Биотехнология производства и получения вакцин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

на тему: Биотехнология получения и производства вакцин

План

Введение

1. Живые вакцины

1.1 Принципы аттенуации бактерий и вирусов

2. Инактивированные корпускулярные вакцины

3. Химические вакцины

4. Анатоксины и ассоциированные вакцины

5. Новые принципы конструирования вакцин

5.1 Вакцины искусственных антигенов

5.2 Субклеточные (рибосомальные) вакцины

5.3 Субъединичные вирусные вакцины

5.4 Генно-инженерные вакцины

Введение

Развитие иммунной биотехнологии было вызвано необходимостью получения большого количества биопрепаратов для профилактики, диагностики и лечения как инфекционных, так и инвазионных заболеваний. Используя достижения иммунологии, микробиологии, технологии, генной инженерии, современная ветеринарно-медицинская биопромышленность получает и производит широкий спектр биопрепаратов, включая вакцины, диагностикумы, микробы-антагонисты (пробиотики), антибиотики, иммунные сыворотки и их производные.

. Удельный вес вакцинации животных в системе противоэпизоотологических мероприятий определяется многими факторами, в том числе и наличием эффективных и безвредных биопрепаратов. Ветеринарная статистика показывает, что имеется тенденция нарастания масштабов применения специфических средств защиты животных при многих инфекционных болезнях. Поэтому развитие современной биопромышленности иммунных препаратов вызвано практической необходимостью получения большого количества (по объему и перечню) иммунопрепаратов для профилактики, диагностики и лечения животных. Со времен Дженера и Пастера, когда были намечены принципиальные способы получения вакцин и их применения, иммунопрофилактика прошла большой путь и выросла в специальный раздел иммунологии и биотехнологии, без которого невозможно решение современных задач промышленного изготовления и применения биопрепаратов. В настоящее время в арсенале иммунопрофилактики находится целый ряд вакцин, различающихся по виду и характеру технологии производства, способу применения и эффективности, а именно: живые, инактивированные, корпускулярные, химические и анатоксины; по числу антигенов - моно- и ассоциированные вакцины. Большинство из названных вакцин по-прежнему получают апробированными классическими способами, и лишь часть из них конструируют по новым, нетрадиционным принципам - это вакцины искусственных антигенов, субклеточные (рибосомальные), субъединичные и генно-инженерные вакцины. При приготовлении вакцин производство их делится на несколько технологических этапов, включая накопление биомассы организмов или продуктов их жизнедеятельности, концентрацию и очистку антигенов, в отдельных случаях их инактивацию, добавление сорбирующих и адъювантных субстанций, лиофилизацию, расфасовку и т.д. Биотехнологические особенности приготовления каждого типа вакцин будут представлены в соответствующих разделах лекции. Что же касается обеспечения выпуска безопасных, стандартных и эффективных в антигеном и иммуногенном отношении вакцин, то во всех случаях применяется универсальная принципиальная схема получения, апробации и внедрения в производственную практику новых вакцин. Она включает следующие этапы: 1. Получение автором вакцинного (аттенуированного) или производственного (вирулентного) штамма; 2. Авторское изготовление вакцины в лабораторных условиях и экспериментальное изучение стерильности, токсичности, безвредности, реактогенности и иммуногенности in vitro и на животных; 3. Экспериментально-производственное изготовление опытной серии препарата и оценка безвредности антигенных и иммуногенных свойств в лабораторных условиях и в ограниченном эпизоотологическом опыте в условиях производства; 4. Государственное комиссионное испытание нового биопрепарата с целью определения безвредности, реактогенности, иммуногенности и эпизоотологической эффективности в широком производственном опыте. Утверждение нормативных документов (технических условий) по изготовлению и контролю вакцин и наставления по ее применению.

