Патоморфологія міоепітеліальних карцином молочної залози

Размещено на http://allbest.ru

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Патоморфологія міоепітеліальних карцином молочної залози

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

міоепітеліальний карцинома молочний залоза

Актуальність теми. Рак молочної залози (РМЗ) - одна з найчастіших пухлин, і на неї припадає майже чверть всіх новоутворень у жінок. Серед злоякісних пухлин у жінок РМЗ займає перше місце. Практично у всіх країнах світу він є основною онкологічною патологією у жінок старше 40 років. Аналіз статистичних показників щодо України свідчить про невпинний ріст захворюваності на РМЗ. В СНД щорічно реєструються понад 50 тисяч нових випадків РМЗ, а смертність від даної патології займає перше місце (Д.Г. Заридзе, 2002; Г.В. Бондар та ін., 2005).

Поряд з проблемами ранньої діагностики РМЗ, актуальними у клінічній онкології є дослідження, спрямовані на пошук досконаліших, ефективніших методів лікування (С.А. Лялькін, 2005; К.О. Галахін та ін., 2005). Тактику формують з урахуванням стадії захворювання, віку, стану репродуктивної системи, гістоструктури пухлини, патогенетичної форми, супутньої патології, гормонального та імунного статусу (K. Heusinger et al., 2005). При цьому різні гістологічні типи РМЗ характеризуються специфічними клінічними особливостями та різним прогнозом.

Найчастішим гістологічним типом РМЗ є інвазивний протоковий рак з притаманними йому гістологічними варіантами й частим сполученням зі специфічними формами РМЗ. Велику різноманітну морфологічну групу РМЗ становлять особливі типи карцином, що рідко зустрічаються (Н.Н. Волченко, 2002).

Загальновідомо, що нормальну протокову і часточкову систему молочної залози (приблизно в однаковому співвідношенні) формують два типи епітеліальних клітин - внутрішній, або “секреторний” шар клітин (лактоцитів), оточений зовнішнім шаром, представленим, в свою чергу, міоепітеліальними клітинами (МЕК). При різних проліферативних ушкодженнях молочної залози злоякісна трансформація може спостерігається як в епітеліальному, так й в міоепітеліальному компонентах часточок та проток.

Участь МЕК в генезі доброякісних і злоякісних новоутворень було визнано відносно недавно. Нормальний міоепітелій багатьма авторами розглядається як необхідний паракриновий інгібітор клітинної проліферації епітеліальних клітин молочної залози в морфогенезі, інвазії та ангіогенезі, а, отже, прогресії пухлини (S.H. Barsky, N.J.Karlin, 2006).

Оскільки МЕК не завжди легко ідентифікувати при забарвленні гематоксиліном та еозином, застосовують імуногістохімічне типування. Більшість імуногістохімічних маркерів МЕК спрямовані на виявлення в цитоплазмі епітеліальних і гладком'язових антигенів. З огляду на змішаний епітеліальний та гладком'язовий фенотип MEК і необхідність відрізняти міоепітеліальний шар від епітеліального, більшість імуногістохімічних маркерів скеровані на виявлення гладком'язових антигенів. Вони включають антитіла проти S-100 протеїну (A.G. Bonadio et al., 2003), гладком'язового актину (SMA) (S. Moritani et al., 2002; A.G. Bonadio et al., 2003), кальпонину (M.P. Foschini et al., 2000), h-кальдесмону (N.P. Wang et al., 1997) і важкого ланцюга гладком'язового міозину (SMMHC) (M.P. Foschini et al., 2000). Найпоширенішими завдяки їхній специфічності і чутливості маркерами МЕК прийнято вважати моноклональні антитіла до гладком'язового актину (SMA) і p63.

Таким чином, оскільки окремі гістологічні типи РМЗ характеризуються специфічними клінічними особливостями та різним прогнозом, встановлення гістогенезу пухлин молочної залози має першорядне значення. Ширше застосування імуногістохімічних методів щодо рідкісних форм карцином молочної залози з нетиповою гістологічною картиною (наприклад, міоепітеліальних), імовірно підвищить число таких діагнозів, що призведе до більш адекватної терапії цих пухлин.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є фрагментом планової НДР Донецького державного медичного університету ім. М.Горького: “Комплексна терапія раку молочної залози на основі нових методів хірургічного, лікарського і гормонального лікування з використанням селективного внутрішнього артеріального впливу лікарських засобів. Клініко-морфологічне дослідження” (№ державної реєстрації 0104U010587, шифр: МК 05.04.19). Авторка брала безпосередню участь у виконанні морфологічного, в тому числі імуногістохімічного та морфометричного дослідження карцином молочної залози.

Мета дослідження - встановити основні структурні параметри міоепітеліальних карцином молочної залози різного ступеня катаплазії для оптимізації диференційного діагнозу та прогнозу.

Задачі дослідження:

1. Верифікувати з використанням імуногістохімічних методик морфологічні ознаки міоепітеліальних карцином молочної залози різного ступеня катаплазії.

2. Встановити кількісні структурні параметри міоепітеліальних карцином молочної залози різного ступеня катаплазії.

3. Провести порівняльний аналіз проліферативної активності і стану рецепторного апарата до стероїдних гормонів в міоепітеліальных карциномах молочної залози та інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання.

4. Встановити найбільш значимі комплексні морфологічні параметри міоепітеліальних карцином для їх розмежування з інвазивними карциномами без міоепітеліального диференціювання.

Об'єкт дослідження: - патоморфологія карцином молочної залози різного генезу і ступеня диференціювання.

