Бета-лактамазная активность ротовой жидкости: происхождение феномена

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение образование "Витебский государственный медицинский университет""

Бета-лактамазная активность ротовой жидкости: происхождение феномена

Жильцов Иван Викторович

доктор медицинских наук

Как известно, в ротовой полости обитает большое количество (более 200 видов) разнообразных микроорганизмов - патогенных, условно-патогенных и непатогенных [6]. Многие из них способны вызывать гнойно-воспалительные поражения челюстно-лицевой области [8,20]. Ротовая микрофлора первой принимает на себя удар любых антибактериальных препаратов, поступающих в организм человека через рот (включая антибиотики, содержащиеся в пище). Ввиду этого, многие представители ротовой микрофлоры обладают устойчивостью к антибиотикам, нередко - сразу к нескольким. лактамазный ротовой жидкость воспалительный

Основной группой антибактериальных препаратов, наиболее часто используемых в клинической практике, являются бета-лактамы, которые в сумме составляют до 80% от всех применяемых антибиотиков [5]. Соответственно, устойчивость микроорганизмов ротовой полости к антибиотикам бета-лактамного ряда имеет наибольшее клиническое значение. Предполагается что данная устойчивость в первую очередь опосредуется бактериальными бета-лактамазами [5, 8,20]. На данный момент описаны 4 основных класса бета-лактамаз - А, В, С и D, причем наиболее распространены бета-лактамазы класса А (TEM и SHV). В клинической практике давно и успешно используются комбинации антибиотиков бета-лактамного ряда с известными ингибиторами бета-лактамаз класса А: ампициллин-сульбактам, амоксициллин-клавуланат, тикарциллин-клавуланат и пиперациллин-тазобактам [4,11].

Тем не менее, ферментативная деградация бета-лактамов вследствие продукции бета-лактамаз различными представителями микрофлоры ротовой полости - важный, но далеко не единственный механизм устойчивости бактерий к данным антибактериальным препаратам. Существует ряд существенных для клиники механизмов резистентности микроорганизмов к бета-лактамным антибиотикам: видоизмененные ПСБ со сниженной аффинностью к бета-лактамным антибиотикам, ускоренная эвакуация антибиотиков из бактериальной клетки с помощью мембранных молекулярных насосов ("помп"), снижение проницаемости наружных мембран бактерий для бета-лактамных антибиотиков [9, 10]. Описан также феномен продукции бета-лактамаз непатогенными бактериями ротовой полости, которые таким образом защищают патогенную микрофлору от воздействия бета-лактамов (т.н. "ко-патогенная" флора); при этом патогенные микроорганизмы могут сами не продуцировать бета-лактамазы [21].

Помимо этого, макроорганизм сам по себе небезразличен к введению антибиотиков. Данные соединения являются чужеродными для него, поэтому он стремится освободиться от них, используя различные пути и механизмы (система цитохромов P 450, почечные дегидропептидазы и т.д. [13,16]).

Следует также принять во внимание недавно описанный феномен т.н. "эндогенной" устойчивости к бета-лактамным антибиотикам за счет наличия бета-лактамазной активности у некоторых эндогенных факторов человеческого организма, прежде всего - у сывороточного альбумина [1,2]. Известно, что альбумин - один из основных белков ротовой жидкости, причем его концентрация может существенно расти при воспалительном процессе либо при кровоточивости слизистой полости рта [12]. Вклад альбумина в общий уровень бета-лактамазной активности ротовой жидкости никогда не изучался.

Уточнение природы бета-лактамазной активности ротовой жидкости позволило бы целенаправленно бороться с обусловленной ею неэффективностью бета-лактамных антибиотиков в лечении как терапевтических, так и хирургических гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области.

Объектом для исследования послужили образцы ротовой жидкости пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области, собранные в 2012-13 гг. на базе отделения челюстно-лицевой хирургии УЗ "Витебская областная клиническая больница №1".

Для выявления природы бета-лактамазной активности ротовой жидкости были выполнены следующие эксперименты:

1. Фракционирование образцов ротовой жидкости (n=4) при помощи препаративного диск-электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле. По завершении электрофореза столбики геля разрезались на равные фрагменты длиной 0,5 см, после чего изолированно определялась бета-лактамазная активность каждого из них; расположение белковых фракций выявлялось путем окраски контрольных столбиков геля красителем Кумасси R250.

