Захисна дія похідних ксантину за умов гострого емоційного стресу в експерименті

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

Інститут фармакології та токсикології

14.03.05 - фармакологія

УДК:615.225.2:613.863

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ЗАХИСНА ДІЯ ПОХІДНИХ КСАНТИНУ ЗА УМОВ ГОСТРОГО ЕМОЦІЙНОГО СТРЕСУ В ЕКСПЕРИМЕНТІ

ЗУБОВА Є.О.

Київ - 2006

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедрі фармакології та медичної рецептури Харківського державного медичного університету, Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Киричок Людмила Трохимівна, Харківський державний медичний університет, професор кафедри фармакології та медичної рецептури (м. Харків)

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор ФРАНЦУЗОВА Стела Борисівна доктор медичних наук, професор, Заслужений діяч науки і техніки України Лук'янчук Віктор Дмитрович, Луганський державний медичний університет, завідувач кафедрою фармакології (м. Луганськ)

Провідна установа: Одеський державний медичний університет МОЗ України, кафедра загальної та клінічної фармакології (м. Одеса)

Захист відбудеться "_21_"_червня_____2006 р. о _15-00__ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.550.01 при Інституті фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м.Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсикології АМН України за адресою: 03057, м.Київ, вул. Ежена Потьє, 14.

Автореферат розісланий "_18_"_травня_____2006 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради,кандидат біологічних наук І.В. Данова

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В сучасних умовах напруженого життя та праці, коли стрес набув не тільки медичного, але й соціального значення, пошук фармакологічних засобів, що підвищують стійкість організму до дії стресових факторів, зберігає свою актуальність (М.Г. Пшенникова, 2001). перспективними стреспротекторами вважаються засоби, дія яких має безпосереднє відношення до природніх процесів захисту організму (Т.О. Дев'яткіна, 1990; Л.Т. Киричок із співавт., 1995), активація яких зберігає його дієздатність за умов стресу (В.І. Петров із співавт., 1996). До препаратів з антистресовими властивостями відносяться транквілізатори, ноотропи, регуляторні нейропептиди та нейроамінокислоти, інгібітори ренін-ангіотензинової системи й деякі інші засоби, антистресову дію яких продовжують інтенсивно вивчати (Я.В. Рожковський із співавт., 1996; Г.О. Сирова, 2005). Необхідність подальшого пошуку стреспротекторів пов'язана з тим, що більшість з існуючих засобів усуває тільки окремі симптоми стрес-синдрому в той час як його патологічні ланки характеризуються багатобічністю. Крім того, у кожної з перелічених фармакологічних груп є побічні ефекти, а саме - порушення уваги та виникнення лікарської залежності від транквілізаторів, тривалий латентний період в дії ноотропів, індивідуальна чутливість до нейропептидів і нейроамінокислот і т.і. Все це обмежує їх застосування для запобігання небезпечних наслідків стресу.

Виходячи з того, що загальною патогенетичною ланкою захворювань емоційно-стресового генезу є так званий "оксидативний стрес", який виникає у зв'язку з порушенням рівноваги між про- і антиоксидацією в бік переваги процесів ПОЛ, перспективними антистресовими засобами вважають антиоксиданти і антигіпоксанти (Т.О. Дев'яткіна із співавт., 2000; Т.А. Скачко-Волкова, 2002). В останні роки до них відносять похідні ксантину, які здатні нормалізувати стан окислювального гомеостазу організма, усувати зміни в прооксидантно-антиоксидантній системі, індуковані патологічними процесами. Ксантини відомі як клас сполук із широким спектром фармакологічних властивостей, завдяки яким вони знаходять широке застосування в клінічній практиці (Ю.Ф. Крилов, Є.І. Карамишева, 1991). В.Д. Лук'янчук із співавт. (1998) спостерігали позитивний вплив похідних ксантину в умовах гіпоксії замкнутого простору з гіпертермією, що дозволило рекомендувати їх в цих умовах як антигіпоксичні засоби. Разом з тим спеціальні дослідження антистресової дії ксантинів в літературі відсутні. Це обумовлює доцільність їх вивчення як засобів, що можуть запобігати виникненню негативних наслідків стресу, та з'ясування механізмів цієї дії з метою експериментального обгрунтування поширення можливостей їх використання в клінічній практиці.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана у відповідності до планової НДР кафедри фармакології та медичної рецептури Харківського державного медичного університету за темою "Пошук шляхів фармакологічної корекції несприятливих наслідків стресу" (№ держ. реєстрації 0103U004548).

Мета дослідження. Експериментальне обгрунтування доцільності використання похідних ксантину для захисту від порушень, викликаних гострим емоційним стресом.

Для досягнення поставленої мети при виконанні дисертаційної роботи були визначені наступні задачі:

1. Дослідити вплив похідних ксантину - кофеїну, еуфіліну, пентоксифіліну - на стан ЦНС при експериментальному емоційному стресі за даними сумаційної здібності, емоційно-поведінкових реакцій щурів та морфології головного мозку.

2. Вивчити вплив кофеїну, еуфіліну, пентоксифіліну на стан гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи при емоційному стресі за інтегральними (коефіцієнти маси лімфоїдних органів та наднирників, еозинофіли крові, стан слизової оболонки шлунку), функціональними (вітамін С і 11-ОКС наднирників та в плазмі крові) й патоморфологічними даними.

3. Встановити дію похідних ксантину на рівень адреналіну й норадреналіну, а також активність ацетілхолінестерази в крові та головному мозку в умовах модельного емоційного стресу.

4. Дослідити вплив похідних ксантину на показники крові й головного мозку, що відображають процеси ПОЛ (дієнові кон'югати, ТБК-активні продукти) і ферментативної антиоксидантної системи (СОД, каталаза) у щурів за умов емоційного стресу.

5. Визначити дію похідних ксантину на показники ЕКГ і рівень артеріального тиску в умовах експериментального емоційного стресу.

6. Вивчити в тих же експериментальних умовах вплив кофеїну, еуфіліну, пентоксифіліну на рівень в крові і в головному мозку цАМФ і цГМФ, що дозволить поглибити уяву про механізм антистресової дії похідних ксантину.

