Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів

Визначення важливої ролі нАХР для утворення попередників В-лімфоцитів поставило питання, за яким механізмом реалізується ця роль. В процесі розвитку пре-В-лімфоцити діляться, а також підлягають селекції, в результаті якої частина клітин знищується шляхом апоптозу. Зокрема, відбраковуються клітини, які занадто сильно зв'язують антигени, присутні в оточенні, і, відповідно, можуть стати потенційно авто реактивними. Як показано вище, нАХР опосередковували проліферативні сигнали в нормальних зрілих В-клітинах і гібридомах. Ми також вивчили роль нАХР у виживанні В-лімфоцитів в кістковому мозку. Виявилось, що у мишей, нокаутних за генами б7- або в2-субодиниць нАХР, достовірно більше попередників В-лімфоцитів підлягало апоптозу, ніж у мишей дикого типу (рис 12.). Це означало, що В-лімфоцити нокаутних мишей підлягали більш суворому відбору, ніж лімфоцити мишей дикого типу.

Оскільки процеси відбору фактично формують антиген-специфічний репертуар імунних клітин, можна було очікувати, що у нокаутних мишей такий репертуар буде вужчим, ніж у мишей із нормальним вмістом нАХР. Для з'ясування цього питання ми вивчили рівень сироваткових імуноглобулінів і природних антитіл у мишей, нокаутних за генами нАХР, у порівнянні з мишами дикого типу.

Сироваткові імуноглобуліни і природні антитіла у нокаутних мишей. В цих експериментах було вивчено вміст імуноглобулінів і природних антитіл у нокаутних мишей трьох типів: у яких бракувало б4, б7 або в2 субодиниць нАХР. Усі три типи досліджених нокаутів містили суттєво менше сироваткових імуноглобулінів класу G, ніж миші дикого типу. На відміну, кількість імуноглобулінів класу М у цих мишей суттєво не відрізнялась від такої у вихідної лінії C57Bl/6. В селезінці в2 нокаутів також містилось менше клітин, які продукували IgG, ніж у мишей дикого типу. Ми визначили в сироватці крові контрольних і б4-нокаутних мишей кількість антитіл проти антигенів, які звичайно вважають мішенями так званих „природних” антитіл: актину, міозину, тубуліну і цитохрому с. Кров нокаутних мишей містила менше IgG антитіл проти актину і міозину, ніж кров мишей дикого типу, але однакову кількість антитіл проти тубуліну і цитохрому с. Таким чином, відсутність нАХР не впливала на базові рівні IgM та клітин, що їх продукують, але змінювала кількість клітин, які переключилися з синтезу і секреції IgM на IgG. За нормальних умов таке переключення відбувається у відповідь на антигени оточення, здебільшого бактеріальні полісахариди. Кількість клітин, що продукують IgG, у таких тварин фактично відповідає до-імунному репертуару В-лімфоцитів. Отримані дані підтвердили зроблене вище припущення, що відсутність нАХР в процесі розвитку В-лімфоцитів призводить до звуження їх антиген-специфічного репертуару.

Роль нАХР в процесах активації В-лімфоцитів і імунній відповіді. Низькі рівні сироваткових IgG та природних антитіл, знайдені у нокаутних мишей, давали підставу очікувати, що такі миші будуть також слабше відповідати на імунізацію білковим антигеном. Однак, на наш подив, миші, яким бракувало б4 або в2 субодиниці нАХР, продукували більше IgG антитіл проти цитохрому с, ніж миші дикого типу.

Для того, щоб пояснити протилежні до- і пост-імунні ефекти відсутності нАХР, ми взяли до уваги той факт, що на відміну від переважно Т-незалежної імунної відповіді на бактеріальні антигени оточення, відповідь на білковий антиген, введений в суміші з ад'ювантом, є Т-залежним процесом і потребує сигналу через костимуляторну молекулу В-лімфоцитів CD40. Тому наступним кроком було вивчено активацію В-лімфоцитів мишей дикого типу і нокаутних мишей під дією антитіл проти CD40.