2. Обработка образцов ротовой жидкости с наиболее выраженной бета-лактамазной активностью (n=10) взвесью гранул голубой сефарозы (реактив, 1 мг которого избирательно связывает до 11,0 мг человеческого сывороточного альбумина, практически не взаимодействуя с другими белками; CAS 66456-82-4) [17]. Данный эксперимент позволяет оценить долю бета-лактамазной активности ротовой жидкости, опосредованную сывороточным альбумином.

К 100 мкл проб ротовой жидкости добавлялось по 100 мкл взвеси гранул голубой сефарозы, смесь встряхивалась 30 минут, затем гранулы отделялись центрифугированием в течение 60 с при 14,5 тыс. об/мин.

3. Ингибирование бета-лактамазной активности образцов ротовой жидкости (n=16) раствором тазобактама (ингибитора бактериальных бета-лактамаз класса А) в конечной концентрации 5 мг/мл.

Образцы слюны сохранялись при ?20°С; непосредственно перед проведением исследования все пробы одновременно размораживались, после чего центрифугировались при 7.000 об/мин в течение 5 минут, затем отделялся прозрачный надосадок, который использовался в дальнейших исследованиях. В случае, если общий объем надосадка оказывался менее 0,2 мл, он доводился до 0,2 мл стерильным физиологическим раствором хлорида натрия.

Определение уровня бета-лактамазной активности ротовой жидкости выполнялось путем спектрофотометрической регистрации распада антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина, для чего использовалась тест-система "БиоЛактам" (ООО "СИВитал", РБ).

В основе тест-системы "БиоЛактам" лежит спектрофотометрическая методика, базирующаяся на изменении окраски синтетического антибиотика цефалоспоринового ряда нитроцефина при распаде его бета-лактамной связи. При этом происходит батохромный сдвиг в хромофорной системе молекулы, и максимум ее поглощения меняется с 390 нм на 486 нм. Нитроцефин разрушается всеми известными бета-лактамазами [14]. Бета-лактамазная активность оценивалась в % распада стандартного количества нитроцефина, вносимого в каждую анализируемую пробу. Эксперименты выполнялись в соответствии со стандартной методикой, изложенной в инструкции, прилагаемой к тест-системе.

Результаты и обсуждение

1. Исследование вклада человеческого сывороточного альбумина в суммарную бета-лактамазную активность ротовой жидкости

Обработка образцов ротовой жидкости взвесью гранул голубой сефарозы показала, что в 4 пробах из 10 включённых в данный эксперимент бета-лактамазная активность практически не изменилась после обработки, а в оставшихся 6 пробах - снизилась в среднем на 19,9±4,4% (см. рисунок 1). Средний уровень бета-лактамазной активности до обработки голубой сефарозой составил 72,7% (95% ДИ: 63,8…81,6; min 51,8 max 90,0), после обработки - 61,2% (95% ДИ: 46,7…75,7; min 30,7 max 88,1).

Как было указано ранее, голубая сефароза - коммерческий реагент, 1 мл гранул которого селективно связывает ?11,5 мг человеческого сывороточного альбумина (ЧСА), что позволяет оценить долю бета-лактамазной активности образцов ротовой жидкости, опосредованную исключительно альбумином.

Соответственно, результаты данного эксперимента показывают, что в 6 пробах ротовой жидкости бета-лактамазная активность совершенно не связана с присутствием ЧСА, в то время как в 4 оставшихся пробах ЧСА опосредует не более 20% суммарной бета-лактамазной активности ротовой жидкости.

Результаты ингибирования бета-лактамазной активности ротовой жидкости раствором тазобактама

Ингибирование бета-лактамазной активности проб ротовой жидкости раствором тазобактама в итоговой концентрации 5 мг/мл показало, что указанная активность в ходе эксперимента снизилась в среднем на 83,2±21,6%. Средний уровень бета-лактамазной активности проб до ингибирования составил 72,6% (95% ДИ: 66,7…78,5; min 55,5 max 91,2), после ингибирования - 11,2% (95% ДИ: 4,2…18,2; min 0 max 36,9).

При этом следует отметить, что в 10 из 16 исследованных проб (62,5%; 95% ДИ: 38,8…86,2) бета-лактамазная активность в результате ингибирования снизилась практически до нуля (уровень снижения составил 95-100% от исходного); это подтверждает, что бета-лактамазная активность в данных образцах ротовой жидкости связана исключительно с присутствием в них бактериальных бета-лактамаз класса А, поскольку тазобактам не взаимодействует с бета-лактамазами других классов, а бета-лактамазную активность ЧСА он ингибирует в значительно меньшей степени (в концентрации 5 мг/мл снижает собственную ферментативную активность альбумина на ?20% от исходной [1]).

