Актуальність теми. За даними ВООЗ, близько 300 млн. людей на Землі постійно використовують протизапальні засоби, що виводить їх на друге місце у світі за використанням у практичній медицині (Л. Давтян, 2005). Дана фармакологічна група містить стероїдні, нестероїдні та інші класи сполук (М.Д. Машковский, 2000). Однак побічні дії і ускладнення, характерні для цих препаратів, значно знижують їх лікувальні властивості та обмежують можливість їх застосування (Г.В. Дзяк, А.П. Викторов, Е.И. Гришина, 1999; А.А. Шептун, 2001; И.А. Зупанец, 2005). Тривале вживання нестероїдних протизапальних засобів (НПЗЗ) призводить до розвитку специфічних побічних явищ - ускладнень з боку шлунково-кишкового тракту (до 65%), центральної нервової системи, органів кровотворення та інші (І.С. Чекман, 2001; С.В. Насонова, 2002). Це повною мірою стосується і нового покоління селективних інгібіторів циклооксигенази-2 (ЦОГ-2), більшість з яких препарати великої вартості (D. E. Grswold, J. L. Adams, 1996; H. Maia, Estudante at all. 1998; В.А. Насонова, 2002; О.П. Вікторов, О.В. Кашуба, 2005).

Внаслідок цього зростає зацікавлення дослідників до рослинних засобів, які здавна застосовувались у народній медицині. Крім того їх перевагою є - мала токсичність, можливість тривалого використання без суттєвих побічних явищ, ефективність, відносна доступність, а в деяких випадках, перевага перед синтетичними ліками (А.М. Гродзинский, 1998; Т.А. Виноградова, Б.Н. Гажев и др., 2001). У зв'язку з цим пошук та створення нових лікарських засобів рослинного походження з протизапальною дією - актуальна проблема фармакології (И.В. Михайлов, 2003). Можливість комплексного використання рослин та наявність достатньої сировинної бази пояснює інтерес до вивчення неофіціальних рослин (А.В. Горбачова, С.Г. Аксиненко, Ю.В. Нестерова, 2002; В.Н. Ковалев, 2005), в тому числі осики звичайної (тополя тремтяча) - Popula tremula. У народній медицині осику використовують для лікування запальних захворювань суглобів: при поліартриті, подагрі, а також при ревматизмі, запаленнях нирок, сечового міхура, простати; як жарознижувальний та потогінний засіб (А.М. Гродзінський, 1992; В.Н. Кортиков, А.В. Кортиков, 1997; Т.А. Виноградова, Б.Н. Гажев и др., 2001).

Кора, листя та бруньки осики містять флавоноїди, глікозиди (саліцин, саліцилпопулозид, популін), ефірну олію, органічні кислоти, оксикоричні кислоти, каротин, вітаміни, дубільні, гіркі та інші біологічно активні речовини. (В.Н. Кортиков, А.В. Кортиков, 2004; Н.В. Бородина, В.Н. Ковалев, 2004). Такий склад може обумовити широкий спектр фармакологічної активності, в тому числі і протизапальну дію. Досі в цьому відношенні осика звичайна не вивчалась. В клінічну практику препарати з осики ще не впроваджені.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано відповідно до планів НДР Національного фармацевтичного університету "Фармакологічні дослідження біологічно активних речовин та лікувальних засобів синтетичного та біологічного походження, їх застосування в медичній практиці" (№ державної реєстрації 0103U000478).

Мета та завдання дослідження. Мета роботи - експериментальне обгрунтування доцільності застосування водного екстракту з кори осики в якості протизапального засобу.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Провести скринінгові дослідження протизапальних властивостей водного екстракту з кори осики, спиртових екстрактів з листя осики та відібрати найбільш активний з них.

2. Провести поглиблене дослідження антиексудативної, анальгетичної та жарознижуючої властивостей екстракту з кори осики.

3. Визначити ефективну дозу і гостру токсичність водного екстракту з кори осики.

4. Вивчити можливу загальнотоксичну дію водного екстракту з кори осики на органи та системи тварин в умовах хронічного експерименту.

5. Встановити деякі сторони механізму протизапальної дії водного екстракту з кори осики.

Об'єкт дослідження - білі миші, мурчаки, білі щури з модельною патологією (ад'ювантний артрит, токсико-алергічний міокардит, асептичний перитоніт).

Предмет дослідження - протизапальні властивості водного екстракту з кори осики.

Методи дослідження. Використовувався комплексний методичний підхід із залученням фармакологічних, токсикологічних, біохімічних, морфологічних, статистичних методів дослідження.

Наукова новизна одержаних результатів. У роботі вперше експериментально доведена наявність антиексудативної, анальгезуючої, жарознижуючої дії водного екстракту з кори осики. Встановлено, що за специфічною активністю водний екстракт з кори осики не поступається препарату порівняння - вольтарену. Механізм протизапальної дії водного екстракту з кори осики, ймовірно, обумовлений антиоксидантною, мембраностабілізуючою, капілярозміцнюючою активностями.

Практична значимість одержаних результатів. Проведені дослідження експериментально обґрунтовують доцільність використання водного екстракту з кори осики для лікування запальних процесів.