Предмет дослідження: - структурні прояви та морфогенетичні аспекти міоепітеліальних карцином молочної залози.

Методи дослідження. Застосування оглядових гістологічних методик надало базисну інформацію. Подальше залучення селективних гістохімічних та імуногістохімічних (використання моноклональних антитіл (МАТ) до панцитокератинів, епітеліального мембранного антигену (EMA), віментину, актину, гладком'язового актину (SMA), S-100 протеїну, онкогену p63, CD 10, рецепторів естрогенів та прогестерону, білку p53 та Ki67) методів з автоматизованим комп'ютерним аналізом зображення тканин пухлин молочної залози й статистичною обробкою результатів дослідження уможливило отримання об'єктивних даних.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше наведена дефініція міоепітеліальних карцином, які розглядаються як новоутворення з питомим об'ємом >0,5 проліферуючих катаплазованих міоепітеліальних клітин, позитивно типованих при використанні імуногістохімічних маркерів МЕК.

Вперше показано, що перехід від аденоматозних і солідних структур до саркоматозних відображає пухлинну прогресію, наростання ступеня катаплазії й означає погіршення прогнозу: у високо- та помірнодиференційованих варіантах цих новоутворень переважають аденоматозні і солідні структури, а при прогресуванні, тобто поглибленні катаплазії (у низько- і недиференційованих варіантах пухлин) домінують структури, формально імітуючі мезенхімальні.

Аргументована необхідність при визначенні гістогенезу інвазивних карцином молочної залози імуногістохімічного типування з обов'язковим використанням не менше двох маркерів МЕК; а) антитіл до актину або гладком'язового актину (позитивна реакція з МЕК у 100% випадків); б) антитіл до цитокератинів та епітеліального мембранного антигену - для підтвердження епітеліальної природи пухлинних клітин.

Документовано, що основні морфометричні показники катаплазії і проліферативної активності пухлинних клітин міоепітеліальних карцином та інвазивних карцином без міоепітеліального диференціювання не мають достовірних розходжень (р>0,05) і не можуть бути використані для розмежування.

Пріоритетними є дані про те, що одним з несприятливих прогностичних чинників є відсутність експресії клітинами міоепітеліальних карцином молочної залози рецепторів до стероїдних гормонів - естрогенів та прогестерону (86,6%), а позитивна реакція у високодиференційованих міоепітеліальних карциномах (13,4%) зумовлена наявністю в них гібридних міосекреторних клітин.

Практичне значення отриманих результатів. Вперше встановлені основні гістологічні, гістохімічні, імуногістохімічні й морфометричні характеристики міоепітеліальних карцином можуть бути задіяні в практиці патологоанатомічних відділень та у спеціалізованих імуногістохімічних лабораторіях і вже використовуються автором в її фаховій діяльності для постановки об'єктивного діагнозу, а також для диференційної діагностики з інвазивними карциномами молочної залози без міоепітеліального диференціювання. Інформація також корисна для підрозділів онкологічних центрів як структурне підґрунтя для розробки нових методів лікування цих новоутворень. Отримані дані також доцільно використовувати під час післядипломної підготовки патологів й онкологів.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно виконані дослідження з комплексного якісного та кількісного гістологічного, гістохімічного, імуногістохімічного і морфомеричного вивчення біоптатів інвазивних карцином молочної залози. Нею ж здійснена клініко-морфологічна характеристика цих пухлин, визначено критерії морфологічної діагностики міоепітеліальних карцином молочної залози з використанням імуногістохімічного типування. Самостійно проведений порівняльний аналіз проліферативної активності і стану рецепторного апарату до стероїдних гормонів у міоепітеліальних карциномах молочної залози та інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання. Власноруч сформульовані мета і задачі дослідження, виконано кількісну та статистичну обробку результатів досліджень, написані і проілюстровані всі розділи дисертації, сформульовані її висновки.

В роботах, опублікованих у співавторстві, реалізовані наукові ідеї здобувача. Співавторами здійснювалася допомога в заборі матеріалу. Дисертантом не були використані результати та ідеї співавторів публікацій.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації повідомлені й обговорені на ХІ з'їзді онкологів України (Київ-Судак, 2006), науково-практичній конференції з міжнародною участю “Морфологічний стан тканин і органів у нормі та при моделюванні патологічних процесів” (Тернопіль, 2006), науково-практичній конференції “Современные аспекты диагностики и лечения патологии молочных желез” (Донецьк, 2005), засіданні Донецького обласного відділення асоціації патологів України (2006), засіданнях Донецького обласного відділення асоціації онкологів України (2005, 2006), на наукових семінарах відділу патоморфології ЦНДЛ при ДонДМУ ім. М.Горького (2004-2006) й засіданні РПК “Патологічна анатомія” МОЗ й АМН України (2005).

Публікації. Результати дисертації опубліковані як розділ монографії, у 9 статтях фахових наукових журналів, у матеріалах та тезах з'їзду і наукової конференції (дві роботи).

Структура та обсяг дисертації. Результати дисертації викладено українською мовою на 147 сторінках принтерного тексту (обсяг тексту основної частини 116 сторінок). Робота складається із вступу, огляду літератури, розділів “Матеріал та методи дослідження”, двох розділів за результатами власних досліджень, аналізу й узагальнення даних, висновків, списку використаних джерел, який містить 179 джерел вітчизняних та зарубіжних авторів (41 - кирилицею і 138 - латиною). Робота ілюстрована 10 таблицями, 41 рисунком (з 82 фотографіями, 8 графіками).