В-лімфоцити мишей, нокаутних за геном в2-субодиниці, відповідали на стимуляцію краще, ніж клітини мишей дикого типу. В протоковій цитофлуориметрії IgM⁺B220⁺ спленоцити як в2-, так і б7-нокаутів зв'язували більше антитіл проти CD40, ніж клітини мишей дикого типу (на 11,4% і 8,4%, відповідно). За інтенсивністю флуоресценції зв'язаних анти-IgМ антитіл, В-лімфоцити селезінки нокаутних мишей експресували приблизно на 5% більше IgM, ніж клітини мишей дикого типу. Таким чином, відсутність нАХР впливала на активацію В-лімфоцитів і, як наслідок, на гуморальну імунну відповідь шляхом підвищення експресії (і, можливо, сигналингу) головних активаційних молекул В-лімфоцитів: антиген-специфічного рецептора і CD40. Як видно із представлених даних, різниця між мишами дикого типу і нокаутними за генами нАХР була невеликою: 5-10% в рівні експресії активаційних молекул, 30 - 60% в проліферації і 50 -150% в продукції антитіл. Це означало, що сигнал, який поступає в В-лімфоцити через нАХР, не є драматичним, а скоріше виконує роль тонкого модулятора їх імунних функцій. Такий висновок добре збігався з обговореною вище регуляторною роллю б4в2 і б7-вмісних нАХР в нейронах мозку і автономних гангліїв.

Підвищений рівень IgM та CD40 на клітинах нокаутних мишей також пояснював вплив нАХР на виживання попередників В-лімфоцитів в кістковому мозку. Рішення негативного відбору: знищити або зберегти клітину, - приймається на основі авідності взаємодії її попередника з антигенами оточення. Підвищена експресія антиген-специфічного рецептору і костимуляторної молекули очевидно посилює авідність взаємодії і реакцію на неї, що сприяє відбракуванню клітин як потенційно автореактивних. Як наслідок, ми спостерігаємо підвищений рівень апоптозу серед клітин нокаутних мишей і звуження їх до-імунного репертуару. Відповідно, у мишей дикого типу сигнал від нАХР сприяє утворенню нормального антиген-специфічного репертуару, але стримує силу імунної відповіді в зрілому стані. Вживання нікотину, яке підвищувало кількість В-лімфоцитів в кістковому мозку, згідно із обговореними даними, повинно розширювати до-імунний репертуар, але знижувати імунну відповідь. Таке твердження добре узгоджуються із визначеною імуносупресивною роллю нікотину. Зменшений тиск негативного відбору автоматично підвищує ризик імунної відповіді на власні антигени, що відповідає описаній в літературі підвищеній вірогідності автоімунних захворювань у людей, що палять тютюн.

Загалом, одержані результати демонструють важливу роль ацетилхоліну в регуляції розвитку і активації лімфоцитів. Утворення до-імунного антиген-специфічного репертуару очевидно регулюється холінергічними сигналами від нервової системи. На периферії регуляторну роль відіграє ацетилхолін не-нейронального походження. Згідно до літературних даних, лімфоцити експресують також рецептори до ацетилхоліну мускаринового типу, причому їх активація потребує значно менших доз ацетилхоліну і призводить до протилежних наслідків, ніж активація нАХР (Richman and Arnason, 1979). У світлі отриманих нами даних можна уявити, що малі дози ацетилхоліну сприяють імунним реакціям, діючи на мускаринові рецептори, а підвищені - гальмують імунну відповідь через нікотинові рецептори. Більше того, різні субтипи нАХР відіграють різні ролі в процесах розвитку і активації В лімфоцитів. Оскільки потужним джерелом ацетилхоліну є активовані Т-лімфоцити, то його продукція є очевидним фактором зворотного зв'язку в імунних реакціях. Відповідно, ацетилхолін можна вважати додатковим медіатором спілкування між Т- і В-лімфоцитами.

Вивчення ролі нАХР в процесах кровотворення. Оскільки кістковий мозок є головним центром кровотворення у мишей, цікаво також було з'ясувати, чи впливають сигнали від нАХР на утворення і диференціювання інших клітин крові. Ми провели морфологічний аналіз відбитків кісткового мозку, селезінки і мазків крові мишей дикого типу, тих, що вживали нікотин, і нокаутних за генами нАХР. За отриманими даними, відсутність в2-вмісних нАХР знижувала частку нормоцитів, не впливаючи на ранні еритроїдні попередники, тобто сприяла трансформації нормоцитів в ретикулоцити. При цьому підвищувалась частка ранніх мієлоїдних попередників і юних форм нейтрофілів.

