Высокоэффективная жидкостная хроматография лекарственных препаратов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

ГОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия

Реферат

Высокоэффективная жидкостная хроматография лекарственных препаратов

Выполнил:

студент 313 группы

Андреева Н.А.

СПБ, 2013

Хроматография была открыта М.С. Цветом в 1903 г. в виде колоночного жидкостно-адсорбционного метода. В этом методе использовались адсорбенты с размером зерен более 50--100 мкм, элюент проходил через колонку самотеком за счет силы тяжести, проточных детекторов не было. Разделение происходило медленно, в течение нескольких часов, и в таком режиме жидкостная хроматография не могла быть использована для аналитических целей.

Хроматография - метод разделения смесей веществ, основанный на последовательном многократном перераспределении компонентов смеси между несмешивающимися неподвижной и подвижной фазами, движущимися относительно друг друга. В качестве неподвижной фазы, как правило, выступает твердая или жидкая субстанция со специально подобранными или направленно сформированными физико-химическими свойствами. Подвижной фазой может быть газ, и тогда эту разновидность называют газовой хроматографией (ГХ), либо - жидкость, и соответственно, такая хроматография называется жидкостной (ЖХ). В жидкостной хроматографии неподвижной фазой является твердый сорбент, через который с определенной скоростью движется подвижная жидкая фаза - элюент.

Отличительной особенностью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) является использование высокого давления (до 400 бар) и мелкозернистых сорбентов (обычно 3--5 мкм, сейчас до 1,8 мкм). Это позволяет разделять сложные смеси веществ быстро и полно (среднее время анализа от 3 до 30 мин). Высокоэффективная жидкостная хроматография - наиболее эффективный метод анализа органических проб сложного состава.

Почти все существующие методы анализа органических соединений непосредственно приложимы лишь к индивидуальным соединениям или простейшим смесям. Так, одновременное раздельное определение 2--3 соединений титриметрическими или спектрофотометрическими методами осуществимо лишь в редких случаях, когда свойства определяемых соединений в достаточной степени различаются.

При разработке титриметрических и спектральных методик требуется немало труда, чтобы доказать специфичность метода, выявить условия и примеси, мешающие выполнению анализа. Хроматография, объединяющая в одном эксперименте разделение и анализ, почти лишена этих недостатков, и поэтому ее применение для анализа сложных смесей предпочтительней.

Процесс анализа пробы делится на 2 этапа:

разделение пробы на составляющие компоненты;

детектирование и измерение содержания каждого компонента.

Задача разделения решается при помощи хроматографической колонки, которая представляет собой трубку, заполненную сорбентом. При проведении анализа через хроматографическую колонку подают жидкость (элюент) определенного состава с постоянной скоростью. В этот поток вводят точно отмеренную дозу пробы.

Компоненты пробы, введенной в хроматографическую колонку, из-за их разного сродства к сорбенту колонки двигаются по ней с различными скоростями и достигают детектора последовательно в разные моменты времени.

Таким образом, хроматографическая колонка отвечает за селективность и эффективность разделения компонентов. Подбирая различные типы колонок можно управлять степенью разделения анализируемых веществ.

Идентификация соединений осуществляется по их времени удерживания. Количественное определение каждого из компонентов рассчитывают, исходя из величины аналитического сигнала, измеренного с помощью детектора, подключенного к выходу хроматографической колонки.

Температура хроматографической колонки может быть комнатной, что позволяет хроматографировать белки, аминокислоты и другие термически нестойкие соединения. Молярная масса разделяемых веществ может достигать ~2000. На рис. 1 показана принципиальная блок-схема жидкостного хроматографа.

Рис. 1

Резервуар 1 для растворителя из нержавеющей стали или другого материала может иметь в аналитическом варианте объем около 1 л. Насос 2 служит для подачи жидкой фазы из резервуара 1 под повышенным давлением. Он обеспечивает подачу жидкости со скоростью до 10 мл/мин при высоком давлении на входе в колонку -- до 100-500 атм. Между насосом и колонкой устанавливается фильтр с диаметром пор около ~10 мкм.

В микроколоночных жидкостных хромотографах применяют насос низкого давления до 10-20 атм.

Для ввода анализируемой пробы служит устройство 3. При давлении жидкости, превышающем ~120 атм., ввод пробы шприцем затруднителен, поэтому используют специальные многоходовые краны. Объем вводимой пробы может составлять 0.05-50 мкг.

