Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені В.Н. КАРАЗІНА

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

АКТИВНІСТЬ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТІВ В ТКАНИНАХ ТІЛА МАТКИ ЖІНОК БЕЗ НОВОУТВОРЕНЬ ТА З ОНКОЗАХВОРЮВАННЯМИ

03.00.04 - біохімія

ЧЕРНАДЧУК СНІЖАНА СЕРГІЇВНА

Одеса - 2006

Дисертацію рукопис.

Робота виконана у Одеському національному університеті імені . . Мечникова Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, доцент

Вовчук Ірина Леонідівна,

Одеський національний університет імені І. І. Мечникова,

доцент кафедри біохіміі, м. Одеса.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Перський Євген Ефроїмович,

Харківський нацональний університет мені В. Н. Каразіна МОН України,

завідувач кафедри біохімії, м. Харків;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Пахомова Вікторія Олексіївна,

Інститут стоматології АМН України,

керівник лабораторії біохімії, м. Одеса.

Провідна установа: Інститут геронтології АМН України, (відділ регуляції метаболізму), м. Київ.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Великий інтерес для досліджень у галузі медицини та біології становить вивчення протеолітичних ферментів, які виконують важливу роль у життєдіяльності живого організму, тому що вони приймають участь не тільки в обміні білків, деградації їх аномальних молекул, поповненні амінокислотного пула клітини, але й у регуляторних процесах та в процесах проліферації та трансформації клітин. З функціонуванням протеаз повязані важливі прояви життєдіяльності: біогенез структур, фагоцитоз, діління клітин, регенерація тканин та ін. Відомо, що патофізіологія багатьох хвороб, в тому числі й онкологічних, асоціюється зі змінами протеолітичної активності, яка сприяє прогресії пухлини, проявленню інвазивних властивостей пухлинними тканинами та метастазуванню.

В тканинах злоякісних новоутворень відзначена збільшена протеолітична активність, у порівнянні з тканинами, із яких ці новоутворення походять. Проте існують суперечні дані про кореляцію між підвищеною активністю тканевих протеаз та метастатичним потенціалом пухлин. Активність протеолітичних ферментів у плазмі крові онкологічно хворих характеризується також протилежними показниками та заслуговує обговорювання.

Існують небагато досліджень широкого спектру протеаз у гормонозалежних пухлинах, відсутні дані про активність в пухлиній тканині тіла матки екзопептидаз, практично не вивчений взаємозвязок між біохімічними аспектами канцерогенезу та гормональним статусом організму.

Отже, дослідження стану протеазної системи за умов канцерогенезу тканин матки є актуальним як з теоретичної, так і з практичної точки зору.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках держбюджетної теми кафедри біохімії Одеського національного університету імені І.І. Мечникова: “Біохімічні та фармакологічні механізми дії метаболітів вітамінів та ферментів в організмі за умов різних експериментальних патологій” (номер державної реєстрації 0104U002661).

Мета i задачi дослiдження. Метою роботи було встановлення вікових особливостей зміни активності ферментів протеолітичної системи в тканинах тіла матки без новоутворень, а також в процесі малігнізації, розвитку та прогресії пухлинної тканини.

Відповідно до вказаної мети були сформульовані наступні завдання:

1. Вивчити вікову динаміку активності протеаз у тканинах тіла матки без новоутворень.

2. Визначити активність компонентів протеазної системи у тканинах матки за наявністю процесу малігнізації та проліферації.

3. Вивчити можливість існування зв'язку між вмістом естрогенів у тканинах тіла матки та

активністю протеолітичних ферментів.

Об'єкт дослідження. Процес протеолізу в тканинах тіла матки без новоутворень та в тканинах з онкопатологією.

Предмет дослідження. Активність ферментів протеолітичної системи в тканинах тіла матки без новоутворень та за умов розвитку онкопроцесу.

Методи дослідження. В роботі застосовано біохімічні методи визначення показників протеазо-інгібіторного та гормонального статусу в тканинах без новоутворень та за умов онкозахворювань тіла матки: спектрофотометричний метод визначення активності ферментів та їх субстратів, радіоімунологічний аналіз визначення вмісту естрогенів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджена активність ендо-, екзопептидаз та ендогених інгібіторів в тканинах тіла матки без новоутворень а також у пухлинах з різноманітною локалізацією та ступенєм диференціації клітин пухлини. Вперше встановлено збільшення активності металопротеїнази - 2 матриксу та карбоксипептидаз А і В в тканинах новоутворень, що свідчить про особливу роль даних ферментів у процесі малігнізації клітин та канцерогенезу.

Виявлено, що зниження ступеню диференціації клітин пухлини супроводжується зменшенням активності аспартильних, трипсиноподібних протеїназ, металопротеїнази - 2 матриксу, карбоксипептидаз А і В, та збільшенням активності цистеїнових протеїназ та ₁-антитрипсину.

Вперше досліджені активності ферментів протеолітичної системи в залежності від вікових особливостей органів репродуктивної системи жінок. Виявлені зміни зазначених біохімічних критеріїв у процесі канцерогенезу в залежності від віку жінок.

Встановлено збільшення вмісту естрогенів в тканинах з онкопатологією тіла матки по відношенню до тканин без новоутворень, що дає можливість висунути гіпотезу про гормональну індукцію біосинтезу протеолітичних ферментів.

Наукове та практичне значення роботи. Встановлена роль досліджених протеаз у розвитку доброякісних та злоякісних процесів в тілі матки. Зроблені у роботі висновки розширюють і доповнюють сучасні уявлення про активність протеолітичних ферментів в умовах малігнізації клітин та розвитку пухлинної тканини. Показана можливість оцінки стану онкозахворювання в тілі матки за допомогою одночасного визначення активності протеаз та вмісту естрогенів, що може бути використано з метою діагностики та прогнозу розвитку пухлинних хвороб.