Із літератури відомо, що нормоцити стримують утворення ранніх мієлоїдних попередників, тож відсутність в2 субодиниці, прискорюючи диференціювання нормоцитів, опосередковано сприяла утворенню юних нейтрофілів. На відміну, відсутність б7-субодиниці нАХР уповільнювала утворення як нейтрофілів, так і ранніх еритроїдних попередників. При цьому автоматично зростала частка лімфоцитів.

Дія нікотину нагадувала ефект відсутності б7-субодиниці нАХР, вірогідно, завдяки десенситизації цього типу рецептора, і, на додаток, сприяла збереженню зрілих нейтрофілів. Сумарні клітини кісткового мозку містили сайти зв'язування радіоактивних епібатидину і б-бунгаротоксину, вказуючи на присутність гетеромерних і б7-вмісних нАХР. Методом протокової цитофлуориметрії ми розділили клітини кісткового мозку на субпопуляції різних рядів і стадій диференціювання і прямо показали, що як мієлоїдні, так і еритроїдні попередники експресують обидва субтипи нАХР, причому, подібно до лімфоцитів, б4в2 нАХР присутні переважно на ранніх стадіях диференціювання, в той час, як б7-вмісні рецептори визначаються як на попередниках, так і на зрілих клітинах. Отримані дані свідчили, що нікотинові рецептори приймають участь в регуляції кровотворення в кістковому мозку, тобто фактично, визначали молекулярну основу холінергічної регуляції цього процесу, описану раніше.

Експресія нАХР лейкоцитами периферичної крові людей та її зміни у хворих на хворобу Альцгеймера. За нашими даними, нАХР лімфоцитів виявились подібними до відповідних рецепторів мозку. У зв'язку з цим виникло питання, чи пов'язані між собою експресія нАХР в мозку і в клітинах крові. Зручною моделлю для таких досліджень є нейродегенеративні захворювання, наприклад, хвороба Альцгемера, за якої кількість нАХР в мозку достовірно знижується. В результаті наших експериментів було з'ясовано, що у деякої частини хворих дійсно спостерігається зниження кількості нАХР на поверхні лейкоцитів у порівнянні з контролями, причому кількість нАХР може залежати від присутності автоантитіл до цього рецептору в плазмі крові.

Отримані дані демонструють потенційний зв'язок між експресією нАХР в мозку і в лейкоцитах і вперше вказують на те, що автоімунна реакція на нАХР може бути однією з причин патологічних змін за хвороби Альцгеймера. Відповідно, зниження кількості нАХР на лейкоцитах периферичної крові може бути додатковим діагностичним критерієм цього захворювання.

ВИСНОВКИ

1. Імунна і нервова системи організму є різними за будовою, призначенням та принципами функціонування, однак використовують багато спільних медіаторів і рецепторів до них. В результаті проведених досліджень показано, що В-лімфоцити експресують нікотинові ацетилхолінові рецептори (нАХР), подібні за будовою і механізмом дії до рецепторів нейронів, які є важливим фактором розвитку і активації цих клітин.

2. Отримано антитіла до пептидних фрагментів б3, б4, б5, б7, в2 і в4 субодиниць нАХР, які блокують активацію рецептору шляхом конкуренції за сайт зв'язування ацетилхоліну; це дало можливість розрізнити субтипи нАХР, складені із різних субодиниць.

3. Фрагмент нативного рецептору, проти якого отримані антитіла, має витягнуту просторову будову; в б7-вмісних нАХР він містить центр зв'язування специфічного антагоністу метиллікаконітину.

4. Функціональна активність антитіл проти б5 і в4 субодиниць нАХР свідчить про те, що ці структурні субодиниці відіграють важливу роль у відкритті іонного каналу.

5. Головним субтипом нікотинових рецепторів в верхньому шийному та інтракардіальному гангліях щура і в нижньому брижовому ганглії та підслизовому сплетінні морської свинки. є б3(б5)в4, а за представленістю б4- і б7-вмісних субтипів нейрони сильно відрізняються як в межах одного ганглію, так і між гангліями різної локалізації, що відображає їх функціональну різноманітність і джерело походження.