7. Встановити кореляційні закономірності змін між рівнем цАМФ, цГМФ крові й тканини головного мозку з іншими вивченими показниками антистресової дії похідних ксантину.

8. Провести порівняльний аналіз захисних властивостей досліджених препаратів в умовах емоційного стресу і виявити серед них найбільш ефективний лікарський засіб.

Об'єкт дослідження - білі щури лінії Вістар з моделлю гострого емоційного стресу.

Предмет дослідження - захисна еффективність похідних ксантину ( кофеїну, еуфіліну і пентоксифіліну) в умовах експериментального емоційного стресу.

Методи дослідження. В роботі використано фармакологічні, фізіологічні, біохімічні, патоморфологічні і статистично-кореляційні методи дослідження.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше в експерименті виявлено захисну дію похідних ксантину за умов емоційного стресу. Встановлено, що вивчені препарати, особливо пнтоксифілін, запобігають виникненню змін з боку центральної нервової, вегетативної, ендокринної, серцево-судинної систем та процесів антиоксидантного захисту організму, включаючи в-ліпопротеїди, показники ПОЛ, активність антиоксидантних ферментів, цАМФ і цГМФ крові й мозку. Вперше встановлено характер центральної дії диметилксантинів в умовах емоційного стресу, який проявився збільшенням сумаційно-порогового показника, попередженням порушень з боку рухових реакцій і дослідницької поведінки щурів у "відкритому полі", покращенням процесу навчання і збереження пам'яті.

Новими є поглиблені дані про захисну дію похідних ксантину при емоційному стресі за рахунок впливу на стан наднирників, вегетативну регуляцію (холінергічну>адренергічну) та прооксидантно-антиоксидантну рівновагу. Новизною характеризуються і дані щодо участі у механізмі антистресової дії ксантинів цАМФ і цГМФ за даними їх кількості як в сироватці крові, так і в тканині головного мозку. Новим є і сформульоване в роботі уявлення про можливість використання цАМФ і цГМФ для оцінки ступеня стресового напруження, в тому числі й на тлі дії вивчаємих лікарських засобів.

Вперше на підставі кількісної оцінки вираженості антистресової дії похідних ксантину встановлено, що ефективність пентоксифіліну в умовах емоційного стресу перевищує активність пірацетаму.

Практичне значення і впровадження результатів роботи в практику. Експериментально обумовлена доцільність використання похідного ксантину - пентоксифіліну для попередження порушень, які виникають при дії гострого емоційного стресу, або для захисту від них при захворюваннях стресового генезу. За матеріалами дисертації підготовлений і виданий інформаційний листок "Пентоксифиллин: новые свойства для профилактики заболеваний стрессового генеза" (Харків, 2004).

Результати дисертаційної роботи впроваджено у навчальний процес на кафедрах фармакології Національного фармацевтичного університету України, Луганського державного медичного університету, Вінницького національного медичного університету і на кафедрі патологічної фізіології Харківського державного медичного університету.

Особистий внесок дисертанта. Автор самостійно провів патентно-інформаційний пошук, виконав усі заплановані електрофізіологічні, фармакологічні і біохімічні дослідження. Патоморфологічне дослідження головного мозку, наднирників, тимусу і селезінки було проведено за методичною допомогою доцента кафедри патологічної анатомії ХДМУ, канд. мед. наук О.А. Омельченко. Дисертант самостійно провів статистичну обробку цифрового матеріалу, виконав кореляційний аналіз залежності між кількістю цАМФ і цГМФ крові і мозку та показниками стану вивчених систем і органів, а також узагальнив результати дослідження, сформулював основні положення і висновки дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні фрагменти роботи доповідалися на Всеукраїнській науковій конференції студентів, аспірантів, клінічних ординаторів "Стрес, шок, термінальні стани" (Донецьк, 2003); 58й науково-практичній конференції студентів і молодих вчених Національного медичного університету імені О.О. Богомольця з міжнародною участю "Актуальні проблеми сучасної медицини" (Киів, 2003); міжвузівській конференції молодих вчених "Медицина третього тисячоліття" (Харків, 2004); науковій конференції студентів і молодих вчених з міжнародною участю (Вінниця, 2004); IV Українській науково-практичній конференції з міжнародоною участю по клінічній фармакології на тему: "Актуальні питання фармакології" (Вінниця, 2004).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 11 наукових робіт, з них 6 статей у виданнях, рекомендованих ВАК України, 5 робіт - в матеріалах і тезах з'їздів і конференцій, 1 інформаційний лист. Серед друкованих праць 7 самостійних (3 статті і 4 тези доповідей).

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 181 сторінці і складається із вступу, огляду літератури, розділу "Матеріал і методи дослідження", 5 розділів власних досліджень, обговорення одержаних даних, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел, який містить 264 публікації, з яких 216 іноземних. Робота ілюстрована 25 таблицями і 38 рисунками.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріал та методи дослідження. Згідно меті і задачам дослідження для виявлення антистресових властивостей похідних ксантину було вивчено в експерименті їх вплив на: центральну нервову, гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникову, вегето-медіаторну, метаболічну і серцево-судинну системи в умовах гострого емоційного стресу (ЕС).

Для моделювання Ес була використана запропонована проф. Ф.П. Вєдяєвим (1983) реалістична модель емоційного стресу "Конфлікт аферентних подразнень". Згідно цієї методики, кожну дослідну групу щурів розміщували у спеціально змонтованій камері, де тварини піддавались послідовному нерегулярному подразненню світлом (електрична лампочка 300 Вт, 5-20 с), звуком (електричний дзвоник 60 Дб, 5-15 с) і електричним струмом (прамокутні імпульси 60 В, 50 Гц, 5-15 мс). Подразники включались автоматично за заданою програмою в випадковій послідовності протягом 4 і 2 годин 2 дні підряд.

Із числа ксантинів досліджувалися триметилксантин кофеїн, диметилксантин на основі теофіліну еуфілін і диметилксантин на основі теоброміну пентоксифілін, які мають різний характер фармакологічної дії.