Матеріали наукових досліджень впроваджені в навчальний процес кафедр фармакології, фармакогнозії, хімії природних сполук НФаУ та кафедри фармакології Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено патентно-інформаційний пошук, у тому числі з використанням пошукових серверів Yandex, Rambler, а також медичної бази даних Medline мережі Інтернет. Сумісно з керівником визначена мета та поставлені завдання. Самостійно обрані методичні підходи досліджень, розроблені основні положення та висновки; виконано експериментальну частину роботи і зроблений огляд літератури, проведені статистична обробка отриманих даних, узагальнення та аналіз експериментальних даних, оформлені таблиці та рисунки.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались на науковій конференції молодих вчених НФАУ (Харків, 2002), науково-практичній конференції "Фармація XXI століття" (Харків, 2002), IX Російському Національному Конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 2002), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (Харків, 2003), ІV Міжнародній науково - практичній конференції "Наука та освіта 2004" (Дніпропетровськ, 2004), Всеукраїнській науково - практичній конференції з міжнародною участю "Лекарства-человеку" (Харьков, 2004), на міжвузівській науковій конференції молодих вчених та студентів "Наукові основи створення лікарських засобів" (Харків, 2005).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 наукових робіт, з них - 5 статей (3 у наукових фахових виданнях), 7 тез доповідей, 1 патент України.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 139 сторінках друкованого тексту та складається із вступу, огляду літератури, розділу "Матеріали та методи дослідження", 4-х розділів експериментальних досліджень, заключення, висновків, списку літератури, який містить 226 джерел, з них 157 вітчизняних і 69 закордонних. Робота ілюстрована 10 рисунками та 40 таблицями.

Основний зміст дисертації

Матеріали та методи дослідження. Експериментальні досліди виконані на 420 білих нелінійних статевозрілих мишах масою 18-25 г, 460 білих нелінійних статевозрілих щурах масою 180-220 г, 30 мурчаках масою 350-550 г, 10 кролях породи шиншила масою 2,4-2,7 кг. Тварини вирощені у розпліднику віварію ЦНДЛ НФаУ. Робота з тваринами проводилась згідно з міжнародними вимогами про гуманне ставлення до тварин та з дотриманням вимог директиви 86/609/ЕЕС з питань захисту тварин, а також "Методическими рекомендациями по выведению лабораторных животных из эксперимента" (Киев, 1986).

Матеріал дослідження - сухі екстракти (субстанції) з листя та кори осики, які отримані на кафедрі фармакогнозії НФаУ під керівництвом професора В.М. Ковальова. Водний екстракт з кори осики отриманий шляхом екстракції гарячою водою з подальшим упарюванням та усушкою. Використання як екстрагента гарячої води при отриманні фенольного комплексу з кори осики забезпечує найбільш повну екстракцію фенольного комплексу в порівнянні з таким екстрагентом, як спирт. Фенольний комплекс - водний екстракт з кори осики - порошок світло-коричньового кольору зі специфічним запахом, гірко-кислий на смак, добре розчинний у воді. Отримані екстракти містять флавоноїди, фенольні глікозиди, ефірні масла, пектин, популін, саліцин, дубильні та інші речовини.

Первинну фармакологічну оцінку антиексудативної дії екстрактів з кори та листя осики проводили на моделях гістамінового, карагенінового, формалінового набряків лап у мишей та щурів (Л.В. Яковлева, И.А. Зупанец, 1987). Екстракти з кори і листя осики розчиняли у дистильованій воді та вводили тваринам внутрішньошлунково за 1 годину до початку експерименту у широкому діапазоні емпіричних доз 15, 20, 25, 50 мг/кг маси тварин. Препаратом порівняння було обрано вольтарен (диклофенак натрію) як стандартний нестероїдний протизапальний засіб у його ефективній дозі 8 мг/кг (О.В. Стефанов, 2001).

Протизапальну дію водного екстракту з кори осики вивчали на моделі експериментальної УФ-еритеми і оцінювали в балах (Ф.П. Тринус, Н.А. Мохорт, 1974).

Анальгезуючу дію водного екстракту з кори осики вивчали на моделі оцтовокислих корчів при внутрішньоочеревинному введенні 0,75% розчину оцтової кислоти та на моделі електричного подразнення кінцівок щурів (С.М. Дроговоз, І.А. Зупанець та ін., 2001).

Жарознижувальну активність вивчали на моделі "молочної" лихоманки у щурів (Ф.П. Тринус и соавт., 1974).

Діуретичну активність вивчали за методом Е.Б. Берхина (1997).

Гостру токсичність досліджуваних речовин вивчали на мишах і щурах при пероральному та внутрішньоочеревинному введенні за експрес-методом Т.В. Пастушенко (1985). Клас токсичності визначали за загальноприйнятою класифікацією (К.К. Сидоров, 1973), ефективну дозу розраховували за методом Б.М. Штабського (1984). Можливу загальнотоксичну дію водного екстракту з кори осики на органи і системи вивчали згідно з Методичними рекомендаціями ДФК МОЗ України (2001). Вивчали вплив екстракту на:

загальний стан тварин, який оцінювали за динамікою маси і температури тіла тварин;

функціональний стан центральної нервової системи - за методом "відкритого поля" (Е.Н. Буркацкая, В.Ф. Бейер и др., 1980; Т.А. Гуськова, 2003);

функціональний стан серцево-судинної системи - за показниками електрокардіограми (ЕКГ) (И.А. Западнюк, В.И. Западнюк и др., 1983; Т.А. Гуськова, 2003);

склад периферійної крові, який визначали за кількістю еритроцитів, лейкоцитів, гемоглобіну, швидкістю зсідання еритроцитів (ШЗЕ) та лейкоцитарною формулою (В.В. Меньшиков, 1987);

функціональний стан печінки - за кількістю загального білка, фракційним складом білків, ферментів АлАТ, АсАТ (В.В. Меньшиков, 1987), та антитоксичну функції - за методом М.С. Гижлярана (1976);

функціональний стан нирок - за якісним визначенням білка в сечі, визначенням рН, питомої ваги, яку вимірювали урометром; кількості азоту сечовини сироватки крові, яку визначали уніфікованим діацетиламоновокислим методом (В.Г. Колб, В.С. Камышников, 1982; В.В. Меньшиков, 1987).

Ульцерогенну дію водного екстракту з кори осики на слизові оболонки шлунково-кишкового тракту (ШКТ) вивчали візуально при макроскопічному обстеженні та гістологічних дослідженнях. Після закінчення досліджень тварин виводили з експерименту, тканини органів фіксували у 10% нейтральному розчині формалину, робили зрізи, які фарбували гематоксилин-еозином Ерлиха та вибірково за Ван-Гізом (О.В. Волкова, Ю.К. Елецкий, 1982).