1. Живые вакцины

Живые вакцины - иммунопрепараты, содержащие наследственно измененные формы возбудителей инфекционных болезней (вакцинные штаммы), которые потеряли вирулентные свойства, но сохранили способность индуцировать выработку иммунитета. Живые вакцины, как правило, готовят из аттенуированных (слабовирулентных) штаммов патогенных микробов, не способных вызывать заболевание, но сохранивших свойство размножаться в организме прививаемого животного и таким образом вызывать вакцинальную реакцию - доброкачественный вакцинальный процесс в виде местного специфического воспаления или общей бессимптомной инфекции. Такая реакция в обоих случаях при локальном или общем воздействии должна вызвать специфическую перестройку иммунореактивности организма и формирование иммунитета. Вакцинные штаммы, предлагаемые для производства живых вакцин, должны удовлетворять следующим требованиям: 1. Относиться к авирулентным или слабовирулентным штаммам, независимо от способа их получения. Эти свойства должны быть достаточно прочными при производстве и использовании вакцины. Следовательно, живая вакцина должна быть безвредной, что, в свою очередь, зависит от степени вирулентности и генетической стабильности вакцинного штамма, а также от общего иммунологического статуса прививаемых животных; 2. Обладать высокой антигенностью и иммуногенностью. Для живых вакцин критерием иммуногенности является ее способность вызывать образование напряженного иммунитета не менее чем у 70% однократно вакцинированных животных; 3. Способность размножаться в определенных органах, а также кратковременная персистенция в организме привитого животного; 4. Генетическая стабильность фенотипических свойств, в особенности низкой вирулентности и высокой антигенности, даже при быстро следующих друг за другом пассажах на естественно восприимчивых видах животных; 5. Наличие генетических маркеров, позволяющих идентифицировать их от эпизоотических (полевых) штаммов возбудителей (более двух и независимых друг от друга); 6. Отсутствие инфекционности (контагиозности) в случае выделения вакцинного штамма из организма привитого животного. Безвредность для других видов животных; 7. Стабильность при хранении и большая широта в дозировании - между минимальной и максимальной иммуногенными дозами. Прививочную (оптимальную) дозу вакцины выражает количество живых микроорганизмов, содержащихся в единице объема. Объем прививочной дозы должен быть не очень большим и не очень малым, чтобы обеспечить удобство введения препарата животному и точность дозирования. Вакцинные штаммы вирусов должны иметь определенные титры активности (инфекционности) в конкретной биологической системе (макроорганизмах, эмбрионах птиц, культурах клеток и проч.). Для определения иммуногенности и степени напряженности иммунитета у вакцинированных животных используют тщательно изученные, со стабильными свойствами контрольные (вирулентные) штаммы соответствующих возбудителей, против которых применяют живые и инактивированные вакцины. Вакцинные штаммы, отвечающие вышеперечисленным требованиям, больше уже не являются возбудителями болезней. За сохранение таких штаммов и поддержание их свойств несут ответственность соответствующие государственные учреждения - ВГНИИК ветпрепаратов. Аттенуированные микроорганизмы с высокой остаточной вирулентностью и инфекционной способностью, не соответствующие вышеназванным критериям вакцинных штаммов, являются «псевдовакцинными», и для них «прививочное сродство» весьма условно.

