Индикация токсигенных Escherichia Coli с помощью инфузорий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Индикация токсигенных Escherichia Coli с помощью инфузорий

Терехов В.И. ГКУ КСББЖ

"Краснодарская", г. Краснодар

Несмотря на внедрение в животноводстве современных технологий, предусматривающих инновации не только в содержании, но и в ветеринарном сопровождении, проблемы инфекционных патологий и особенно факторных, остаются актуальными [9]. По-прежнему подавляющее количество случаев факторных болезней молодняка сельскохозяйственных животных, сопровождающихся диарейным синдромом, связано с Escheriohia coli [2].

Установлено, что в развитии массовых кишечных инфекций у молодняка животных в основном участвуют токсигенные E.coli, продуцирующие термолабильный (TL), термостабильный (TS), шигаподобные (STX I, II) и другие токсины [3, 8, 10, 12].

В настоящее время токсигенные E.coli выявляют с помощью методов, позволяющих обнаружить у бактерий как гены, отвечающие за выработку токсинов, так и собственно продуцируемые ими токсины. К ним относятся полимеразно-цепная реакция, твердофазный радиоиммунологический, ганглиозид-иммуноферментный метод, тест Бикена, реакция коагглютинации, культурально-клеточные исследования (цитотоксичность), проба отека мышиной лапы, метод лигирования петель кишечника кролика и анальная проба на мышах сосунах [3, 11]. Данные методы являются дорогостоящими, трудновоспроизводимыми, дефицитными по используемым реагентам, а некоторые из них не соответствуют требованиям комиссии по проблемам этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук.

Между тем лабораторной практике известен достаточно простой метод тестирования токсичности кормов (качественный метод определения наличия микотоксинов) с помощью инфузорий [1].

В связи с этим цель работы состояла в разработке метода биотестирования токсигенности E.coli с использованием инфузорий.

Материалы и методы исследований. В работе использовали инфузорий 4 видов - Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus, Colpoda steinii и Tetrahymena pyriformis. Культивирование инфузорий осуществляли в среде Лозина-Лозинского.

Тест-объектами служили непатогенный штамм E.coli М-17 (положительный контроль), являющийся пробиотическим (препарат "Колибактерин") и патогенные штаммы E.coli из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалея и изолированные от больных телят и поросят в из хозяйств Краснодарского края. Наличие генов патогенности устанавливали методом ДНК-диагностики в Центральном НИИ эпидемиологии (г. Москва) и НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея (г. Москва). Для выявления специфических участков ДНК генов шигатоксина I типа (STX 1), шигатоксина II типа (STX 2), термостабильного (ST) и термолабильного (LT) токсинов, цитотоксического некротизирующего фактора (0NF) и гемолизина (GEM) использовали тест-системы "АмплиСенс E.Coli-tox" ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ и экспериментально изготовленные тест-системы в ВНИИЭМ. Культивирование эшерихий осуществляли в бульоне Хоттингера, который служил также в качестве отрицательного контроля.

Алгоритм исследования состоял в следующем. На предметное стекло наносили 3 капли суточной среды культивирования инфузорий, после чего проводили подсчет их количества (для удобства подсчета желательно, чтобы количество инфузорий составляло 10-20 особей в поле зрения) с помощью бинокулярной лупы или микроскопа (увеличение 2 * 8), затем добавляли 1 каплю бульонной тест-культуры E.coli. Спустя 5 минут производили предварительный просмотр и подсчет количества живых инфузорий, для того чтобы исключить погрешность, связанную с влиянием различных факторов окружающей среды (запах, колебания температуры, осмотического давления), так как инфузории являются весьма чувствительными к ним. После просмотра, стекла с инфузориями помещали в чашки Петри, которые ставили в термостат с температурой 18-23°С (оптимальная для жизни инфузорий). Чтобы капли с инфузориями не высыхали, на дно чашки клали фильтровальную бумагу, смоченную водопроводной водой. По истечении 2-х часов производили окончательный подсчет числа живых инфузорий, который сравнивали с первоначальным значением. Погибшими считали только лизированные особи. Для получения наиболее достоверных данных, опыт дублировали 3 раза, после чего подсчитывали средний показатель.