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріал і методи дослідження. Нами попередньо були вивчені матеріали 120 спостережень РМЗ пацієнток, госпіталізованих у Донецький обласний протипухлинний центр (ДОПЦ) для хірургічного лікування. Після ретельного клініко-анатомічного аналізу амбулаторних карт, історій хвороб, а також патоморфологічних заключень нами були вилучені із подальшого морфологічного дослідження ті випадки, де в анамнезі вже були оперативні втручання з нагоди РМЗ цієї або другої молочної залози, а також ті, де на момент госпіталізації в стаціонар і на етапах комплексного лікування до проведення біопсії або операції пацієнтки отримували хіміо- та променеву терапію.

Таким чином, для подальшого звичного морфологічного дослідження й імуногістохімічного аналізу було відібрано 72 спостереження, в яких було діагностовано інфільтруючі форми часточкового або протокового інвазивного раку молочної залози різного ступеня катаплазії, а також міоепітеліальний рак. Ці випадки ми розбили на дві групи: I група - інфільтративні міоепітеліальні карциноми з різним ступенем диференціювання (37 спостережень), II група - інфільтративні карциноми молочної залози різного ступеня катаплазії без міоепітеліального диференціювання (35).

Значну частину наших спостережень складали особи працездатного та соціально-активного віку. Давність захворювання у всіх пацієнток варіювала від одного до 36 місяців. Як в групі хворих з інфільтративними часточковими та протоковими карциномами без міоепітеліального диференціювання, так і в групі з міоепітеліальними карциномами переважали випадки із давністю недуги не більше 6 місяців - 53 особи (73,6%).

Морфологічні дослідження виконані на біопсійному та операційному матеріалі інвазивних форм РМЗ 72 хворих, які поступили на лікування в ДОПЦ, і, як ми вже наголошували, матеріал забраний при первинному звертанні пацієнток, тобто до проведення будь-якої терапії.

Шматочки тканин фіксували у 10%-ному розчині холодного нейтрального формаліну (pH 7,4) протягом 24 годин. Після дегідратації їх заливали у високоочищений парафін з полімерними добавками (Richard-Allan Scientific, США) при температурі не вище 60°С. З парафінових блоків на ротаційному мікротомі Microm HM325 з системою переносу зрізів STS (Carl Zeiss, Німеччина) виготовляли серійні гістологічні зрізи завтовшки 5 мкм. Парафінові зрізи фарбували гематоксиліном та еозином, за ван Гізоном, за Вергоффом, для виявлення сульфатованих і несульфатованих глікозаміногліканів препарати фарбували толуїдиновим синім при рН 2,6 і 5,3, глікопротеїдів - ставили ШИК-реакцію.

Для подальшого імуногістохімічного дослідження частину серійних парафінових зрізів поміщали на покриті адгезивом скельця Super Frost Plus (Menzel, Німеччина). Дослідження проводили на депарафінізованих і регідратованих зрізах. При цьому зрізи піддавали, так званій, тепловій індукції епітопного повернення (HIER) для “демаскування” антигенів, яку здійснювали зануренням зрізів тканини на скельцях у відновлюючий буфер Target Retrieval Solution (DAKO, Данія) і прогріванням їх на водяній випарній бані GFL1023 при t = 90-95°С протягом 20-30 хвилин або у мікрохвильової пічі Samsung CE 118KFR з урахуванням рекомендацій фірми виробника антитіл. Ця процедура забезпечує відновлення структури антигенів перед імунозабарвленням. Після блокування неспецифічного зв'язування білків протеїновим блоком (DAKO) й ендогенної пероксидазної активності - пероксидазним (DAKO) проводили трьохетапну імуноферментну реакцію. На першому етапі наносили немічені первинні антитіла. Використовували мишачі моноклональні антитіла до панцитокератинів (клон АЕ1/АЕ3, DAKO), епітеліального мембранного антигену ЕМА (клон Е29, DAKO), віментину (клон Vim 3V4, DAKO), актину (клон HHF35, DAKO), гладком'язового актину SMA (клон 1A4, DAKO), CD10 (клон 56C6, Novocastra), p63 (клон 4A4, DAKO) і поліклональні антитіла до протеїну S-100 (DAKO), а також для визначення прогностичних чинників використовували МАТ до р53 (клон DО7, DAKO), Ki-67 (клон MIB-1, DAKO), рецепторів естрогенів (клон 1D5, DAKO) та прогестерону (клон 1A6, DAKO). На другому етапі додавали сполучні вторинні біотинільовані мишачі антитіла, потім - стрептавідин, кон'югований з пероксидазою хрону. Кількість пероксидази, котра зв'язувалася з гістологічним препаратом, визначали за допомогою гістохімічної реакції, за субстрат використовували діамінобензидін DAB+ (DAKO). Візуалізацію первинних антитіл проводили за допомогою полімерної системи детекції DAKO EnVision+. Для візуалізації гістологічної структури зрізів оброблені імуногістохімічні препарати дозабарвлювали гематоксиліном Майєра. Далі їх заключали у напівсинтетичне середовище Permanent Mounting Medium (DAKO).

