вакцини для профілактики ротавірусного гастроентериту”.

Мета і задачі досліджень. Мета даної роботи полягала у науковому обґрунтуванні та розробці технології промислового культивування вакцинного штаму ротавірусу мавп SA-11 та поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої (ПКК СНЕВ).

Для досягнення зазначеної мети були поставлені та вирішені наступні наукові задачі:

1. обрати широкодоступний на ринку України матеріал для використання його у якості носія для культивування поверхневозалежних культур клітин (ПКК) та дослідити методи покращення біоафінності поверхонь обраних матеріалів;

2. визначити мінімальну посівну концентрацію ПКК СНЕВ та дослідити методи скорочення lag-фази у випадку інокуляції низькими посівними кількостями клітин;

3. визначити оптимальну інфікуючу дозу вакцинного штаму ротавірусу;

4. дослідити вплив та визначити оптимальні концентрації субстратів глюкози та глютаміну, на основі чого визначити оптимальні умови культивування БА;

5. запроектувати систему для культивування БА та розробити методи виготовлення насадок з обраного широкодоступного та біоафінного носія;

6. розробити промислову технологію культивування ротавірусу мавп штаму SA-11 та ПКК СНЕВ у насадковій системі, з урахуванням визначених оптимальних умов культивування БА.

Об'єкт дослідження: поверхневозалежна культура клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої, ротавірус мавп штаму SA-11.

Предмет дослідження: технології промислового культивування культур клітин тварин та вірусів. Регуляція проліферації та метаболізму культур клітин тварин in vitro.

Методи дослідження: методи із використанням культур клітин тварин in vitro та вірусологічні методи. Експериментальні, біохімічні, фізико-хімічні, статистичні методи.

Наукова новизна отриманих результатів.

Вперше:

- показано можливість культивування поверхневозалежних культур клітин (ПКК) на широкодоступних на ринку України полімерних матеріалах, зокрема, плівці поліетилену низької щільності, виготовленій за ГОСТ 10354-82, що призначена для застосування у сільському господарстві та харчовій промисловості;

- досліджено вплив глюкози на виживання клітин під час інокуляції. В результаті досліджень виявлено, що збільшення концентрації глюкози впливає на частку кількості живих, після інокуляції, клітин у 97,34% випадків, а визначена оптимальна концентрація глюкози під час інокуляції складає 2,8 г/л;

- досліджено вплив щільності моношару клітин ПКК СНЕВ під час інфікування ротавірусом на його вихідний титр. Так, вихід ротавірусу зростає при збільшенні густини до 430 000 клітин на 1 см² після чого, вихідний титр ротавірусу зменшується.

Вдосконалено:

- метод покращення біоафінності поверхонь полімерів, а саме поверхні поліетиленової плівки та виявлено, що знежирена шляхом промивання хромовою сумішшю впродовж не більше ніж 5 хвилин поверхня плівки з поліетилену низької щільності не поступається за своїми біоафіннми властивостями стандартній поверхні для культивування ПКК гідрофілізованому полістиролу. При застосуванні ж стандартної методики окиснення полімерів впродовж 30 і більше хвилин, біоафінність поверхні поліетиленової плівки різко погіршується;

- процес внесення середовища кондиціювання при культивуванні ПКК. Зокрема, доведено, що додавання середовища кондиціювання до базового середовища скорочує тривалість lag-фази ПКК СНЕВ при її інокуляції у низьких посівних концентраціях, проте оптимальна концентрація середовища кондиціювання має не перевищувати 25%, замість згадуваних раніше іншими авторами 50%, для культур клітин тварин.

Набуло подальшого розвитку:

- дослідження позитивного впливу зменшених концентрацій глюкози під час культивування КК на питому швидкість росту клітин. Так, визначено, що під час культивування вплив глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ можна описати кінетичною моделлю субстратного інгібування. У свою чергу, для забезпечення максимальної швидкості росту ПКК СНЕВ оптимальна концентрація глюкози під час культивування має становити 0,53 г/л.