Работа включала 3 этапа, по результатам которых предстояло:

· биотестирования токсигенности эшерихий на примере токсигенного штамма E.coli О157:Н7 с генами STX типов I и II из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалея;

· установить характер реагирования инфузорий на различные варианты токсигенных эшерихий, изолированных от больных животных в хозяйствах Краснодарского края - E.coli 546 (LT), E.coli 533 (ST), E.coli 44 (STX1, 2), E.coli 196 (GEM), E.coli 174(GEM, NF, STX);

· ыявить влияние продолжительности культивирования токсигенных эшерихий на жизнеспособность инфузорий.

Результаты исследований. Результаты первого этапа экспериментальной работы представлены в таблице 1, из которой видно, что различные виды инфузорий по-разному реагировали на культуры эшерихий. Так, инфузории видов Paramecium caudatum и Colpoda steinii не только не погибали, но даже в ряде случаев размножались в присутствии бульонных культур как не патогенной, так и патогенной кишечной палочки.

Инфузории вида Tetrahymena pyriformis оказались вообще не пригод-ными для тестирования эшерихий, поскольку они гибли как после добавления культуры токсигенного штамма E.coli О157Н7, так и пробиотического штамма E.coli M-17, а также стерильного бульона Хоттингера.

Инфузории Stylonychia mytilus в значительной степени реагировали на внесение культуры E.coli О157:Н7. Установлено, что количество погибших инфузорий после 2-часового контакта с культурой эшерихий данного штамма было достоверно большим, чем после контакта с бульоном Хоттингера и культурой апатогенной E.coli М-17.

Таблица 1. Чувствительность разных видов инфузорий к суточной культуре E.coli

* - Р<0,005 по отношению к контролю и E.coli М-17

Следовательно, результаты проведенных исследований показали, что для тестирования токсигенных эшерихий можно использовать лишь один вид инфузорий - Stylonychia mytilus, так как только он оказался специфически чувствительным к токсинам E.coli. Остальные виды инфузорий были либо вообще не чувствительными к продуктам метаболизма эшерихий (Paramecium caudatum и Colpoda steinii), либо наоборот - слишком чувствительными к ним и стерильной питательной среде (Tetrahymena pyriformis).

Существенным было то обстоятельство, что гибель стилонихий сопровождалась полным распадом клеток инфузориий, что весьма удобно при подсчете оставшихся в живых особей простейших.

Тестирование полевых штаммов эшерихий, у которых методом ДНК-диагностики было подтверждено наличие генов, отвечающих за образование различных токсинов, показало, что стилонихии по разному реагируют на культуральную среду различных вариантов бактерий. Как видно из материалов таблицы 2, все взятые в опыт штаммы E.coli реализуют свой генетический потенциал, продуцируя эк-зотоксины, обуславливающие в той или иной степени гибель инфузорий. Наибольшее (45,0±2,30%) количество погибших Ц инфузорий наблюдали после их контакта с культурой штамма E.coli 174, у которого установлены гены гемолизина, некротизирующего фактора и шигатоксина. Культуры эшерихий, вырабатывающих только шигатоксин (E.coli О157:Н7, E.coli 44 ) или термостабильный токсин (E.coli 533), обуславливали гибель порядка 18-23% инфузорий. Менее токсичной для Stylonychia mytilus оказалась культура штамма E.coli 546, продуцирующего только термолабильный токсин и культура штамма E.coli 196, продуцирующего только гемолизин. После 2-х часовой экспозиции стилонихий с данными культурами наблюдали гибель 7-13% инфузорий.

Таблица 2. Чувствительность инфузорий Stylonychia mytilus к суточным культурам эшерихий

* - Р<0,005 по отношению к контролю и E.coli М-17

В контроле гибель инфузорий была в пределах 1-2%, что может отражать их естественную гибель.