Поглиблене вивчення протизапальної активності водного екстракту з кори осики проводили на модельній патології, максимально наближеної до людської: ізадринового міокардиту у щурів (В.К. Кухта, Э.И. Олецкий и др., 1980; К.М. Резников и др., 1985), ад'ювантного артриту у щурів (Т.Н. Коньева, 1980), асептичного перитоніту у щурів (И.А. Ерохин и др., 1989).

Для встановлення можливих механізмів дії водного екстракту з кори осики вивчали вплив субстанції на проникність судин передньоочеревинної стінки щурів (П.П. Голиков, 1964; H. F. Dudley, 1984) і тканинних бар'єрів у місці запалення (Л.Н. Сернов, В.В. Гацура, 2000).

Антиоксидантну дію водного екстракту з кори осики оцінювали в дозі, яка інгібувала перекисну хемілюмінесценцію (ХЛ) сироватки щурів в експериментах іn vitro в системі сироватка - пероксид водню - люмінол (А.И. Кузьменко, 1999; М.А. Рыжикова и соавт., 1999). Другий етап - вивчення впливу водного екстракту з кори осики на стан прооксидантно-антиоксидантного гомеостазу організму тварин в умовах експериментального гепатиту, викликаного тетрахлорметаном (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1977). Цей показник оцінювали за вмістом продуктів перекісного окислення ліпідів (ПОЛ) та активністю і рівнем основних компонентів антиоксидантного (АО) захисту організму. Досліджували концентрацію дієнових кон'югатів (ДК) (И.Д. Стальная, 1977) та кінцевих продуктів ПОЛ, які реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-реактанти) (И.Д. Стальная, Г.Г. Гаршвили, 1977).

Статистичну обробку результатів досліджень проводили з використанням методів варіаційної статистики за допомогою t - критерію Ст'юдента (Г.Ф. Лакін, 1990, С.М. Лапач и соавт., 2001).

Результати досліджень та їх обговорення

Першим етапом роботи була скринінгова серія дослідів антиексудативної активності екстрактів з кори та листя осики при субплантарному введенні флогогенів (0,1% розчин гістаміну, 1% розчин карагеніну, 2% розчин формаліну) на різних моделях асептичного запалення у мишей і щурів. Модель гістамінового набряку характеризується поверхневими змінами мембран клітин, периферичного кровообігу. На цій моделі найбільш виражену протизапальну дію проявляє водний екстракт з кори осики у дозі 25 мг/кг, який на 24,3% інгібує набряк у порівнянні з контролем (Р<0,05) (рис. 1). За даними літератури відомо, що антиексудативна активність речовини на моделі карагенінового набряку (Б.М. Клебанов, 1992) свідчить про її вплив на кінінову систему, гістамін та простагландини. Враховуючи, що водний екстракт з кори осики і препарат порівняння - вольтарен виявили на цій моделі достатньо високу активність (водний екстракт з кори осики вірогідно (Р<0,05) інгібував набряк у мишей в дозах 15, 20, 25, 50 мг/кг на 43,4%, 45,0%, 49,4%, 46,3%, відповідно (рис. 2), а у щурів в цих самих дозах на 25,3%, 44,7%, 52,9%, 39,5% (рис. 3), а вольтарен інгібувал набряк на 52,6% у мишей і на 56,7% у щурів (Р<0,05). Найбільшу активність водний екстракт з кори осики у дозі 25 мг/кг виявив на моделі формалінового набряку: екстракт інгібував набряк на 54,6%, а вольтарен на 54,5% (Р<0,05) у порівнянні з контролем (рис. 4). Згідно даних літератури формалін викликає деструкцію мембранних білків (О.В. Стефанов, 2001). Можливо припустити, що висока антиексудативна активність водного екстракту з кори осики пов'язана з інгібуванням процесів перекісного окислення ліпідів, зі збереженням структурної цілосності мембрани, що приводить до зменшення судинної проникності. Результати скринінгових досліджень, проведених на 3-х моделях асептичного запалення свідчать, що найбільш виражену протизапальну активність у порівнянні з контролем виявив водний екстракт з кори осики, тому його було обрано для поглибленого дослідження.

Антиексудативну дію водного екстракту з кори осики вивчали на моделі експериментальної УФ-еритеми. Патогенетична основа ультрафіолетового опромінення - є гостре запалення, в основі якого лежить інтенсифікація ПОЛ мембран і зміна їх морфологічної структури. Як показали експерименти, досліджуваний екстракт з кори осики та вольтарен вірогідно (Р<0,05) у 1,8 і 2 рази відповідно знижують інтенсивність гіперемії УФ-запалення (46,7% і 50,6% відповідно). Це свідчить про наявність у них антиекссудативних якостей.

Рис. 1. Антиексудативна активність екстрактів з осики на моделі гістамінового набряку лапи у мишей. * - Р<0,05 щодо контрольної патології.

запальна активність екстракт кора осика

Рис. 2. Антиексудативна активність екстрактів з осики на моделі карагенінового набряку лапи мишей. * - Р<0,05 щодо контрольної патології.

Рис. 3. Антиексудативна активність екстрактів з осики на моделі карагенінового набряку лапи щурів. * - Р<0,05 щодо контрольної патології.

Рис. 4 Антиексудативна активність екстрактів з осики на моделі формалінового набряку лапи мишей. * - Р<0,05 щодо контрольної патології.