Матеріали роботи включені до лекційного курсу “Ензимологія” для спеціальності “Мікробіологія”, спеціального курсу “Методи сучасної біохімії”, для спеціальності “Біологія”, які читаються на кафедрі біохімії Одеського національного університету імені І.І. Мечникова.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автор особисто проаналізував сучасну наукову літературу за темою дослідження, підібрав методи вирішення поставлених завдань. Усі експериментальні дані, використані в дисертації, отримані при безпосередній участі автора роботи. Аналiз результатiв i висновки зробленi разом з науковим керiвником, к.б.н., доц. І.Л. Вовчук.

Апробацiя результатiв дисертацiї. По темі дисертації були зроблені доповіді на міжнародному конгресі FEBS м. Лісабон (2001), а також доповіді на Першому міжнародному конгресі “Молекулярная биотехнология” в м. Трабзон (2001), на міжнародному IX зїзді онкологів в м. Москва (2001), на 56-й, 57-й, 58-й наукових конференціях професорсько-викладацького складу і наукових співробітників Одеського національного університету ім. І. І. Мечникова (м.Одеса, 2001, 2002, 2003), на Всеукраїнській конференції молодих вчених “Актуальные вопросы современного естествознания” в м. Симферополі (2001, 2003), на міжнародній конференції молодих вчених "Биология - наука XXI века" (м.Пущино, 2002), на Всеукраїнській науково-практичній конференції "Довкілля і здоровя" (м.Тернопіль, 2003), на IV міжнародній медичній конференції молодих вчених "Медицина - здоровя XXI сторіччя" (м. Дніпропетровськ, 2003).

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи опубліковано в 9 статтях у наукових фахових виданнях України, які включені в перелік, затверджений ВАК України, та в іноземних наукових виданнях, а також у 5 тезах доповідей у збірках наукових конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 142 сторінках друкованого тексту та складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків, списку використаної літератури з 82 робіт вітчизняних і 120 зарубіжних авторів. У роботі представлено 8 таблиць і 16 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

В огляді літератури представлені сучасні дані, які стосуються опису широкого спектру протеолітичних ферментів за умов канцерогенезу. Детально проаналізовано інформацію про синтез та функцію як класичних естрогенів, так і некласичних фенолстероїдів.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Реактиви і матеріали. В ході роботи були досліджені біопсійні зразки тканин без новоутворень та тканинні зразки з доброякісними та злоякісними пухлинами, вилучені операційним шляхом, які були люб'язно надані співробітниками патоморфологічної лабораторії Одеського обласного онкодиспансеру. Усі дослідження тканинних зразків провадили до терапевтичного лікування хворих. Вилучену операційним шляхом тканину відмивали від крові охолодженим до + 4 С 0,9 % розчином NaCl, гомогенізували при + 4 С з 0,9 % з розчином NaCl та центрифугували при 12000 об. / хв. продовж 45 хвилин.

Отриманий екстракт тканини використовували для проведення біохімічних досліджень.

В роботі використовували наступні комерційні препарати: гемоглобін, казеїн, азоказеїн, гліцин, дитіотреїтол (ДДТ), етилен-діаміно-тетраацетат (ЕДТА), Hippuryl-Phe, Hippuryl - Arg ("Sigma", США), соєвий інгібітор трипсину Кунітца (СІТ) ("Reanal", Угорщина), N-бензоїларгінін-п-нітроанілід (БАПНА) (“Fluka”, Швеція), розчин трипсину (“Спофа”, Чехословакія). Було використано неорганічні солі, кислоти та луги кваліфікації не нижче ЧДА.

Визначення активності катепсин D-подібних протеїназ. Метод заснований на визначенні кількості продуктів гідроліза 1 % гемоглобіну при рН 3,5, що не осаджуються 10 % розчином трихлороцетової кислоти (ТХО), за методом М.L. Anson , A.E. Mirsky у модифікації К. Н. Веремеенко (1932).

Визначення активності катепсин L -подібних протеїназ. Метод засновано на визначенні кількості продуктів гідроліза 1 % азоказеїну при рН 6,0, що не осаджуються 10 % ТХО [В.И. Черная,1989].

Визначення активності катепсин В - подібних протеїназ. Метод засновано на визначенні кількості продуктів гідроліза синтетичного субстрату БАПНА при рН 6,0, за методом B.F. Erlangera (1961).

Визначення активності трипсиноподібних протеїназ. Активність трипсиноподібних протеїназ визначали за методом Kunitz в модифікації К. Н. Веремеєнко (1947), метод засновано на визначенні кількості продуктів гідроліза 2 % казеїна при рН 7,6, що не осаджуються 10 % ТХО.

Визначення активності ₁-антитрипсину. Визначення проводили за методом К. Н. Веремеєнко у модифікації А.Н. Левицького (1988), в якому активність інгібітору оцінювалась гальмуванням гідролізу казеїну кристалічним трипсином.

Визначення активності карбоксипептидаз А і В. Активність карбоксипептидази А визначали по гідролізу синтетичного субстрату Hippuryl-Phe - 2 мМ, активність карбоксипептидази В - по гідролізу Hippuryl-Arg - 2 мМ [Bradshaw R.S., 1969].

Визначення активності металопротеїнази - 2 матриксу. Активність металопротеїнази - 2 матриксу (ММП-2) визначали по гідролізу субстрату 10% желатіни [Bradshaw R.S., 1969].

Визначення вмісту естрадіола. Застосовано радіоімунологічний аналіз з використанням стандартних наборів “Фармос Диагностика” (Фінляндія) за методом Л. М. Берштейна (2003).

Визначення вмісту естрогенів. Принцип методу засновано на здібності естрогенів з реактивом фенол-серної кислоти давати червоне забарвлення з максимальною адсорбцією світла при 530 нм [Jayle F. M., Crepy O., 1950].