Препаратом порівняння було обрано відомий стреспротектор пірацетам, який є циклічним похідним ГАМК із групи ноотропів і виявляє стимулюючу дію на пізнавальні процеси, навчання, пам'ять, увагу, а також розумову працездатність без розвитку седативного та психостимулюючого ефекту.

Препарати, що досліджувалися, були вітчизняного виробництва (кофеїн - ДЗ ДНЦЛЗ, м. Харків; еуфілін - фарм. фірма “Дарниця”, м. Киів; пентоксифілін - ТОВ “Фарм. компанія “Здоров'я”, м. Харків; пірацетам - АТ “Галичфарм”, м. Львів), вводились у дозах, апробованих в експериментальних роботах за умов гіпоксії з перегріванням в замкнутому просторі (І.П. Бєлоусова, 2000; О.А. Коробков, 2002): кофеін (100 мг/кг), еуфілін (100 мг/кг), пентоксифілін (100 мг/кг) і пірацетам (150 мг/кг) - на різних моделях ЕС (А.Н. Іноземцев, 1996; Е.В. Карнаух, 2001). Препарати вводили внутрішньошлунково через зонд дворазово у перший і другий день моделювання ЕС перед початком стресування. Досліди проводили у першій половині дня.

Основна частина дослідів проведена на білих половозрілих щурах-самцях лінії WAG популяції Вістар з масою тіла 150,0-250,0 г. Усього в роботі використано 420 тварин. Утримання і використання в експерименті тварин відповідало вимогам "Європейської конвенції по захисту хребетних тварин, яких використовують з експериментальною і науковою метою" (Страсбург, 1986).

Експериментальні тварини були розподілені на 6 груп по 6 особин у кожній. I група - інтактні щури, які утримувалися в умовах віварію і служили контролем; ІІ група - тварини, які піддавалися впливу гострого ЕС; ІІІ-V групи - тварини, які зазнавали впливу ЕС з попереднім введенням одного із досліджуваних препаратів. Щурам VІ групи вводили в аналогічних умовах препарат порівняння - пірацетам.

Центральну нейротропну дію препаратів визначали за величиною сумаційно-порогового показника (СПП), який відображає поріг безумовно-рефлекторної рухової реакції щурів на мінімальне напруження електричного струму (С.В. Сперанський, 1965). Емоційно-поведінкові реакції і рухову активність тварин вивчали у "відкритому полі" за G.S. Hall (Д.А. Кулагін, В.Н. Федоров, 1969). Горизонтальну рухливість визначали за кількістю пересічених твариною квадратів, поведінкові реакції оцінювали за числом обстежених отворів і числом ставань на задні лапки, а емоційні реакції - за числом вмивань, уринацій і фекальних шариків за час перебування щура у "відкритому полі". За допомогою методики умовної реакції пасивного уникнення (УРПУ) вивчали вплив препаратів на процеси формування пам'яті (фіксацію, консолідацію, відтворення) та її зберігання (Л.А. Громов, П.І. Середа, 1992).

Стан гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи досліджували за даними коефіцієнтів маси наднирників, тимуса, селезінки, стан слизової оболонки шлунку за наявністю виразок і крововиливів, вмістом еозинофілів в крові. Крім цих інтегральних показників, визначали рівень 11-ОКС у наднирниках і плазмі крові (Ю.А. Панков, І.Я. Усватова, 1965; P. De Moor at al., 1960), вміст вітаміну С в наднирниках (R.W. Birch еt al., 1933), а також проведено патоморфологічні дослідження органів-мішеней (головний мозок, тимус, наднирники, селезінка). Знеживлювання щурів здійснювали шляхом одномоментної декапітації під ефірним наркозом.

Про стан адренергічної медіаторної ланки стресової реакції судили за вмістом моноамінів - адреналіну і норадреналіну - в крові і в тканині головного мозку, який визначали флюорометричним методом на спектрофлюориметрі Hitachi 650-10S за В.О. Осинською (1965). Стан холінергічної медіації визначали за активністю холінестерази в сироватці крові і гомогенаті головного мозку титруванням уксусної кислоти, яка утворюється в умовах досліду при ферментативному гідролізі введеного в середовище ацетилхоліну, і виражали в відсотках розкладеного ацетилхоліну (С.Р. Зубкова, Т.В. Правдич-Немінська, 1947).

Особливу увагу було приділено порушенню рівноваги між інтенсивністю перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) і антиоксидантною активністю (АОА) в умовах ЕС і на тлі введення похідних ксантину. З компонентів ліпопротеїдного спектру плазми крові було вивчено вміст фракції з найбільш виразними прооксидантними властивостями - бета-ліпопротеїдів (в-ЛП), - турбідиметричним методом за Бурштейном-Самаєм (1968). Про інтенсивність процесів ПОЛ судили за накопиченням дієнових кон'югатів та ТБК-активних продуктів - малонового діальдегіду в крові і головному мозку. Активність АО-системи оцінювали за вмістом супероксиддисмутази і каталази в тих же тканинах (С. Чеварі із співавт., 1985; 1991).

Про стан серцево-судинної системи щурів судили за даними ЕКГ і електроп'єзографії. Вказані електрофізіологічні методи дослідження проводили під легким ефірним наркозом, вплив якого на реєстровані показники був незначним і мав місце як у досліді, так і в контролі. Біоелектричну активність міокарду щурів реєстрували на електрокардіографі "Салют" у ІІ стандартному відведенні з використанням гольчастих електродів зі швидкістю лентопротяжки 50 мм/с і калібровочним імпульсом 10 мм=1 мВ (В.В. Мурашко, А.В. Струтинський, 1991). Рівень артеріального тиску на хвостовій артерії щурів визначали електроп'єзографічним методом (М.С. Расін із співавт., 1971).

Для виявлення деяких сторін механізму антистресової дії ксантинів в умовах ЕС вивчено вміст циклічного аденозин-3,5-монофосфата (цАМФ) і циклічного гуанін-3,5-монофосфата (цГМФ), а також їх співвідношення в плазмі крові і гомогенаті цільного мозку методом імуноферментного аналізу за допомогою наборів фірми "Интерлок" (Москва).