Практична цінність отриманих результатів. Розроблено технологію промислового культивування вакцинного штаму ротавірусу мавп SA-11 та поверхневозалежної культури клітин свинячої нирки ембріональної версинізованої для виробництва ротавірусних антигенів.

Запропонована технологія промислового культивування зазначених БА передбачає:

1. Використання нової системи культивування БА, яка містить:

- розвинену поверхню для прикріплення та росту клітин у вигляді насадки, сформованої з хаотично переплетених та ущільнених стрічок поліетиленової плівки низької щільності;

- нову систему рециркуляції та аерації середовища культивування, розміщену всередині апарату, в основі роботи якої лежить принцип перекачування рідини водопідйомником Архімеда.

2. Використання розробленого алгоритму керування процесом культивування БА у напівбезперервному режимі з порційним внесенням субстратів. Згідно запропонованого алгоритму розраховуються об'єми концентрованих розчинів субстратів росту, які необхідно ввести, та кратність розведення середовища для підтримки концентрацій субстратів та метаболітів на оптимальному рівні.

3. Стадію виготовлення, підготовки та стерилізації насадки з плівки поліетилену низької щільності для культивування поверхневозалежних культур клітин.

Результати випробування нової технології культивування БА для виробництва антигенів ротавірусу мавп штаму SA-11 для культуральної інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення “РІП-4” у ТОВ “Інститут біотехнологій” засвідчили, що впровадження нової технології культивування БА дозволяє збільшити антигенний титр ротавірусу у 4 рази порівняно з традиційною технологією культивування зазначених БА, а також, скоротити витрати на виробництво одиниці продукції у 2 рази.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем самостійно проведено інформаційний пошук та аналіз літератури за темою дисертації. Власноруч проведені експериментальні дослідження, оброблені їх результати та виконано статистичну обробку даних. Автор також брала участь у проведенні та впровадженні розробок у дослідно-промислове виробництво інактивованої протиротавірусної вакцини ветеринарного призначення на кафедрі вірусології КМАПО.

Апробація роботи. Результати досліджень доповідались здобувачем, обговорювались та отримали позитивну оцінку на VII-ій міжнародній науково-технічній конференції “Пріоритетні напрями впровадження в харчову промисловість сучасних технологій, обладнання і нових видів продуктів оздоровчого та спеціального призначення” (Київ, 2001 р.); 68-мій науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів (Київ, 2002 р.); міжнародній науково-практичній конференції “Новые технологии получения и применения биологически-активных веществ” (Алушта, 2002 р.); Першій всеукраїнській науково-практичній конференції студентів, аспірантів та молодих учених” (Київ, 2003 р.); конференції-конкурсі робіт молодих учених “Актуальні проблеми біохімії та біотехнології” (Київ, 2003 р.); ІІІ-ій міжнародній науково-практичній конференції “Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія” (Харків, 2003); 70-тій науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів (Київ, 2004); IV-ій міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (Київ, 2004); ІІ-ій міжнародній конференції “Біотехнологія. Освіта. Наука” (Львів, 2004).

Публікації. Результати дисертаційної роботи повністю відображені у 13 наукових працях, в тому числі у 5 статтях у наукових фахових виданнях, що входять до переліку ВАК України по спеціальності “Біотехнологія” та одному деклараційному патенті на винахід “Спосіб культивування поверхнево-залежних культур клітин тварин та людини” (№_20031211040), а також, у 7 тезах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, трьох розділів, висновків, списку використаних літературних джерел із 150 найменувань (50 вітчизняних і країн СНД та 100 іноземних) та 7 додатків. Робота викладена на 160 сторінках (основний текст на 100 сторінках), ілюстрована 13 таблицями, 16 рисунками, 4 фотографіями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обґрунтовано актуальність проблеми, визначені мета, задачі, об'єкт і предмет дослідження, сформульовано наукову новизну роботи, розкрите її теоретичне та практичне значення, визначено особистий внесок здобувача, наведені дані про апробацію отриманих результатів.