Для обчислення отриманих результатів застосовували методи статистичного аналізу (обробка результатів статистичними методами з використанням параметричних критеріїв оцінки розбіжності між вибірками). Достовірно різними вважалися результати при Р ? 0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

В розвитку пухлинної хвороби одну з головних функцій виконують протеолітичні ферменти, які приймають участь в деструкції тканинних барєрів, використовуючи різноманітні механізми: специфічну активацію проферментів та гідролітичну дію на субстрати.

В пухлинних тканинах значно змінюється спектр та активність ферментів. Такі зміни відбуваються у різноманітних ферментів та характеризують перебудову обміну пухлинних клітин, зумовлену локалізацією пухлини, ступенєм диференціації клітин, етапом пухлинної прогресі, та іншими факторами регуляції.

Нами були проведені досліди по вивченню активності протеаз у процесі малігнізації тканин тіла матки, а також у процесі прогресії та інвазії клітин новоутворень.

Дослідження змін у метаболізмі клітин та тканин за наявністю процесу малігнізації мають важливе значення не тільки для з'ясування суті пухлинного росту, але й для розробки правильної тактики боротьби проти пухлинної хвороби. Одним з підходів до подібного роду дослідів являється вивчення активності ферментів в процесі канцерогенезу. У цьому зв'язку особливо важливим є вивчення активності протеолітичних ферментів.

На першому етапі нашої роботи ми досліджували активність протеолітичних ферментів в тканинах тіла матки без новоутворень (табл. 1).

Для вивчення можливих компенсаторних переключень окремих ферментів системи протеолізу нами був використаний онтогенетичний підхід, оскільки онтогенез є одною з найбільш показових моделей, в яких реалізуються переключення одних ензимних систем на другі в ході розвитку і, особливо, геронтогенезу (табл. 1).

Так, в системі протеолізу тканин тіла матки без новоутворень спостерігалися фізіолого-вікові особливості переключення окремих ланцюгів системи протеолізу. Зокрема, пізній репродуктивний (41-50 років) та менопаузальний (51-60 років) періоди життя жінок супроводжувались значним підвищенням активності досліджуваних ендопептидаз (трипсиноподібних ензимів та катепсин L-, B-, D- подібних протеаз) та вірогідним зниженням активності даних ферментів у жінок, які знаходились в клімактеричному періоді (61-70 років) по відношенню до більш молодих жінок.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблиця 1

Активність протеолітичних ферментів (мкмоль/мг білка Ч хв) в тканинах тіла матки без новоутворень в різні фізіолого-вікові періоди жінок

Фізіолого-вікові періоди	Катепсин D- подібні протеази	Катепсин L- подібні протеази	Катепсин B- подібні протеази	Трипсино- подібні протеази	Інгібітор трипсину (у. о.)	Метало-протеїназа-2	Карбокси-пептидаза А	Карбокси-пептидаза В
Репро-дуктивний період (31-40 років) (n=27)	0,020,001	0,500,04	0,050,004	0,360,03	0,080,009	735,2761,83**	55,884,93**	935,5389,55**
Пізній репро-дуктивний період (41-50 років) (n=25)	0,030,002*	0,500,04	0,100,009*	0,420,04*	0,080,008	805,3391,03**	62,347,03**	897,8493,04**
Мено-паузальний період (51-60 років) (n=25)	0,020,002*	0,680,07*	0,070,007	0,470,05*	0,080,008	802,1091,00**	78,458,54**	784,3280,26**
Кліма-ктерічний період (61-70 років) (n=25)	0,010,001	0,450,04	0,060,005	0,330,03	0,040,003	1000,3798,04**	93,489,70**	1263,59130,00**

Примітка: * - вірогідне підвищення активності досліджуємих ендопептидаз у жінок в репродуктивний та менопаузальний періоди
по відношенню до жінок в клімактеричному віці;

** - вірогідні зміни активності ММП-2 та карбоксипептидаз А і В по відношенню до інших досліджуємих ферментів.

Размещено на http://www.allbest.ru/

При дослідженні активності металопротеїнази - 2 матриксу та карбоксипептидаз А і В в тканинах без новоутворень нами була зареєстрована найбільша активність ферментів у жінок, які знаходились в клімактеричному періоді (61-70 років).

Узгоджена дія металопротеїнази - 2 матриксу та карбоксипептидаз, можливо, пов'язана з необхідністю утворення маломірних олігопептидів з подальшою їх трансформацією в біологічно активні пептиди, які необхідні для діяльності тканин тіла матки.

Аналізуючи весь ензимний спектр системи протеолізу в тканинах матки без новоутворень в онтогенезі, слід відмітити, що найбільший вклад в загальну протеолітичну активність тканин вносять металопротеїназа - 2 матриксу та карбоксипептидази, особливо карбоксипептидаза В.

Така закономірність характерна для усіх вікових груп досліджених жінок. З віком кількісне відношення активностей досліджуваних ферментів змінюється. Так, збільшувався внесок екзопептидаз по відношенню до ендопептидаз.

Зниження активності ендопептидаз може бути пов'язано зі зниженням швидкості метаболічних процесів в організмі, зростанням ендокринно-метаболічних порушень, прогресією імуносупресії та кахексією - процесами, які характерні для старіння та з існуванням інгібіторного контролю.

В подальшому усі наші дослідження були проведені на ферментах, які вносять найбільший питомий вклад в загальну протеолітичну активність, зокрема на металопротеїназі - 2 матриксу, та карбоксипептидазах А і В.

В експерименті нами була застосована модель процесу малігнизації. Нами були обрані доброякісні новоутворення, які характеризуються інтенсивним розвитком: для тканини ендометрію - залозо-кістозна гіперплазія та аденоматоз (cancer in situ), для міометрію - фібролейоміома.