Всі експериментальні дані отримано на апаратурі, яка регулярно метрологічно контролювалася, про що є відповідні свідоцтва.

Цифровий матеріал оброблено загальноприйнятим у медико-біологічних дослідженнях методом варіаційної статистики. Для оцінки достовірності отриманих результатів (Р) використано критерій “t” Ст'юдента, а зміни, що спостерігалися, розцінювались як статистично достовірні при Р?0,05. В залежності від постановки дослідів і використаних методів експерименту зіставлення дії досліджуваних препаратів проводили вихідним фоном, або з контролем, а також з ЕС і між собою.

Прояв антистресової дії визначали за допомогою методів, де отриманий цифровий матеріал дорівнювали до умовних балів (Ю.І. Добряков, 1978; Л.Т. Киричок, 1979; О.М. Важнича, Т.О. Дев'яткіна, 2001). Шляхом порівняльної оцінки ефективності ксантинів щодо показників, які характеризують послаблення вивченого стрес-синдрому, визначали препарат з найбільш виразними антистресовими властивостями.

Оцінка участі цАМФ і цГМФ в механізмі антистресової дії ксантинів виконана за допомогою коефіцієнта кореляції Пірсона (В.Г. Книгавко із співавт., 1997), що дало можливість встановити ступінь щільності кореляційного зв'язку між ними в крові і в головному мозку та іншими показниками і на цій підставі отримати уяву про зв'язок захисної дії вивчених препаратів за умов ЕС із станом ключових ланок окислювального метаболізму.

3. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив похідних ксантину на стан центральної нервової системи в умовах емоційного стресу. На тлі функціональних та структурних нейротропних наслідків ЕС, що свідчать про перевагу в цих умовах процесів збудження, ксантини виявляють захисну дію, підсилюючи процеси гальмування в ЦНС (за СПП, який збільшується у порівнянні з ЕС), запобігаючи порушенню рухливих реакцій і дослідницької поведінки у "відкритому полі", покращуючи процес навчання і сприяючи збереженню короткострокової і довгострокової пам'яті (за даними УРПУ). На емоційні реакції ксантини діють по-різному, підсилюючи уринацію подібно до ЕС і стабілізуючи дефекацію на рівні контролю (табл. 1). Структурні зміни проявляються збереженням архітектоніки кори головного мозку на рівні інтактного контролю.

При зіставленні описаних ефектів між препаратами відмічена односпрямованість у характері ефектів, ступінь яких частіше однакова, а інколи переважає у пентоксифіліна. Його ефекти, як більш активного, відповідають дії препарата порівняння, а в окремих дослідах - перевищують її (УРПУ). Схожість ефектів ксантинів з дією пірацетама за умов ЕС дозволяє судити про них , як про стреспротектори метаболічної дії (Т.А. Вороніна, С.Б. Середенін, 1998; Г.М. Молодавкін із співавт., 2002) з позитивним впливом на функції головного мозку.

Вплив похідних ксантину на стан гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи (ГГНС) в умовах емоційного стресу. ГГНС є ендокринним регулятором захисних процесів в організмі (є.М. Горбань із співавт., 1998) на підставі складної реакції, яка формується за участю ЦНС на гіпоталамо-гіпофізарному рівні й проявляється з боку наднирників. Відповідно результатам багатьох досліджень антистресових ефектів (Є.В. Бєлова, 1993; Т.М. Мішуніна, В.Я. Кононенко, 2001; А.Б. Трефілов, 2004) в умовах наших дослідів зі стресом спостерігалося (табл. 1) статистично достовірне зменшення коефіцієнтів маси тимусу й селезінки, виразлива еозинопенія й виразково-дистрофічний процес у шлунку (індекс Паулса 0,65 бала при 0 в контролі). З боку наднирників відмічено збільшення їх маси при зниженні вмісту вітаміну С та підвищенні в них і в плазмі крові 11-ОКС. Характер структурних змін свідчить про функціональне напруження органів-мишеней ГГНС, не виключаючи їх виснаження при більш тривалому впливі стреса. Похідні ксантину в однаковій мірі захищають ГГНС від впливу ЕС. Це проявляється збереженням контрольного рівню коефіцієнтів маси лімфоїдних органів (тимуса, селезінки), антиеозинопенічним ефектом і нормалізацією стану слизової шлунку. Разом з цим, ксантини однозначно за характером і силою дії захищають функціональний стан наднирників, про що свідчать їх вагові коефіцієнти і С-вітамінний баланс із взаємопов'язаним з ним рівнем 11-ОКС в наднирниках і в крові.

Відмічені захисні ефекти ксантинів по відношенню до ГГНС доповнюються і патоморфологічними даними, які відображають збереження структури і стратифікації в корі і мозковому шарі наднирників та менш виразну у порівнянні з ЕС гіперплазію і гіпертрофію їх функціонуючих клітин; у вилочковій залозі - нормальні морфологічні ознаки лімфоцитопоезу і епітеліоретикулопоезу з підсиленням апоптозу кортикальних тимоцитів на тлі виразної макрофагальної реакції; в селезінці - появу великих фолікулів з активними центрами розмножування, покращення кровопостачання (розширення судин) і нормалізацію співвідношення білої і червоної пульпи. така структура органів, що відображують стан ГГНС, наближується до контролю й свідчить про відсутність ознак стресового напруження. У всіх цих дослідах ефекти вивчених препаратів зіставлюються між собою та з ефектами пірацетаму, що свідчить про неспецифічність ГГН-механізму антистресової дії похідних ксантину.

Вплив похідних ксантину на стан вегето-медіаторних процесів в умовах емоційного стресу. ЕС в наших дослідах супроводжується підвищенням симпатичного і парасимпатичного тонусу, про що можна судити (табл. 1) за збільшенням вмісту катехоламінів (адреналін>норадреналін) в крові і в головному мозку, а також за зниженням активності холінестерази в тих самих субстратах, що свідчить про збільшення в них кількості ацетилхоліну. Виходячи із отриманих даних у відсотках, вегето-медіаторна рівновага при цьому практично не порушується: вміст адреналіну у досліджуваних тканинах збільшується на 70-71%, а кількість ацетилхоліну - на 71-76%.