Аналитическую хроматографическую колонку 4 обычно делают из нержавеющей стали или толстостенного стекла, длиной ~10-25 см (может быть и больше), с внутренним диаметром 3-8 мм. Предпочтительны прямые колонки.

В микроколоночных жидкостных хроматографах применяют колонки меньшей длины с внутренним диаметром 1-2 мм и даже меньше.

Устройство для ввода пробы и хроматографическая колонка находятся в воздушном или водяном термостате 5, которых поддерживает заданную температуру с точностью до 0.1 °C.

Рабочая температура термостатирования лежит между температурами замерзания и кипения жидкой ПФ(подвижной фазы), чаще всего в диапозоне от 20 до 50 °C.

Система 6 включает детектор специального типа. Применяют спектрофотометрические (с постоянной или переменной длиной волны), рефрактометрические, адсорбиционно-термометрические, флуориметрические детекторы и некоторые другие.

Детекторы бывают двух типов. Детекторы первого типа реагируют на изменение свойств растворителя (например, показателя преломления). Детекторы второго типа реагируют на свойства растворенного вещества, например, спектрофотометрические детекторы, обладающие высокой чувствительностью и селективностью.

Сигнал от детектора преобразуется, усиливается и регистрируется самописцем на бумаге в виде хроматограммы, аналогичной хроматограмме в ГЖХ.

В ВЭЖХ используют как нормально-фазовый, так и обращенно-фазовый варианты. В первом случае полярность НФ больше полярности ПФ, во втором, наоборот, полярность НФ меньше полярности ПФ.

Анализ по величинам удерживания

Этот вид анализа основан на том, что при постоянных условиях хроматографирования время удерживания данного вещества, а также все производные от него параметры являются постоянными величинами. В зависимости от наличия эталонных веществ, табличных значений параметров удерживания или детальных сведений о закономерностях поведения данного класса соединений можно избрать один из трех способов анализа.

Прямое сравнение величин удерживания осуществимо в том случае, когда в распоряжении исследователя имеется набор эталонов соединений, присутствие которых предполагается в данной смеси. В хроматограф вводят изучаемую смесь и затем последовательно все необходимые эталоны, измеряют времена удерживания. Различие времени удерживания эталона и идентифицируемого пика однозначно свидетельствует о неидентичности двух соединений, а совпадение указывает на то, что идентичность двух веществ вполне вероятна. Для того чтобы с большей надежностью убедиться в совпадении времен удерживания, эталон можно ввести в хроматограф вместе с изучаемой смесью. Количества идентифицируемого вещества и эталона при этом должны быть приблизительно равны. Если времена удерживания веществ действительно одинаковы, относительная высота идентифицируемого пика возрастет вдвое, а ширина (если колонка не перегружена образцом) не изменится. Увеличение высоты пика менее чем в два раза и возрастание ширины свидетельствуют о неидентичности двух соединений. С помощью такого приема удается уловить незначительные различия в величинах удерживания.

Предположим, что на колонке эффективностью 5000 теоретических тарелок время удерживания эталона 10 мин, а неизвестного пика -- 10,2 мин. При обычной технике эксперимента такое различие недостоверно. Введя два вещества в колонку одновременно, получим суммарный пик. Если приведенное незначительное различие в удерживании действительно имеет место, ширина этого пика будет примерно на 60% больше ширины индивидуального. Такое увеличение ширины легко заметить визуально или с помощью простейших измерений. Тем самым различие двух соединений становится совершенно очевидным. Совпадение времен удерживания, строго говоря, не является доказательством идентичности веществ, а лишь указывает на ее вероятность. Степень вероятности можно значительно повысить, если повторить всю процедуру в иных условиях, лучше всего в системе с другим механизмом удерживания.

Если набор эталонных соединений отсутствует, можно попытаться провести идентификацию по табличным значениям величин удерживания. Межлабораторная воспроизводимость абсолютных величин пока неудовлетворительна. Поэтому множество опубликованных в такой форме данных почти бесполезно при качественном анализе. Иногда на основе опубликованных величин можно рассчитать параметры удерживания со значительно большей надежностью. Однако в этом случае близость табличных и наблюдаемых величин -- весьма шаткое доказательство. Тем не менее такой способ идентификации вполне применим по отношению к тем объектам, состав которых хорошо изучен. Лекарственные вещества, а также примеси в них можно отнести именно к такой категории. При воспроизведении методик анализа в этом случае фактически необходимо провести не идентификацию ранее неизвестных веществ, а лишь «привязать» измеренные величины удерживания к опубликованным величинам удерживания и структурам соединений.