Дослідження активності металопротеїнази - 2 матриксу за наявністю різноманітних гістоморфологічних діагнозів доброякісних новоутворень ендометрію, які розглядаються як cancer in situ (рис. 1) показали, що активність цього фермента в тканинах без новоутворень була відносно невеликою та збільшувалась у ході розвитку патологічного процесу - максимальна активність металопротеїнази матриксу 2 реєструвалась за наявності залозо-кістозної гіперплазії на фоні аденоматозного ендометрію (21279,76 мкмоль / мг білка).

При дослідженні аденокарциноми ендометрію - пухлини, у яку може перетворитися аденоматоз, нами були отримані слідуючі дані: активність металопротеїнази - 2 матриксу вірогідно збільшувалась в 7,2 - 9,4 рази в тканинах аденокарциноми, в порівнянні з ендометрієм без новоутворень і була прямопропорційна ступеню диференціації пухлинних клітин (рис. 1).

Отримані дані свідчать про те, що в низькодиференційованих, бластоматозних злоякісних пухлинах порушуються функції даних ферментів та відбувається виключення їх з процесу обміну білків, тому що ці клітини інтенсивно забезпечуються надходженням вільних амінокислот, а в інтенсивно проліферуючих, малігнізуючих клітинах, протеази виконують характерні для них фізіологічні функції.

Рис. 1. Активність металопротеїнази - 2 матриксу в тканинах ендометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень; 1- ендометрій без новоутворень (n=102); 2 - залозо -кістозна гіперплазія (n=12); 3 - ендометріоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=11); 4 - аденоматоз (n=15); 5 - аденоматоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=15); 6 - ендометріоз + аденоматоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=27); 7 - високодиференційована аденокарцинома (n=14); 8 - помірнодиференційована аденокарцинома (n=19); 9 - низькодиференційована аденокарцинома (n=28).

За наявністю доброякісних новоутворень міометрію активність металопротеїнази-2 збільшується (в порівнянні з тканинами без новоутворень) у 14,4 - 16, 2 раза на протязі розвитку проліферуючого потенціалу пухлинних клітин (рис. 2).

Рис. 2. Активність металопротеїнази- 2 матриксу в тканинах міометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень; 1- міометрій без новоутворень (n=102); 2 - фібролейоміома (n=42); 3 - фібролейоміома проліферуюча (n=31).

Слід підкреслити, що на відміну від результатів інших дослідників, наші дані свідчать, що металопротеїназа є найбільш показовим біохімічним критерієм за наявності доброякісних новоутворень, які характеризуються процесом малігнізації, що може свідчити про тканиноспецифічність процесів в тілі матки.

Збільшення активності в доброякісних новоутвореннях по відношенню до злоякісного процесу свідчить про участь даних протеолітичних ферментів у процесі малігнізації та проліферації трансформуючих клітин.

Збільшення активності ММП-2 можливо пояснити з одного боку експресією гену, який кодує даний фермент, що було доведено іншими дослідниками [Sodestrom, 1996]. З другого боку, активність протеїназ регулюється їх ендогенними інгібіторами. Дисбаланс даних компонентів може бути пов'язаний зі збільшенням інвазивності та розвитком малігнізованого фенотипу клітин, а також може знаходитись під гормональним контролем.

Активність даного ферменту в тканинах без новоутворень була незначною і в процесі онтогенезу практично не змінювалась (табл. 2).

При дослідженні активності ММП-2 в тканинах доброякісних та злоякісних новоутворень вікові зміни проявлялись достатньо чітко. Активність ферменту за наявності новоутворень поступово збільшувалась у хворих жінок в віці 40-60 років а потім мала тенденцію до зниження.

В тканині аденокарциноми активність цього ферменту, в кожній віковій групі, вірогідно збільшувалась по відношенню до тканин без новоутворень в 7,1-13,2 раза. За наявності доброякісного процесу в тканинах новоутворень, нами було виявлено збільшення активності даного ферменту в 16,7-23,8 раза.

При більш детальному дослідженні карбоксипептидаз А і В за умов доброякісних процесів, нами були зареєстровані слідуючі закономірності (рис. 3).

В зразках доброякісних патологій ендометрію по відношенню до ендометрію без новоутворень, нами було виявлено збільшення активності карбоксипептидази А (в 1,1-1,6 раза) за наявності одночасно гіперпластичних та неопластичних процесів (рис. 3).

Найбільше збільшення по відношенню до тканин без новоутворень (в 2,7 раза) нами було виявлено за наявності в тілі матки одночасно аденоматозу (cancer in situ) та залозо-кістозної гіперплазії.

Активність карбоксипептидази В також значно збільшувалася по відношенню до тканин без новоутворень за наявністю гіперпластичних процесів, однак максимальна ативність була нами зареєстрована за аденоматозу (cancer in situ) (2442,10 мкмоль арг /мг білка).

Таблиця 2

Активність металопротеїнази - 2 матриксу (мкмоль/мг білка х хв) в тканинах тіла матки жінок в різні фізіолого - вікові періоди

Фізіолого - вікові періоди	Тканина тіла матки без новоутворень	Доброякісні новоутворення тіла матки	Злоякісні пухлини тіла матки
Репро-дуктивний період (31-40 років)	735,2769,12 (n=27)	12928,871011,54 ** (n=33)	8939,90900,22 ** (n=15)
Пізній репро-дуктивний період (41-50 років)	805,3378,36 (n=25)	13492,031121,36 ** (n=53)	9009,00911,54 ** (n=15)
Мено-паузальний період (51-60 років)	802,1078,14 (n=25)	19152,271757,87 *, ** (n=45)	10638,271203,05 *, ** (n=22)
Кліма-ктерічний період (61-70 років)	1000,3798,68 (n=25)	18018,001698,37 ** (n=25)	7142,83675,59 ** (n=9)

Примітка: ** - вірогідні зміни досліджуємих показників в трансформуючих тканинах по відношенню до тканин без новоутворень;

* - збільшення активності ММП-2 у жінок в віці 50-60 років по відношенню до іншого віку;

n - кількість досліджуємих жінок.