6. В-лімфоцити і клітинні лінії В-лімфоцитарного походження експресують два субтипи нікотинових рецепторів: б4(б5)в2 і б7(б5в4), - і механізм їх функціонування подібний до такого в нервових клітинах.

7. Субтип б4(б5)в2 переважно представлено на незрілих В- і Т-лімфоцитах первинних лімфоїдних органів, що інервуються холінергічними нервами, а кількість б7-вмісного субтипу збільшується в міру дозрівання лімфоцитів і виходу їх із зони холінергічної інервації.

8. Активація нікотинових рецепторів сприяє проліфераціі і виживанню В-лімфоцитів в процесі диференціювання в кістковому мозку і таким чином розширює їх антиген-специфічний репертуар. В зрілих В-лімфоцитах нікотинові рецептори, напроти, стримують активацію в процесі імунної відповіді. Механізм дії нАХР на ці процеси опосередкований впливом на антигенний рецептор В-лімфоцитів і костимуляторну молекулу CD40.

9. Активація нікотинових рецепторів, представлених на клітинах кісткового мозку, регулює також загальні процеси кровотворення, зокрема генерацію і виживання клітин мієлоїдного ряду і еритрону.

10. У частини пацієнтів з хворобою Альцгеймера кількість нікотинових рецепторів на лейкоцитах крові знижена, що обумовлено наявністю автоантитіл проти нАХР. Визначення кількості нАХР на лейкоцитах крові, може бути додатковим діагностичним критерієм хвороби Альцгеймера.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Скок М.В. Основи імунології. Курс лекцій: Підручник. - К.: Фітосоціоцентр, 2002. - 152 с.

2. Skok M.V., Grailhe R., Agenes F., Changeux J.-P. The role of nicotinic acetylcholine receptors in lymphocyte development // J. Neuroimmunol. - 2006. - Vol. 171, № 1-2. - С. 86-98. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, виконано цитофлуориметричний аналіз клітин химерних і нокаутних тварин, написано статтю).

3. Скок М.В., Звєркова А.С., Комісаренко С.В. Роль нікотинових ацетилхолінових рецепторів в регуляції процесів кровотворення // Доповіді НАН України. - 2005, № 10. - С. 180-184. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, підготовлено препарати для аналізу, написано статтю).

4. Skok M.V., Grailhe R., Changeux J.-P. Nicotinic receptors regulate B lymphocyte activation and immune response // Eur. J. Pharmacol. - 2005. - Vol. 517, № 3. - P. 246-251. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено всі експерименти, написано статтю).

5. Л.М. Коваль, С.І. Романюк, Д.В. Колибо, М.В. Скок, С.В. Комісаренко. Роль нікотину в регуляції проліферативних процесів В-лімфоцитах // Укр. біохім. журн. - 2005. - т.77, №2. - C.104-110. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, сплановано експерименти, зроблено внесок в написання статті).

6. Skok M.V., Koval L.M., Petrova Y.I., Lykhmus O.Y., Kolibo D.V., Romanyuk S.I., Yevdokimova N.Y., Komissarenko S.V. The effect of simulated microgravity on hybridoma cells // Acta Astronautica. - 2005. - Vol. 56, № 8. - P. 721-728. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, сплановано експерименти, написано статтю).

7. Грігоров О.О., Скок М.В., Скок В.І. Альфа-субодиничний склад нікотинових холінорецепторів підслизового сплетення тонкого кишечника морської свинки // Фізіол. журн. - 2004. - т.50, №3. - C. 73-78. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

8. Purnyn H.E., Rikhalsky O.V., Skok M.V., Skok V.I. Functional nicotinic acetylcholine receptors in the neurons of rat intracardiac ganglia //

9. Фізіол. журн. - 2004. - т. 50, № 4. - C. 79-84. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

10. Koval O.M., Voitenko L.P., Skok M.V., Lykhmus E.Y., Tsetlin V.I., Zhmak M.N. and Skok V.I. The в-subunit composition of nicotinic acetylcholine receptors in the neurons of the guinea pig inferior mesenteric ganglion // Neurosci. Lett. - 2004. - Vol.365, № 2. - P. 143-146. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

11. Скок М.В. Нікотинові рецептори нейронного типу: будова і функції у клітинах різного походження (огляд) // Укр. біохім. журн. - 2004. - т.76, № 3. - С. 5-15.