В огляді літератури подано інформацію про сучасний стан виробництва продуктів біотехнології культивування культур клітин тварин та вірусів. Наведено статистику та масштабність захворюваності людей та сільськогосподарських тварин на ротавірусну інфекцію та обґрунтовано необхідність розробки сучасної продуктивної технології культивування ротавірусу. Описані світові тенденції у створенні високоефективних систем культивування ПКК та напрямки пошуку оптимальних умов культивування культур клітин тварин.

Матеріали та методи дослідження. Під час виконання роботи використано поверхневозалежні лінії клітин тварин і людини: КК свинячої нирки ембріональної версенізованої, КК тестикулів поросят (ПТП), КК фібробластів миші (L-929) та КК аденокарциноми гортані людини (HEP-2). КК отримані з Інституту вірусних інфекцій РАМН (Єкатеринбург) та із Музею клітинних культур Інституту цитології РАН (С.-Петербург).

Для одержання ротавірусних антигенів використовували мавпячий ротавірус, штам SA-11, наданий лабораторією етіології, епідеміології і профілактики ентеровірусних інфекцій Інституту поліомієліту та вірусних енцефалітів ім. М. П. Чумакова РАМН. Ротавірус зберігали і пасажували на кафедрі вірусології КМАПО у клітинній лінії СНЕВ.

Під час досліджень використовували живильні середовища: модифіковане Дульбекко, мінімальне середовище Ігла (Dulbecco's modified Eagle's Medium, ДМЕМ, D 5468, Sigma), середовище 199 (М 5017, Sigma) та збагачене мінімальне середовище Ігла (МЕМ, М3024, Sigma). Для рутинного субкультивування матричної культури ПКК СНЕВ використовували суміш середовищ ДМЕМ та 199 у співвідношенні 1:1 з додаванням 5 % сироватки ембріонів корів („Сангва”, Львів). Розчини глюкози та глютаміну готували із сухих порошкових реагентів високої чистоти, придатних для культивування КК (глюкоза G7021; глютамін G8540, Sigma), згідно з рекомендаціями виробника.

У якості носіїв органічного та неорганічного походження для дослідження можливості використання їх поверхонь для культивування ПКК, використовували: поліетиленову плівку (ГОСТ 10354-82), поліпропіленову плівку (ГОСТ 26996-86), полістиролову плівку (ГОСТ 20282-86), полівінілхлоридну трубку (ТУ 64-2-286-79), поліамідне волокно, плівковий фторопласт (ГОСТ 100007-80), нержавіючу сталь (12Х18Н10Т), радіотехнічну кераміку та склотканину.

Дослідження можливості підвищення біоафінної здатності поліетиленової плівки проводили за методикою хімічного окиснення поверхонь полімерів у хромовій суміші за умови варіювання часу окиснення: від 0 до 1800 сек. Дослідження біоафінності окиснених поверхонь поліетиленової плівки проводили, культивувуючи ПКК на стандартних поверхнях із наступним підрахунок кількості клітин, які зросли за стандартною методикою.

Визначення кількості іммобілізованих на поверхні насадки клітин проводили із використанням колориметричного методу для визначення проліферативної активності клітин шляхом їх інкубації з розчином редокс індикатора резазурина.

Дослідження впливу концентрації субстратів росту на вихід кількості клітин проводили за методом початкових швидкостей росту. Оцінку отриманих результатів проводили за допомогою регресивного та дисперсійного методів аналізу даних.

Для визначення антигенної активності ротавірусу у культуральній вірусовмісній рідині використовували специфічний еритроцитарний ротавірусний антитільний діагностикум “Ротатест” виробництва Ростовського науково-дослідного інституту мікробіології та паразитології.