Вивчення активності карбоксипептидаз А і В за наявністю злоякісного процесу в тілі матки, показало збільшення активності цих ферментів (по відношенню до показників тканини без новоутворень) в середньому в 1,3 раза, за винятком зразків низькодиференційованої аденокарциноми - для карбоксипептидази А, де спостерігалось незначне зниження активності (рис. 3).

Дослідження активності карбоксипептидаз у зразках аденокарциноми різного ступеня диференціації (рис. 3) виявило, що по мірі зниження ступеня диференціації пухлинних клітин активність досліджуваних ферментів зменшувалась.

Зменшення активності карбоксипептидаз в низькодиференційованих, бластоматозних злоякісних пухлинах, також як і для металопротеїнази, на наш погляд, може свідчити про порушення функцій даних ферментів та виключення їх з процесу обміну білків.

Рис. 3. Активність карбоксипептидази А (А) і B (В) в тканинах ендометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень; 1- ендометрій без новоутворень (n=102); 2 - залозо -кістозна гіперплазія (n=12); 3 - ендометріоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=11); 4 - аденоматоз (n=15); 5 - аденоматоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=15); 6 - ендометріоз + аденоматоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=27); 7 - високодиференційована аденокарцинома (n=14); 8 - помірнодиференційована аденокарцинома (n=19); 9 - низькодиференційована аденокарцинома (n=28).

Активність карбоксипептидаз А і В в тканинах доброякісних патологій міометрію, по відношенню до міометрію без новоутворень, показало вірогідне збільшення цього показника (в 2,1 і 3,5 раза, відповідно) за наявності новоутворень з великим проліферативним потенціалом (рис. 4).

Слід відмітити, що значне збільшення питомої активності карбоксипептидази А (в 2,1 раза) та карбоксипептидази В (в 3,5 раза) в зразках проліферуючої фібролейоміоми обумовлено можливо активацію ферментів під дією метаболітів пухлини, або за рахунок активації проферментів, тому що дане збільшення супроводжувалось зниженням вмісту білка.



Рис. 4. Активність карбоксипептидаз А (А) і В (В) в тканинах міометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень;

1 - міометрій без новоутворень (n=102);

2 - фібролейоміома (n=42);

3 - фібролейоміома проліферуюча (n=31).

Дослідження роботи екзопептидаз в різні фізіолого-вікові періоди тіла матки показало, що активність карбоксипептидаз А і В в тканинах тіла матки без новоутворень мала тенденцію до збільшення з віком (табл. 3). За наявності доброякісного процесу максимальна активність карбоксипептидази А була нами виявлена у жінок в клімактерічний період (60-70 років), а карбоксипептидази В - після 50 років. В зразках злоякісних новоутворень активність досліджуваних протеаз вірогідно знижувалась у хворих жінок після 60 років (табл. 3). матка естроген фермент проліферація

В межах одного віку активність карбоксипептидаз А і В (табл. 4) вірогідно збільшувалась в тканинах з доброякісними та злоякісними патологіями по відношенню до активності досліджуваного біохімічного показника в тканинах тіла матки без новоутворень.

Таблиця 3

Активність екзопептидаз (мкмоль/мг білка х хв) в тканинах тіла матки в різні фізіолого-вікові періоди жінок

Фізіолого-вікові періоди	КАРБОКСИПЕПТИДАЗА А	КАРБОКСИПЕПТИДАЗА В
	Тканина тіла матки без новоутворень	Доброякісні новоутворе-ння тіла матки	Злоякісні пухлини тіла матки	Тканина тіла матки без новоутворень	Доброякісні новоутворе-ння тіла матки	Злоякісні пухлини тіла матки
Репро-дуктивний період (31-40 років)	55,88 5,12 (n=27)	99,05 10,10 ** (n=33)	83,02 7,51 ** (n=15)	935,53 89,56	1904,29 175,26 **	1612,25 148,53 **
Пізній репро-дуктивний період (41-50 років)	62,34 5,78 (n=25)	103,12 9,12 ** (n=53)	115,74 104,95 ** (n=15)	897,84 92,62	1829,93 191,52 **	1860,43 150,26 **
Мено-паузальний період (51-60 років)	78,45 8,65* (n=25)	102,70 9,14 ** (n=45)	100,00 98,35 ** (n=22)	784,32 80,25	2077,73 195,98 **	1914,59 201,10 *, **
Кліма-ктерічний період (61-70 років)	93,48 8,98* (n=25)	123,13 9,89 ** (n=25)	87,61 9,62 (n=9)	1263,59 114,32	1410,63 125,65 **	1328,28 112,30*

Примітка: n - кількість досліджуємих жінок;

* - онтогенетичні зміни;

** - вірогідні зміни досліджуємих показників в трансформуючих тканинах по відношенню до тканин без новоутворень.

Оскільки гормонально-ензимні взаємовідношення відіграють значну роль при розвитку багатьох патологій, ми провели досліди, які надали можливість простежити регуляцію вивчених нами протеаз естрогенами.

В результаті дослідження вмісту естрадіола в тканині ендометрія без новоутворень, як у жінок репродуктивного, так і менопаузального віку, встановлено, що величина цього параметру вірогідно нижче, ніж його значення в тканинах з онкопроцесом (в 2 рази) (рис. 5). У жінок з онкопроцесом репродуктивного віку величина досліджуваного показника вища в 1,4- 1,6 рази, ніж у хворих, які знаходилися в менопаузальному та клімактеричному періодах.

Рис. 5. Вміст естрадіолу в тканинах ендометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень.

Досліди вмісту естрадіола в тканинах міометрію (рис. 6), показали аналогічну закономірність - збільшення даного біохімічного показника в тканинах з процесом малігнізації по відношенню до тканин без новоутворень (в 1,3 - 1,5 рази).