Інтерпретацію результатів імуногістохімічного забарвлення проводили відповідно до типу реакції. При використанні МАТ до панцитокератинів, віментину, актину, гладком'язового актину (SMA) і поліклональних антитіл до протеїну S-100 оцінювали кольорові реакції в цитоплазмі залозистих клітин пухлини. При використанні МАТ до епітеліального мембранного антигену ЕМА та CD10 враховували мембранне забарвлення. Оскільки рецептори до p63, р53, Ki-67, естрогенів (ER) і прогестерону (PR) - виключно ядерні антигени, при оцінці імуноферментного забарвлення враховували лише кольорові реакції (від жовтого до темнокоричневого забарвлення), розташовані в проекції ядер залозистих клітин пухлини. Неспецифічне зв'язування, яке виявлялося в стромі пухлини, зрідка в лімфоїдних клітинах, а також у цитоплазмі ракових клітин, не враховували. Облік позитивних реакцій проводили за кількістю клітин, які відреагували (виражали у відсотках до загальної кількості злоякісно трансформованих клітин на площі гістологічного препарату) і за інтенсивністю їх імунозабарвлення.

Дослідження препаратів у прохідному світлі проводили на дослідницькому мікроскопі Olympus AX70 (Японія) із цифровою відеокамерою Olympus DP50, з'єднаною із персональним комп'ютером. Мікрофотографування та морфометричне вивчення препаратів нами здійснено з використанням програми AnalySIS Pro 3.2 (фірма SoftImaqinq, Німеччина) згідно рекомендацій виробника програмного забезпечення. Статистична обробка одержаних даних виконувалась за допомогою програми Excel на комп'ютері ОЕМ IBM PC/АT Pentium. Під час проведення морфометричних досліджень керувались основними принципами, викладеними у керівництві Г.Г. Автанділова (2002).

Морфологічне та морфометричне дослідження здійснено на базі морфологічного відділу лабораторії фундаментальних досліджень Інституту невідкладної та відновної хірургії ім. В.К.Гусака АМН України та відділу патоморфології ЦНДЛ Державного медичного університету ім. М.Горького (завідувач - професор В.Г. Шлопов).

Результати дослідження та їх обговорення. Проаналізувавши доступну нам вітчизняну і зарубіжну літературу, ми з'ясували в інформаційних джерелах, що відсутні не лише чіткі морфологічні критерії діагностики міоепітеліальних карцином, а і немає формалізованого поняття, які пухлини треба відносити до даної групи новоутворень (наявність МЕК в пухлині не є абсолютним показанням її зарахування до групи міоепітеліальних). При дефініції генезу інвазивних карцином ми виходили із загальновизнаного факту, що у нормальній протоці співвідношення секреторних і міоепітеліальних клітин складає приблизно 1:1. Зміну цього співвідношення при різних проліферативних процесах можна розглядати як новоутворення молочної залози або з міоепітеліальним диференціюванням клітин, або з лактоцитарним. Наявність у пухлинній паренхімі МЕК без ознак атипії і схильності до проліферації при їх питомому об'ємі <0,5 є підставою розглядати таку пухлину як новоутворення без міоепітеліального диференціювання. Виявлення МЕК з ознаками катаплазії і схильністю до проліферації, як при дослідженні МЕК за допомогою загальногістологічних методик, так і при використанні забарвлень з імуногістохімічними маркерами проліферації (р53 і Кі67), перевищення їх питомого об'єму >0,5 є підставою розглядати такі новоутворення, як міоепітеліальні.

Форма міоепітеліальних клітин залежить від багатьох чинників. У нормі і секреторні, й міоепітеліальні клітини мають форму кубічного епітелію і їх дуже важко відрізняти при рутинних методах забарвлення гістологічних препаратів. Така подібність призводить до частих діагностичних помилок - як при верифікації “доброякісних” і потенційно злоякісних пухлин молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням, так і, особливо, при діагностиці низько- та “недиференційованих” пухлин. Додаткові складності в діагностиці створюють так звані псевдоміоепітеліальні клітини, які при рутинних методиках забарвлення не відрізняються від істинних МЕК, а при імуногістохімічному забарвленні мають епітеліальний фенотип. Вони мають округлу або злегка витягнуту форму, центрально розташоване гіперхромне ядро з чіткими ядерцями, цитоплазма їх рясна, вакуолізована, еозинофільна або прозора, оптично пуста. Присутність великої кількості таких клітин в пухлинній паренхімі без використання імуногістохімічних методів спричиняє неправильну трактовку морфологічної картини і помилкову діагностику. Найважливішою диференційнодіагностичною ознакою в таких випадках є негативна реакція з маркерами МЕК при позитивному імунозабарвленні з цитокератинами та епітеліальним мембранним антигеном.

У низькодиференційованих карциномах молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням клітини пухлини мають округлу, овальну, полігональну або витягнуту форму, формують пучки, концентричні фігури, створюючи саркоматозну картину. Наявність ділянок з веретеноподібних еозинофільних клітин зі значним числом фігур мітозу, в тому числі з присутністю поодиноких атипових форм, є підставою відносити такі пухлини до розряду високозлоякісних. Кубічні міоепітеліальні клітини трансформуються у веретеновидні міоїдні клітини з відростками цитоплазми також при атрофічних процесах, що в умовах патології призводить до неправильного встановлення діагнозів лейоміосаркоми, веретеноподібної саркоми, карциносаркоми, листоподібної аденоми, ліпобластоми, метапластичної карциноми. Істинну природу таких ділянок пухлини можна визначити лише при використанні імуногістохімічних методів забарвлення гістологічних препаратів з маркерами МЕК. В наших спостереженнях пухлин з наявністю гіперклітинного саркомоподібного компонента (5 із 37 випадків, 13,5%) імуногістохімічно була виявлена реактивність витягнутих пухлинних клітин для актину, гладком'язового актину (SMA), рідше для панцитокератинів (AE1/AE3), що визначало міоепітеліальну лінію клітин.