Аналіз ефектів вивчених препаратів показав, що під їх впливом активному збереженню підлягає холінергічний тонус: усі препарати в однаковому ступені підтримують, як і пірацетам, активність холінестерази в крові і в головному мозку.

Таблиця 1 Вплив похідних ксантину на стан центральних нейроендокринних та вегето-медіаторних показників у щурів за умов емоційного стресу

Примітки в цій та табл. 2: * - Р<0,05 порівняно з контролем; ** - Р<0,05 порівняно з ЕС.

З боку адренергічної медіації стабілізація нормального рівня стосується норадреналіна крові (кофеїн=еуфілін=пентоксифілін) і мозку (кофеїн=еуфілін). Кількість адреналіна зберігається на рівні ЕС в крові з вираженою тенденцією до нормалізації в мозку. При цьому пірацетам не надає захисної дії симпато-адреналовому тонусу.

Як видно, застосування похідних ксантину в умовах ЕС призводить в цілому до зниження вегето-медіаторного тонусу, відновлюючи в більшій мірі холінергічну ланку і тільки частково - адренергічну. Виходячи з даних літератури, треба вважати, що захисний антистресовий вплив похідних ксантину на рівні вегето-медіаторної ланки стрес-стимульованої системи забезпечується шляхом відновлення тих його компонентів (ацетилхолін, норадреналін), які забезпечують тривале збереження компенсаторно-пристосувальних можливостей організму (М.Л. Хачатур'ян, Р.А. Серов, 1991; В.Г. Шаляпіна, 1996; А.Н. Арипов, Н.М. Акбарова, 1994; І.П. Бєлоусова, 2000). наднирковий стрес адреналін мозок

Вплив похідних ксантину на окислювальну рівновагу в умовах емоційного стресу. Гострий ЕС в організмі експериментальних тварин активує вільнорадикальне ПОЛ у вигляді зростання рівня ДК і ТБК-активних продуктів (ТБК-АП) в головному мозку і сироватці крові, з одночасною активацією АОС в тих самих тканинах (табл. 2). Ці порушення поєднуються з порушенням ліпідного обміну у вигляді збільшення рівню в-ЛП в сироватці крові. В умовах наших дослідів відмічено більш виразне збільшення вмісту ДК і ТБК-АП, поряд з відставанням захисної ферментативної активності, з чого витікає наявність порушення окислювальної рівноваги в бік переваги процесів пероксидації над антиоксидантним захистом. Односпрямованість цих змін в головному мозку і в крові підтверджує типовий характер стресового впливу у вигляді розвитку оксидативного стресу, ступінь якого більш виражена в системі крові, ніж в нервовій тканині.

Вивчені похідні ксантину істотно попереджають зниження показників ПОЛ у порівнянні з ЕС, але в більшості дослідів не забезпечують досягнення контрольного рівня. Цей характер зсуву більш виражений в крові у порівнянні з головним мозком і більш приближений до пірацетаму у кофеїна. Активність АОС в дослідах з введенням похідних ксантину утримується на рівні ЕС в крові (еуфілін, пентоксифілін) і в головному мозку (усі препарати, включаючи і пірацетам); в решті випадків - зберігається на рівні контрольних цифр.

Як видно, похідні ксантину вирівнюють біоокислювальну рівновагу, головним чином, послаблюючи процеси пероксидації і зберігаючи антиоксидантний захист організма на рівні ЕС або контроля. Це позитивно відображається і на загальному рівні в-ЛП крові. Одержані дані підтверджують наше уявлення про ксантини як про стреспротектори метаболічної дії, включаючи до неї властивість зберігати нормальний стан окислювального гомеостазу (R. Tanaka, 1997). Порівняльний аналіз ксантинових препаратів між собою не виявив закономірної переваги в дії якогось з них, в тому числі й пірацетаму, що дає підставу думати про неспецифічний захист, який завдяки зв'язку внутріклітинного АЦ-комплекса з багаточисельними рецепторами різних типів набуває якісно неоднаковий характер з боку окремих органів (П.А. Кометіані, 1974; В.П. Кухар із співавт., 1991; І.С. Чекман, 1991).

Таблиця 2 Вплив похідних ксантину на окислювальний метаболізм у щурів за умов емоційного стресу

Вплив похідних ксантину на стан серцево-судинної системи в умовах емоційного стресу. Гострий ЕС викликає порушення біоелектричної активності і скорочувальної функції міокарда у поєднанні з розвитком функціональної патології за гіперкінетичним типом. Електрична нестабільність виявляється розвитком тахікардії (рис. 1). При цьому характерними змінами на ЕКГ є депресія та інверсія зубця Т, що свідчить про наявність гіпоксії міокарда, і ішемічне зміщення сегмента S-T відносно ізоелектричної лінії. У тварин розвивається артеріальна гіпертензія.

Попереднє введення усіх досліджуваних препаратів, за винятком кофеїна, зберігає ЧСС у порівнянні з ЕС на вихідному рівні. Амплітуда зубця R залишається нормальною під впливом еуфіліна і пентоксифіліна, у відповідь на введення кофеїна і пірацетама спостерігається тенденція до її збереження. Амплітуда зубця Т підвищується у порівнянні з ЕС тільки після введення кофеїна, під впливом решти препаратів відмічається тенденція до її відновлення. Введення еуфіліна і пентоксифіліна повністю усуває зміщення сегмента S-T відносно ізоелектричної лінії, а введення кофеїна і пірацетама лише частково - у 50% і 67% тварин відповідно. АТ відповідає вихідному рівню в дослідах з еуфіліном і пентоксифіліном; кофеїн не захищає цей показник, який в даних умовах досягає рівню стреса. Виявлена захисна дія еуфіліна і пентоксифіліна, особливо по відношенню до АТ, виражена краще, ніж у препарата порівняння - пірацетама. Як видно, похідні ксантину мають помірну тканинну специфічність, а особливості їх дії на серцево-судинну систему можуть залежати від співвідношення ферментативного й рецепторного механізмів в фармакологічному ефекті (І.С. Чекман, 1991).