Все 6 проб ротовой жидкости, в которых часть бета-лактамазной активности (суммарно до 16,8%) была обусловлена эндогенными факторами, имели явные примеси крови и/или воспалительного экссудата. Соответственно, данная активность, скорее всего, связана с особыми свойствами человеческого сывороточного альбумина, что хорошо согласуется с результатами предыдущего эксперимента, согласно которому, ЧСА может обуславливать до 19,9% суммарной бета-лактамазной активности ротовой жидкости.

Анализ бета-лактамазной активности изолированных белковых фракций ротовой жидкости

Фракционирование 4-х упомянутых ранее образцов ротовой жидкости с изолированным определением бета-лактамазной активности белковых фракций показало, что таковой активностью обладают многие белки, входящие в состав ротовой жидкости, и, в частности, сывороточный альбумин (молекулярная масса от 66,4 до 66,6 кДа [19]). Яркая полоса, соответствующая б-амилазе (58-62 кДа [17]), хорошо заметна на электрофореграммах ротовой жидкости (типичный пример приведён на рисунке 3).

Тем не менее, во всех четырёх случаях максимум указанной активности соответствовал белкам, молекулярная масса которых приблизительно соответствует 38,5-43,8 кДа. При этом в участках геля, соответствующих максимальному уровню бета-лактамазной активности, не было выявлено и документировано ни одной видимой глазом полосы окрашивания, что говорит об очень незначительной концентрации данных белков и, соответственно, об их очень высокой удельной бета-лактамазной активности, что нетипично для эндогенных белковых факторов макроорганизма наподобие ЧСА.

Известно, что молекулярная масса бета-лактамаз класса А, продуцируемых патогенными, условно-патогенными и непатогенными представителями микрофлоры полости рта (Morganellamorganii, Enterobactercloacae, Pseudomonasfluorescens, Psychrobacterimmobilis, Serratiamarcescens,Streptomycescacaoi, Morganellamorganii, Acinetobacterbaylyi, Pectobacteriumcarotovorum и др.), может находиться в интервале 38-44 кДа [3].

Таким образом, можно констатировать, что бета-лактамазная активность изученных образцов ротовой жидкости связана преимущественно с белками, отличающимися низкой концентрацией (на соответствующих участках электрофореграмм не видны окрашенные полосы), но высокой удельной бета-лактамазной активностью, и при этом имеющих молекулярную массу около 40 кДа, что существенно меньше, чем у человеческого сывороточного альбумина.

1. Бета-лактамазная активность ротовой жидкости преимущественно (на 80-100%) обусловлена белками с молекулярной массой 38-43 кДа, обладающими чрезвычайно высокой бета-лактамазной активностью на единицу массы, причём указанная активность эффективно (в среднем на 83% от исходной, max 100%, min 45%) подавляется ингибиторами бета-лактамаз класса А (в частности, тазобактамом). Помимо этого, данные белки не сорбируются гранулами голубой сефарозы, сохраняя свою активность в ротовой жидкости.

Указанные белки с наибольшей вероятностью являются бета-лактамазами класса А, продуцируемыми представителями патогенной, условно-патогенной и непатогенной микрофлоры полости рта;

2. В существенно меньшей степени (на 0-20%) бета-лактамазная активность ротовой жидкости обусловлена эндогенными факторами человеческого организма, прежде всего - человеческим сывороточным альбумином;

3. Наиболее очевидным способом преодоления высокой бета-лактамазной активности ротовой жидкости является использование для лечения профильных пациентов ингибитор-защищенных антибиотиков бета-лактамного ряда.

Библиографический список

1. Природа бета-лактамазной активности сыворотки крови: структура активного центра альбумина / И.В. Жильцов [и др.] // Медицинская панорама: рецензируемый научно-практический журнал для врачей и деловых кругов медицины. - Минск. - 2011. - №7 (124). - с. 49-54.

2. Природа бета-лактамазной активности сыворотки человеческой крови / И.В. Жильцов, И.С. Веремей, В.М. Семенов и др. // Медицинская панорама: рецензируемый научно-практический журнал для врачей и деловых кругов медицины. - Минск. - 2011. - №7 (124). - с. 31-35.