12. Glushakov A.V., Voytenko L.P., Skok M.V., Skok V.I. Distribution of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing different alpha-subunits in the submucosal plexus of the guinea-pig // Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. - 2004. - Vol. 110, № 1. - P. 19-26. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

13. Skok M.V., Kalashnik E.N., Koval L.N., Tsetlin V.I., Utkin Y.N., Changeux J.-P., Grailhe R. Functional nicotinic acetylcholine receptors are expressed in B lymphocyte-derived cell lines // Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol. 64, №. 4. - P.885-889. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено експерименти зі зв'язуванням радіоактивних лігандів, написано статтю).

14. Скок М.В., Коваль Л.Н., Бачинская Н.Ю., Комиссаренко С.В. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы на лимфоцитах периферической крови при болезни Альцгеймера // Доповіді НАН України. - 2003, № 9. - C.194-198. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, сплановано експерименти, написано статтю).

15. Коваль О.М., Скок М.В., Скок В.І. б-субодиничний склад нікотинових холінорецепторів нейронів нижнього брижового ганглія морської свинки: електрофізіологічне дослідження // Нейрофізіологія. - 2003. - т. 35, № 1. - C. 9-19. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

16. Коваль О.М., Войтенко Л.П., Скок М.В., Скок В.І. б-субодиничний склад нікотинових холінорецепторів нейронів нижнього брижового ганглія морської свинки: імуногістохімічне дослідження // Нейрофізіологія. - 2003. - т. 35, № 2. - С. 99-107. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, зроблено внесок в написання статті).

17. Skok M.V., Lykhmus O.Yu., Bobrovnik S.O., Solodova O.V., Tzartos S.J., Tsouloufis T., Vanderesse R. and Marraud M. Production of antibodies to б(181-192) peptides of neuronal nicotinic acetylcholine receptor coupled to protein carriers in different orientations // Укр. біохім. журн. - 2002. - т. 74, №4. - С.54-60. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено аналіз виділених антитіл, написано статтю).

18. Skok M., Lykhmus E., Bobrovnik S., Tzartos S., Tsouloufis T., Vanderesse R., Coutrot F., Thong Cung M., Marraud M., Krikorian D., Sakarellos-Daitsiotis M. Structure of epitopes recognized by the antibodies to б(181-192) peptides of neuronal nicotinic acetylcholine receptors: extrapolation to the structure of acetylcholine-binding domain // J. Neuroimmunol. - 2001. - Vol.121, № 1-2. - P.59-66. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, отримано моноклональні антитіла, проаналізовано результати, написано статтю).

19. Voitenko L.P., Voitenko S.V., Skok M.V., Purnyn H.E., Skok V.I.. Nicotinic acetylcholine receptor subtypes in rat superior cervical ganglion neurons as studied by sequential application of two б-subunit-specific antibodies // Neuroscience Letters. - 2001. - Vol. 303, № 1. - P. 37-40. (Дисертантом отримано антитіла для проведення досліджень, сплановано експеримент, проаналізовано результати, написано статтю).

20. Лихмус О.Ю., Скок М.В., Мірошниченко О.С., Комісаренко С.В. Вуглеводний компонент нікотинових ацетилхолінових рецепторів, присутніх на нервових та імунних клітинах // Доповіді НАН України. - 2001. - № 10. - C. 185-189. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, сплановано експерименти, написано статтю)

21. Калашник О.М., Лихмус О.Ю., Скок М.В. та Комісаренко С.В. Експресія та можливі функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитах // Доповіді НАН України. - 2000. - № 4. - C.171-175. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено експерименти з протокової цитофлуориметрії, написано статтю).

22. Skok M.V., Voitenko L.P., Voitenko S.V., Lykhmus E.Y., Kalashnik E.N., Litvin T. I., Tzartos S.J. and Skok V.I. Study of б subunit composition of nicotinic acetylcholine receptor in the neurons of autonomic ganglia of the rat with subunit-specific anti-б(181-192) peptide antibodies // Neuroscience. - 1999. - Vol. 93, № 4. - P. 1437-1446). (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, отримано антитіла для проведення досліджень, проаналізовано результати, написано статтю).