За даними літератури (Л. Давтян, 2005) більшість НПЗЗ, окрім протизапальної, мають також жарознижуючу та анальгезуючу дії, ми вивчили ці властивості у водного екстракту з кори осики. Оцінку жарознижувальної активності екстракту, що вивчався проводили згідно з методикою (Ф.П. Тринус и соавт., 1988). Встановлено, що жарознижуюча дія водного екстракту з кори осики дорівнює такій у вольтарену - 53,1% і 56,3% відповідно, а за знезболювальним ефектом (на моделі оцтовокислих корчів) екстракт з кори осики перевищує дію препарату порівняння - анальгіну у 1,5 рази - 62,7% і 39,7% відповідно, що можна пояснити впливом цього екстракту на периферичні механізми формування болю, зв'язані з пригнічуванням ендогенних медіаторів болю в осередку запалення і зменшенням ексудативного компоненту (А.Я. Сигидин, и др. 1988; Ф.П. Тринус и соавт., 1988). На моделі електричного подразнення кінцівок щурів екстракт проявляє анальгезуючу дію і знижує поріг больової чутливості на 47,2% в порівнянні з контролем (Р<0,05).

За даними літератури, флавоноїди різних груп (зокрема оксикоричні кислоти) обумовлюють діуретичну активність багатьох рослин, та лікарських препаратів на їх основі (В.А. Барабой, 1976). Тому нами були проведені дослідження діуретичної активності водного екстракту з кори осики. Було встановлено, що діуретична активність екстракту у дозі 25 мг/кг дорівнює активності препарату порівняння гіпотіазиду (129% та 133%, відповідно). На відміну від синтетичних салуретиків рослинні не мають ускладнень при застосуванні, не змінюють кислотно-лужний баланс, не призводять до дефіциту калію (Т.А. Виноградова, Б.Н. Гажев, 2001). Для подальших досліджень нами було проведено визначення ефективної дози екстракту. На моделі формалінового набряку ЕД₅₀ водного екстракту з кори осики становить 25 мг/кг.

Середню летальну дозу (ЛД₅₀) при внутрішньошлунковому та внутрішньоочеревинному введені мишам та щурам виявити не вдалося. При введенні у шлунок максимально припустимої дози (100-5000 мг/кг) тварини почувалися добре протягом всього строку (14 днів) спостереження. За класифікацією К.К. Сидорова (1979), водний екстракт з кори осики відноситься до практично нетоксичних речовин ЛД₅₀ 5000 мг/кг.

Наступним етапом нашої роботи було вивчення можливої токсичної дії водного екстракту з кори осики на органи і системи експериментальних тварин при тривалому (упродовж 3 місяців) використанні. Екстракт вводили перорально одноразово щурам, у дозі 1ЕД_50, 2,5ЕД_50, 10ЕД₅₀. Кролям - у дозі 10ЕД₅₀. Крім того, була контрольна група тварин, яким вводили дистильовану воду (О.В. Стефанов, 2001).

Про вплив водного екстракту з кори осики на органи та системи за умов тривалого застосування робили висновок, виходячи з: динаміки маси та температури тіла, функціонального стану центральної нервової системи, нирок, печінки, зі стану вуглеводного обміну, активності ферментів сироватки крові, клінічного та біохімічного аналізів крові та сечі, показників ЕКГ, та за результатами гістоморфологічних досліджень.

Усі показники вивчали в динаміці та аналізували з даними контрольних груп і початковими показниками експериментальних груп.

Протягом всього періоду досліджень зовнішній вигляд, поведінка тварин контрольних і дослідних груп залишалася без змін. Тварини не виявляли занепокоєння, оборонні та орієнтувальні рефлекси були чітко виявлені. Як відомо, динаміка маси і температури тіла є об'єктивними інтегральними показниками токсичної дії лікарської речовини. Нормальне збільшення маси тварин контрольних та дослідних груп - свідоцтво відсутності негативної дії на організм тварин. По закінченню дослідного періоду маса щурів збільшилась у середньому на 72% в експериментальній групі і на 67% в контрольній, маса кролів збільшилась в середньому на 30% в обох групах.

У результаті досліджень клінічного аналізу крові встановлено, що у тварин впродовж усього періоду була відсутня достовірна різниця у кількості лейкоцитів, еритроцитів, гемоглобіну, показниках лейкоцитарної формули, у швидкості зсідання еритроцитів дослідних і контрольних груп. Всі показники периферійної крові не виходили за межі фізіологічної норми. Отримані дані дозволяють зробити висновок, що водний екстракт з кори осики не впливає на клінічні показники крові експериментальних тварин.

Дослідження стану серцево-судинної системи, свідчать, що тривале введення тваринам водного екстракту з кори осики не змінює показників роботи серця. Аналіз електрокардіограми підтвердив відсутність негативного впливу комплексу БАР водного екстракту з кори осики на серцево-судинну систему. Таким чином, встановлено, що екстракт кори осики не впливає на судинний тонус, діяльність серця.

Відсутність певної різниці у тварин контрольних та дослідних груп у кількості залишкового азоту сироватки крові, рН сечі і мікроскопії сечових осадів свідчить про нормальний функціональний стан нирок і відсутність негативного впливу екстракту на функції нирок.

Вивчення параметрів рухової активності (кількість перебіжок, стійок, дефікацій, уринацій) у дослідних і контрольних групах протягом усього періоду спостережень показало відсутність суттєвих змін (Р>0,05), з чого свідчить, що водний екстракт із кори осики не впливає на функціональний стан ЦНС.

При вивченні функціонального стану печінки визначали зміст загального білка у сироватці крові, його фракційний склад, кількість холестерину та глюкози. Проведені дослідження свідчать про відсутність достовірної різниці (Р>0,05) цих показників у експериментальних та контрольній групах. Це свідчить про відсутність негативного впливу досліджень екстракту на функції печінки при тривалому застосуванні. Активність АлАТ у середньому склала 1,24±0,02 мкмоль/млгод у групі контрольних тварин і 1, 19±0,08 мкмоль/млгод у дослідних тварин; АсАТ-відповідно 0,61±0,11 мкмоль/млгод і 0,62±0,09 мкмоль/млгод (Р>0,05). Тривалість гексеналового сну в контрольній групі склала у середньому 30,0±0,76 хв, у дослідних - 19,2±0,9 хв (Р<0,05). Таким чином, водний екстракт з кори осики прискорює метаболічні процеси в печінці, що проявляється у скороченні в 1,6 рази гексеналового сну і не впливає на активність ферментів.