3. BRENDA - The Comprehensive Enzyme Information System. Information on EC 3.5.2.6 - beta-lactamases / [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http:// www.brenda-enzymes.info/enzyme.php?ecno=3.5.2.6#MOLECULAR WEIGHT. - Дата доступа: 22.01.2015.

4. Drawz, S.M. Three decades of beta-lactamase inhibitors / S.M. Drawz, R.A. Bonomo // Clin Microbiol Rev. - 2010. - Vol. 23, №1. - P. 160-201.

5. Elander, R. Industrial production of beta-lactam antibiotics / R. Elander // Applied microbiology and biotechnology. - 2003. - Vol. 61 (5-6). - P. 385-392.

6. Elisabeth, M. Bacterial diversity in the oral cavity of ten healthy individuals / M. Elisabeth, D. Clara, C. Gary et al. // ISME J. - 2010. - Vol. 4 (8). - P. 962-974.

7. Francesco D.G. Cibacron Blue and proteomics: the mystery of the platoon missing in action / Francesco D.G., Pier G.R., D'Amato A., Chung M. // J. Proteomics. - 2011. - Vol. 74 (12). - P. 2856-2865.

8. Guobis, Ю. Microflora of the oral cavity in patients with xerostomia / Ю. Guobis, V. Kareivienл, N. Baseviиienл et al. // Medicina (Kaunas). - 2011. - Vol. 47 (12). - P. 646-651.

9. Karbach, J. Multiple resistance to betalactam antibiotics, azithromycin or moxifloxacin in implant associated bacteria / J. Karbach, A.S. Callaway, B. Willershausen et al. // Clin. Lab. - 2013. - Vol. 59 (3-4). - P. 381-387.

10. Livermore, D.M. Mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics / D.M. Livermore // Scand. J. Infect. Dis. Suppl. - 1991. - Vol. 78. - P. 7-16.

11. Mealey, K.L. Penicillins and beta-lactamase inhibitor combinations / K.L. Mealey // J. Am. Vet. Med. Assoc. - 2001. - Vol. 218, №12. - P. 1893-1896.

12. Meurman, J.H. Salivary albumin and other constituents and their relation to oral and general health in the elderly / J.H. Meurman, P. Rantonen, H. Pajukoski, R. Sulkava // Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. - 2002. - Vol. 94 (4). - P. 432-438.

13. Moellering, R.C. The carbapenems: new broad spectrum beta-lactam antibiotics / R.C. Moellering, G.M. Eliopoulos, D.E. Sentochnik // J. Antimicrob. Chemother. - 1989. - Vol. 24, Suppl. A. - P. 1-7.

14. Novel method for detection of b-lactamases by using a chromogenic cephalosporin substrate / H.C. Callaghan [et al.] // Antimicrobial agents and chemotherapy. - 1972. - Vol. 1, №4. - P. 283-288.

15. Occurrence and mechanisms of resistance to beta-lactam antibiotics in clinically important species of Enterobacter / D. Michбlkovб-Papajovб [et al.] // Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. - 2001. - Vol. 50, №3. - P. 121-130.

16. Pea, F. Pharmacokinetic aspects of treating infections in the intensive care unit: focus on drug interactions / F. Pea, M. Furlanut // Clin. Pharmacokinet. - 2001. - Vol. 40, №11. - P. 833-868.

17. Peng, Y. Purification and high-resolution top-down mass spectrometric characterization of human salivary б-amylase / Y. Peng, X. Chen, T. Sato et al. // Anal. Chem. - 2012. - Vol. 84 (№7). - P. 3339-3346.

18. Putnam, F.W. The Plasma Proteins, 2nd Ed., Vol. 1 / Ed. F.W. Putnam // Academic Press, New York (1975). - pp. 133-181.

19. Prieto-Prieto, J. Microbiological basis of oral infections and sensitivity to antibiotics / J. Prieto-Prieto, A. Calvo // Med Oral Patol Oral Cir Bucal. - 2004. - Vol. 9, Suppl. 15-8. - P. 11-14.

20. Tets, V.V. Unknown pathogens from the human oral microflora of interest for otorhinolaryngology / V.V. Tets, G.V. Tets, D.S. Vikina et al. // Vestn. Otorinolaringol. - 2014. - Vol. 1. - P. 33-36.

21. Van Steenbergen, T.J.M. Pathogenic synergy: mixed infections in the oral cavity / T.J.M. van Steenbergen, A.J. van Winkelhoff, J. de Graaff // Antonie van Leeuwenhoek. - 1984. - Vol. 50, Issue 5-6. - P. 789-798.

Размещено на Allbest.ru