Слід відзначити, що в жодному з 35 спостережень карцином молочної залози без міоепітеліального диференціювання, навіть в групі низько- і недиференційованих пухлин, ми не верифікували мезенхімоподібних (саркоматозних) ділянок, позитивно забарвлених при імуногістохімічному типуванні з епітеліальними або міоепітеліальними маркерами.

В основу морфологічної характеристики РМЗ покладений принцип гістологічної класифікації пухлин та класифікації за рівнем патогістологічного диференціювання пухлинної тканини. Останній оцінюється за результатами мікроскопічного дослідження, відповідно до критеріїв C.W.Elston, I.O.Ellis (1991) і доповнених P.Hermanek et al. (1999) та реєструється як GX - у тих випадках, коли рівень диференціювання пухлинних клітин не можна оцінити, G1 - високодиференційований, G2 - помірнодиференційований, G3 - низькодиференційований і G4 - недиференційований. В літературі ми не знайшли морфологічних критеріїв встановлення рівня патогістологічного диференціювання пухлинних тканин карцином молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням. Однак, оскільки комплексна морфологічна ідентифікація пухлини зберігає свою послідовну цінність як критерії прогнозу РМЗ та входить до переліку найбільш значущих незалежних індикатрис прогнозу, ми визнали за можливе застосувати цю класифікацію щодо міоепітеліальних пухлин, додавши деякі зміни при діагностиці недиференційованих (G4) пухлин молочної залози міоепітеліального генезу. Зокрема, з нашої точки зору, доцільно для практичного її застосування виділити підтипи саркоматозних (G4) пухлин, такі як лейоміосаркоматозний, ліпосаркоматозний та інші.

Так як MEК не завжди легко ідентифікувати при рутинному забарвленні гематоксиліном й еозином, ми поділяємо точку зору, що їх гістогенез на сьогодні необхідно визначати за допомогою імуногістохімічного типування. Більшість імуногістохімічних маркерів МЕК спрямовані на виявлення у цитоплазмі епітеліальних і гладком'язових антигенів. З огляду на змішаний епітеліальний та гладком'язовий фенотип MEК і необхідність відрізняти міоепітеліальний шар від епітеліального, імуногістохімічні маркери повинні бути скеровані на виявлення саме гладком'язових антигенів. У зв'язку з цим для підтвердження міоепітеліального генезу інвазивних карцином нами використано імуногістохімічне типування з наступними маркерами МЕК: антитіл до панцитокератинів АЕ1/АЕ3, епітеліального мембранного антигену (ЕМА), віментину, актину, гладком'язового актину (SMA), CD10, p63 і протеїну S-100.

При імуногістохімічному забарвленні інвазивних карцином молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням документована позитивна реакція з декількома міоепітеліальними маркерами. В 100% випадків міоепітеліальний компонент інвазивних карцином виявлявся при використанні антитіл до актину та гладком'язового актину. У 78,4% випадків міоепітеліальні клітини позитивно забарвлювалися при задіянні антитіл до віментину.

Віментин, який класично експресується фібробластами, - не специфічний маркер МЕК. Експресію віментину не слід враховувати як абсолютний показник міоепітеліального гістогенезу новоутворення без дослідження інших маркерів МЕК. Особливе значення це має в “чистих” міоепітеліальних карциномах сакоматозного типу. На відміну від сарком в міоепітеліальних карциномах, окрім віментину, обов'язково повинна спостерігатися експресія інших маркерів МЕК.

У 67,6% МЕК позитивно забарвлювалися при задіянні антитіл до панцитокератинів АЕ1/АЕ3. Однак залучення цього маркера не є інформативним, оскільки епітеліальні секретуючі клітини завжди позитивні при використанні антитіл до панцитокератинів. Інші маркери МЕК з нашої панелі були ефективні у меншому числі випадків - 56,7%, 43,2% і 27,0% відповідно до S-100 протеїну, p63 та CD10.

Результати проведеного імуногістохімічного дослідження показали, що діагностика пухлин молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням повинна проводитися з численнішою кількістю антитіл для виявлення антигенів МЕК. При цьому імуногістохімічні маркери повинні бути спрямовані на виявлення гладком'язових антигенів. Ми рекомендуємо використовувати для підтвердження діагнозу міоепітеліальної карциноми не менше двох маркерів, один з яких - актин або гладком'язовий актин.

З метою об'єктивізації морфологічного діагностичного процесу ми визначили основні морфометричні характеристики тканинної структури інвазивного раку з та без міоепітеліального диференціювання різного ступеня катаплазії. До таких параметрів ми віднесли: питомий об'єм волокнистих і залозистих структур в карциномах міоепітеліального генезу, питомий об'єм паренхіми і строми в карциномах без міоепітеліального диференціювання, а також питомий об'єм судин, осередків некрозу та коефіцієнт васкуляризації.

Важливою особливістю інвазивних карцином з міоепітеліальним диференціюванням є те, що при проведенні морфометричного аналізу дуже важко виділити стромальний компонент. Паренхіма низько- і недиференційованих міоепітеліальних карцином саркоматозного типу на світлооптичному рівні не відрізняється від строми. При використанні імунозабарвлення з віментином у стромі чітко виявлялися стінки судин, проте паренхіма, представлена волокнистими структурами, також дає позитивне забарвлення. У зв'язку з цим коефіцієнт васкуляризації пухлин ми розраховували виходячи із сумарного значення питомого об'єму паренхіми і строми в інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання та сумарного питомого об'єму залозистих і волокнистих структур в карциномах міоепітеліального генезу.