Таким образом, установлено, что Stylonychia mytilus обладают специфической чувствительностью к экзометаболитам патогенных эшерихий. В большей степени действуют летально на данных инфузорий шигатоксин и термостабильный токсин, в меньшей степени - термолабильный токсин и гемолизин. Наибольший процент гибели стилонихий вызывала культуральная среда E.coli 174, содержащая несколько токсических экзометаболитов.

Ряд авторов [4, 6, 7] указывает, что на жидких питательных средах, в том числе и бульоне Хоттингера пик накопления экзотоксинов кишечной палочки происходит в течение первых 12-24 часов. В тоже время для получения вакцинных препаратов, содержащих токсины возбудителей эшерихиоза Новак Д.Д. и Вульф ВТ. [5] предлагают культивировать бактерии не менее 5-7 дней. В связи с чем, был проведен опыт по изучению влияния продолжительности культивирования на накопление токсинов в питательной среде.

С этой целью для опыта отобрали 3 штамма E.coli, у которых методом многократных ПЦР-исследований было подтверждено постоянное наличие генов, отвечающих за выработку STX, LT и ST. В качестве контроля использовали стерильный бульон Хоттингера.

Результаты данного опыта отображены в таблице 3, из материалов которой видно, что накопление токсинов не ограничивается первыми сутками инкубации, а активно продолжается в течение последующих дней.

Таблица 3. Выживаемость инфузорий после прибавления к ним среды культивирования E.coli

Так, штамм E.coli 44, у которого выявлены гены, отвечающие за выработку STХ 1 и 2, в течение первых суток продуцировал токсин в минимальном количестве, при котором выживало 78,8±6,1% инфузорий. Однако, по прошествии 4-х суток в среде культивирования количество токсинов увеличилось на столько, что количество выживших инфузорий составляло 53,2±2,5%. На 7-е сутки инкубации культуральная среда содержала максимальное количество шигатоксинов, о чем свидетельствовала гибель 88% простейших.

Динамика накопления токсинов в питательной среде при культивировании E.coli 546 (LT) и 533 (ST) была схожей. Эти штаммы также начинали продуцировать токсины уже с первого дня культивирования, но в течение первых 3-х суток их количество было небольшим. Однако, начиная с 4-х суток, в культуральной среде концентрация токсинов начала резко нарастать, достинфузорий. Между тем, на 7-й день установили четкую тенденцию снижения токсичности культур этих штаммов, что могло быть связано с инактивацией токсинов в среде культивирования.

Следовательно, результат опыта показал, что выбранные нами штаммы E. coli действительно продуцируют экзотоксины, количество которых в питательной среде зависит от продолжительности культивирования бактерий. Так, для получения LT и ST необходимо культивировать продуцентов не менее 6 дней, но не более 7, а для STX - не менее 7 дней.

Заключение. Таким образом, индикацию токсигенных Exoli среди клинических изолятов можно осуществлять методом биотестирования с использованием инфузорий Stylonychia mytilus, которые высоко чувствительны не только к цитотоксинам (STX и NF), но и цитотонинам (LT и ST) возбудителя эшерихиоза. Кроме того, с помощью Stylonychia mytilus можно контролировать продукцию экзотоксинов E^oN и подбирать оптимальный режим культивирования для получения биопрепаратов.

Список литературы

1. Виноходов Д.О. Токсилокологические исследования кормов с использованием инфузорий. -СПб, 1995. -С.64-65.

2. Ефанова Л.И. Этиологическая структура факторных инфекций свиней и крупного рогатого скота в хозяйствах ЦЧЗ России / Л.И. Ефанова, О.А. Ман-журина, А.В.Степанов// Вестник Курской государственной сельскохозяйственной академии. -2012. -N°6. -С.71-72.

3. Зароза В.Г. Эшерихиоз телят. -М.: Агропромиздат, 1991.-239с.

4. Мартыненко Л.Д. Динамика накопления термолабильного энтеротоксина E. coli О148 на жидких питательных средах // Л.Д. Мартыненко, Т.Э. Калинина, В.В. Лобанов // Сборник научных трудов НИИЭиМ им Н.Ф. Гамалеи "Бактериальные токсины". -Москва, 1987. -С. 89-92.