Відомо, що більшість протизапальних препаратів стероїдної й нестероїдної структури виявляє пошкоджувальну дію на слизові оболонки шлунка та кишечника (А.А. Шептун, 2001; И.А. Зупанец, 2005). Дослідження, що проведені з екстрактом, свідчать про відсутність подразнювального впливу кори з осики на слизову оболонку шлунково-кишкового тракту, що є його несумнівною перевагою перед іншими протизапальними засобами. Отримані нами результати узгоджуються з даними літератури, і обґрунтовані багаторічним досвідом застосування рослин у народній медицині (E. P. Zueva, 1999; А.Л. Буданцев, 2001).

Відсутність негативного впливу досліджуваного екстракту з кори осики на органи та системи підтверджено результатами гістоморфологічних досліджень.

Одним з важливих механізмів розвитку запалення є зростання судинної проникності, тому нами проведені експерименти по вивченню впливу водного екстракту з кори осики на проникність судинної стінки. Капілярозміцнюючу дію екстракту оцінювали за його здатністю затримувати забарвлення папул при підшкірному введенні різноманітних флогогенних речовин (формалін, гістамін, карагенін, білок, каолін) (П.П. Голиков, 1964). Встановлено, що попереднє введення водного екстракту з кори осики у 3,2 рази уповільнює забарвлення формалінової папулы у тварин експериментальної групи в порівнянні з контролем (4,4+0,1 хв і 14,4+0,4 хв, відповідно); у 3 рази каолінової, у 2,7 рази карагенінової і у 2,3 рази гістамінової. Аналіз отриманих результатів дозволяє зробити висновок, що біологічно активні речовини, яки містяться у корі осики здатні зменшувати проникність судинної стінки. Згідно з даними літератури (А.Я. Сигидин, Г.Я. Шварц та ін., 1988), вольтарен в аналогічних умовах проведення експерименту найбільш активно пригнічує дію карагеніну і формаліну, у меншій мірі - каоліну та гістаміну. Результати наших досліджень узгоджуються з даними літератури, а екстраполяція результатів дозволяє висловити думку про аналогічну дію водного екстракту з кори осики. Вивчено вплив екстракту з кори осики на проникність тканинних бар'єрів у осередку запалення. Встановлено, що екстракт знижує важкість судомної реакції, що викликана введенням коразолу, змінює час її появи та не викликає загибелі тварин. Судомну реакцію оцінювали від 1 до 6 балів. Капілярозміцнювальний ефект екстракту з кори осики можна пояснити наявністю в його складі фенольних сполук, флавоноїдів та інших речовин, які спроможні ущільнювати судинно-тканьові бар'єри (В.А. Барабой, 1976, І.С. Чекман, 2000).

Відомо, що структура мембран клітин багато в чому визначається мірою перекисного окислення ліпідів, швидкість якої залежить від наявності антиоксидантів, що перешкоджають дифузії кисню та ініціюванню ПОЛ, що збільшує стабільність мембран клітин (Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков, 1980; Е.Н. Панасюк, Л.Н. Скакун, 1985). Антиоксиданти широко представлені у рослинах і зумовлюють протизапальний ефект (А.А. Кричевская и соавт., 1980; В.В. Николаевская і соавт., 1987; В.А. Дубинская и соавт., 1997; О.О. Герасимова, 2003). Беручи до уваги вищенаведене, ми припустили, що комплекс БАР із кори осики може виявляти антиоксидантні властивості, впливати на процеси ПОЛ та сприяти стабілізації мембран клітин.

Антиоксидантну активність водного екстракту з кори осики вивчали в експериментах in vitro за допомогою хемілюмінесценції (ХЛ) в системі сироватка - пероксид водню - люмінол (А.И. Кузьменко, 1999). ХЛ, яка супроводжує вільнорадикальне окислення ліпідів сироватки в присутності пероксиду водню і люмінолу, реєстрували на хемілюмінометрі ХЛМ-01. Водний екстракт з кори осики і препарат порівняння - флакумін пригнічували світіння сироватки крові щурів, індукованої Н₂О₂, тобто виявляли антиоксидантну дію у широких діапазонах концентрацій. Підвищення концентрацій супроводжувалося посиленням їх антиоксидантної активності та пригніченням спалахів ХЛ у модельній системі. Оскільки водний екстракт з кори осики пригнічував перекисну ХЛ, можна припустити, що речовини-антиоксиданти, які входять до екстракту, можуть зв'язувати як один, так і більше вільних радикалів (І. Rochman, 1996).

Другим етапом стало вивчення впливу водного екстракту з кори осики на інтенсивність процесів ПОЛ у тварин з експериментальним гепатитом, що викликаний тетрахлорметаном (И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили, 1997). Досліджувану речовину вводили протягом 14 діб в дозі 25 мг/кг до моделювання патології. Тварини були поділені на групи: перша - інтактна; друга - контрольна патологія; третя - тварини, яким вводили досліджуваний екстракт у дозі 25 мг/кг на фоні ушкодження печінки тетрахлорметаном за годину до ін'єкції гепатотоксину; четверта - тварини, які отримували препарат порівняння - сілібор у дозі 25 мг/кг. Ушкодження гепатоцитів викликали внутрішньоочеревинним введенням тваринам гепатотоксину. На 15 добу тварин виводили з експерименту. Запальний процес супроводжується біохімічними змінами у крові, тому ми вивчали вплив водного екстракту з кори осики на систему ПОЛ-АОС у крові і печінці тварин. Спостерігали вірогідне стосовно інтактного контролю збільшення концентрації тіобарбітурової кислоти реактантів (ТБК-реактанти) в 2,2 рази, дієнових кон'югатів (ДК) в 2,1 рази і зменшення рівня відновленого глутатіону (ВГ) в 2,9 рази у гомогенаті печінки, в сироватці крові ТБК збільшився у 2,6 рази, рівень ВГ зменшився у 2,8 рази. При лікуванні водним екстрактом з кори осики спостерігали, що він достовірно інгібує процеси ПОЛ: знижує ТБК в 2,4 рази у сироватці крові, в 2,8 рази у гомогенаті печінки, в 2,8 рази знижує ДК в гомогенаті печінки, а також збільшує концентрацію ВГ в гомогенаті печінки та крові тварин - в 2,7 і 2,6 рази відповідно. Таким чином, механізм протизапальної дії водного екстракту з кори осики може бути пов'язаний з антиоксидантними, а також капілярозміцнюючими, мембраностабілізуючими властивостями.