Рис. 6. Вміст естрадіолу в тканинах міометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень.

За даними літератури, походження гіперестрогенії різноманітне і залежить від віку [Бохман Я. В., 1989]. У жінок в постменопаузальний період гіперестрогенія повґязана з зростанням частки некласичних фенолстероідів [Дильман В.М., 1983, Берштейн Л.М., 2000].
В звґязку з цим, нами були проведені досліди вмісту суми класичних естрогенів і некласичних фенолстероідів в залежності від патоморфологічної оцінки онкопроцесу в тілі матки жінок.

При вивченні доброякісних новоутворень тіла матки найбільший вміст естрогенів, в порівнянні з тканиною ендометрію без новоутворень, було виявлено за наявністю гіперпластичних поцесів на фоні запалення (в 11,2 - 12,4 рази) (рис. 7).

Рис. 7. Вміст естрогенів в тканинах ендометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень; 1- ендометрій без новоутворень (n=102); 2 - залозо -кістозна гіперплазія (n=12); 3 - ендометріоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=11); 4 - аденоматоз (n=15); 5 - аденоматоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=15); 6 - ендометріоз + аденоматоз + залозо -кістозна гіперплазія (n=27); 7 - високодиференційована аденокарцинома (n=14); 8 - помірнодиференційована аденокарцинома (n=19); 9 - низькодиференційована аденокарцинома (n=28).

За наявністю доброякісних новоутворень в міометрії максимальне підвищення вмісту естрогенів спостерігалось (в 10,3 раза) за наявності проліферуючої фібролейоміоми (рис. 8).

Рис. 8. Вміст естрогенів в тканиниах міометрію

Примітка: *- Р ? 0,05 до тканин без новоутворень; 1- міометрій без новоутворень (n=102); 2 - фібролейоміома (n=42); 3 - фібролейоміома проліферуюча (n=31).

Як свідчать наведені дані (рис. 7, 8), достовірні відмінності між вмістом естрогенів у тканинах доброякісних та злоякісних новоутворень мають місце лише за умов глибоких порушень диференціації клітин.

У зразках тканин жінок зі злоякісними пухлинами ендометрію виявлено збільшення вмісту естрогенів, в порівнянні з тканиною без новоутворень, яке корелює зі зниженням ступеню диференціації пухлинних клітин. Отримані дані можна пояснити тим, що основна популяція клітин низькодиференційованого раку ендометрію представлена стовбурними раковими клітинами, які мають високу проліферативну активність. Ці клітини у нормальних, високодиференційованих та помірнодиференційованих пухлинних тканинах ендометрію, в протилежність низькодиференційованим, мають здатність до перетворення в спеціалізовані гормоночутливі клітини, які мають власні рецептори стероїдних гормонів.

Наші досліди показали, що в тканинах тіла матки без новоутворень вміст естрогенів збільшувався (в 1,2 раза) в кінці репродуктивного періоду та знижався в 2 раза після 60 років (табл. 5).

Таблиця 4

Вміст естрогенів (мкг / мг) в тканинах тіла матки в різні фізіолого-вікові періоди жінок

Фізіолого-вікові періоди	Тканина без новоутворень	Доброякісні новоутворення тіла матки	Злоякісні пухлини тіла матки
Репродуктивний період (31-40 років)	66,18±6,48 (n = 27)	589,68±54,03 * (n = 45)	570,41±61,82 * (n = 5)
Пізній репродуктивний період(41-50 років)	92,65±8,63 (n = 25)	647,16±65,46 * (n = 55)	615,49±59,62 * (n = 10)
Менопаузальний період (51-60 років)	66,18±5,94 (n = 25)	745,31±73,35 * (n = 53)	814,49±87,14 * (n = 14)
Клімактерічний період(61-70 років)	33,09±3,07 * (n = 25)	829,97±89,14 * (n = 37)	1029,67±111,29 * (n = 7)

Примітка: * - вірогідні зміни досліджуємих показників в трансформуючих тканинах по

відношенню до тканин без новоутворень;

n - кількість досліджуємих жінок.

У кожнії віковій групі досліджуваних жінок, за наявністю доброякісних та злоякісних новоутворень тіла матки спостерігалося збільшення вмісту естрогенів від 8 (в репродуктивний період) до 30 разів (після 60 років).

Отримані нами результати дозволяють припустити, що з віком у жінок як класичні естрогени, так і некласичні фенолстероїди відіграють основну роль в патогенному впливі на тканини тіла матки.

Таким чином, всі приведені дані свідчать про специфічну роль тканинних протеаз (карбоксипептидаз А і В та металопротеїнази- 2 матриксу) в ході канцерогенезу і регуляторну роль естрогенів в цьому процесі.

ВИСНОВКИ

1. Всі наведені в дисертаційній роботі досліди свідчать про те, що в тканинах як без новоутворень, так і з онкозахворюваннями найбільшу активність мали металопротеїназа - 2 та карбоксипептидаз А і В.

2. В системі протеолізу тканин тіла матки без новоутворень спостерігалися вікові механізми переключення окремих ланцюгів системи протеолізу. Так, зокрема, пізній репродуктивний (41-50 років) та менопаузальний (51-60 років) періоди життя жінок супроводжувалися значним підвищенням активності ендопептидаз (трипсиноподібних ензимів, катепсин L-, B-, D-подібних протеаз) та вірогідним зниженням активності даних ферментів у жінок, які знаходились у клімактеричному періоді (61-70 років) по відношенню до жінок меньшого віку. Активність металопротеїнази-2 та карбоксипептидаз А і В в тканинах без новоутворень, була найбільшою у жінок, які знаходилися в клімактеричному періоді (61-70 років).