23. M.V. Skok, S.V. Komissarenko. Immune response to cytochrome c in BALB/c mice is delayed due to inability of non-specific antigen-presenting cells to provide its immunodominant epitope // Immunology Letters. - 1995. - Vol. 47. - P. 87-92. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено всі експерименти, написано статтю).

24. Э.М. Кавун, М.В. Скок. Динамика антителообразования, изотипы и специфичность антител в иммунном ответе мышей BALB/c на цитохром с // Биохимия (Москва). - 1994. - т.59, № 6. - C. 881-888. (Дисертантом особисто сформульовано завдання роботи, проведено дослідження динаміки імунної відповіді і ізотопів антитіл, зроблено внесок в написання статті).

25. M. Skok, L. Voitenko, S. Voitenko, E. Lykhmus, E. Kalashnik, V. Skok, S. Tzartos, Monoclonal antibodies, which bind and selectively block different nicotinic acetylcholine receptor subtypes: studies with lymphocytes // Abstracts 17^th Summer Meeting on Molecular Biology “Immuno-Neuro-Endocrine Interactions”. - Penn State (USA). - 1998. - P.81.

26. M.V. Skok, L.P. Voitenko, S.V. Voitenko, E.Yu. Lykhmus, E.N. Kalashnik, S.J. Tzartos and V.I. Skok Study of nicotinic acetylcholine receptor expression with б subunit-specific anti-б(180-191) peptide antibodies // Abstracts 5^th IUBMB Conference on the Biochemistry of Health and Diseases. - Jerusalem (Israel). - 1998. - P. 69.

27. M. Skok, Е. Kalashnik, E. Lykhmus. Neuronal nicotinic acetylcholine receptors in lymphocytes // Abstracts “Neuronal Nicotinic Receptors: From Structure to Therapeutics “. - Venice (Italy). - 1999. - P. 77.

28. M.V. Skok, E.Y. Lykhmus, E.N. Kalashnik. Mouse lymphocytes express two subtypes of neuronal nicotinic acetylcholine receptor, which appear at different stages of B lymphocyte development // Abstracts of the Fifth John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology “Immunology in Health and Disease”. - Pushchino (Russia). - 2000. - P. 91-92.

29. M.V. Skok, E.Y. Lykhmus, N.Y. Bachinskaya. Nicotinic acetylcholine receptors in lymphocytes: implications for Alzheimer disease // Abstracts of the ESN Conference on “Advances in molecular mechanisms of neurological disorders”. - Perugia (Italy). - 2001. - J. Neurochem. - Vol. 77, Suppl. 1. - P.23.

30. M.V. Skok, O.Y. Lykhmus, L.M. Koval, D.V. Kolibo, S.I. Romanyuk. Structure and role of nicotinic acetylcholine receptors in lymphocytes studied with subunit-specific anti-peptide antibodies // Abstracts of the 4^th Parnas Conferenc. - Wroclaw (Poland). - 2002. - P. 23.

31. М.В. Скок, О.Ю. Лихмус, Л.М. Коваль, Д.В. Колібо, С.І. Романюк. Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів на клітинах імунної системи // Тези 8-го Українського біохімічного з'їзду. - Чернівці (Україна). - Укр. біохім. журн. - 2002. - т. 74, № 4б, додаток 2. - C. 12-13.

32. Koval L.M., Kalashnik O.M., Skok M.V. Structure and role of nicotinic acetylcholine receptors in lymphocytes // Abstracts of the 6th John Humphrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology “Molecular Basis of the Immune Response”. - Pushchino (Russia). - 2002. - P. 63.

33. Скок М.В., Петрова Ю.І., Колибо Д.В., Лихмус О.Ю., Коваль Л.М., Романюк С.І., Комісаренко С.В. Вплив імітованої мікрогравітації на клітини, що продукують антитіла // Сборник тезисов Третьей Украинской конференции по перспективным космическим исследованиям. - Кацивели (Крым). - 2003. - C. 89.

34. Koval L., Romanyuk S., Komisarenko S., Skok M. Structure and functions of nicotinic acetylcholine receptors in transformed B lymphocytes // Abstracts of the First (Inagural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv (Ukraine). - 2004. - P. 285.