Як в міоепітеліальних карциномах, так і в інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання при поглибленні катаплазії відзначається збільшення питомого об'єму судин, і, як наслідок, зростання коефіцієнта васкуляризації. Достовірних розходжень питомого об'єму судин в карциномах міоепітеліального генезу і в карциномах без міоепітеліального диференціювання - як при різних ступенях патогістологічного диференціювання пухлини в кожній з груп, так і при порівнянні груп між собою, ми не виявили (р>0,05). Що стосується коефіцієнта васкуляризації, то в інвазивних карциномах з міоепітеліальним диференціюванням привертає увагу достовірна різниця даного показника при недиференційованих G4 формах порівняно з помірнодиференційованими G2 (р<0,05). Достовірної різниці між аналогічними показниками в групі хворих з інвазивними карциномами молочної залози без міоепітеліального диференціювання нами виявлено не було (р>0,05).

Незважаючи на відносно високі показники васкуляризації і добре кровопостачання пухлини, в інвазивних карциномах молочної залози низького ступеня диференціювання реєструється високий питомий об'єм осередків некрозу. З нашої точки зору, незрілість колагенових структур, що складають як внутрішньочасточкову строму, так і базальну мембрану мікросудин, виражені дистрофічні зміни стінок судин мікроциркуляторного русла (МЦР) у вигляді мукоїдного наухання і фібриноїдних змін (аж до фібриноїдного некрозу), які виявляються при гістохімічному дослідженні, створюють передумови для їх підвищеної проникності і розвитку гострих порушень кровообігу всередині самої часточки. Крім того, слід зазначити високу частоту змішаних, а також аглютинаційних тромбів у судинах мікроциркуляторного русла, що спостерігаються поблизу осередків некрозу. Описані вище дистрофічні зміни в ГМЦР частіше спостерігаються саме в раках низького ступеня диференціювання незалежно від гістогенезу пухлини.

Наголосимо, що показники питомого об'єму вогнищ некрозу при недиференційованих G4 інвазивних карциномах молочної залози (як міоепітеліального генезу, так і без міоепітеліального диференціювання) достовірно відрізняються від аналогічних показників в карциномах помірного ступеня диференціювання G2 (р<0,05).

Проліферативну активність пухлинних клітин розглядають в якості одного із найважливіших прогностичних факторів. До найпопулярніших імуногістохімічних методик в оцінці проліферативної активності РМЗ відносять типування за допомогою моноклональних антитіл до антигенів р53 та Кі-67. Відомо, що низькодиференційовані пухлини мають вищу проліферативну активність, ніж високодиференційовані, і що рівень Kі-67 прогнозує безрецидивне й загальне виживання.

При всіх ступенях патогістологічного диференціювання (і в інвазивних карциномах з міоепітеліальним диференціюванням, й у РМЗ без міоепітеліального диференціювання спостерігається коливання індексів накопичення в ядрах атипових клітин білків р53 і Кі67 у широких межах. Від випадку до випадку варіювала також інтенсивність забарвлення - від жовтувато-коричневого до насиченого темно-коричневого кольору. Достовірних розходжень між показниками індексів накопичення р53 і Кі67 в ядрах атипових клітин при карциномах міоепітеліального генезу і у карциномах без міоепітеліального диференціювання при порівнянні груп однакових ступенів патогістологічного диференціювання ми не виявили (р>0,05).

Клітини паренхіми недиференційованого інвазивного раку молочної залози (G4) відрізняються різко вираженою катаплазією, поліморфізмом і дискомплексацією. Ядра - поліморфні, гіперхромні з нерівномірним розподілом хроматину, містять декілька добре контурованих ядерець. Виявляється багато патологічних форм мітозу. Індекс накопичення в пухлинних ядрах білка р53 і Ki-67 у недиференційованих карциномах найвищий і складає, в середньому, при карциномах з міоепітеліальним диференціюванням - 54±8,3% і 65±4,7% відповідно до р53 та Кі67, а при інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання - 52±6,9% і 67±5,3%. Коливання показників при G4 карциномах з міоепітеліальним диференціюванням найвище, в окремих випадках інвазивних карцином з міоепітеліальним диференціюванням відсоток позитивно забарвлених клітин досягав 80%.

Показники індексів накопичення р53 і Кі67 в ядрах пухлинних клітин при недиференційованих G4 карциномах міоепітеліального генезу і в карциномах без міоепітеліального диференціювання достовірно відрізняються від аналогічних показників у відповідних групах карцином з помірним диференціюванням G2 (р<0,05).

Патогістологічна класифікація (G) заснована на об'єктивній кількісній морфологічній оцінці проліферативної активності клітин пухлини. Щонайчастіше для цього при рутинній патогістологічній діагностиці використовують показники мітотичного режиму. Разом з тим, слід зазначити, що і розміри ядра, й величина ядерно-цитоплазматичного відношення слугують важливими морфометричними параметрами при оцінці ступеня катаплазії пухлин різних локалізацій. Крім того, встановлено, що збільшення площі перетину ядра пухлинної клітини корелює з погіршенням прогнозу.

Зі зниженням диференціювання пухлинних клітин в часточкових інвазивних карциномах молочної залози спостерігається значне зростання мітотичного індексу і, таким чином, підвищення проліферативної активності пухлини. Проліферативна активність клітин інвазивного РМЗ чітко пов'язана зі ступенем гістологічної злоякісності новоутворення, що підкреслює велике значення цього показника, який точно характеризує біологічну природу пухлини, ступінь інвазивності, потенції новоутворення до рецидивування та метастазування.