1.1 Принципы аттенуации бактерий и вирусов

Термин аттенуация происходит от латинского «attenuatio» - «уменьшение» и означает искусственное стойкое ослабление, уменьшение вирулентности возбудителей инфекционных болезней. Явление аттенуации впервые открыто в 1880 году Л.Пастером. Аттенуация вирусов и бактерий широко используется при приготовлении живых вакцин, а говоря точнее - при селекции штаммов, предназначенных для изготовления живых вакцин. Аттенуацию микроорганизмов осуществляют различными методами, основанными на адаптации возбудителя к организму невосприимчивых или мало восприимчивых в естественных условиях животных или же на приспособлении микроорганизма к неблагоприятным условиям культивирования, при которых он подвергается воздействию химических, физических, биологических и других факторов. При любом методе аттенуации снижается вирулентность микроорганизма для естественно восприимчивых к нему животных, и это вновь приобретенное свойство возбудителя должно быть наследственно закреплено. Примерами вакцинных штаммов, которые аттенуированы путем воздействия на микроорганизмы физических или химических факторов могут служить: - сибиреязвенные штаммы, вирулентность которых Пастер и Ценковский ослабляли путем выращивания культуры возбудителя при высокой температуре (42,5°С); - бескапсульные штаммы сибиреязвенных вакцин СТИ (автор штамма Н.Н.Гинсбург) или ГНКИ (С.Г.Колесов) были получены направленным воздействием условий культивирования и последующей селекцией штаммов; штамм для вакцин СТИ - путем посева вирулентной культуры на чашках со свернувшейся нормальной лошадиной сывороткой, в результате чего был получен бескапсульный авирулентный иммуногенный мутант «СТИ-1»; штамм для вакцины ГНКИ - путем чередующихся пересевов на свернувшуюся нормальную лошадиную сыворотку и агар, не содержащий пептона, в результате чего было получен слабовирулентный бескапсульный мутант «Щуя-15»; - французские ученые А.Кальмет (Calmette) и К.Герен (Guerin) ослабили вирулентность туберкулезной палочки путем длительного (230 пассажей в течение 18 лет) культивирования на картофеле с желчью, в результате чего получили авирулентный вакцинный штамм БЦЖ (BCG); - вакцинный штамм Br. abortus получили американские ученые Д.Бек и У.Э.Коттон путем многолетнего культивирования вирулентного штамма на картофеле. Вакцинные штаммы из вирусов получают, как правило, длительным пассированием их в организме одного и того же вида животных, не являющихся естественными хозяином данного вируса. При этом вирулентность вируса для другого вида животных усиливается, а для хозяина - ослабляется и становится в достаточной степени постоянной и низкой, что дает возможность использовать данный штамм в качестве вакцинного. Так, Л.Пастер антирабическую вакцину получил путем многократного пассирования вируса уличного бешенства через мозг кролика, в результате чего резко возросла вирулентность вируса для кролика и утратилась вирулентность для других видов животных, а также для человека. Английские ученые С.Айер и Н.Лобсон путем последовательных пассажей на куриных эмбрионах получили аттенуированный штамм вируса псевдочумы птиц (Ньюкасловский вирус - штамм «Н»), из которого готовили живую вакцины против этой болезни. Хадсон добился значительного ослабления вирулентного вируса чумы свиней путем пассажей его через организмы кроликов, этот слабовирулентный штамм используют в качестве живой вирусной вакцины. Аналогичным образом ослабили вирус чумы свиней и американские исследователи Х.Капровский и Дж.Бейкер. Метод пассирования микроорганизмов через виды, не являющиеся естественными хозяевами возбудителя, применим и для бактерий. Так, Конев культуру возбудителя рожи свиней ослаблял путем пассирования его через организм кроликов с последующей проверкой ее вирулентности на голубях. Казанский ветеринарный институт предложил в качестве вакцинного штамма Br. melitensis №89, который аттенуировали путем 25-кратного пассажа через организм куриного эмбриона. Вспоминая материал предыдущих лекций, мы можем сказать, что аттенуацию можно вызвать воздействием бактериофага, антибиотиков, лучистой энергии. Аттенуированные штаммы можно получить селекцией диссоциирующих культур. Возможна естественная аттенуация возбудителей инфекционных болезней в природе и лабораторных условиях при хранении коллекции микроорганизмов. На все штаммы микроорганизмов, применимых для изготовления и контроля биопрепаратов (вакцин, анатоксинов, диагностикумов), составляют подробные паспорта. В паспортах указывают лимиты вирулентности, за пределами которых эти штаммы для изготовления указанных препаратом непригодны; сельскохозяйственных, промысловых и лабораторных животных, чувствительных к ним в естественных условиях; основные пути и методы заражения этих животных; продолжительность инкубационного периода, а также степень опасности для человека; дают подробную характеристику серологических свойств штаммов с указанием времени образования специфических антител у вакцинированных животных и титров их в РСК, РДСК, РП, РДП в агаровом геле, РА, РТГА (РЗГА), РН, РНГА и др. при постанове как микро-, так и макрометодами. Для определения титров антигенов необходимо иметь стандартные специфические сыворотки, методики изготовления антигенов и методики постановки серологических реакций и их оценки (учета). Живые вакцины считаются одними из наиболее эффективных прививочных препаратов, что обусловлено высокой приживаемостью вакцинных штаммов и более полным сохранением в них набора протективных антигенов. Иммунизация живыми вакцинами несложна и в большинстве случаев однократна. Однако живые вакцины могут вызвать поствакцинальные осложнения, их трудно стандартизировать и сохранять.