35. Komisarenko S.V., Koval L.M., Skok M.V. Structure and functions of nicotinic acetylcholine receptors expressed in B lymphocyte-derived cell lines // Abstracts of 29^th FEBS Meeting. - Warsaw (Poland). - 2004. - Eur. J. Biochem. - Vol. 271, Suppl. 1. - P. 123.

36. Koval L.M., Romanyuk S.I., Kolibo D.V., Komisarenko S.V. Skok M.V., Nicotinic acetylcholine receptors regulate proliferation of B lymphocytes // Abstracts of the 12^th International Congress of Immunology and 4^th Annual Conference of FOCIS. - Montreal (Canada). - Chemical and Investigative Medicine Journal Supplement. - 2004. - Vol. 27, № 4. - P.163C.

37. Skok M.V., Grailhe R., Agenes F., Changeux J.-P. Signaling through nicotinic acetylcholine receptors regulates lymphocyte development and activation // Abstracts of the 5^th Parnas Conference. - Kiev (Ukraine). - Ukr. Biochem. J. - 2005. - Vol. 77, №. 2. - P. 34.

38. Koval L.M., Lykhmus E.Yu., Romanyuk S.I., Kolibo D.V., Komisarenko S.V., Skok M.V. Nicotinic acetylcholine receptors mediate the effect of nicotine on antibody-producing cells // Abstracts of the 5^th Parnas Conference. - Kiev (Ukraine). - Укр. біохім. журн. - 2005. - т. 77, №. 2. - С. 59.

39. Skok M, Zverkova A, Grailhe R, and Changeux JP. Haemostasis is regulated through nicotinic acetylcholine receptors // Abstracts of the XXth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. - Sydney (Australia). - J. Thromb. Haemost. - 2005. - Vol. 3, Suppl. 1. - P0342.

40. Skok M.V. The role of nicotinic acetylcholine receptors in B lymphocyte proliferation and survival // Abstracts of International Workshop “New insights in cell proliferation, autophagy and apoptosis: fundamental and medical aspects”. - Odessa (Ukraine). - 2005. - P. 9.

АНОТАЦІЯ

Скок М.В. Будова і функції нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 2006.

Дисертацію присвячено дослідженню нікотинових ацетилхолінових рецепторів В-лімфоцитів у порівнянні з такими автономних гангліїв. Представлені дані мають важливе теоретичне значення для розуміння загальних механізмів функціонування та взаємодії імунної та нервової систем, холінергічної регуляції процесів кровотворення та впливу нікотину на імунні реакції. З'ясовано важливі структурні особливості нікотинових рецепторів, ідентифіковано їх головні субтипи в В-лімфоцитах і декількох автономних гангліях. Визначено, що вони регулюють формування репертуару і активацію В-лімфоцитів, впливаючи на експресію антиген-специфічних рецепторів та костимуляторних молекул CD40. Показано, що нікотинові рецептори, експресовані в ранніх мієлоїдних і еритроїдних попередниках клітин крові в кістковому мозку, регулюють дозрівання цих клітин. Виявлено, що автоантитіла проти нікотинових рецепторів можуть бути причиною зниження кількості цих рецепторів в крові деяких пацієнтів з хворобою Альцгеймера, що складає основу для розробки альтернативних методів діагностики цього захворювання.

Ключові слова: нікотиновий ацетилхоліновий рецептор, В-лімфоцити, антитіла, автономні ганглії, хвороба Альцгеймера.

АННОТАЦИЯ

Скок М.В. Структура и функции никотиновых ацетилхолиновых рецепторов В-лимфоцитов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению никотиновых ацетилхолиновых рецепторов, а именно, установлению их субъединичного состава и возможных функций в В лимфоцитах сравнительно с нейронами вегетативных ганглиев. Представленные данные имеют важное теоретическое значение для понимания взаимодействия и общих механизмов функционирования иммунной и нервной систем, холинергической регуляции процессов кроветворения и влияния никотина на иммунные процессы.