Помірнодиференційований інвазивний РМЗ міоепітеліального генезу та без міоепітеліального диференціювання характеризуються чітко вираженими ознаками пухлинного мітотичного режиму, що супроводжується наявністю патологічних фігур мітозу. Однак кількісний показник мітотичної активності пухлинних клітин (мітотичний індекс) свідчить про помірний проліферативний потенціал пухлинних клітин. В G2 пухлинах з міоепітеліальним диференціюванням він становить 8,89±0,66, в карциномах без міоепітеліального диференціювання - 8,56±0,59.

Зі зниженням ступеня диференціювання пухлинних клітин в інвазивних карциномах молочної залози спостерігається значне зростання мітотичного індексу. При низько- і, особливо, недиференційованих пухлинах молочної залози міоепітеліального генезу відзначається ріст цього показника щодо помірнодиференційованих карцином G2 в 1,6 та 2,04 разів. При інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання мітотичний індекс зростає при поглибленні катаплазії аналогічно щодо помірнодиференційованих карцином G2 в 1,57 разів при низько- й удвічі при недиференційованих пухлинах.

В обох групах поєднано зі зниженням диференціювання клітин пухлинної паренхіми спостерігається незначне зменшення ядерно-цитоплазматичного співвідношення в клітинах пухлини при одночасному зростанні середньої довжини перетину ядер пухлинних клітин. Достовірних розходжень даних показників в карциномах міоепітеліального генезу й у таких без міоепітеліального диференціювання (як при різних ступенях гістопатологічного диференціювання пухлинної тканини в кожній з груп, так і при порівнянні груп) ми не виявили (р>0,05).

Нами була визначена експресія рецепторів до стероїдних гормонів в 15 випадках інвазивних форм РМЗ міоепітеліального генезу з різним ступенем диференціювання. Для отримання достовірніших даних, дослідження було виконане на серійних зрізах і результати забарвлення оцінювалися виключно в міоепітеліальному компоненті пухлин. Якщо клітини пухлини були імунопозитивними при використанні міоепітеліальних маркерів (актин, віментин, гладком'язовий актин (SMA), протеїн S-100, CD10 та p63) вони розцінювалися як міоепітеліальні.

У більшості випадків (86,6%) нами документована відсутність рецепторів до естрогенів і прогестерону (ER?PR?) в міоепітеліальному компоненті пухлин. Жодна з “чисто” міоепітеліальних карцином не експресувала рецептори до стероїдних гормонів.

При дослідженні рецепторного статусу до стероїдних гормонів пухлинних клітин інвазивних карцином молочної залози епітеліального генезу відсутність рецепторів до естрогенів і прогестерону (ER?PR?) документована лише у 25,8% випадків. В більшості спостережень РМЗ без міоепітеліального диференціювання (58,1%) виявлена гіперекспресія рецепторів естрогенів і прогестерону (ER+PR+), тоді як експресію рецепторів естрогенів та прогестерону (ER+PR+) в міоепітеліальному компоненті інвазивної карциноми діагностовано лише в 6,7% (одне спостереження із 15). Такі позитивно забарвлені клітини при постановці реакції давали теж чітку позитивну реакцію як з маркерами МЕК, так і при забарвленні з антитілами до панцитокератинів й епітеліального мембранного антигену. На суміжних ділянках клітини з аналогічними морфологічними характеристиками і позитивно забарвлені з маркерами МЕК демонстрували негативний результат з антитілами до рецепторів естрогенів і прогестерону. Ми схильні розглядати поодинокі клітини, що дають позитивне забарвлення з антитілами до рецепторів естрогенів і прогестерону в інвазивних карциномах молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням, як гібридні міосекреторні.

Відсутність рецепторів статевих гормонів (ER?PR?) у клітинах пухлин молочної залози - один з основних несприятливих прогностичних факторів із-за неефективності гормонотерапії. У цій групі методом вибору для одержання очікуваного результату є поліхіміотерапія.

Широке використання товстоголкової трепан-біопсії у пацієнток з пухлинами молочної залози дозволяє у більшості випадків визначити рецепторний статус новоутворення вже на етапі первинної верифікації діагнозу. Хворі на РМЗ з міоепітеліальним диференціюванням, рецепторний статус пухлин яких переважно негативний, не мають можливостей адекватної відповіді на застосовувану системну гормонотерапію, що свідчить про гірший прогноз перебігу захворювання. У таких пацієнток також немає показань для виконання одночасно з хірургічним втручанням на молочній залозі операцій щодо виключення функції яєчників.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене теоретичне обгрунтування та нове наукове рішення актуальної задачі - встановлення основних структурних характеристик міоепітеліальних карцином молочної залози різного ступеня катаплазії для оптимізації диференційного діагнозу та прогнозу.

2. За результатами комплексного морфологічного аналізу визначено, що до інвазивних міоепітеліальних карцином молочної залози треба відносити новоутворення з питомим об'ємом >0,5 проліферуючих катаплазованих міоепітеліальних клітин, позитивно типованих при використанні імуногістохімічних маркерів. Наявність у пухлині міоепітеліальних клітин без ознак проліферації та атипії з питомим об'ємом <0,5 дозволяє ідентифікувати ці новоутворення як карциноми без міоепітеліального диференціювання.

3. Міоепітеліальна складова раків молочної залози досить варіабельна: атипові міоепітеліальні пухлинні клітини формують аденоматозні, солідні і дифузні саркоматозні ділянки, що відображають прогресію пухлини і впливають на прогноз; у високо- та помірнодиференційованих варіантах цих новоутворень переважають аденоматозні і солідні структури, а при поглибленні катаплазії (у низько- і недиференційованих варіантах пухлини) домінують структури, формально імітуючі мезенхімальні.