Наявність протизапальної, жарознижуючої, анальгезуючої активності свідчить про доцільність застосування водного екстракту з кори осики в експериментах при запальної патології. Тому нами вивчена протизапальна ефективність екстракту на класичних моделях: ізадриновий міокардит, ад'ювантний поліартрит та асептичній перитоніт у щурів. Ці моделі є максимально наближеними до патології людини.

Ад'ювантний поліартрит викликали субплантарним введенням ад'юванта Фрейнда в дистальну третину хвоста з розрахунку 0,1 мл на щура (Ф.П. Тринус и соавт., 1987). Спостереження за тваринами проводили протягом 14 діб. Препарат порівняння - вольтарен і водний екстракт з кори осики вводили внутрішньошлунково 1 раз на добу в ефективних дозах - 8 мг/кг і 25 мг/кг, відповідно. Вплив досліджуваних речовин на розвиток і перебіг ад'ювантного поліартриту оцінювали за здатністю зменшувати біль і набряк кінцівок. Враховували загальний стан тварин та гематологічні показники. Результати досліджень показали, що у всіх тварин експериментальних груп зростали місцеві і загальні ознаки запалення. Проявою місцевого запалення були зміни з боку периферійної крові: збільшувалась кількість лейкоцитів на максимумі запалення в 1,6 рази в порівнянні з інтактними тваринами (рис. 5). Вірогідно (Р<0,05) збільшувалась ШЗЕ. На третю добу запалення ШЗЕ зростала в 6 разів в порівнянні з інтактними тваринами (рис. 6).

Рис. 5. Вміст лейкоцитів у щурів при експерементальному ад'ювантному поліартриті нелікованих (1), при лікуванні водним екстрактом з кори осики (2), та вольтареном (3). * - Р<0,05 у порівнянні з вихідними даними; ** - Р<0,05 у порівнянні з піком запалення; *** - Р<0,05 у порівнянні з нелікованими тваринами.

Унаслідок лікування водним екстрактом з кори осики і вольтареном значно зменшився набряк кінцівок, лейкоцитоз був менш наявним. Згідно гістологічним дослідженням покращувалася морфологічна структура суглобів. Кінцевого одужання експериментальних тварин на час спостереження не відзначалося, але, не зважаючи на те, що запальний процес не купірувався екстрактом повністю, встановлено, що в перші тижні захворювання екстракт доцільно рекомендувати для лікування.

Рис. 6. ШЗЕ у щурів при експериментальному ад'ювантному поліартриті нелікованих (1), при лікуванні водним екстрактом з кори осики (2), та вольтареном (3). * - Р<0,05 у порівнянні з вихідними даними; ** - Р<0,05 у порівнянні з піком запалення; *** - Р<0,05 у порівнянні з нелікованими тваринами.

Альтеративне ураження міокарда викликали у щурів уведенням фуразолідону в дозі 200 мг/кг внутрішньоочеревинно та ізадрину 40 мг/кг внутрішьом'язово (А.А. Семенова, 1985; О.В. Стефанов, 2001). Водний екстракт з кори осики і препарат порівняння - вольтарен вводили протягом 4-х діб, ефективність оцінювали за показниками ЕКГ, активністю маркерних ферментів пошкодження кардіоміоцитів аспартатамінотрансферази (АсАТ), за результатами патоморфологічного дослідження, ваговим коефіцієнтом серця.

Ступінь пошкодження кардіоміоцитів відображають продукти ПОЛ - малоновий альдегід, дієнові кон'югати у сироватці крові та гомогенаті міокарда (таблиця 1).

Таблиця 1

Вплив водного екстракту з кори осики і вольтарена на показники цитоліза і ПОЛ при ізадриновому міокардиті у щурів (Mm, n=24)

Примітки:

1. * - Р ? 0,05 щодо інтактних тварин;

2. ** - Р ? 0,05 щодо контролю;

3. # - Р ? 0,05 щодо вольтарену.

При введенні ізадрину спостерігали у сироватці крові: збільшення АсАТ у 1,4 та КФК у 1,7 разів, СОД знизилась у 1,7 рази, вміст ВГ - у 2,1 рази, також відмічалося зростання рівню ТБК - реактантів у 3,6, а ДК у 2,9 рази в порівнянні з інтактними тваринами. У гомогенаті міокарду спостерігали збільшення ТБК - реактантів у 4,3 рази, ДК у 4,4 рази, рівень ВГ (відновлений глутатіон) знизився у 1,6 рази, СОД - у 2,2 рази, рівень каталази зріс у 2,4 рази в порівнянні з інтактними тваринами. Опис цих змін свідчить про важкість пошкодження субклітинних структур міокарду. З боку дослідження ЕКГ: порушення проводимості та збудженості серця, розвиток ішемії міокарду та тахікардії.