Оцінка антистресової дії похідних ксантину. Встановлена превентивна антистресова дія похідних ксантину підтверджена розрахунковими методами. відповідно до одного з них (О.М. Важнича, Т.О. Дев'яткіна, 2001), де цифровий матеріал виражено в балах із знаками "+" або "-", які свідчать про напрямок вивченої дії, позитивна алгебраїчна сума балів вказує на наявність антистресової дії. Виходячи з цього, всі вивчені ксантинові препарати володіють антистресовою активністю в межах +16 і +20 балів, що відповідає силі стреспротекторного впливу пірацетаму із 17 балів. При цьому найбільша ефективність відзначається у пентоксифіліна (20 балів), менша - у еуфіліна (18 балів) й найменша - у кофеїна (16 балів).

Вплив похідних ксантину на вторинні месенджери ключових внутрішньоклітинних сигнальних систем в умовах емоційного стресу. Як видно із табл. 2, ЕС призводить до зміни в крові і в мозковій тканині рівня цАМФ і цГМФ, які в обох тканинах носять різнонаправлений характер, відображуючи перевагу стрес-стимульованих реакцій (цАМФ) над антистресовими (цГМФ), що більше виражено в крові, ніж в головному мозку (П.А. Кометіані, 1974).

Вивчені похідні ксантину викликають в різній мірі позитивну динаміку внутрішньоклітинних нуклеотидів. Найбільш активним препаратом є пентоксифілін, який зберігає рівень обох показників в мозку і цАМФ - в крові, перевищуючи ефект пірацетаму. Еуфілін однобічно знижує рівень цАМФ головного мозку. Усі інші ефекти, в т.ч. у кофеїна і пірацетама, проявляються тенденцією до зберігання контрольного рівню. Ця залежність добре відображається й в співвідношенні вивчених вторинних месенджерів (рис. 2), тим більше, що саме співвідношення у щурів за умов емоційного стресу за показниками ЕКГ та рівнем АТ;

А-ЧСС; Б-зубець R; В-зубець Т; Г-рівень АТ.

цАМФ і цГМФ в різних біосубстратах, навіть у сечі, вважається характерним і надійним критерієм для оцінки цАМФ- і цГМФ-залежного метаболізму, особливо в умовах патології (В.І. Лущак, 2000).

Роль внутрішньоклітинних сигнальних систем в антистресовій дії похідних ксантину за даними кореляційного аналізу. Використовуюючи кореляційний аналіз, нами було встановлено тісний лінійний взаємозв'язок між цАМФ і цГМФ в крові та в мозковій тканині (зворотня залежність), а також між кожним з цих посередників й деякими показниками головних ланок стрес-стимульованої системи. Ці результати об'єктивно підтверджують наше припущення про участь внутрішньоклітинних сигнальних систем у розвитку стресових порушень і в той же час доводять їх роль як об'єктів фармакологічної дії похідних ксантинів, що обумовлює профілактичний антистресовий ефект останніх по відношенню до тих же функцій. При цьому ГЦ-система на фоні ЕС, що моделювали, як антистресова, веде себе більш стабільно, ніж АЦ-система, яка особливо в крові, активніше реагує на ЕС, залучаючи до його несприятливого впливу велику кількість пов'язаних з нею реакцій.

Наявність визначеного числа показників функціонального стану основних захисних систем, що тісно корелюють й з АЦ-, й з ГЦ-системами, свідчить про те, що обидві вони, а саме їх вторинні месенджери як на тканинному, так і на транспортному рівні приймають участь в механізмі антистресової дії похідних ксантину. Головний напрямок цього впливу проявляється послабленням стрес-реактивної АЦ-системи та підсиленням стрес-лімітуючої ГЦ-системи.

Порівняльна оцінка вираженості кореляційної залежності в ефектах вивчених препаратів дозволяє відмітити найбільшу кількість тісних кореляцій у пентоксифіліна (табл. 3) на рівні всіх ланок досліджених систем, що вказує на більш широкий спектр його антистресової дії у порівнянні з іншими ксантинами й пірацетамом.

Таблиця 3 Кількість найбільш тісних кореляційних зв'язків між рівнем цАМФ і цГМФ та показниками функціонального стану досліджуваних систем при дії похідних ксантину в умовах емоційного стресу

Таким чином, дослідження впливу похідних ксантину кофеїну, еуфіліну й пентоксифіліну щодо систем і процесів, стимульованих емоційним стресом, дозволили виявити у них стреспротекторну дію, а порівняльним аналізом встановлено, що найбільш ефективним препаратом в цих умовах є пентоксифілін.

ВИСНОВКИ

В дисертації наведено теоретичне узагальнення і нове рішення наукової задачі, а саме фармакологічного захисту організму від несприятливої дії емоційно-стресових факторів за допомогою похідних ксантину - кофеїну, еуфіліну і пентоксифіліну, у яких вперше експериментально встановлена наявність антистресових властивостей.

1. Гострий емоційний стрес в стадії тривоги викликає у білих щурів порушення з боку ЦНС у вигляді підвищення сумаційної здатності, активації поведінкових реакцій, підсилення емоційних проявів і послаблення формування і збереження пам'яті. Про реакцію ГГНС свідчить зниження коефіцієнтів маси лімфоїдних органів, еозинопенія, крововиливи і виразки в слизовій оболонці шлунка, гіпертрофія наднирників і підсилення їх функцій, що сполучається з патоморфологічними змінами щодо вказаних органів. Вегето-медіаторні процеси порушуються шляхом підвищення симпато-адреналового і холінергічного тонусу. Порушення біоокислювальної рівноваги проявляється збільшенням продуктів ПОЛ (ДК і ТБК-АП) і підвищенням активності ферментів СОД і каталази антиоксидантної системи та супроводжується статистично вірогідним збільшенням рівню цАМФ в крові і мозковій тканині і зниженням в тих самих субстратах кількості цГМФ.