2. Инактивированные корпускулярные вакцины

Инактивированные корпускулярные вакцины, в отличие от живых, получают из производственных, предварительно отселекционированных, или свежевыделенных вирулентных и иммуногенных штаммов возбудителей. Государственная служба контроля ветеринарных препаратов (ВГНИИК ветпрепаратов) предъявляет определенные требования к штаммам микроорганизмов, которые могут быть использованы для изготовления средств специфической иммунопрофилактики, включая инактивированные корпускулярные вакцины. Такие штаммы называют производственными. Наряду с ними в таких учреждениях биопромышленности имеются такие же штаммы микроорганизмов, используемые только для заражения подопытных животных при контроле активности вакцин и иммунных сывороток. Такие штаммы называют контрольными. Производственные и контрольные штаммы микроорганизмов должны быть классифицированы, т.е. должна быть установлена их видовая принадлежность, клонирование, т.е. они должны представлять собой однородную популяцию, происходящую из одной клетки или вируссодержащей бляшки, с характерными для нее генетически закрепленными признаками: морфологическими (размер, форма, пигментация колонии; размер и форма клеток или вирионов; наличие или отсутствие жгутиков, капсул, спор); биохимическими (приобретение или утрата клетками способности использовать определенные аминокислоты, фактору роста, способность утилизировать углеводы); антигенными (утрата тех или иных антигенов или их наличие); другие признаки (например, степень чувствительности к физическим, химическим факторам воздействия на бактериальную клетку или вирион). Общебиологической закономерностью считаются появление диссоциантов в потомстве даже одной микробной клетки или вириона. Поэтому в популяции производственных и контрольных штаммов микроорганизмов допускают присутствие диссоциированных форм микроорганизмов в количестве, не превышающем 5% от общего числа клеток (вирионов), при условии, если они не влияют отрицательно на фенотипические свойства штамма. Штаммы, предназначенные для изготовления инактивированных вакцин, анатоксинов или диагностикумов, должны представлять собой культуру типичного представителя определенного рода и вида микроорганизмов, обладать четко очерченным набором свойства, позволяющих отнести этот штамм в этому роду и виду. В живом состоянии эти штаммы должны сохранять высокую вирулентность (меру патогенности). Вирулентность определяют на в каждом случае конкретных восприимчивых крупных и лабораторных животных, на развивающихся эмбрионах птиц или на культурах клеток. Вирулентность выражают ЛД50, ИД50, ТЦД50. Производственные штаммы, используемые для приготовления инактивированных вакцин, анатоксинов и диагностикумов, по антигенности и другим свойствам должны быть идентичными большинству культур, циркулирующих в естественных условиях и вызывающих инфекционные заболевания (эпизоотические штаммы). Кроме того, такие штаммы микроорганизмов должны обладать высокими иммуногенными свойствами, т.е. вызывать состояние невосприимчивости к заражению живыми вирулентными культурами соответствующего вида или серологического варианта у соответствующих сельскохозяйственных и лабораторных животных. Наиболее достоверные сведения об иммуногенных свойствах штамма получают при постановке опытов по прямому заражению предварительно вакцинированных этим штаммом лабораторных животных или естественно восприимчивых сельскохозяйственных и домашних животных. Перечисленные нами требования должны быть общими для всех производственных и контрольных штаммов, независимо от того, какой препарат готовится на их основе. Кроме этих основных требований имеются дополнительные, предъявляемые штаммам, используемым при изготовлении живых и инактивированных вакцин. В зависимости от методов инактивации производственных штаммов микроорганизмов различают: гретые вакцины, полученные прогреванием суточной бульонной культуры микробов при температуре 56-60° в течение 0,5-2,0 часов; анавакцины, полученные при воздействии на культуру формалином (0,3-0,5%) и теплом (39-40°С) в течение 28-30 суток. Кроме того, в зависимости от применяемого химического вещества, способного вызвать инактивацию клеток, бывают спиртовые, ацетоновые, мертиолятовые, хлороформенные, карболовые вакцины. Для получения инактивированных (убитых) вакцин необходимо сохранить антигенные свойства исходной культуры, что требует сложных питательных сред и щадящих способов инактивации микробов. Убитые корпускулярные вакцины менее эффективны по сравнению с живыми, для достижения напряженного иммунитета их нужно вводить в организм многократно. Это на длительное время продлевает иммунизацию, что особенно нежелательно в условиях неблагоприятной эпизоотической обстановки. Наличие у инактивированных вакцин большого количества балластных веществ является причиной аллергических и других побочных реакций и отклонений при их введение.