Порівняльний аналіз ефективності екстракту з кори осики та вольтарену показав, що їх значення ідентичні у порівнянні з нелікованими тваринами. Це підтверджується показниками сироватки крові: зміншення рівня АсАТ у 1,2 і 1,3 рази; КФК у 1,7 і 1,4 рази; ДК у 1,1 і 1,2 рази та каталази у 1,1 і 1,2 рази, а також збільшення СОД у 1,2 і 1,5 рази та ВГ у 1,2 і 3,2 рази відповідно. У гомогенаті міокарду: зменшення рівня ТБК-реактантів у 1,2 і 1,3 рази, ДК у 1,2 і 1,5 рази; збільшення рівня СОД у 1,3 і 1,5 рази та ВГ у 1,1 рази відповідно. З боку ЕКГ спостерігалося покращення показників; вірогідно (Р0,05) нормалізувалася ЧСС (частота серцевих скорочень), зменшився ВКС (ваговий коефіцієнт серця). Поліпшився стан фосфоліпідного спектру мікросомальної фракції мембран кардіоміоцитів, вірогідно (Р0,05) знизився рівень лізофосфатиділхоліну у 1,3 рази.

Одже, на підставі експериментальних даних слід відмітити, що застосування водного екстракту з кори осики є перспективним засобом для лікування різних пошкоджень міокарду у перші тижні захворювання.

Експериментальні дослідження протизапальної активності водного екстракту з кори осики на моделі асептичного перитоніту проводили на щурах масою 180-200 г. Тваринам вводили перорально водний екстракт з кори осики у дозі 25 мг/кг за 30 хв до внутрішньо очеревинного введення 1 мл розчину Люголя як агента запалення. Оцінкою розвитку запалення була кількість черевної рідини та відсоток дегранульованих тучних клітин (таблиця 2).

Таблиця 2

Вплив водного екстракту з кори осики на кількість черевної рідини і дегрануляцію тучних клітин у брижі щурів при перитоніті (Мm, n=18)

Примітка: * - Р0,05 щодо контролю.

Так, введення водного екстракту з кори осики вірогідно (Р<0,05) зменшило кількість рідини у 2,7 рази та відсоток дегранульованих клітин у 3,1 рази в порівнянні із нелікованими тваринами. Ця дія обумовлена зниженням проникності судин та стабілізацією клітинних мембран, які попереджують вихід із тучних клітин біологічно активних речовин - медіаторів запалення.

Таким чином, проведені дослідження свідчать, що водній екстракт з кори осики виявляє значні протизапальні, жарознижуючі та анальгетичні властивості на різних моделях патології, співставимі з такими вольтарену. Екстракт при пероральному введенні білим щурам, кролям не справляє негативного впливу на функціональний стан життєво важливих органів та систем, відноситься до практично нетоксичних речовин. Наші дослідження експериментально обґрунтовують доцільність використання водного екстракту з кори осики при станах, які супроводжуються запальними процесами.

Висновки

1. Волковой В.А., Деркач Н.В. Вивчення механізму дії протизапального водного екстракту кори осики // Одеський медичний журнал. - 2003. №6. - С.15-16. (проведено огляд літератури, виконані експериментальні дослідження, підготовлено до друку).

2. Деркач Н.В., Волковой В.А., Щербак О.А. Противовоспалительное действие водного экстракта коры осины на модели токсико-аллергического миокардита // Буковинський медичний вісник. - 2003. №4. - С.146-149 (проведено огляд літератури, виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка даних, підготовлено до друку).

3. Деркач Н.В., Волковой В.А., Решетняк Н.В. Воздействие водного экстракта коры осины на экспериментальный перитонит // Буковинський медичний вісник. - 2004. №3. - С.158-159 (проведено огляд літератури, виконані експериментальні дослідження на, проведена статистична обробка даних, підготовлено до друку).

4. Патент України 7 А61К35/78, на винахід "Спосіб виділення біологічно активних речовин з кори осики, які виявляють антимікробну, репаративну, протизапальну, анальгетичну та діуретичну активність"/ Н.В. Бородіна, В.Н. Ковальов, І.Л. Дикий, Н.В. Деркач, Л.М. Малоштан, В.А. Волковой; Національний фармацевтичний університет (Україна). - №73209; заявл.: 19.05.2003; опубл.: 15.06.2005. Бюл. №6.

5. Волковой В.А., Деркач Н.В., Решетняк Н.В. Фармакологическое изучение экстрактов осины / "Лекарства - человеку". - Харьков, 15 марта 2002. - Т. ХYІІ. - №1. - С.95-97 (проведено огляд літератури, виконані експериментальні дослідження на 50%, проведена статистична обробка даних, підготовлено до друку).

6. Волковой В.А., Деркач Н.В., Решетняк Н.В. Определение острой токсичности и эффективной дозы биологически активных веществ коры осины // "Лекарства - человеку." - Харьков. - 2002. - Т. ХYІІ - №2. - С.85-87. (проведено огляд літератури, виконані експериментальні дослідження, проведена статистична обробка даних, підготовлено до друку).

7. Волковой В.А., Деркач Н.В., Бородина Н.В. Исследование антиэксудативной активности экстракта коры осины / ІХ Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" Тезисы докладов 8-12 апреля 2002 г. Москва. - С.595.

8. Волковой В.А., Деркач Н.В., Решетняк Н.В. Изучение диуретической активности экстрактов из листьев и коры осины / ІХ Российский национальный конгресс "Человек и лекарство" Тезисы докладов 8-12 апреля 2002 г. Москва. - С.595.

9. Волковой В.А., Деркач Н.В. Деякі фармакологічні властивості комплексу БАР кори осики / Фармація ХХІ століття тези доповідей всеукраїнської науково-практичної конференції 23-24 жовтня 2002 року м. Харків. - Харків: Вид-во НФаУ: "Золоті сторінки", 2002. - С.141.

10. Деркач Н.В., Волковой О.В., Антиоксидантная активность водного экстракта коры осины / ІІІ Міжнародна науково-практична конференція "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія". Тези доповідей. - Харків - 2003, Ч.1 - С.69.