2. Кофеїн (100 мг/кг внутрішньошлунково двічі) у білих щурів стабілізує сумаційну здатність нервової системи, відновлює рухову активність тварин у "відкритому полі", прискорює подібно до пірацетаму перебіг рефлекторних реакцій, підвищуючи відсоток навчених тварин (66,7% проти 16,6% при ЕС); зберігає коротко- і довгострокову пам'ять краще (66,7% і 50%), ніж пірацетам (50% і 33,2%). Захищає від порушення всі показники гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи, із вегето-медіаторних показників - норадреналін крові і мозку, а також подібно до пірацетаму - активність ацетілхолінестерази крові і мозку. На рівні пірацетаму гальмує підвищення продуктів ПОЛ і активує СОД в крові, стан антиоксидантної системи в мозку, особливо активність каталази, в цілому - загальну кількість бета-ліпопротеїдів, але слабкіше за пірацетам. Щодо серцево-судинної системи, стабілізує роботу серця. Як і пірацетам, зберігає співвідношення цАМФ/цГМФ в крові і в головному мозку. За числом (6) максимально тісних кореляційних зв'язків у порівнянні з іншими дослідженими препаратами проявляє найменшу стреспротекторну активність.

3. Еуфілін (100 мг/кг внутрішньошлунково двічі) попереджає порушення з боку ЦНС, поступаючись за впливом на СПП кофеїну і відповідаючи ефектам пірацетама, за винятком збереження довгострокової пам'яті, де препарат порівняння діє слабкіше. Слабкіше за пірацетам захищає вивчені інтегральні показники гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи, за винятком виразково-дистрофічних змін в шлунку і еозинопенії, попереджає порушення функціонального стану наднирників. Захищає вегетативну регуляцію за рахунок збереження норадреналіну в крові і в головному мозку, адреналіну - в головному мозку і активності холінестерази в крові і в головному мозку, подібно до пірацетаму. Як і кофеїн, але слабкіше за пірацетам, зберігає рівень бета-ліпопротеїдів крові. Не допускає порушення окислювальної рівноваги подібно до пірацетаму, стабілізуючи на рівні контроля кількість ТБК-АП і каталази в крові і зберігаючи активність обох антиоксидантних ферментів головного мозку на рівні ЕС. Як і пірацетам, не порушує роботу серця і знижує АТ. Подібно пірацетаму, проявляє тенденцію до збереження в крові і в мозковій тканині цАМФ і цГМФ і статистично достовірно відновлює цАМФ в головному мозку. За числом максимально тісних кореляційних зв'язків (12) еуфілін посідає середнє місце серед ксантинових стреспротекторів.

4. Пентоксифілін (100 мг/кг внутрішньошлунково двічі) захищає сумаційну здатність нервової системи, емоційно-поведінкові реакції щурів у "відкритому полі", покращує її когнітивну здатність. Проявляє захисний вплив на стан гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникової системи за всіма вивченими показниками, крім еозинопенії. Вирівнює в головному мозку співвідношення між норадреналіном і адреналіном, а також підвищує на рівні контролю активність ацетілхолінестерази крові і головного мозку. Підтримує пероксидантно-антиоксидантну рівновагу за рахунок ТБК-АП і СОД крові, в головному мозку активність обох ферментів антиоксидантної системи залишається високою. Запобігає стрес-стимульованим зсувам в роботі серця і рівні АТ. Кількість цАМФ і цГМФ в головному мозку не змінюється, проявляючи найбільше число максимально тісних кореляційних зв'язків з вивченими показниками (28). Ефекти пентоксифіліну дорівнюють або перевищують дію пірацетама і перевершують стреспротекторні властивості кофеїну і еуфіліну.

5. Загальними механізмами стреспротекторної дії вивчених похідних ксантину є мембраностабілізуюча дія на підставі збереження прооксидантно-антиоксидантної рівноваги і вегетативної регуляції адрено- і холінергічного тонусу організму за умов емоційного стресу.

6. цАМФ і цГМФ, як частина універсальної аденілат- і гуанілатциклазної системи, активно реагують на емоційно-стресовий вплив і можуть бути показниками антистресової дії похідних ксантину.

7. Експериментально доведена стреспротекторна активність кофеїну, еуфіліну і особливо пентоксифіліну може бути доцільно використана при захворюваннях стресового генезу.

СПИСОК ПРАЦЬ, НАДРУКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Киричек Л.Т., Зубова Е.О. Молекулярные основы окислительного стресса и возможности его фармакологической регуляции // Международный медицинский журнал. - 2004. - Т.10, №1. - С. 144-148 (особисто здобувачем зібрано літературу, складено огляд літератури і написано статтю).

2. Зубова Е.О., Горбач Т.В. Влияние производных ксантина на интенсивность перекисного окисления липидов и антиоксидантную систему при остром эмоциональном стрессе в эксперименте // Медицина сегодня и завтра. - 2004. - №1. - С. 57-60 (особисто здобувачем проведені дослідження, статистично оброблені результати, написано статтю).

3. Зубова Є.О. Вегето-медіаторні показники антистресової дії ксантинів // Медицина сегодня и завтра. - 2004. - №2. - С. 39-41.

4. Киричок Л.Т., Зубова Є.О., Горбач Т.В. Внутрішньоклітинні сигнальні системи в механізмі антиоксидантної дії ксантинів при емоційному стресі в експерименті // Ліки. - 2004. - №3-4. - С. 13-16 (особисто здобувач розробив план експерименту, провів основні дослідження та проаналізував одержані результати).

5.Зубова Е.О. Влияние производных ксантина на состояние центральной нервной и сердечно-сосудистой систем при эмоциональном стрессе в эксперименте // Экспериментальная и клиническая медицина. - 2004. - №4. - С. 69-71.

6. Зубова Е.О. Пентоксифиллин: новые свойства для профилактики заболеваний стрессового генеза // Інформаційний лист. - Харків, 2004. - 1с.