3. Химические вакцины

Химические вакцины готовят из молекулярных антигенов, извлеченных из микробной клетки тем или иным способом (чаще с помощью химических средств или ультразвука). Поэтому их еще и называют молекулярными вакцинами. К ним относят такие вакцины, полученные из растворимых дериватов микробной клетки, например, токсинов, но описывают как анатоксины. Химические (молекулярные) вакцины могут быть получены как методом биосинтеза, так и химическим синезом. До сих пор в практике используют, начиная с 40-гг. нашего века, лишь биосинтетический метод. Однако эксперименты последних лет показывают возможность в ближайшем будущем на практике использовать и химически синтезированные вакцины. Несомненно, что современные химические вакцины, полученные из очищенных антигенов, по иммуногенности все же уступают живым вакцинам. Но в то же время они обладают неоценимыми преимуществами: уменьшена опасность поствакцинальных осложнений, они менее реактогенны, более стандартны, имеется возможность концентрировать антигены в небольшие объемы, адсорбировать их на различных веществах, применять адъюванты и таким образом повышать антигенные свойства биопрепаратов. Более того, химические вакцины могут быть применены в ассоциированных препаратах, т.е. возможно конструирование многокомпонентных препаратов против многих возбудителей. Для создания химических вакцин необходимо, во-первых, расшифровать структуру микробной клетки, особенно специфичность антигенных структур. Из микробной клетки выделяют так называемые протективные антигены - это иммунологически активные вещества, имеющие различную химическую природу, способные при введении в организм обеспечивать формирование специфического иммунитета. Протективные антигены состоят из тех структурных элементов, которые обеспечивают патогенность микроорганизма, но в то же время определяют антигенность и специфическую иммуногенность. Они находятся или на поверхности микробной клетки, или на ЦПМ, или в клеточной стенке, и также могут быть внеклеточными продуктами жизнедеятельности микробных клеток. С химической точки зрения протективные антигены - это макромолекулы. Они являются высокомолекулярными полимерами - гликопротеидами, белково-полисахаридно-липидными комплексами. У всех микроорганизмов - бактерий, вирусов, риккетсий - природа протеиновых антигенов общая. Известно, что антигенность вещества в значительной степени обусловлена его макромолекулярностью - она, в свою очередь, зависит от молекулярной массы антигена. При конструировании химических вакцин имеется возможность укрупнения молекул антигена путем агрегации, образования ковалентных химических связей. Считается общепризнанным, что полимеризация антигена является одним из практических путей повышения его иммуногенности. Получение химической вакцины биосинтетическим путем включает: 1. подбор соответствующего микроорганизма, максимально продуцирующего протективный антиген; 2. выбор питательной среды, обеспечивающей прирост биомассы и выход протективного антигена. Самыми приемлемыми являются синтетические и полусинтетические среды (отсутствие балластных веществ); 3. отработку условий культивирования, включая глубинное, в биореакторах большой скорости; 4. отработку методов промышленного извлечения антигена из биомассы и его очистки, позволяющие сохранить первоначальную антигенную структуру препарата и обеспечить достаточную степень чистоты препарата при удовлетворительном содержании антигена (экстрагирование биомассы цельных и лизированных клеток: ферментативный лизис, длительное замораживание и быстрое оттаивание, озвучивание, механическая обработка, щелочной лизис). Очистку антигена производят в зависимости от свойств антигена и применяют изоэлектрическое осаждение кислотами и щелочами, высаливание нейтральными солями, осаждение спиртов, сорбцию и элюцию, ультрафильтрацию, хроматографические способы и т.д. Антигены выделяют как из живой, как и из инактивированной культуры. Для инактивации используют те же физические и химические методы, которые применяют для получения убитых вакцин (формальдегид, фенол, глутаральдегид, солянокислый гидроксиламин, перекись водорода, азид натрия и др.). Главным принципом получения антигена является применение щадящих физико-химических методов, возможное сокращение числа этапов в технологической цепи и повышение иммуногенности препарата. Принципиально важным вопросом является обеспечение безвредности вакцины, ее стерильности (фильтрация, 0,3%-й формалин при 40°С в течение 5 суток, в-пропиолактон и др.). Для сорбции антигенов чаще используют гель гидроокиси алюминия, который одновременно обладает и адьювантным действием. Сорбированные вакцины создают в организме депо, из которого постепенно всасываются антигены, обеспечивающие пролонгированное действие препарата. Это дает возможность уменьшить кратность вакцинации при сохранении высокого профилактического эффекта.

4. Анатоксины и ассоциированные вакцины

К химическим вакцинам относятся и анатоксины - препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов. Они полностью лишены токсических свойств, но сохраняют антигенное и иммуногенное свойства. Метод получения анатоксинов был заработан и предложен французским ученым Рамоном в 1923 г. Первым этапом получения анатоксина является выращивание токсигенных культур бактерий, вызывающих у пораженных животных токсинемические инфекции (столбняк, ботулизм, анаэробные раковые инфекции, стафилококкоз и др.). Микроорганизмы культивируют в жидких питательных средах в определенном режиме для максимального накопления экзотоксина, затем путем экзотоксин отделяют от бактерий и обезвреживают (инактивируют). Для получения анатоксина (по Рамону) на токсин комбинированно воздействуют формалином (0,3-0,5%) и температурой (39-40°С) в течение 28-30 суток. Эффективность и безвредность анатоксина зависят от степени его очистки. Наличие в препарате бактериальных протеинов, белков питательной среды увеличивают его реактогенность и сенсибилизирующие свойства. Очищенные анатоксины в значительной степени лишены указанных отрицательных свойств. Кроме того, их можно концентрировать в небольшом объеме жидкости и адсорбировать. В настоящее время в качестве детоксицирующего средства, наряду с формальдегидом, широко используют в-пропиолактон. Предложена также обработка токсина протеолитическими ферментами - пепсином, трипсином, пролазой и папаином с последующей фильтрацией на колонках с сефадексом Y-100 и Y-200. Эффективность анатоксинов зависит не только от качества антигена, но также от формы препарата и метода применения. Анатоксины могут быть приготовлены в виде жидких, сухих, эмульгированных и сорбированных препаратов. Ассоциированные вакцины - препараты, в состав которых входят несколько синергических, сбалансированных между собою антигенов. Преимущество их перед моновакцинами - возможность обеспечить одновременную выработку иммунитета против нескольких инфекций при введении в организм одного комплексного препарата.