11. Деркач Н.В., Волковой В.А. Влияние водного экстракта коры осины на течение УФ эритемы / "Лекарства - человеку" Всеукраинская научно-методическая конференция с международным участием - Харьков, 2004. - С.45.

12. Захарова О.В., Деркач Н.В. Вплив водного екстракту кори осики на слизову оболонку шлунку / Міжвузівська наукова конференція "Наукові основи створення лікарських засобів". Тези доповідей. - Харків, 2005. - С. 206.

Анотація

Деркач Н.В. "Протизапальна активність водного екстракту з кори осики" - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.03.05. - фармакологія. - Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена вивченню протизапальних властивостей водного екстракту з кори осики. У роботі вперше теоретично обгрунтована та експериментально доведена антиексудативна, анальгезуюча, жарознижувальна дії водного екстракту з кори осики.

В експериментах встановлено, що найвищу активність водний екстракт з кори осики проявляє у дозі 25 мг/кг маси тварин і пригнічує асептичне запалення, визване карагеніном на 52,9%, формаліном на 54,6%, і не поступається препарату порівняння - вольтарену (56,7% і 54,5%, відповідно), а також на моделі експериментальної УФ-еритеми знижує інтенсивність запалення у 1,8 рази в порівнянні з контрольною групою (Р0,05).

Анальгезуюча дія водного екстракту з кори осики на моделі оцтових корчів перевищує дію препарата порівняння - анальгіна (62,7% і 37,7%, відповідно), на моделі електричного подразнення кінцівок щурів активність водного екстракту з кори осики склала 47,2% (Р<0,05); жарознижувальна дія водного екстракту з кори осики дорівнює вольтарену - 53,6% і 56,1%, відповідно.

При вивченні протизапальної активності водного екстракту з кори осики виявлено відсутність токсичних ефектів на органи та системи тварин у гострому і хронічному експерименті. Встановлено, що при пероральному та внутрішньоочеревинному введенні водного екстракту з кори осики білим щурам і мишам ЛД5000 мг/кг.

Ймовірний механізм протизапальної дії водного екстракту з кори осики обумовлений антиоксидантною, мембраностабілізуючою, капілярозміцнюючою активністю.

Протизапальна дія водного екстракту з кори осики зберігається й в умовах модельної патології при ізадриновому міокардиті, ад'ювантному поліартриті, та асептичному перитоніті. При ізадриновому міокардиті екстракт зменшує рівень ТБК-АП у 1,2 рази, ДК у 1,2 рази та сприяє зростанню активності ферментів антиоксидантної системи захисту - СОД у 1,3 рази та ВГ у 1,1 рази; полипшує стан фосфоліпідного спектра мікросомальної фракції мембран кардіоміоцитів. При цьому за ефектністю практично не поступається препарату порівняння вольтарену.

Внаслідок лікування водним екстрактом з кори осики значно зменшується набряк і клітинна інфільтрація в осередку запалення, нормалізується морфологічна структура суглобів, серця, очеревини. Наші дослідження експериментально обґрунтовують доцільність використання водного екстракту з кори осики при станах, які супроводжуються запальним процесом.

Ключові слова: водний екстракт з кори осики, асептичне запалення, фармакологічна активність, ізадриновий міокардит, ад'ювантний поліартрит, асептичний перитоніт.

Аннотация

Деркач Н.В. "Противовоспалительная активность водного экстракта из коры осины". - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.03.05 - фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2006.

В диссертации приведены результаты экспериментального изучения противовоспалительной активности водного экстракта из коры осины. В работе впервые теоретически обосновано и экспериментально доказано противовоспалительное, анальгезирующее, жаропонижающее действие экстракта.

Антиэкссудативное действие экстрактов из коры и листьев осины изучали на 3-х моделях асептического воспаления (гистаминовом, каррагениновом, формалиновом). Препаратом сравнения был выбран вольтарен в дозе 8 мг/кг массы животного. В экспериментах установлено, что наибольшую активность проявляет водный экстракт из коры осины в дозе 25 мг/кг, который угнетает отек, вызванный каррагенином на 52,9%; формалином на 54,6% и не уступает препарату сравнения (56,7% и 54,5%, соответственно). На модели экспериментальной УФ-эритемы экстракт достоверно в 1,8 раз снижает интенсивность воспаления в сравнении с контрольной группой (Р0,05). Анальгезирующее действие экстракта на модели уксуснокислых корчей превышает в 1,6 раза действие препарата сравнения анальгина (62,7% и 37,7%, соответственно), а на модели электрического раздражения конечностей крыс активность экстракта составила 47,2% в сравнении с контрольной группой. Жаропонижающая активность водного экстракта из коры осины на модели молочной лихорадки не уступает эффекту вольтарена - 53,6% и 56,1%, соответственно. Эффективная доза, рассчитанная по методу В.М. Штабского, составила 25 мг/кг.

Водный экстракт из коры осины не проявил токсичного действия в остром эксперименте при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении в дозах 300-5000 мг/кг. Согласно классификации К.К. Сидорова, экстракт относится к практически нетоксичным веществам - ЛД₅₀5000 мг/кг (IV-V класс токсичности).

В хроническом эксперименте водный экстракт из коры осины не оказывает токсического влияния на функции центральной нервной системы, сердечно-сосудистой, мочевыделительной системы, обменные процессы в печени, не изменяет морфологический состав периферической крови, не оказывает ульцерогенного действия.

Изучены некоторые механизмы противовоспалительного действия водного экстракта коры осины. Так как, в основе воспаления лежит повышение сосудистой проницаемости, изучено влияние экстракта на проницаемость сосудистой стенки. Установлено, что предварительное введение экстракта замедляет в 3,2 раза прокрашивание формалиновой папулы, в 3 раза каолиновой, в 2,7 раза каррагениновой по сравнению с контролем.

Экспериментально подтверждено, что изучаемый экстракт способен ингибировать активность биогенных аминов и, вследствие этого, понижать проницаемость сосудистой стенки, что может определять его противовоспалительное действие.