Інфекційну активність ротавірусів у культуральній вірусовмісній рідині визначали мікрометодом за цитопатичною дією на ПКК СНЕВ за стандартною методикою.

Статистичну обробку отриманих в ході досліджень даних проводили загальноприйнятими методами із використанням програми “Excel”, пакету “Аналіз даних”, достовірність різниць оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Аналіз і узагальнення результатів досліджень

В роботі представлені дослідження, проведені по чотирьох напрямах: вибір матеріалу для культивування на його поверхні поверхневозалежних культур клітин (ПКК) та оптимізація способу підготовки поверхні носія; оптимізація умов культивування біологічних агентів; проектування насадкової системи культивування, а також, розробка режиму культивування та принципової схеми виробництва ротавірусних антигенів.

Розробка способу культивування поверхневозалежних культур клітин на поверхнях штучних матеріалів. Досліджуючи широкодоступні на ринку України матеріали щодо придатності їх поверхонь для культивування поверхневозалежних культур клітин, було встановлено, що прикріплення та проліферація клітин можлива лише на поверхнях плівок чи пластинок полімерів. Водночас, культивування було неможливе на поверхнях гранул чи волокон тих же полімерів, а також на поверхнях поліакриламіду, полівінілхлориду та фторопласту. З іншого боку, високі ступені біоафінності по відношенню до перещеплюваних культур клітин були виявлені у харчової нержавіючої сталі та радіотехнічної кераміки (табл. 1).

Таблиця 1 Біоафінність поверхонь полімерних та неорганічних матеріалів

При дослідженні якості моношарів клітин, які виросли на поверхнях зразків матеріалів, встановлено, що клітини не змінювали своєї морфології та не утворювали вогнищ дегенерації, отже, визначені біоафінні матеріали виявились не токсичними для обраних ліній ПКК. Зважаючи на те, що найдоступнішим та поширеним на ринку України з досліджених матеріалів є поліетиленова плівка (ПЕП) низької щільності, що виготовляється за ГОСТ 10354-82 для застосування у сільському господарстві та харчовій промисловості, цей матеріал було обрано як найбільш придатний для подальшого створення насадки для культивування ПКК.

При дослідженні окиснювального методу покращення біоафінності поверхні носія (поліетиленової плівки), а саме модифікації поверхонь полімерів шляхом їх хімічного окиснення (у хромовій суміші), було виявлено, що обробку ПЕП доцільно проводити не довше ніж 5 хвилин (300 сек), оскільки більш тривале окиснення поверхні носія негативно впливає на вихід біомаси клітин (рис. 1).

Визначення оптимальних умов культивування біологічних агентів. При дослідженні можливості інокуляції ПКК СНЕВ на поверхню ПЕП у малих посівних кількостях клітин, було виявлено, що фази латентного росту культури при посівних кількостях клітин: від 25 до 200 тис. клітин/мл, сильно розтягнуті (до 48 годин), у той час, як при вищих посівних кількостях, фаза латентного росту коротша (до 24 годин). Визначення кількості живих клітин ПКК СНЕВ на 48-72 годину після інокуляції на ПЕП показало, що при посівних кількостях клітин до 100 000 клітин на один мілілітр поживного середовища (чи до 50 000 клітин на см² ПЕП), клітини ПКК СНЕВ не здатні адаптуватися до умов культивування. У свою чергу, при інокуляції ПКК СНЕВ на ПЕП у кількості 200 000 клітин/мл хоч і спостерігається подовжена lag-фаз, проте на 96 годину культивування питома швидкість росту культури близька до питомої швидкості росту для більших кількостей клітин в інокуляті: для посівної кількості 200 000 клітин - 0,29 год^-1, а для більших кількостей від 0,17 год^-1 до 0,2 год^-1, на відміну від повної зупинки росту при менших посівних кількостях клітин. Отже, мінімальною посівною концентрацією ПКК СНЕВ для інокуляції на поверхню поліетиленової плівки було визначено 100 000 клітин на 1 см² поверхні росту (200 000 клітин на мілілітр живильного середовища).