Условием конструирования и производства ассоциированных вакцин является эпизоотологические показатели для одновременной иммунизации против соответствующих болезней, возможность устранения конкурентного действия антигенов в ассоциации, данные об отсутствии повышенной реактогенности и сенсибилизирующей активности сложной вакцины по сравнению с монопрепаратом. бактерия вирус вакцина

Применение ассоциированных вакцин облегчает организацию иммунопрофилактики, сокращает число инъекций и в ряде случаев повышает их иммуногенность и эпизоотологическую эффективность. В настоящее время выпускают следующие ассоциированные вакцины.

5. Новые принципы конструирования вакцин

Начиная с 70-х гг. нашего века появились новые тенденции в области конструирования вакцин. Наряду с совершенствованием классических технологий изготовления традиционных (старых) вакцин, усиленно развивалось создание так называемых искусственных вакцин, или вакцин искусственных антигенов. В это же время были получены еще два принципиально новых типа вакцин - из отдельных структур микроорганизмов, или субклеточные вакцины из бактерий и субъединичные вирусные вакцины а также были сконструированы генно-инженерные вакцины.

5.1 Вакцины искусственных антигенов

Создание вакцин искусственных антигенов предусматривает синтез налогов природных антигенных детерминант, ответственных за индукцию протективного иммунитета против определенного микроорганизма. Иммуногенные свойства искусственных антигенных детерминант определяют два фактора: расположение на поверхности молекулы и их конформационная структура. Практически процесс получения искусственных антигенов складывается из 3-х звеньев: 1) выделение биологически активного антигена; 2) расшифровка его молекулярной структуры; 3) искусственный ресинтез химическим или генно-инженерным путем. Этот путь перспективен для создания вакцин против возбудителей, антигены которых обладают иммуногенными и протективными свойствами. Существует два типа современных искусственных вакцин: I. Из искусственных иммунизирующих молекул, синтезированных по принципу природных аналогов: · Конъюгированные антигены (гаптен-носитель); · Синтетические белки; · Синтетические полиаминокислотные антигены; · Конъюгенты синтетических полиаминокислотных антигенов с синтетическими адъювантами; · Синтетические полисахариды. II. Из искусственных иммунизирующих молекул, не имеющих аналогов в природе: · искусственные комплексы или конъюгенты антигенных детерминант с синтетической неприродной молекулой с иммуномодулирующим действием. Принципиальная новизна современного этапа конструирования вакцин не только в том, что начато создание искусственных макромолекул, обладающих необходимыми антигенными детерминантами. Сейчас открыты гены иммунного ответа (Ir-гены), и доказано, что их действие проявляется на уровне T-системы лимфоцитов. Главное - это нахождение путей фенотипической коррекции контроля иммуногенеза. В результате может быть получен иммунный ответ и в том случае, если организм не реагирует на данный антиген. Поэтому наиболее перспективным путем в области создания новых вакцин признают конструирование таких микромолекулярных комплексом, в состав которых входят как необходимые антигенные детерминанты, так и структура-носитель, обеспечивающая фенотипическую коррекцию. Другими словами, иммуногенность вакцин можно увеличить, используя специальные адъюванты. В настоящее время созданы синтетические низкомолекулярные соединения, являющиеся химическими аналогами бактериальных структур, которые обладают иммунорегуляторной активностью. Первым из этого типа соединений был синтезирован мурамилдипептид (МДП). Известно, что основу клеточной стенки бактерий образует муреин - сложное макромолекулярное соединение, обладающее выраженным иммуномодулирующим действием. МДП вызывает усиление гуморального ответа на введение вакцины. Это дает основание считать, что наиболее перспективными являются вакцины, представленные антигеном, связанным с синтетическим иммуномодулятором. В качестве носителя антигенной детерминанты, обладающего свойствами адъюванта, можно использовать такие неприродные полимерные объединения, как, например, поливинилпириды (класс синтетических полуэлектролитов). Они усиливают функцию Т-хелперов и способствуют взаимодействию В- и Т-лимфоцитов, увеличивая число антителобразующих клеток. К настоящему времени расшифровано действие и других адъювантов, в частности, адъюванта Фрейнда, липополисахарида (ЛПС), такие как и МПД, которые стимулируют активность Т-лимфоцитов; БЦЖ и ЛПС - активируют макрофаги. На основе конъюгации синтетических антигенных детерминант (бактериальных и вирусных) с синтетическими носителями (МДП) созданы первые полностью синтетические вакцины против дифтерийного токсина, стрептококков, вируса гриппа, вируса гепатита В. Получены синтетические антигены вируса ящура.