3. За наявності доброякісних новоутворень тканин тіла матки нами був виявлений більш широкий спектр протеаз тих же ферментів, що і в тканинах без новоутворень. Найбільша активність карбоксипептидаз А і В та металопротеїнази-2 реєструвалась в доброякісних новоутвореннях, які характеризуються наявністю процесу малігнізації. З віком у жінок з доброякісним процесом в тілі матки активність карбоксипептидаз А і В та металопротеїнази- 2 збільшувалась, пік активності припадає на вік 50-60 років.

4. В тканинах злоякісних новоутворень тіла матки нами виявлена найбільша активність карбоксипептидаз А і В та металопротеїнази-2. Однак активність даних ферментів за наявності злоякісного процесу залишається нижчою, ніж при доброякісних новоутвореннях з інтенсивним процесом малігнізації та проліферації. З віком в тканинах злоякісних новоутворень тіла матки активність карбоксипептидаз А і В та металопротеїнази- 2 збільшується, пік активності припадає на вік 50-60 років.

5. Виявлено значне збільшення вмісту естрогенів як при злоякісних, так і при доброякісних новоутвореннях в тілі матки по відношенню до тканин без новоутворень. Збільшення активності металопротеїнази - 2 та карбоксипептидаз А і В в тканинах тіла матки жінок пов`язано зі збільшенням вмісту як класичних естрогенів, так і некласичних фенолстероїдів, які є важливими регуляторами біосинтезу білка.

СПИСОК ОПУБЛКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦЇ

1. Вовчук І.Л., Бендерська Н.В., Чернадчук С.С., Мотрук Н.В. Протеїнази сироватки крові жінок з доброякісними та злоякісними пухлинами репродуктивних органів // Вісник Одеського національного університету імені І.І. Мечникова - 2001. - Т. 6, № 1. - С.5-10. (Дисертантка брала участь у пошуку, обробці одержаної інформації та виконанні експерименту, сумісно зі співавторами інтерпретувала дані).

2. Вовчук И.Л., Дизик А.Е., Ануфриев М.Г., Чернадчук С.С., Бендерская Н.В., Мотрук Н.В. Пептидгидролазная активность сыворотки крови женщин с онкологическими заболеваниями эндометрия // Вопр. мед. химии. - 2001. - Т. 47, № 1. - С. 98-102. (Дисертанткою зроблений добір умов та виконання спектрофотометричного методу аналізу для визначення активності ферментів протеолітичної системи у сироваткі жінок з патологією тканин тіла матки).

3. Vovchuk I., Benderskaya N., Chernadchuk S., Motruk N. et al. The study of Content of estrogens in the tumor tissues of women reproductive system // Proceedings of the 1-st Eurasion Congress on Molecular Biotechnology. - Turkey, 2001. - 1. - P. 288-290.

4. Чернадчук С.С., Вовчук И.Л Активность катепсина В в опухолевой ткани репродуктивных органов женщин // Ученые записки Таврического национального университета. Серия "Биология" - 2003.- Т. 16 (55), №2 - С. 202-207. (Дисертантка визначала активність катепсин В-подібних протеаз в тканинах тіла матки).

5. Вовчук І.Л., Чернадчук С.С. Активність лужної фосфатази в пухлинних тканинах тіла матки // Вісник Одеського національного університету імені І.І. Мечникова - 2003. - Т. 8, №6.- С.185 - 189. (Дисертанткою здійснені підбір умов та виконання експерименту щодо визначення активності лужної фосфатази).

6. Вовчук І.Л., Чернадчук С.С., Блохін Ю.В., Раздражнюк Г.С. Активність карбоксипептидаз у тканинах новоутворень тіла матки // Вісник Одеського національного університету імені І.І. Мечникова - 2004. - Т. 9, №1.- С.25 - 33. (Дисертантка провела експеримент щодо визначення активності екзопептидаз тканин тіла матки онкологічно хворих жінок).

7. Вовчук І.Л., Чернадчук С.С. Активность тканевых катепсин L-подобных протеиназ у женщин с онкопатологией тела матки // Укр. біохімічний журнал - 2004. - Т. 76. - № 2, С. 124 - 127. (Дисертантка брала участь у пошуку, обробці одержаної інформації та провела експеримент щодо визначення активності ферменту).

8. Чернадчук С.С., Вовчук І.Л. Активність металопротеїнази матриксу (МПМ-2) у тканинах новоутворень ендометрія та міометрія // Вісник Одеського національного університету імені І.І. Мечникова - 2005. - Т. 10, № 5.- С.58 - 63. (Дисертантка провела експеримент та зробила добір літературних джерел за темою статті).

9. Вовчук И.Л., Дизик А.Е., Ануфриев М.Г., Чернадчук С.С., Бендерская Н.В., Мотрук Н.В. Пептидгидролазная активность сыворотки крови женщин со II стадией злокачественного поражения эндометрия // Вопр. мед. химии. - 2000. - Т. 46, № 5. - С. 510-511. (Дисертанткою здійснені підбір умов та виконання експерименту щодо визначення активності трипсиноподібних- та катепсиноподібних ферментів).

10. Вовчук И.Л., Бендерская Н.В., Чернадчук С.С., Мотрук Н.В. Тканевые протеиназы опухолей яичника и матки // Ученые записки Таврического национального университета. Серия "Биология" - 2001. - Т. 14 (32), № 2. - С.17-20. (Дисертантка брала участь у пошуку, обробці одержаної інформації, обробка та статистичний аналіз результатів дослідження).

11. Vovchuk I., Anufriev M., Chernadchuk S., Benderskaya N., Motruk. N. Proteinase-inhibiting system of blood serum and endometrium of postreproductive age women benign and pernicious tumor // FEBS Annual Abstracts. - Lisbon, 2001. - P. 153.

12. Чернадчук С.С., Бендерская Н.В., Вовчук И.Л. Содержание фенолстероидов в опухолевой ткани у женщин с патологией эндометрия // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино, 2002. - Т. 1. - С. 158.