5. Патент 2070819 Российская Федерация, МПК А61 К39/108 Способ получения вакцины против эшерихиоза телят /Д.Д.Новак, В Т Вульф. Опубл. 27.12.1996.

6. Паутова И.Г. Изучение условий культивирования штамма Н19 E.coli для получения шигеллоподобного токсина / И.Г Паутова, Ю.В. Вертиев, И.С. Николаева // Сборник научных трудов НИИЭиМ им Н.Ф. Гамалеи "Бактериальные токсины". -Москва, 1987. -С. 103-108.

7. Пирожков М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К. Пирожков // Дисс. док. вет. наук. -Москва, 2002. -298 с.

8. Терехов В.И. Антигенный состав и патогенные свойства штаммов Е. coli, изолированных от телят и поросят в Краснодарском крае / В.И. Терехов, Я.М. Караев, Н.В Когденко, Н.В. Коткова // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные. -2008. -N°4. -С. 6-8.

9. Шахов А.Е. Этиология факторных инфекций животных и меры их профилактики. / А.Е Шахов //Ветеринарная патология. -2005. -N°3. -С. 22-24.

10. El-Mahrouk I. Study of some virulence factors of E. coli from diarrheic sheep and goats / I.El-Mahrouk, A.M.O.M.G.Agour, A.M.Montasser // Bulletin of Ani-mal Health and Production in Africa. -2012. -Т.60. -N°2. -P.153-163.

11. Rouillard T. Detection et identification par PCR des facteurs de virulence de souches d'Escherichia coli responsables de diarrhees neonatales / T Rouillard, J.Guennec, P.Y. Moalic // Revista de Medicina Veterinaria. -2002. -Т.153. -N°4. -P.261-268.

12. Truszczynski M. Vaccines against porcine colibacillosis, particularly after weaning / M. Truszczynski, Z. Pejsak //Medycyna Weterynaryjna. -2014. -R.70. -N°1. -S.3-6.

биотестирование скот молодняк диарея

Резюме

Изучена возможность использования инфузорий с целью биотестирования токсигенных Escheriohia coli, вызывающих диарею у молодняка крупного рогатого скота и свиней. Было испытано 4 вида инфузорий - Paramecium caudatum, Stylonychia mytilus, Colpoda steinii и Tetrahymena pyriformis. Инфузорий выращивали на среде Лозина-Лозинского. Эшерихии инкубировали в бульоне Хоттингера. Суть метода заключалась в том, что на предметное стекло наносили 3 капли суточной среды культивирования инфузорий, после чего проводили подсчет их количества под увеличением 2 х 8, после чего добавляли 1 каплю бульонной тест-культуры E.coli. Спустя 5 минут производили предварительный, а через 2 ч окончательный просмотр и подсчет количества живых инфу-зорий.

Установлено, что инфузории видов Paramecium caudatum, Colpoda steinii и Tetrahymena pyriformis не пригодны для тестирования токсигенных свойств эшерихий, так как первые два не погибают при добавлении культуры патогенной E.coli, а третий вид напротив весьма чувствителен и погибает даже при добавлении стерильного бульона Хоттингера. Специфически чувствительным к экзотоксинам эшерихий оказался только вид Stylonychia mytilus. В наибольшей степени на стилонихии оказывают губительное влияние цито-токсины (STX, СNF) эшерихий, обуславливая гибель данных инфузорий при 2-часовой экспозиции с суточной культурой в количестве 22-47%. Под действием цитотонинов (TL, TS, GEM) эшерихий стилонихии погибали в меньшем количестве - 7-21%. Использование метода биотестирования на стилонихиях позволило установить, что накопление экзотоксинов в среде культивирования происходит в течение 6-7 дней. Однако культивирование энтеротоксигенных эшерихий более 6 дней приводит к инактивации TL-, TS-токсинов.

Ключевые слова: Escheriсhia coli, токсигенность, экзотоксины, шигатоксин, термолабильный токсин, термостабильный токсин, биотестирование, инфузории, Stylonychia mytilus

Размещено на Allbest.ru