4. При визначенні гістогенезу інвазивних карцином молочної залози необхідне імуногістохімічне типування з обов'язковим використанням не менше двох маркерів міоепітеліальних клітин: а) антитіл до актину або гладком'язвого актину, що позитивно реагують з міоепітеліальними клітинами в 100% випадків; б) антитіл до цитокератинів та епітеліального мембранного антигену - для підтвердження епітеліальної природи пухлинних клітин.

5. Основні морфометричні показники катаплазії і проліферативної активності пухлинних клітин у міоепітеліальних карциномах та інвазивних карциномах без міоепітеліального диференціювання не мають достовірних розбіжностей (р>0,05) і не можуть бути використані для розмежування цих новоутворень.

6. Одним з несприятливих прогностичних чинників є відсутність експресії клітинами міоепітеліальних карцином молочної залози рецепторів до стероїдних гормонів - естрогенів та прогестерону (86,6%); позитивне забарвлення у високодиференційованих міоепітеліальних карциномах (13,4%) обумовлене наявністю в них гібридних міосекреторних клітин.

7. Встановлені основні гістологічні, гістохімічні, імуногістохімічні й морфометричні характеристики міоепітеліальних карцином доцільні для використання у практиці патологоанатомічних відділень та в спеціалізованих імуногістохімічних лабораторіях при постановці об'єктивного діагнозу, а також для диференційної діагностики з інвазивними карциномами молочної залози без міоепітеліального диференціювання.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Постолюк І.Г., Волос Л.І. Класифікація раку молочної залози // Г.В. Бондар, І.Є. Сєдаков, В.Г. Шлопов. Первинно-неоперабельний рак молочної залози.-Донецьк: “Каштан”, 2005.-С.14-31. Дисертантом особисто дана оцінка діагностичної і прогностичної значущості різних класифікацій раку молочної залози.

2. Основы иммуногистохими. Часть 1. Антитела / В.К. Гринь, А.А. Селезнев, И.Г. Постолюк, Е.В. Селезнева // Вестник неотложной и восстановительной медицины.-2004.-Т.5, №1.-С.176-179. Дисертантом дано теоретичне обгрунтування взаємодії антитіл з поверхневими антигенами клітин при проведенні імуногістохімічних досліджень.

3. Основы иммуногистохими. Часть 2. Методы визуализации антигенов / В.К. Гринь, А.А. Селезнев, И.Г. Постолюк, Е.В. Селезнева // Вестник неотложной и восстановительной медицины.-2004.-Т.5, №2.-С.385-389. Дисертантом проведено порівняльний аналіз різних методів візуалізації антигенів, що використовуються при проведенні імуногістохімічних досліджень.

4. Якісні й кількісні характеристики стану судинного русла раку молочної залози до і після внутрішньоартеріальної поліхіміо-та променевої терапії / І.Є. Cєдаков, І.Г. Постолюк, Л.І. Волос, О.О. Селезньов // Вестник неотложной и восстановительной медицины.-2005.-Т.6, №3.-С.497-503. Дисертантом самостійно проведене морфологічне та морфометричне дослідження судинного русла раку молочної залози, визначена прогностична значущість досліджуваних показників.

5. Проліферативна активність клітин місцево-поширеного раку молочної залози до і після внутрішньоартеріальної хіміо- та променевої терапії / І.Є. Cєдаков, І.Г. Постолюк, Л.І. Волос, О.О. Селезньов // Вестник неотложной и восстановительной медицины.-2005.-Т.6, №4.-С.651-657. Дисертантом самостійно проведене морфологічне та морфометричне дослідження показників проліферативної активності пухлинних клітин раку молочної залози, визначена їх прогностична значущість.

6. Лікувальний патоморфоз раку молочної залози під впливом внутрішньоартеріальної поліхіміотерапії в неоад'ювантному режимі / І.Є. Cєдаков, І.Г. Постолюк, В.Г Шлопов, Л.І. Волос // Питання експериментальної та клінічної медицини.-2005.-Вип.9, Т2.-С.89-95. Дисертантом самостійно проведене морфологічне дослідження тканини раку молочної залози різного ступеня диференціювання і визначені кількісні структурні параметри лікувального патоморфозу.

7. Постолюк І.Г., Волос Л.І. Міоепітеліальні пухлини молочної залози: імуногістохімічна верифікація // Питання експериментальної та клінічної медицини.-2006.-Вип.10, Т1.-С.188-192. Дисертантом особисто проведений аналітичний огляд літератури, самостійно виконане імуногістохімічне дослідження та проведений аналіз отриманих результатів.

8. Постолюк І.Г. Міоепітеліальні пухлини молочної залози // Вестник неотложной и восстановительной медицины.-2006.-Т.7, №1.-С.109-115.

9. Постолюк І.Г. Стан міоепітеліального компонента в інфільтративних карциномах молочної залози // Вестник неотложной и восстановительной медицины.-2006.-Т.7, №2.-С.226-229.

10. Постолюк І.Г. Стан рецепторного апарата до стероїдних гормонів в міоепітеліальних пухлинах молочної залози // Вісник наукових досліджень.-2006.-№3(44).-С.108-110.

11. Постолюк І.Г. Патоморфологічна діагностика злоякісних пухлин молочної залози з міоепітеліальним диференціюванням // Матеріали XI з'їзду онкологів України.-Судак, 2006.-С.90.

Размещено на Allbest.ru