В связи с увеличением в последнее время числа острых и смертельных отравлений различными лекарственными препаратами все более актуальным становится вопрос химико-токсикологических и судебно-химических исследований по идентификации лекарственных препаратов в крови, поскольку с этим связан выбор метода лечения пациентов. В связи с этим с каждым годом растут требования, предъявляемые к судебно-химическим исследованиям, поскольку расширяется список определяемых препаратов, увеличивается число отравлений комбинацией двух и нескольких лекарственных препаратов, повышаются требования к чувствительности методик, к избирательности. Все это требует разработки новых методик анализа, основывающихся на современных инструментальных методах исследования.

Химико-токсикологический и судебно-химический анализ различных лекарственных препаратов в биологических средах представляет значительные трудности в связи с существенными различиями как самих биологических матриц, так и анализируемых лекарственных препаратов. Кроме того, важно учитывать метаболизм лекарственных препаратов.

Химическое исследование лекарственных препаратов в биологических средах включает несколько последовательных стадий: стадии извлечения лекарственного препарата из биологического объекта, стадии очистки от соэкстрактивных веществ, стадии концентрирования и стадии анализа. Традиционно для извлечения лекарственных препаратов из биологических объектов используют жидкость-жидкостную экстракцию раздельно для веществ кислого и основного характера, и основным методом исследования остается метод тонкослойной хроматографии (ТСХ). Используемый в настоящее время метод ТСХ имеет ряд недостатков: данный метод неспецифичен, поскольку идентификация неизвестного лекарственного препарата этим методом часто неоднозначна (а иногда невозможна) из-за совпадения параметров нескольких лекарственных препаратов, не дает количественной оценки вещества и требует затрат большого количества реактивов и времени.

Таким образом, приемы хроматографического качественного анализа по величинам удерживания можно использовать далеко не всегда, особенно на стадии исследования новых соединений.

Сейчас все более широко внедряются инструментальные методы анализа, обладающие высокой чувствительностью и избирательностью: газовая хроматография с масс-селективным детектором (ГХ/МСД), высокоэффективная жидкостная хроматография с многоволновым детектированием (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез (КЭ). Все эти методы можно также использовать в скрининговом варианте.

Для идентификации и количественного определения лекарственных препаратов при исследовании методом ВЭЖХ (в том числе и для исследования в режиме скрининга) отбираются пробы по 0,6 мл из хлороформных экстрактов из биообъектов для определения веществ кислого и основного характера. Пробы из обоих экстрактов (вещества кислого и основного характера) объединяют, высушивают при комнатной температуре, сухой остаток растворяют в 2%-ном растворе ацетонитрила в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты и исследуют методом ВЭЖХ. Таким образом, в одной пробе определяются вещества кислого и основного характера. Количественное содержание лекарственных препаратов определяют по калибровочным графикам, построенным по серии разведений стандартных веществ методом абсолютной калибровки с использованием программного комплекса «Мультихром».

Приготавливают растворы эталона различных концентраций, выбранных таким образом, чтобы они охватывали ожидаемый диапазон концентраций определяемого соединения. Снимают хроматограммы и строят график. Затем измеряют пик определяемого вещества и находят его концентрацию с помощью полученного графика. Разумеется, график может быть заменен соответствующим уравнением, параметры которого нетрудно найти известным способом. Этот метод требует строгой воспроизводимости объема образца, дозируемого в колонку. Если хроматограф снабжен качественным дозатором, относительная погрешность результата обычно не превышает 2--3%. Чаще всего, при работе в среднем диапазоне масс определяемых соединений (0,1--10 мкг), явления необратимой сорбции или нелинейности детектора не осложняют работу, калибровочный график представляет собой прямую, проходящую через начало координат. Тогда допустимо снизить трудоемкость анализа, используя всего один калибровочный раствор, по концентрации определяемого вещества не слишком отличающийся от испытуемого. Для достижения максимальной точности калибровку необходимо проверять не реже, чем через каждые 4--5 ч работы.