13. Бендерская Н.В., Чернадчук С.С., Вовчук И.Л. Состояние гормональной и протеиназно-ингибиторной систем в перерожденной ткани яичников // 6-я Пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века". - Пущино, 2002. - Т. 1. - С. 53.

14. Вовчук І.Л., Чернадчук С.С. Аналіз факторів ризику виникнення раку ендометрію у жінок в Одеській області // Матеріали Всеукраїнської науково-практичної конференції "Довкілля і здоровя". - Тернопіль, 2003. - С. 29. (Дисертанткою розроблена анкета опитування хворих жінок на рак тіла матки та здійснено статистичний аналіз факторів ризику виникнення раку ендометрію).

АНОТАЦІЯ

Чернадчук С.С. Активність протеолітичних ферментів в тканинах тіла матки жінок без новоутворень та за умов онкозахворювань.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна. Харків, 2005.

У дисертації досліджується активність ферментів протеолітичної системи, які приймають участь у розвитку новоутворень в органах жіночої репродуктивної системи. Встановлені вікові зміни активності ферментів протеолітичної системи органів репродуктивної системи досліджуваних жінок, а також виявлено збільшення активності ключових ферментів: карбоксипептидаз А і В та металопротеїнази-2 за розвитком та прогресією пухлинної тканини гормоночутливого органу - тіла матки, що пов`язано з індукцією їх біосинтезу як класичними естрогенами, так і некласичними фенолстероїдами, які є важливими регуляторами біосинтезу білка.

Показана різноманітна роль протеолітичних ферментів за умов розвитку доброякісного та злоякісного процесів, що може бути використано в прогностичних та диференціальних цілях при розвитку онкопроцесу.

Ключові слова: протеази, металопротеїназа-2, карбоксипептидаза, естрогени, аденокарцинома, тіло матки.

Чернадчук С.С. Активность протеолитических ферментов в тканях тела матки женщин без новообразований и при онкопатологии. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина. Харьков, 2005.

Диссертация посвящена исследованию активности ферментов протеолитической системы, принимающих участие в развитии новообразований в женской половой системе.

При сравнительном анализе активности протеолитических ферментов в тканях тела матки без новообразований установлен наибольший вклад металлопротеиназы - 2 матрикса и карбоксипептидаз А и В. Значительно меньшей активностью обладали трипсиноподобные энзимы и катепсин L-, B-, D-подобные протеазы.

Установлены возрастные особенности переключения отдельных звеньев системы протеолиза, связанные с физиологическим состоянием матки. Так, в частности, поздний репродуктивный (41-50 лет) и менопаузальный (51-60 лет) периоды жизни женщин сопровождались значительным повышением активности исследуемых эндопептидаз (трипсиноподобные энзимы, катепсин L-, B-, D-подобные протеазы). В климактерическом периоде (61-70 лет) наблюдалось достоверное снижение активности данных ферментов. При исследовании активности металлопротеиназы-2 матрикса (ММП-2) и экзопептидаз - карбоксипептидаз А, В, в тканях без новообразований нами была зарегистрирована наивысшая активность этих ферментов у женщин в климактерическом периоде (61-70 лет).

Исследования активности ММП-2 при различных гистоморфологических диагнозах доброкачественных новообразований эндометрия показали, что по мере развития патологического процесса активность ММП-2 увеличивалась при железисто-кистозной гиперплазии на фоне аденоматозного эндометрия, что, вероятно, свидетельствует о возможном ее участии в инициации процесса канцерогенеза.

При исследовании аденокарциномы эндометрия, активность матричной металлопротеиназы достоверно увеличивалась в 7,2 - 9,4 раза в тканях аденокарциномы, по сравнению с эндометрием без новообразований и была прямопропорциональна степени дифференциации клеток злокачественной опухоли.

При доброкачественных новообразованиях миометрия активность ММП-2 увеличивалась по мере развития процесса малигнизации и возрастания пролиферативного потенциала опухолевых клеток (в сравнении с тканями без новообразований).

Исследования активности карбоксипептидаз А и В в образцах доброкачественных новообразований эндометрия и миометрия показали, что по отношению к тканям без новообразований, как и в случае исследований активности ММП-2, нами было зарегистрировано увеличение активности карбоксипептидазы А при наличии одновременно гиперпластических и неопластических процессов.

Изучение активности карбоксипептидаз А и В при злокачественном процессе в теле матки, показало снижение исследуемого показателя по отношению к показателям ткани с доброкачественными новообразованиями. Активность этих ферментов была прямопропорциональна степени дифференциации клеток злокачественной опухоли.

Установлено значительное повышение содержания эстрогенов как при злокачественных, так и при доброкачественных новообразованиях в теле матки по отношению к тканям без новообразований.

Ключевые слова: протеазы, металлопротеиназа-2, карбоксипептидаза, эстрогены, аденокарцинома, тело матки.

Chernadchuk S.S. Activity of proteolytic enzymes in the womb body cancer deceases. - Manuscript.

The thesis for a degree of candidate of science in biology by speciality - 03.00.04 - biochemistry - V.N. Karazin Kharkov National University, Kharkov, 2005.

The thesis is devoted to the study of the proteolytic system enzymes activity, which participate in the tumor process in female reproductive system organs. Age dynamics of proteolytic system enzymes activity in reproductive system of the examined women has been established. It has been found that activity of the key proteases increased: activities of carboxypeptidases A and B and metalproteinase-2 grew according to the development and progress of the tumor tissue in womb. It is connected with the induction of their biosynthesis with the classic estrogens as well as non-classis phenolsteroids, which are important regulators of protein biosynthesis.

Diverse role of proteolityc enzymes under the development of tumors of different nature has been shown, what may be used for the prognostic and differential aims during onco-process development.

Key words proteases, metalproteinase-2, carboxypeptidase, estrogens, adenocarcinoma, womb body.

Размещено на Allbest.ru

...