7. Зубова Е.О. Антиамнестическая активность метилксантинов при эмоциональном стрессе в эксперименте // Збірник тез Всеукраїнської наукової конференції студентів, аспірантів, клінічних ординаторів "Стрес, шок, термінальні стани" (Донецьк, 16-17 жовтня 2003 р.). - Донецьк, 2003. - С. 18.

8. Зубова Є.О. Антиоксидантні властивості похідних ксантину // Збірник тез 58 науково-практичної конференції студентів та молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю "Актуальні проблеми сучасної медицини" (Київ, 28-31 жовтня 2003 р.). - Київ, 2003. - С. 20.

9. Зубова Е.О. Антистресовая активность производных ксантина в условиях острого эмоционального стреса. Медицина третього тисячоліття: Збірник тез міжвузівської конференції молодих вчених (Харків, 20 січня 2004 р.). - Харків, 2004. - С. 21-22.

10. Зубова Е.О. Влияние производных ксантина на тонус симпатической нервной системы при эмоциональном стрессе в эксперименте // Матеріали наукової конференції студентів та молодих вчених з міжнародною участю. - Вінниця, 2004. - С. 312.

11. Зубова Е.О. Антистрессовый эффект - новое проявление поликомпонентного фармакологического действия пентоксифиллина // Матеріали IV Української науково-практичної конференції з міжнародною участю з клінічної фармакології: "Актуальні питання фармакології".- Вінниця, 7-8 жовтня 2004 р. - С. 42-46.

АНОТАЦІЇ

Зубова Є.О. Захисна дія похідних ксантину за умов гострого емоційного стресу в експерименті. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.05 - фармакологія. - Інститут фармакології і токсикології АМН України, Київ, 2006.

Дисертація присвячена вивченню захисної дії серед похідних ксантину в умовах моделі гострого емоційного стресу. Експериментально доведено, що кофеїн, еуфілін і пентоксифілін у дозі 100 мг/кг внутрішньошлунково двічі мають стресспротекторну активність.

Виявлено найбільш активний препарат - пентоксифілін, який запобігає порушенням з боку сумаційної здатності ЦНС, емоційно-поведінкових реакцій, захищає гіпоталамо-гіпофізарно-наднирникову систему, що проявляється збереженням маси наднирників і лімфоїдних органів (тимуса, селезінки), а також вмісту аскорбінової кислоти та 11-ОКС в наднирниках, 11-ОКС в плазмі крові і захистом слизової оболонки шлунку від дистрофічних порушень, забезпечує вегето-медіаторну рівновагу в мозку і крові, підтримує пероксидантно-антиоксидантну рівновагу за рахунок ТБК-АП і СОД крові, стабілізує АД і частоту серцевих скорочень.

Отримані дані свідчать про наявність у похідних ксантину нових стреспротективних властивостей і можуть бути підставою для їх використання в профілактиці захворювань стресового генезу.

Ключові слова: похідні ксантину, кофеїн, еуфілін, пентоксифілін, гострий емоційний стрес, експериментальне дослідження, стреспротективна активність.

Зубова Е.О. Защитное действие производных ксантина в условиях острого эмоционального стресса в эксперименте. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности14.03.05 - фармакология. - Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 2006.

Диссертация посвящена изучению защитного действия среди производных ксантина в условиях модели острого эмоционального стресса. Экспериментально доказана стресспротекторная активность кофеина, эуфиллина, пентоксифиллина в дозе 100 мг/кг внутрижелудочно дважды.

Выявлен наиболее активный препарат - пентоксифиллин, который предотвращает нарушения со стороны суммационной способности ЦНС, эмоционально-поведенческих реакций крыс в “открытом поле”, улучшает ее когнитивную способность, защищает гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковую систему, что проявляется сохранением массы надпочечников и лимфоидных органов (тимуса, селезенки), а также содержания аскорбиновой кислоты и 11-ОКС в надпочечниках, 11-ОКС в плазме крови и защитой слизистой оболочки желудка от дистрофических нарушений, обеспечивает вегето-медиаторное равновесие в головном мозге, выравнивая соотношение между адреналином и норадреналином, а также повышает на уровне контроля активность ацетилхолинэстеразы крови и головного мозга. Подддерживает пероксидантно-антиоксидантное равновесие за счет ТБК-АП и СОД крови, предотвращает стресс-стимулированные смещения в работе сердца и уровне АД.

Кофеин стабилизирует суммационную способность нервной системы, восстанавливает двигательную активность животных в “открытом поле”, ускоряет течение рефлекторных реакций, повышает процент обученных животных; сохраняет кратко- и долгосрочную память. Защищает от нарушения все показатели гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, из вегето-медиаторных показателей - норадреналин крови и мозга, а также - активность ацетилхолинэстеразы крови и мозга. Тормозит повышение продуктов ПОЛ и активирует СОД в крови, состояние антиоксидантной системы в мозге, особенно активность каталазы, в целом - общее количество бета-липопротеидов. Относительно сердечно-сосудистой системы, стабилизирует работу сердца. В сравнении с другими исследованными препаратами проявляет наименьшую стресспротекторную активность.

Эуфиллин предупреждает нарушения со стороны ЦНС, уступая по влиянию на СПП кофеину. Защищает изученные интегральные показатели гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, за исключением язвенно-дистрофических изменений в желудке и эозинопении, предупреждает нарушение функционального состояния надпочечников. Защищает вегетативную регуляцию за счет сохранения норадреналина в крови и в головном мозге, адреналина - в головном мозге и активности ацетилхолинэстеразы в крови и в головном мозге. Как и кофеин, сохраняет уровень бета-липопротеидов крови. Не допускает нарушения окислительного равновесия, стабилизируя на уровне контроля количество ТБК-АП и каталазы в крови и сохраняя активность обоих антиоксидантных ферментов головного мозга на уровне ЭС. Не нарушает работу сердца и снижает АД. Проявляет тенденцию к сбережению в крови и в мозговой ткани цАМФ и цГМФ и статистически достоверно восстанавливает цАМФ в головном мозге. Занимает среднее место среди ксантиновых стресспротекторов.