В процессе выполнения исследований создан уникальный инструмент - функционально активные антитела против фрагментов альфа и бета субъединиц никотинового рецептора, которые фактически являются селективными блокаторами разных его субтипов. Использование таких антител позволило выяснить важные структурные особенности рецептора, в частности, конформацию соответствующего антигенного фрагмента, локализацию центра связывания метилликаконитина, характер пост-трансляционных модификаций и роль структурных субъединиц в функционировании рецептора. С помощью антител были идентифицированы основные субтипы никотиновых рецепторов в нескольких вегетативных ганглиях и показано, что их состав отражает функциональную гетерогенность нейронов как внутри ганглия, так и между ганглиями разной локализации. Методом связывания антител и радиоактивных лигандов установлена экспрессия двух субтипов никотинового рецептора в В-лимфоцитах и в предшественниках клеток крови. В функциональных тестах in vitro показано, что эти рецепторы опосредуют стимулирующее действие никотина на пролиферацию трансформированных В-лимфоцитов. На моделях мышей, нокаутных по генам отдельных субъединиц никотинового рецептора, и химерных мышей, которые содержали лишь часть клеток крови нокаутных животных, установлено, что никотиновые рецепторы регулируют как развитие лимфоцитов в первичных лимфоидных органах, так и их активацию в иммунном ответе. В частности, показано, что активация никотиновых рецепторов способствует выживанию предшественников В-лимфоцитов в ходе негативного отбора и тем самым расширению до-иммунного репертуара их антигенных специфичностей. В зрелых В-лимфоцитах никотиновые рецепторы сдерживают активацию и гуморальный иммунный ответ. Молекулярный механизм такого влияния связан с регуляцией экспрессии антиген-специфичного рецептора и костимуляторной молекулы СD40. Установлено, что никотиновые рецепторы двух субтипов: б4(б5)в2 и б7(б5в4), - выполняют разные функции в лимфоцитах и, возможно, отвечают на ацетилхолин разного происхождения.

Исследование роли никотиновых рецепторов в процессах кроветворения показало, что лимфоциты - не единственные клетки, дифференцировка которых регулируется через эти рецепторы. Экспрессия рецепторов двух субтипов была найдена в клетках костного мозга, а отсутствие или десенситизация этих рецепторов нарушала образование и созревание ранних миелоидных и эритроидных предшественников клеток крови.

Никотиновые рецепторы были идентифицированы также на лейкоцитах периферической крови людей. Зафиксировано их снижение у части больных болезнью Альцгеймера, которая также сопровождается уменьшением количества подобных рецепторов в мозге. Найдено, что причиной снижения количества никотиновых рецепторов на клетках крови могут быть аутоантитела. Таким образом, впервые показано, что одним из патогенных факторов болезни Альцгеймера может быть аутоиммунная реакция. Обнаружение связи между болезнью, снижением числа рецепторов на клетках крови и наличием аутоантител создает возможность разработки альтернативных методов диагностики этого заболевания.

Полученные данные устанавливают молекулярную основу холинергической регуляции гемопоэза, иммунопоэза и активации лимфоцитов и свидетельствуют о важной роли ацетилхолина не-нейронального происхождения как медиатора при кооперации иммунокомпетентных клеток.

Ключевые слова: никотиновый ацетилхолиновый рецептор, В-лимфоциты, антитела, вегетативные ганглии, болезнь Альцгеймера.

SUMMARY

Skok M.V. Structure and functions of nicotinic acetylcholine receptors of B lymphocytes. - Manuscript.

Thesis for a doctor's degree by specialty 03.00.04 - Biochemistry. - Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2006.

The thesis deals with the study of nicotinic acetylcholine receptors in B lymphocytes compared to the neurons of autonomic ganglia. The presented data helps to clarify the general mechanisms underlying functioning and interaction of nerve and immune systems, as well as cholinergic regulation of haemopoiesis and the effects of nicotine on immune reactions. The subunit composition of nicotinic receptors expressed in lymphocytes and in several autonomic ganglia has been identified. These receptors were shown to influence the antigen-specific repertoire of B lymphocytes and their activation during the immune response through B cell receptor and co-stimulatory molecule CD40. Nicotinic receptors expressed in the myeloid and erythroid blood cell precursors in the bone marrow regulate their maturation. Nicotinic receptors were found decreased in the blood leukocytes of some patients with Alzheimer disease due to the presence of autoantibodies that forms a basis for the development of alternative diagnostic tests of this disease.

Key words: nicotinic acetylcholine receptor, В lymphocytes, antibodies, autonomic ganglia, Alzheimer disease.

Размещено на Allbest.ru