З метою виявити фактори, що впливають на тривалість lag-фази при інокуляції ПКК СНЕВ у кількості 200 000 клітин/мл, було досліджено вплив середовища кондиціювання на проліферативну активність ПКК СНЕВ. Дослідження впливу середовища кондиціювання (СК) на активність росту ПКК СНЕВ проводили шляхом внесення на початку культивування від 12,5 до 50 % СК у основне живильне середовище(рис. 2).

За результатами підрахунку кількості клітин на першу добу культивування у середовищі без додавання СК вона зменшувалась на 10 %, у той час як у лунках із додаванням середовища кондиціювання, навпаки збільшувалась до 35%, що свідчить про позитивний вплив на проліферативну активність ПКК СНЕВ введення середовища кондиціювання.

Розрахована питома швидкість росту ПКК СНЕВ на 72 годину для проб з додаванням 50% СК була меншою, ніж для проб з меншим вмістом СК: 0,13 проти 0,33-0,37 доби^-1, відповідно. Отже, для інтенсифікації росту ПКК СНЕВ було рекомендовано при інокуляції насадки додавати 25% СК до основного середовища культивування.

Для визначення оптимальної інфікуючої дози вакцинного штаму ротавірусу було проведено дослідження впливу кількості клітин ПКК СНЕВ під час інфікування на вихідний титр ротавірусу. За результатами дослідження встановлено, що при інфікуванні клітин, що зростають на ПЕП у густині більш ніж 500 000 клітин на 1 см² поверхні, вихідний титр ротавірусу зменшується.

Окрім того, було визначено, що інфікування клітин у ранній стаціонарній фазі та пізніше негативно впливає на вихідний титр ротавірусу мавп штаму SA-11, (табл. 2).

Таблиця 2 Вплив щільності клітин ПКК СНЕВ на вихід інфекційного титру ротавірусу.

При визначенні мінімальної інфікуючої дози ротавірусу, найкращий результат було отримано при інфікуванні клітин 100 дозами вірусу або при інфікуванні 100 000 клітин 30 ТЦД₅₀.

Згідно з результатами, отриманими в ході дослідження впливу глюкози в межах (1-4) г/л та глютаміну (0,1-0,6) г/л на вихід кількості клітин, встановлено, що глюкоза на початку культивування, як і середовище кондиціювання, позитивно впливає на приріст клітин (рис. 3, а.). Розрахована з використанням регресивного методу аналізу даних

оптимальна концентрація глюкози для забезпечення максимального виживання клітин ПКК СНЕВ після інокуляції на ПЕП становила 2,8 г/л.

Проте, аналізуючи розраховані значення питомих швидкостей росту (рис.3, б.), було встановлено, що підвищення концентрації глюкози впливало лише на виживання клітин на 24 годину культивування, і, навпаки, збільшення концентрації глюкози негативно впливало на питому швидкість росту культури під час культивування.

Для визначення оптимальної концентрації глюкози було проаналізовано моделі впливу субстрату на питому швидкість росту БА та визначено, що модель субстратного інгібування, запропонована Вебом, найкраще описує вплив глюкози на питому швидкість росту ПКК СНЕВ (коефіцієнт детермінації даної моделі складав 0,98):

,

де - питома швидкість росту культури, год^-1; _max - максимальна швидкість росту, год^-1; S - концентрація субстрату, г/л; K_S константа насичення субстратом; K_І константа інгібування; b - коефіцієнт, що описує характер впливу субстрату (визначається експериментально. При b рівному одиниці рівняння Веба приймає форму рівняння Моно; концентрація субстрату (0,98), більше за нуль - субстрат впливає як активатор; менше за нуль - субстрат впливає як інгібітор).