5.2 Субклеточные (рибосомальные) вакцины

В последние годы началась разработка вакцинных препаратов нового типа - препаратов, стоящих из рибосом соответствующего возбудителя. Эти вакцины получили название рибосомальных или субклеточных. Они имеют некоторые преимущества перед живыми вакцинами или изолированными антигенами микробной клетки. Открытие иммуногенности бактериальных рибосом было сделано в 1965 г. Исследуя протективную активность субклеточных фракций микобактерий, Доуманс и др. выделили рибосомы, содержащие р-РНК и экспериментально доказали их иммуногенность. Эти результаты послужили толчком для продолжения исследования и разработки рибосомальных вакцин в ряде стран (вакцины против сальмонеллеза, эшерихий, стрептококков, гемофилл, франциселл, бруцелл, лептоспир и др.). Для дезинтеграции бактериальной клетки применяются следующие методики: жидкостный пресс, механическое разрушение, обработка ультразвуком. Рибосомы выделяются и очищаются при разных режимах дифференциального ультрацентрифугирования или высаливания сернокислым аммонием. Применяется также обработка рибосом детергентами, полиэтиленгликолем. Преимуществами рибосомальных вакцин являются следующие их особенности: 1) бактериальные рибосомы не обладают токсичностью для животных и малореактогенны; 2) вакцины обладают более выраженной иммуногенностью по сравнению с корпускулярными вакцинами; 3) рибосомальные вакцины способны индуцировать перекрестный иммунитет к разным серотипам и серогруппам в пределах вида возбудителя. Механизм действия рибосомальные вакцин окончательно не расшифрован и в настоящее время ведутся исследования по обеспечению перечисленных преимуществ. По мнению исследователей, в рибосомальных вакцинах микобактерий протективный эффект оказывает бактериальная РНК, репродуцирующаяся в клетках с помощью обратно транскриптазы (сходство с РНК-вирусами). Таким образом, предлагается новая гипотеза возникновения резистентности к бактериям, независимой от антител и факторов клеточного иммунитета. Однако доказать подобное действие в других случаях не оказалось возможным. Наоборот, при других экспериментальных инфекциях защитный эффект рибосомальных препаратов имеет явно иммунологическую природу с участием как гуморальных, так и клеточных факторов иммунитета. Неэффективным оказалось также введение высокоочищенных препаратов РНК бактерий. Вторая гипотеза о механизме действия рибосомальных вакцин была сформулировала на основании данных, полученных при изучении вакцины на S. typhimurium, и согласно этой теории главным иммуногенным фактором является видоспецифический рибосомальный белок 30S. Существует и третье мнение. В составе рибосомальных препаратов часто обнаруживаются антитела клеточной оболочки бактерии - капсульные полисахариды, белки клеточной стенки и т.д. Можно предположить иммуногенное действие и этих «контаминирующих» агентов. Таким образом, вопрос о протективном факторе рибосомальных вакцин весьма противоречив и далек от решения. Неясно, выполняют ли рибосомы роль носителя, адсорбирующего молекулу антигена и изменяющего условия его контакта с иммунокомпетентными клетками, или они являются адъювантами. Наиболее вероятным представляются образование и совместное действие комплексов РНК-антиген. Их действие требует специальных, неизвестных пока условий. Иммунологическая специфичность определяется антигеном, а РНК участвует в представлении антигена иммунокомпетентным клеткам или оказывает действие на кооперацию клеток иммунитета. В настоящее время разработана рибосомальная вакцина против возбудителей пневмоний человека - Str. pneumoniae, H. influenzae, Kl. pneumoniae, Str. piogenes. В качестве адъюванта использован пептидогликан клебсиеллы. Приготовлена вакцина из шигелл Зонне.

5.3 Субъединичные вирусные вакцины

Живые и инактивированные вакцины во многих случаях обеспечивают надежную защиту организма животных. Однако они не лишены недостатков - у привитых могут возникать поствакцинальные осложнения, аллергические реакции и т.п. Поэтому была начата работа по усовершенствованию вирусных вакцин. Субъединичные вакцины - это дальнейший путь улучшения расщепленных вирусных вакцин. Для того,чтобы получить их, нужно иметь в очищенной форме антигены, необходимые для иммунизации. Поэтому производство субъединичных вакцин включено против тех возбудителей инфекций, у которых известна антигенная структура, определены протективные антигены и их можно отделить и сконцентрировать как субъединицы биопрепарата. В процессе формирования иммунитета к вирусам критически полными антигенами являются наружные белки. Именно этот факт испоьзовался как основа для создания субъединичных вакцин. Наиболее перспективной моделью для создания субъединичных вакцин являются так называемые оболочечные вирусы, имеющие липопротеидную мембрану. Субъединичные вакцины можнл отнести к 3-ему поколению инактивированных вирусных вакцин. Традиционными являются культуральные вакцины - 1е поколение. Современные вакцины характеризуются высокой степенью очистки и концентрации - 3е поколение. Типичным примером использования различных типов вакцин является вакцинация против гриппа человека. В наши дни используется несколько типов тнактивированных очищенных вакцин - субвирионных из полностью разрушенных вирионов (сплит-вирусные вакцины) и субвирионных субъединичных вакцин - с наивысшей степенью очистки от балластных веществ. Таким образом, субъединичные вакцины против гриппа и парагриппа животных должны содержать в качестве субъединиц гемагглютинин и нейрамидазу. Определены и выделены в чистом виде субъединицы возбудителей ящура, адено- и герпесвирусных инфекций , против которых также получены субъединичные вакцины. Но надо помнить, что вирусные субъединичные вакцины только тогда активны, если они индуцируют вируснейтрализующие антитела. Технологический процесс изготовления субъединичных вакцин состоит из следующих этапов:

1) получение вируса зараженных культур клеток или эмбрионов;

2) очистка вируса с помощью пластинчатого сепаратора или на колонке с сефадоксом;

3) микрофильтрация;

4) понцентрирование (примерно в 50 раз) на фильтрах;

5) дополнительная очистка ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы;

6) расщепление концентратов детергентами;

7) извлечение гликопротеинов вирусов путем ультрацентрифугирования или ультрафильтрации;

8) диализ;

9) стерилизующая фильтрация концентрата субъединиц;

10) стандартизация концентрата субъединиц;

11) контроль биопрепарата В настоящее время также разрабатываются и бактериально субъединичные вакцины, в которых в качестве протективных субъединиц используются очищенные Н- и О- антигены из клеточной стенки капсулы, ЦПМ, жгутиков, пили и т.д. Получены также вакцины против пневмококкоза, пастереллеза, колибактериоза и ряда других болезней. Все последователи отмечают биотехнологические сложности получения субъединичных вакцин и одновременно отмечают перспективность научного направления и большие возможности биопрепаратов этого типа.

5.4 Генно-инженерные вакцины

В 70-х гг. нашего века успехи генетической клеточной инженерии дали возможность разработать новую технологию получения противовирусных вакцин, получивших название генно-инженерных вакцин. Необходимость таких разработок диктовалась следующими причинами: 1) недостатком природных источников сырья/подходящих животных ; 2) невозможностью размножать вирус в классических объектах/культуры ткани и пр. Принцип создания генно-инженерных вакцин включает: а) выделение природных генов антигенов или их активных фрагментов; б) встройку этих генов в простые биологические объекты - бактерии, дрожжи; в) получение необходимого продукта в процессе культивирования биологического объекта - продуцента антигена. Геномы вирусов по сравнению с геномом клетки (прокариотической или эукариотической) ничтожно малы по размерам. Гены, кодирующие протективные белки, можно клонировать у ДНК -содержащих вирусов непосредственно, у РНК-содержащих вирусов - после обратной транскрипции их генома(для вирусов с непрерывным геномом) или даже отдельных генов ( у вирусов с фрагментированным геномом). На первом этапе развития новой биотехнологии ученые занимались преимущественно клонированием вирусных генов, кодирующих синтез белков, несущих главные антигенные детерминанты. Вскоре были получены рекомбинантные бактериальные плазмиды , несущие гены или геномы вирусов гепатита В, гриппа, полимиолита. Следующим этапом явилось получение антигена. Вопрос оказался сложным, ибо экспрессии вирусных генов в прокариотной системе была ничтожной. Это можно объяснить тем, что вирусы в ходе эволюции приспособились к паразитированию в организме человека. Однако со временем были получены экспрессии антигенов. И одним из наиболее типичных примеров, показывающих необходимость создания генно-инженерных вакцины, является гепатит В. Проблема заключается в том, что до сих пор не найдены чувствительные к вирусу культуры клеток или животных. Поэтому разработка генно-инженерного метода получения вакцин стала необходимостью. Метод заключается в том, что геном клонируют в клетках Е. coli с использованием плазмидных и фаговых векторов. Бактерии, несущие рекомбинантные плазмиды, продуцируют белки, специфически реагирующие с антителами против самого вируса. В 1982 г. в США была получена первая экспериментальная вакцина против гепатита В. Для продукции вирусспецифических белков (антигенов) используют и эукариотические клетки (дрожжи, животных). Интенсивно ведутся работы по созданию и других генно-инженерных вакцин, в частности против гриппа, герпеса, ящура, клещевого энцефалита и других вирусных инфекций. Новейшим подходом в создании вирусных вакцин является включение генов, отвечающих за синтез вирусных протеинов, в геном другого вируса. Таким образом создаются рекомбинантные вирусы, обеспечивающие комбинированный иммунитет.

Размещено на Allbest.ru