Метод внутреннего стандарта позволяет исключить погрешность ввода пробы и некоторые другие ошибки, связанные с подготовкой образца. При работе по этому методу необходимо выбрать постороннее соединение (внутренний стандарт), отсутствующее в анализируемой смеси и хорошо отделяющееся от всех пиков. Из этого соединения и определяемого вещества готовят серию искусственных калибровочных смесей. Концентрация определяемого вещества в таких смесях должна примерно соответствовать концентрации его в анализируемых смесях. В избранном для анализа режиме хроматографируют калибровочные смеси и измеряют площади пиков Sx (определяемый компонент) и SCT (внутренний стандарт).

Для идентификации лекарственного препарата исследуются в первую очередь экстракты из мочи и желчи, поскольку, как правило, в этих объектах лекарственные препараты присутствуют в высоких концентрациях. Для количественного определения исследуются экстракты из крови, поскольку только для крови имеются данные по терапевтическим, токсическим и летальным дозам. Жидкость-жидкостная экстракция в делительных воронках, применяемая в настоящее время, имеет ряд недостатков: необходим большой объем биожидкости (до 100 мл), большой расход реактивов, многостадийность, длительность (кровь при подкислении и подщелачивании образует с экстрагентами стойкую суспензию), неточность.

Поскольку для исследования методом ВЭЖХ необходимо всего 5-10 мкл пробы, была исследована возможность проведения однократной экстракции лекарственных препаратов из одной пробы крови (мочи и желчи) объемом 0,6 мл в пробирках.

Исследования проводили на модельных смесях биожидкостей с известным количеством лекарственных препаратов (смесь № 1: азалептин + анаприлин + фенобарбитал, смесь № 2: донормил + имован + золпидем). Экстракцию проводили из 0,6 мл биожидкости. В качестве экстрагентов использовались хлороформ и смеси растворителей на основе хлороформа с изо-пропиловым спиртом, с ацетоном, с ацетонитрилом, с этилацетатом и другими растворителями. Установлено, что степень извлечения исследуемых лекарственных препаратов смесями хлороформа с ацетоном в соотношении 9:1 и хлороформа с ацетонитрилом в соотношении 9:1 выше в 1,5-2 раза, чем чистым хлороформом.

Были проведены сравнительные исследования количественного содержания лекарственных препаратов, извлекаемых из биологических жидкостей по предлагаемому методу и методу А.А. Васильевой, результаты представлены в таблице. Экспериментально установлено, что степень извлечения лекарственных веществ из крови предлагаемым методом в среднем в 20-30 раз выше, чем по методу А.А. Васильевой.

Таким образом, полученные данные на примере модельных смесей на основе крови, мочи и желчи и реальных пробах показали, что для идентификации лекарственного препарата при отравлениях можно использовать предлагаемый метод однократной экстракции из 0,6 мл биологических жидкостей смесями растворителей: хлороформа с ацетоном и хлороформа с ацетонитрилом. Степень извлечения лекарственных веществ из крови предлагаемым методом в 20-30 выше, чем в извлечениях по методу А.А. Васильевой. Кроме того, данный метод позволяет количественно определять лекарственные препараты в биологических матрицах. Предлагаемый метод имеет ряд преимуществ: значительно снижает трудоемкость анализа, снижает стоимость анализа за счет уменьшения объемов используемых реактивов, сокращает случайные и систематические ошибки в процессе подготовки проб, избирателен и чувствителен.

Результаты сравнительного исследования количественного содержания лекарственных препаратов, извлекаемых из биологических объектов

Список литературы

жидкостный хроматография адсорбционный

1. Количественный анализ хроматографическими методами. /под ред. Э. Кец -- М.: Мир. 1990, 320 с.

2. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. М. Высшая школа. 1983, 240 с.

3. Кокорина Н.О. Скрининг лекарственных препаратов в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, Москва - Тюмень, 2005. С. 146-147.

4. Лурье Ю.Ю. Справочник по аналитической химии. М.: Химия. 1989, 448 с.

5. Крупина Н.А., Краснова РР, Ковалева Т.А. Обнаружение и определение лекарственных веществ нейтрального и основного характера в крови (сыворотке) газохроматографическим методом с использованием азотно-фосфорного детектора Москва - Тюмень, 2005. С. 171-173.

6. Шатц В.Д. Высокоэффективная жидкостная хроматография.

7. Зенкевич И.Г., Косман В.М. Методы количественного хроматографического анализа лекарственных веществ.

Размещено на Allbest.ru